TaqDNA聚合酶

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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流TaqDNA聚合酶【精品文档】第3页如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流TaqDNA聚合酶PCR技术出现初期，DNA聚合酶应用的是大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段。由于该酶不能忍受反应循环中解链所需的高温(93～95℃)，因此在反应过程中必须不断添加聚合酶以满足每次扩增的需要；另一方面，由于K1enow片段聚合反应温度偏低(37℃)，容易引起引物与DNA模板的非专一性配对，或受某些DNA二级结构干扰，结果产生许多非均一性的产物区带。耐热DNA聚合酶引入PCR后，使其操作大大简化，克服了用K1enow酶每一循环

2、中反复追加酶的缺点，并成为PCR自动化和迅速应用于分子生物学和其他学科的促进剂。目前，PCR耐热DNA聚合酶中以TaqDNA聚合酶应用最广泛。该酶是从水生栖热菌(Thurmusaquaticus，简称Taq)株中分离出来的。一、酶活性与热稳定性：（1）Gelfoad等于1989年总结出Taq酶的合成速率如下。75～80℃150／s70℃>60／s55℃24／s37℃1．5／s22℃0．25／s可见在一定范围内，温度越高，Taq酶的合成速率越高。温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有

3、良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。（2）TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切核酸酶活性。如果模板上有一段退火的不能延伸的寡聚核苷酸“阻断物”时，它会被此外切核酸酶活性逐个切除而不会阻止来自上游(3’—OH)的链的延伸；Taq酶无3’一5’外切核酸酶活性（3）TaqDNA聚合酶还具有反转录活性，类似于反转录酶。在2—3mmol／LMg2’，68’C时即能发挥此活性。有学者报道该酶在Mnz+存在时，反转录活性更佳，没有Mn2+时不能反转录150—250bp以上的核酸片段。这一特性可直接用于RNA的扩增，使其简化。（4）TaqDNA聚合酶

4、具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的3’端加上一个碱基。尽管4种碱基均可被聚合到3’端，但Taq酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP.所以，在标准PCR条件下，PCR产物3’端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。TaqDNA聚合酶可在-20℃储存至少6个月。二、TaqDNA聚合酶的应用条件：TaqDNA聚合酶的应用条件：需Mg2+（1mmol/L）。低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。一价阳离子高至0.1mol/L对其活性无影响最适浓度：NaCl=40mmoL/LKCl=60mmol/L最适

5、pH：7.8三、其作用功能在于，在有4种核苷三磷酸盐的反应体系中，以高温下变性的DNA为模板，从分别结合在目的DNA两端的引物出发，按5，一3’方向合成DNA新链。产物dsDNA再经加热解链，耐热的TaqDNA聚合酶又在下一轮新股DNA链的合成中显示活性。Taq酶的合成速率取决于温度、Mg2’、去污剂、模板的二级结构、dNTP浓度等等。附一：幻灯片内容：1.TaqDNA聚合酶简述TaqDNA聚合酶是一种耐热DNA聚合酶，分子量约为65000。该酶最初由极端嗜热水生菌中提取并纯化，目前已能通过基因工程大量生产。2.Taq一般特性：53，外切、反转录活性、末端转

6、移功能、很高的耐热稳定性3.Gelfoad等于1989年总结出Taq酶的合成速率如下。75～80℃150／s70℃>60／s55℃24／s37℃1．5／s22℃0．25／s可见在一定范围内，温度越高，Taq酶的合成速率越高。温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。4.TaqDNA聚合酶的应用条件：需Mg2+（1mmol/L）。低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。一价阳离子高至0.1mol/L对其活

7、性无影响最适浓度：NaCl=40mmoL/LKCl=60mmol/L最适pH：7.85.TaqDNA聚合酶的应用：TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)中，能以DNA为模板，需引物引导，以dNTP为原料，按碱基配对原则，从5’-3’【精品文档】第3页如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。（在一定范围内，温度越高，Taq酶的合成速率越高）2.Taq在pcr中de应用3.其作用功能在于，在有4种

8、核苷三磷酸盐的反应体系中，以高温下变性的DNA为模板