貉源犬瘟热病毒分离鉴定及其H、F基因序列分析

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学校代码：10289分类号：S858.9+Q786密级：公开学号：102300027江苏科技大学硕士学位论文貉源犬瘟热病毒分离鉴定及其H、F基因序列分析研究生姓名郭抗抗导师姓名闫喜军申请学位类别理学硕士学位授予单位江苏科技大学学科专业生物化学与分子生论文提交日期2013年06月04日物学研究方向动物病毒分子生物论文答辩日期2013年06月09日学答辩委员会主席唐玉斌评阅人2013年06月04日 分类号：S858.9+Q786密级：公开学号：102300027理学硕士学位论文貉源犬瘟热病毒分离鉴定及其H、F基因序列分析学生姓名郭抗抗指导教师闫喜军研究员江苏科技大学二O一三年六月 AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceIsolationandidentificationofCanineDistemperVirusfromraccoondogandsequenceanalysisofitsHandFgeneSubmittedbyGuokang-kangSupervisedbyYanxi-junJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,2013 江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日 江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密√。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日 摘要犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种高度接触性、致死性传染病。我国于1980年从病犬体内首次分离到犬瘟热病毒。目前，随着我国养殖业的快速发展，犬瘟热病已成为危害毛皮经济动物最大的传染病之一。然而近年来，其他科属包括大熊猫、小熊猫、猕猴等多种动物均出现感染犬瘟热病毒的报道，可见犬瘟热病毒的感染呈现不断扩大的趋势，由于该病的高传染性和高致死性，所以对该病的早期预防和早期诊断就显得尤为重要。本研究从哈尔滨一水貂养殖场，采集5只疑似犬瘟热病死貉子的肝、肺、脾、肠等脏器，利用Vero细胞成功分离一株病毒，通过免疫荧光，RT-PCR等方法鉴定为CDV，命名为CDV-HLJ(11)。通过理化特性鉴定分离毒CDV-HLJ(11)对酸、热、乙醚等环境因素敏感，动物回归实验用分离到的CDV-HLJ(11)株第三代细胞毒对貉（狐狸）攻毒显示对貉与狐狸均有明显的致病性。采用RT-PCR方法对分离到病毒的H、F基因进行扩增并测序，并分别与GenBank上已发表的毒株序列进行比对。结果显示，分离株CDV-HLJ（11）的H基因序列与野毒株HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高，分别为99.9%、99.7%、99.6%，与疫苗株StrainCDV3、Convacvaccinestrain的同源性最低为91.4%。分离株CDV-HLJ（11）的F基因序列与野毒株HeB(07)1、JL(07)1最高，分别为98.9%、99.4%，与疫苗株Onderstepoort、GZ1最低，分别为91.4%、91.1%。进化发育树分析分离毒为野毒株，在基因分型上为Asia-Ⅰ型。关键词CDV；分离鉴定；F基因；H基因I AbstractCaninedistemper(CD),ahighcontactresistance,deadlyinfectiousdiseases,iscausedbyCDV.OurcountryseparatedtheCDVforthefirsttimein1980frominfecteddogs.Atpresent,withtherapiddevelopmentofaquacultureinChina.Caninedistemperhasbecomeoneofharmfureconomicalanimalbiggestinfectiousdiseases.However,inrecentyears,somanykindsofanimalsincludingthegiantpanda,panda,monkeyareinfectedbycaninedistempervirus.Caninedistempervirusinfectionshowedatrendencywhichexpandedinceasingly.Duetothehighinfectivityandmortalityofthedisease,theearlypreventionandearlydiagnosisofthediseaseareparticularlyimportant.RaccoondogspecimensuspectedascaninedistempervirusfromHaerbinwerecollectedforvirusisolationinverocellsculture.ItwasdemonstratedtobeacaninedistempervirusbyimmunofluorescenceandRT-PCR.TheHgeneoftheisolatedstrainwasamplifiedbyRT-PCR.CDV-HLJ(11)issensitivetoenvironmentalfactorssuchasacid,hot,ether.Animalregressionexperimentalshowsafter10dayspoisonattackgrouphaveobvioussymptomsreactionaccompaniedbydeath,provedseparatethepoisonousCDV-HLJ(11)pairoffox,theraccoondoghavetheobviouspathogenicity.TheHgeneandFgeneoftheisolatedstrainwasamplifiedbyRT-PCR,andlaterwasclonedandsequenced.ItshowsthehomologyofnucleicacidsequencesofHgenewithHeB(07)1,SD(09)3andSD(07)1washigh(99.9%,99.7%,99.6%).ThehomologyofnucleicacidsequenceswithStrainCDV3andConvacvaccinestrainwaslow(91.4%.).ThehomologyofnucleicacidsequencesofFgenewithJL(07)1andHeB(07)1washigh(98.9%、99.4%).ThehomologyofnucleicacidsequencesofFgenewithOnderstepoortandGZ1strainwaslow（91.4%、91.1%）.PhylogenetictreeshowsthattheisolatedstrainiswildstrainandisAsia-Ⅰ.KeywordsCDV;Isolationandidentification;Hgene;FgeneII 目录摘要............................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................II第1章绪论..................................................................................................................11.1CDV生物学特点..........................................................................................................11.1.1病原结构特点........................................................................................11.1.2核酸组成及特点....................................................................................21.1.3CDV的分离培养...................................................................................21.2流行病学特点...............................................................................................................31.3CDV致病机理...............................................................................................................31.4病理变化........................................................................................................................31.5犬瘟热诊断....................................................................................................................41.5.1病原学方法............................................................................................41.5.2免疫学方法............................................................................................41.5.3单克隆抗体............................................................................................51.5.4胶体金技术............................................................................................61.5.5分子生物学方法....................................................................................71.6犬瘟热基因工程疫苗研究进展...............................................................................71.6.1基因疫苗................................................................................................71.6.2基因工程亚单位疫苗............................................................................81.7CDV相关蛋白及基因研究进展...............................................................................81.7.1核衣壳(N)蛋白及其基因......................................................................81.7.2融合(F)蛋白及其基因...........................................................................91.7.3附着或血凝(H)蛋白及基因..................................................................91.8研究目的及意义........................................................................................................10第2章貉源犬瘟热病毒的分离鉴定........................................................................112.1材料..............................................................................................................................112.1.1病料......................................................................................................112.1.2实验动物..............................................................................................112.1.3细胞......................................................................................................112.1.4主要试剂和仪器..................................................................................112.1.5常用溶液和试剂的配置及处理..........................................................122.2方法..............................................................................................................................122.2.1病毒分离..............................................................................................122.2.2理化特性鉴定......................................................................................122.2.3RT-PCR鉴定........................................................................................132.2.4免疫荧光试验......................................................................................142.2.5动物回归试验......................................................................................142.3结果..............................................................................................................................152.3.1病毒分离结果......................................................................................152.3.2理化特性..............................................................................................152.3.3RT-PCR检测........................................................................................16III 2.3.4免疫荧光检测......................................................................................162.3.5动物回归实验......................................................................................172.4讨论..............................................................................................................................19第3章H、F基因的克隆及序列分析.......................................................................213.1材料..............................................................................................................................213.1.1主要试剂..............................................................................................213.1.2试剂的配置..........................................................................................213.1.3仪器......................................................................................................213.1.4克隆载体和受体菌..............................................................................223.1.5病毒毒株..............................................................................................223.2方法..............................................................................................................................223.2.1引物设计..............................................................................................223.2.2病毒基因组RNA的提取.................................................................223.2.3RT-PCR.................................................................................................223.2.4凝胶电泳..............................................................................................233.2.5PCR产物的回收纯化..........................................................................233.2.6目的基因与T载体的连接.................................................................233.2.7转化......................................................................................................243.2.8H、F基因序列测定及分析................................................................243.3结果..............................................................................................................................243.3.1H基因RT-PCR....................................................................................243.3.2F基因RT-PCR.....................................................................................253.3.3H基因序列分析...................................................................................263.3.4F基因序列分析...................................................................................353.4讨论..............................................................................................................................41结论..............................................................................................................................44参考文献......................................................................................................................45附录..............................................................................................................................50攻读硕士学位期间发表论文......................................................................................53致谢..............................................................................................................................54IV ContentsAbstract(Chinese).........................................................................................................IAbstract(English).......................................................................................................IIChapter1Introduce.....................................................................................................11.1CDVBiology..................................................................................................................11.1.1Etiology...................................................................................................11.1.2Nucleicacidcompositionandcharacteristics.........................................21.1.3CDVculturedinvitro.............................................................................21.2Epidemiologicalstudies................................................................................................31.3Canninedistemperdiseasemechanism.....................................................................31.4Pathologicalchanges.....................................................................................................31.5Thediagnosisofcanninedistemper...........................................................................41.5.1Pathogenicexamination..........................................................................41.5.2Immunologicaltests................................................................................41.5.3Molecularbiologymethods....................................................................51.5.4Colloidalgold..........................................................................................61.5.5Molecularbiologymethods....................................................................71.6Distempergeneticallyengineeredvaccineresearchprogress...............................71.6.1Genevaccine...........................................................................................71.6.2Geneticengineeringsubunitvaccine......................................................81.7CDVproteinandgeneticresearchprogress.............................................................81.7.1Nucleocapsid(N)proteinanditsgene....................................................81.7.2Fusion(F)proteinanditsgene...............................................................91.7.3Attachmentorbloodclotting(H)proteinandgene................................91.8Thepurposeandmeaningofresearch....................................................................10Chapter2IsolationandidentificationofCanineDistemperVirusfromraccoondogs............................................................................................................112.1Materials........................................................................................................................112.1.1Diseasedanimals...................................................................................112.1.2Experimentalanimals............................................................................112.1.3Cells......................................................................................................112.1.4Mainreagentsandinstruments.............................................................112.1.5Commonsolutionandreagentsconfigurationandprocessing.............122.2Methods.........................................................................................................................122.2.1IsolationofCDV...................................................................................122.2.2Physico-chemicalcharacterization.................................................................122.2.3RT-PCR.................................................................................................132.2.4Immunofluorescence.............................................................................142.2.5Animalregressionexperiments.............................................................142.3Results...........................................................................................................................152.3.1Virusisolation.......................................................................................152.3.2Physicalandchemicalproperties..........................................................152.3.3RT-PCR.................................................................................................16V 2.3.4Immunofluorescence.............................................................................162.3.5Animalregressionexperiments.............................................................172.4Dissucion.......................................................................................................................19Chapter3SequenceanalysisofFandFgene...........................................................213.1Materials........................................................................................................................213.1.1Reagents................................................................................................213.1.2Reagentsconfiguration.........................................................................213.1.3Instruments............................................................................................213.1.4Thestrainofthevirus...........................................................................223.1.5Thestrainofthevirus...........................................................................223.2Methods.........................................................................................................................223.2.1Primerdesign........................................................................................223.2.2ViralgenomicRNAextraction.............................................................223.2.3RT-PCR.................................................................................................223.2.4PCRofHandFgene............................................................................233.2.5ThepurifionofPCRproduct................................................................233.2.6TheconnectionofthetargetgeneandT-carrier...................................233.2.7Transformation......................................................................................243.2.8SequencingandanalysisofHandFgene............................................243.3Results...........................................................................................................................243.3.1TheRT-PCRofHgene.........................................................................243.3.2TheRT-PCRofFgene..........................................................................253.3.3SequencingandanalysisofHgene......................................................263.3.4SequencingandanalysisofFgene.......................................................353.4Discussion.....................................................................................................................41Conclusions.................................................................................................................44Peferences...................................................................................................................45Appendix.....................................................................................................................49PapersPublishedinthePeriedofMasterDegreeEducation................................53Acknowledgement.....................................................................................................54VI 第1章绪论犬瘟热是由犬瘟热病毒引起一种高度接触传染性、致死性疫病，主要感染鼬[1]科、部分浣熊科以及犬科动物，尤其是幼犬。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海[2]豹科等多种动物，均有CD自然发病的报道，犬瘟热的发病大有不断扩大之势。Jeneer于1809年首次公开报道了犬瘟热，但当时并不清楚致病原。而Carre[3]在1905年证实引起犬瘟热病的病原为一种病毒，所以犬瘟热又被称为Carre[4]氏病。1926年Laidlaw和Duncan通过实验也证实犬瘟热病是由病毒引起。我[5]国首次分离到犬瘟热病毒是在1980年，当时是在病犬体内分离到的。现在犬瘟热全国各地都有发生，大有流行趋势，目前该病是对养犬业、毛皮动物养殖业[4]和野生动物保护业危害最大的疫病之一，所以研制高效的疫苗对预防犬瘟热，减少经济损失至关重要。1.1CDV生物学特点1.1.1病原结构特点犬瘟热病毒(CDV)属于副黏病毒科麻疹病毒属。另外该属还含有小反刍兽病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒等3种病毒，该属的4种病毒均不含有神经氨酸酶，但[6]均可引起核内包涵体并诱发胞浆。6[5]犬瘟热病毒为不分节段的负链RNA病毒，分子量为6×10Da。病毒粒子大小为100—400nm不等，含有双层囊膜结构，对外界环境因素比较敏感，内部的核衣壳呈螺旋对称，直径18nm左右，病毒一般多为长杆形、椭圆形或圆形、[6]也有极少部分呈不定形。犬瘟热病毒共含有6种结构蛋白，主要包括大蛋白(thelargevirusspecificiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein,L)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、基质膜蛋白(Matrixprotein,M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,N)、附着或血凝蛋白（AttachmentproteinorHemagglutininprotein,H）以及磷蛋白(Phosphoprotein,P)[7]。N蛋白主要组成犬瘟热病毒的核衣壳，外面具有双层囊膜，其内部为M蛋白，M蛋白主要连接病毒囊膜内侧与核衣壳。H和F为两种重要糖蛋白，二者在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥重要作用，H蛋白细胞趋向作用，而F[8]蛋白是融合过程中所必需的，两者缺一不可。病毒对有机溶剂比较敏感，比如氯仿、乙醚等均可用于灭活病毒，一般pH值﹤7，酸性条件下也可杀死病毒，1 另外对热、紫外线等环境因素也比较敏感，通常消毒药就可用于犬瘟热病毒的灭[9]活。1.1.2核酸组成及特点[11-14]CDV为单股线性负链RNA病毒，全基因组长为15kb～16kb。按照3’～5’端的顺序依次为：3’端前导序列、N、P、M、F、H和L基因以及5’端前导序列，各序列长度分别为N1683nt、P1655nt、M1442nt、F2205nt、H1947nt、L[8]6573nt。55nt组成了3’端前导序列，而5’端前导序列由38nt组成，二者是启动、调节序列，控制基因的转录复制过程，同时又是犬瘟热病毒基因的转录终止、重[15]起始序列。两个序列之间为编码各种蛋白的基因，P基因没有开放阅读框，而其他基因均含有开放阅读框。P基因为2个阅读框，二者部分重叠，第一个起始于基因的42～44nt，止于1564～1566nt第二个起始于P基因65～67nt，止于587～589nt上，前者编码P蛋白，后者编码C蛋白。非编码区位于每个结构蛋白的3’端和5’端，这些区域含有1个半保守多腺核苷终止信号及基因间非转录三核苷酸标符，H-L间为CUA，L-5端先导序列间为CAA，其余均为CUU，[8,16]在标符后是下一个基因转录起始信号。与CDV其它基因相比，编码H蛋白[17]的H基因的序列变异频率最高，是目前人们研究各种毒株变异性的高频基因。P基因是CDV所有基因中最保守，变异频率最低的，因此进行遗传进化树分析[18]时P基因和H基因就显得尤为重要。1.1.3CDV的分离培养犬瘟热病毒的分离成功率很低是由于具有脂囊膜，对乙醚、氯仿等有机溶剂[19]以及光热均比较敏感，结构脆弱，对环境的抵抗力及其弱。分离培养犬瘟热病毒最重要的就是选择培养细胞，选择合适的培养细胞能够克服缓慢的弊端。通常培养细胞分为原代细胞及传代细胞系两大类。犬瘟热病毒对鸡胚成纤维细胞敏感而且生长稳定，犬瘟热病毒对鸡胚成纤维细胞可以形成典型的细胞病变且易于易观察，对其他营养条件并不高，因此鸡胚成纤维细胞适合作为分离培养CDV[20]的首选细胞。用其他组织细胞也能够分离CDV，比如Vantsi成功分理处分离[21]出犬瘟热病毒，其是用感染CDV的动物的肺巨噬细胞。Haig（1948）将适应于雪貂的CDV疫苗株（Onderstepoort）培养于鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上获得[22]成功。分离犬瘟热病毒的传代细胞系主要有有猫肾细胞系（CRFK）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）及其克隆株（VeroE6）BGMK（GreenMon2keyKidney）细胞系、绒猴B淋巴细胞系（B95a）、人子宫颈癌细胞系（Hela）、犬肾细胞系（MDCK）、人喉头癌细胞系（HEP–2）、CV-1（TC7clone）细胞系、Bsc-1细胞系、兔肾细胞系（RK13）、BD细胞系等。近年来，利用Vero细胞成功分离出犬2 [23-24][25]瘟热病毒多有报道，因而被认为是分离CDV的首选细胞。John等报道犬瘟热病毒易在MDCK细胞系和Vero细胞上生长。用传代细胞分离培养病毒时，细胞形成单层的时间不宜过长，否则影响病毒的敏感性。1.2流行病学特点带毒犬及病犬是犬瘟热最主要的传染源，感染犬瘟热病毒的其他动物也可以作为传染源。犬瘟热的传播方式多种多样，最常见的是通过直接接触的方式进行传播，而[6]配种期间频繁接触以及未经检疫动物的交换等会增大感染CDV的几率。1.3CDV致病机理在空气暴露条件下，病毒先侵入口腔及上呼吸道，然后会传播到扁桃体及支气管淋巴结，原发性增殖开始进行，最短2d，最长4d病毒就会进入血液，从而[26]引起病毒血症。最后，CDV散播到全身各淋巴器官引起感染动物体温升高。大约50%的感染犬自身免疫系统不能产生足够的抗体，而表现典型性的症状；另外50%的的犬自身免疫系统可在感染后迅速产生抗体，能够有效地抵抗犬瘟热病[27]毒的侵袭，没有出现临床症状。感染犬瘟热病毒的犬一般在感染后的8～9d犬瘟热病毒在单核细胞及淋巴细胞的携带下进入血流，引起二次病毒血症，伴有[28]第二次体温升高，另外还会引起白细胞数量减少，主要是淋巴细胞减少。[29]Moro等的研究表明，自然感染CDV的犬小脑的白质和灰质层之间有凋亡细胞出现，他们认为细胞凋亡对CDV引起的脱髓鞘的发病机制有着重要意义。此外，感染CDV后，少突胶质细胞的代谢紊乱首先出现在脱髓鞘过程中，由此导致了[34]早期的髓鞘病变。1.4病理变化犬瘟热病引起的病变一般分布全身各组织器官。症状主要为出血及肿大，具体表现为：腹下皮肤点状出血，肺脏器官有出血点、间质性肺炎及水肿，胃肠粘[30]膜出血，脾肿大、出血，气管环状出血，肾膜以及心外膜点状出血等。解剖出现神经症状的病犬可见典型症状如：脑脊液增多，脑膜充血，脑室扩张等脑炎[31][32]症状。另外，解剖病犬还可见到膀胱出血水肿以及粘膜下瘀血等症状。犬瘟热毒引起组织细胞中嗜酸性的胞浆及核内包涵体，是病理组织学上最典型且最[29]具诊断意义的症状。犬瘟热引起的另一个典型的病变特征为淋巴细胞数量减[33]少，而显微镜下观察淋巴结的病理变化，结果与脾脏大体一致。诊断动物有3 [34]无感染CDV一般根据是否检出巨细胞，一般具有特异性。1.5犬瘟热诊断犬瘟热得出诊断一般分为初步诊断和进一步确诊。诊断方法包括病原学，免疫学，分子生物学等。1.5.1病原学方法犬瘟热病毒的分离成功率很低是由于具有脂囊膜，对乙醚、氯仿等有机溶剂[19]以及光热均比较敏感，结构脆弱，对环境的抵抗力及其弱，一般一次很难成功分离出病毒，需要反复不断地试验。犬瘟热病毒对能够表达犬的淋巴细胞激活信号分子的细胞非常敏感，能够提高犬瘟热病毒分离的成功率，与其它细胞相比，病毒感染细胞1d后就能够被检测到，极大地缩短了分离时间（Seki等2001）。病毒鉴定可采用中和试验，耐酸，耐热等理化特性鉴定，电子显微镜下观察病毒粒子形态进行确认，还可以犬瘟热检测为阴性的动物进行攻毒观察是否引起犬瘟热症状。1.5.2免疫学方法（1）免疫荧光技术将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而[35]可对抗原进行细胞定位，具有很高的灵敏性与特异性。杨百亮等利用建立的间接免疫荧光法的检测样品，其结果与临床诊断的准确率不高，仅为77%，主要[36]由于该方法受样品的影响较大。袁书智等利用犬瘟热病毒荧光抗体技术对CDV在细胞中的位置进行了定位研究，结果表明，诊断动物是否感染CDV，可以检测感染动物外周血液白细胞中是否含有犬瘟热病毒抗原，该方法适用于感染犬与死犬，同时还可滴定犬瘟热病毒疫苗效价，而且还具有快速性，测定抗体效价与微量中和试验相比可节省3～4d时间。（2）血清中和试验动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验(NeutralizationTest)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。Appel[37]等利用微量血清中和实验对样品进行检测，发现此方法具有很高的敏感性和[55]特异性。乔贵林等利用建立的检测CDV抗体的中和试验成功的应用于免疫犬4 的血清抗体检测。血清中和试验尽管有许多优点，但因其耗时较长，很少应用于CDV的快速诊断。（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是enzymelinkedimmunosorbentassay的缩写。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。[38]金鑫等用建立的三抗体夹心法Dot-ELISA检测犬瘟热病毒抗原，结果准确率达到94.74%。检测犬和水貂早期是否感染犬瘟热病毒可使用[39][40]Blixenkrone-Moller等建立的抗犬瘟热病毒IgM的ELISA。简中友等，姜骞[41]等对传统的ELISA方法结合基因技术进行了改进，包被抗原使用的是重组N蛋白，检测结果与进口诊断试剂盒准确率分别达到92.4%、97.1%。ELISA提供了一种简单易行的对CD的早期诊断，免疫动物群抗体检测以及流行病学调查血清学诊断方法。1.5.3单克隆抗体（1）单抗技术的基本原理抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖；而骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。在培养基中进行选择性培养，经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。McAb具有：高度稳定性、高度特异性、不可知性、高抗体活性、专一性等(肖国平，2003)。（2）单克隆抗体技术的应用目前，McAb技术在免疫学范畴内已经属于常规技术，在其他生命学科，如细胞生物学、遗传学、微生物学、生物化学、肿瘤学等领域内的应用也愈来愈广泛，目前这种应用已不局限在科学研究的范围内，单克隆抗体所引起的诊断学领5 域内的革命，在临床治疗学上的意义和其他经济领域内所产生的作用，也将愈来愈显著。具体应用体现在以下方面(常国权，1990)：免疫组化化学技术中的应用、在肿瘤诊断及治疗中的应用、在细胞免疫研究中的应用、在疾病防治方面的应用。单克隆抗体的发展已使抗体制各技术进入了一个全新的时代，其相关的药物已广泛应用到生物医学中的许多领域，如血液性疾病、戒毒、自身免疫性疾病、感染性疾病、器官移植肿瘤、中毒性疾病、变态反应性疾病等方面的诊断和治疗。1.5.4胶体金技术免疫胶体金快速诊断技术可以追溯到Valkin于1985年报道的用以检测血清和尿液的HCG(绒毛膜促性腺激素)的免疫渗滤试验。1989年Chun等提出用胶体金代替酶作为标记物用于渗滤试验，并成功的制备了检测抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的试剂盒,而得到广泛的应用。免疫胶体金快速诊断技术因其快速简便已在人医的临床检验和其它领域取得广泛的应用(王福勇，1999)。如：传染病病原抗体的检测、蛋白质的检测和药物测定等。抗犬瘟热病毒P1蛋白单克隆抗体的制备及初步应用。(1)免疫胶体金快速诊断技术的基本原理以微孔滤膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后,经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合,再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果（冯娟等，2005）,目前常见的有两处形式：免疫渗滤试验或滴金免疫渗滤试验；另一种称为免疫层析试验。（2）胶体金快速诊断技术的研究与应用目前胶体金技术的应用主要包括3个方面：a.病原体抗原或抗体的检测目前主要集中在乙型肝炎表面抗原或抗体的检测，将行肝炎表面抗原或抗体，衣原体感染，溶血性练球菌感染以及艾滋病感染、梅毒抗体血清的检测。b.人体激素或疾病相关蛋白的检测胶体金技术较早的应用于妇女优生优育检测，主要是检测血中或尿中的人绒毛膜促性腺激素（HCG），也有检测促黄体生成激素（LH）以及促卵泡成熟激素（FSH）等。c.药物滥用检测目前用于检测毒品主要是RIA、ELISA、FPIA、TCL等方法。胶体金免疫层析法携带方便，不需要仪器设备，操作人员不需专业技能，但只是处于试验研究阶段。d.寄生虫相关抗原或抗体的检测6 弓形虫病是一种人兽共患病的寄生虫病，人群中有较高的感染率。孕妇感染后，除可引起流产、死胎外，还可通过胎盘垂直传播造成胎儿神经系统发育障碍、畸形，同时也是、肿瘤等免疫缺陷患者死亡的重要原因。由于其临床症状缺乏特异性，要检出确诊非常困难，黄菱等建立了DIGFA检测肿瘤患者血清弓形虫IgG抗体，与IHA法对比检测，其结果具有良好的一致性，此外，胶体金快速诊断技术也用在其他一些医学检测中，如大便隐血测试卡、血清铁质测试条、免疫球蛋白血清测试条、免疫球蛋白全血测试板、杀虫剂、军团杆菌属等。1.5.5分子生物学方法PCR是最主要也是最常用的分子生物学方法，可以检测犬瘟热病毒的特异性核酸片段，具有特异性强，灵敏度高的优点，广泛应用于犬瘟热病毒的检测。转录-聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）[42-43]相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，细胞中RNA病毒的含量。尤其在犬瘟热发病早期作出诊断有利于采取有效的防治措施，减少经济损失。李[44]金中等根据Barret报道的犬瘟热病毒Onderstepoort株F基因序列，第一次在国内建立了犬瘟热病毒的RT-PCR诊断方法，应用于CDV的临床诊断。Frisk等[45]研究结果表明，引物序列对RT-PCR的受的影灵敏性影响较大，但仍可作为诊[46]断犬瘟热的一种高特异性和灵敏性的分子生物学方法。Shin等对RT-PCR和Nest-PCR进行比较研究，结果表明普通的一步法RT-PCR的敏感性比Nest-PCR[47][48]的敏感性差。EliaG等，Saito等采用实时荧光定量PCR方法证明病毒在淋巴组织中含量高于全身其他各种组织中，尿液次之，因此可以检测尿液中是否含有犬瘟热病毒来对疑似病例进行诊断。1.6犬瘟热基因工程疫苗研究进展目前国内外在犬瘟热的免疫预防中，主要使用弱毒苗，但常常出现免疫失败现象。但使用基因工程疫苗可以克服这一现象，下文将主要阐述基因疫苗以及亚单位疫苗。1.6.1基因疫苗基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。基因疫苗具有免疫应答持久、不受母源抗体7 的干扰等优点，可以很好地避免免疫失败的发生，是研究者关注的热点。目前犬[49]瘟热基因疫苗的研究已取得了一定的进展。SixtN等将CDVF和H基因分别插入真核载体PVIJ构建表达载体，PVIJ-CDV-F与FPVIJ-CDV-H，转染鼠Ltk细胞，观察免疫BALB/c小鼠体液和细胞免疫水平，结果表明，两种基因疫苗[50]免疫后均小鼠呈现出I型介导的细胞毒性淋巴细胞应答。Cherpi1lodP等用CDV强毒株A75/17的F、H、N基因分别与真核表达载体PCI相连，构建了PCI-N、PCI-F、PCI-H三种质粒，将三种质粒混合均匀后后肌肉注射BALB/c小鼠，间隔2周一次，4次免疫后检测其抗体水平，小鼠血清中虽可检测出抗F、H的ELISA抗体，但滴度远不及抗N抗体。而且具较高的抗F、H抗体的小鼠，同样呈现较高的中和抗体水平，且经2-3次免疫后所有免疫小鼠的杀伤性T细胞（CTL）活性均出现大幅度提高。CDV-SnyderHill株F和H蛋白基因分别与pVR1012载体构建了真核表达质粒pPB261和pPB229，并将两种质粒混合均匀后用阳离子脂质体DMRIE-DOPE包裹制备了DNA疫苗，用其免疫犬瘟热检测为阴性且健康犬，结果表明DMRIE-DOPE包裹CDV的DNA疫苗可以诱导犬产生了很高滴度的抗体，说明DNA疫苗能够引起足够的保护性免疫反应（Fischer[51]etal，2003）。1.6.2基因工程亚单位疫苗人们主要利用犬瘟热病毒的衣壳蛋白成分和囊膜糖蛋白成分作为免疫原。Norrby等用纯化的CDV的H、F蛋白抗原接种健康犬，结果表明接种犬产生大量抗体，证明F蛋白可以作为合成疫苗或者亚单位疫苗用于犬瘟热病毒的预防[16][52]。江国托等在鼠体内表达犬瘟热病毒F蛋白，结果在鼠产生了较高滴度的中和抗体(1:32)。目前国内真正应用到实际生产应用中的亚单位疫苗还没有。一是技术还不够成熟，另外重组亚单位疫苗生产成本高居不下，只有不断改进技术降低成本，才可以在生产上推广应用。1.7CDV相关蛋白及基因研究进展F、H是组成犬瘟热病毒囊膜的两个重要糖蛋白，能够刺激宿主免疫系统产生中和抗体。N蛋白基因高度保守，而H蛋白基因变异频繁，是犬瘟热病毒不断变异产生新毒株的主要原因。H，N及F蛋白在犬瘟热感染宿主以及CDV的致病力方面发挥着重要作用，因而犬瘟热病毒H，N和F蛋白成为国内外学者研究热点。1.7.1核衣壳(N)蛋白及其基因8 核衣壳N蛋白基因含有1683个nt，分子量为58KDa，有一个ORF，于53-55位的AUG开始，编码523个氨基酸，，分为3个区，即可变区N末端(17-159aa)、可变区C末端(408-519aa)及高度保守的中间区(160-407aa)，N蛋白是核衣壳的重要组成成分，N蛋白基因是高度保守的，而N蛋白的中间保守区在结构和功能上起着重要作用，有研究显示接种病毒9h后，N蛋白即可表达，[53]并可检测到N蛋白。据Hamburger等(1991)报道，与N蛋白对CDV的致病性发挥着重要作用，抗犬瘟热病毒N蛋白的单抗Ll能与在Vero细胞上传代致弱的犬瘟热病毒毒株的N蛋白结合，但不能与2株强毒结合，然而，当这2个强毒株在Vero细胞上传[54]代数次后，Ll便能与其N蛋白结合。野毒株与疫苗株Onderstepoort的N蛋白及其基因的同源性分别为95.2%和93.2%，氨基酸序列差别最大的区域是N端和[55][56]C端。Yoshida等构建了疫苗株Onderstepoort株一系列N蛋白缺失基因来研究犬瘟热病毒N蛋白的抗原表位，结果表明犬瘟热病毒诱导产生抗体的抗原表位为N蛋白的337-358或l-80位氨基酸，用免疫荧光定位缺失基因表达的N蛋白在细胞中的位置，结果发现位于细胞核中的N蛋白都含有前1-80位氨基酸，说明前1-80位氨基酸是所进入细胞核所必需的。N蛋白是高度保守的蛋白，在细胞免疫方面发挥重要作用。1.7.2融合(F)蛋白及其基因F基因长为2205个nt，基因组内有4个起始密码子，翻译时利用的是位于461-463位的第4个AUG，从起始密码子到757位核苷酸为F2蛋白编码基因，编码99个aa，分子量为23KDa，从758至2071位核苷酸为Fl蛋白编码基因，编码438个氨基酸，分子量为40KDa。mRNA翻译的最初产物是FO蛋白，分子量是62KDa，在蛋白水解酶的作用下，裂解为Fl和F2蛋白，二者再通过二硫键连接成蛋白二聚体，Fl蛋白位于囊膜的外侧。起始于第4个AUG的CDVF蛋白与疏水区末端很近，只余下8个氨基酸残基的信号肽，位于推测的信号肽序列前端的Ala可能起裂解位点的作用，以便去掉信号肽。F蛋白是组成囊膜重要糖蛋白之一，能够刺激宿主细胞产生中和抗体，而且在病毒的侵入中也发挥重要作用，是CDV重要的免疫原。1.7.3附着或血凝(H)蛋白及基因H基因编码CDV的附着血凝蛋白，H基因含有1944-1946个nt，CDV与MV和RPV的H蛋白的同源性分别为53%和52%，而MV和RPV的同源性为64%，三者平均同源性为36%。H蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的很重要的抗原，在麻疹病毒属所有结构蛋白中H蛋白的变异率9 是最高的，抗CDVH蛋白7个抗原决定簇中的6个McAb能中和CDV，阻止CDV的感染，但均不能封闭MV的感染及其血凝活性，而能抑制MV血凝活性并且中和MV的抗MVH蛋白的单抗也不能中和CDV，故H蛋白很可能在新麻[57]疹病毒属成员分类中起决定作用。H基因是变异最为频繁的基因，而H基因的不断变异是CDV不断产生新的毒株，这是犬瘟热不断爆发且难于预防的重要原因。1.8研究目的及意义本研究从哈尔滨一养殖场的疑似犬瘟热病死貉子的脏器中分离到一株犬瘟热强毒，并对其进行鉴定，进行攻毒实验证实其为野毒株。同时从分子生物学角度进行序列及系统进化树分析，确定其来源及遗传变异，对犬瘟热的诊断及预防具有重要意义，可以为经济动物养殖提供理论基础及科学防治，同时可以增加CDV研究内容，为下一步疫苗的研制提供潜在的毒株。10 第2章貉源犬瘟热病毒的分离鉴定犬瘟热病毒(CDV)属于副黏病毒科麻疹病毒属，不分节段的负链RNA病6[5]毒，分子量为6×10Da，犬瘟热病毒的分离成功率很低是由于具有脂囊膜，对乙醚、氯仿等有机溶剂以及光热均比较敏感，结构脆弱，对环境的抵抗力及其弱[19]。用Vero细胞培养分离CDV时，一般需大量的反复的实验才可成功分离出，但闫如勋（2011）构建的SLAM的Vero细胞系可明显的提高犬瘟热病毒分离的成功率。近些年来，随着我国毛皮经济动物饲养业的快速，犬瘟热在全国各地有大流行之势。本实验采集哈尔滨一养殖场的疑似犬瘟热病死的貉子，分离犬瘟热病毒，为下一步疫苗的研制提供理论基础及潜在的毒株。2.1材料2.1.1病料采集5只临床症状明显的哈尔滨某养殖场疑似犬瘟热（CD）病死貉子的肝、o脾、肺、肠等脏器，胶体金试纸条初步鉴定病原CDV阳性后，放置于-70C冰箱冷冻保存，备用。2.1.2实验动物实验用6月龄犬瘟热检测为阴性的貉（狐狸）由中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地提供。2.1.3细胞Vero细胞由中国农业科学院特产研究所预防兽医实验室保存。2.1.4主要试剂和仪器胎牛血清（FBS，兰州民海生物技术有限公司)，DMEM培养基（GIBICO公司），RNA提取试剂Trizol（Invitrogen公司），RT-PCR反应试剂盒(TaKaRa公司)，胰蛋白酶(大连宝生物公司)。CO2培养箱（日本SANYO），微波炉（惠而浦公司），BCD-272AY容声冰箱：广东科龙电器股份有限公司，恒温水浴箱DK-80型（上海精宏实验设备有限公司），SW-OJ-2F洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司，BSC-1300ⅡA2型生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司，CF16RXⅡ型立式冷冻离心机：HITACHI，WaterPurificationSystems：MILLIPORE，BioPhotometer:eppendorf，DMI3000B生物显微镜：Leica；TE2000U荧光显微镜：Nikon。11 2.1.5常用溶液和试剂的配置及处理o（1）血清的处理：新购买的小牛血清于恒温水浴锅56C，30min灭活，-20oC保存备用（如胎牛血清则不需灭活）。o（2）无RNA酶灭菌水DEPC处理水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180C×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。（3）50×TAE电泳缓冲液：242gTri，37.2gNa2EDTA·2H2O，加800mL的去离子水，充分搅拌溶解后，加入57.1mL的冰醋酸，充分搅拌，最后去离子水定容至1L，使用时50倍稀释。(4)10mg/mL溴化乙锭（EB）的配置：用100mL的去离子水溶解1g溴化乙锭充分搅拌至完全溶解后，放棕色瓶室温避光保存，EB的工作浓度为0.5μg/ml。(5)磷酸盐缓冲液(PBSpH7.2)的配置：8gNaCl，0.2gKCl，3.634gNa2HPO4·12oH2O，0.2gKH2PO4，加去离子水至900mL，调pH值至7.2定容至1L，120C灭菌30min，保存备用。2.2方法2.2.1病毒分离(1)病料处理将采集的貉子脏器病料置于研钵中研磨至黏稠状后，加入无血清的MEM培o养液，以8000rpm/min离心30min取上清，0.22um滤膜过滤，37CCO2培养箱培养24h后将没有出现细菌的用作病毒分离。(2)病毒分离培养采用同步接毒的方式，向传代后的Vero细胞悬液中按1:20（体积比）接入经处理后的病料上清，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE）的出现情况。出现CPE则继续增殖传代，病毒增殖液保存于-20℃。设正常细胞为对照。2.2.2理化特性的鉴定2.2.2.1耐酸性试验取两瓶均为4mL的病毒液，用0.1mol/LHCL将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0，并在另一个小瓶内加入相同于酸量的培养基作为对照，置4℃冰箱中2h，再用5.6%NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右，对照组再加入相同于NaHCO3量的培养基，分别测定两瓶病毒液的TCID50。2.2.2.2耐热性试验12 将病毒液分成等量4mL的8小瓶，其中4小瓶置56℃水浴中1h，另4小瓶置4℃水浴中1h做对照，测定对照组与实验组病毒的TCID50。2.2.2.3氯仿敏感试验o取4mL病毒液，加入分析纯氯仿使其终浓度为5%，放置4C震荡混匀10min，5000rpm离心5min，然后吸取上层液体，滴定病毒TCID50。对照组4mL病毒液加入pH7.0的PBS溶液使其终浓度为5%，同样条件处理，然后滴定TCID50。2.2.2.4乙醚敏感试验取4mL病毒液分装于两个青霉素瓶中，每瓶4ml，在其中1瓶加入乙醚，使终浓度为20%，对照组加入相同量的pH7.2的PBS，两瓶均用橡皮塞塞紧，置4℃冰箱内作用24h，其间不段振荡，随后以2000rpm离心20min。已加乙醚的小瓶，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发干净，然后滴定两组病毒的TCID50。2.2.3RT-PCR鉴定2.2.3.1CDV鉴定引物设计与合成根据Genbank上发表的CDV3H基因(EU726268)序列在保守区设计一对检测引物，扩增片段预计为430bp：上游引物：P1:5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAWGGAT-3’，下游引物：P2:5’-ATGCTTGGTATTACCTCTACTAACTTG-3’。一对扩增测序引物，扩增长度为1879bp：上游引物：P1:5’-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3’，下游引物：P2:5’-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3’。送至大连宝生物有限公司合成。2.2.3.2病毒RNA制备采用Trizol试剂提取RNA。具体步骤如下：（1）在1.5ml的EP管中加入病毒原液500μL，再加入Trizol500μL，充分混匀，室温放置10min。（2）加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min。o（3）离心4C、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管。（4）加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。o（5）离心4C、13000r/min、15min，用移液枪小心吸去所有上清。o（6）1mL75%乙醇洗一遍，离心4C、8000r/min、10min，用移液枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。13 （7）加入适量DEPC处理水。o（8）立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于-70C，可保存一o年；若加入DEPC水后则只能在-20C保存1个月左右2.2.3.3反转录（RT）o20uL反转录体系中，随机引物1μL，RNA5μL，70C加热10min，冰浴2～3min；再加5×Reversetranscription4μL，dNTP（10mmol/L）2μL，Ribonucleaseinhibitor（20U）1μL，MLV反转录酶1μL，DEPCH2O6μL，充分混合后低速离oo心，经42C60min，70C15min，冰上冷却后进入PCR反应。2.2.3.4PCR反应25μLPCR反应体系如下：成分用量模板3μl10×PCRbuffer2.5μldNTP2μl引物P10.5μlP20.5μlrTaq酶(5U/μl)0.25μlddH2O16.25μloooo反应程序为：95C预变性5min：循环参数为：94C30s：52C30s,72C1min：o30个循环：72C延伸10min。2.2.3.5凝胶电泳PCR扩增产物在浓度为1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压为120V，30min后，凝胶成像系统内观察条带情况，并拍照。并将电泳后的目的片段按DNA凝胶纯化试剂盒操作说明进行凝胶回收。2.2.4免疫荧光试验取接种3代后产生病变的Vero细胞，用pH7.2的PBS冲洗3次，室温丙酮o固定10min，用pH7.2的PBS冲洗3次。加入兔抗CDV阳性血清，37Clh，用pH7.2的PBS冲洗3次，加山羊抗兔IgG荧光标记二抗（含终浓度0.01%的伊文o思兰染色液），37Clh，用pH7.2的PBS冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，晾干后用荧光显微镜观察有无特异性荧光。2.2.5动物回归试验用分离到的CDV-HLJ(11)株第三代细胞毒对健康且未经免疫的狐狸（貉）攻毒，选取6只犬瘟热检测阴性且未经免疫的狐狸（貉）分别编号，每组设3只14 作为对照组，设3只实验组，实验组与对照组隔离培养。用皮下注射方式对实验4.19组狐狸（貉）攻毒，攻毒剂量为4×10TCID50，对照组皮下注射同样剂量的生理盐水。每日下午2：00观察记录每只狐狸（貉）的体温与状态变化。2.3结果2.3.1病毒分离结果采用同步接毒的方法并传代，传至第3代时，接毒后第2天产生细胞病变（见图2.2），正常Vero细胞（见图2.1)。AB图2.1正常细胞和感染病料病变细胞Fig.2.1NormalcellandInfectedcellA:正常细胞B:病变细胞A;NormalcellB:Infectedcell2.3.2理化特性分离株CDV-HLJ（11）经酸、热、氯仿、乙醚处理后，其TCID50与对照组差值均大于2.0，说明病毒具有囊膜结构，对酸、热抵抗力弱，对氯仿，乙醚敏感。详细结果见表2.1。15 表2.1分离株CDV-HLJ(11)对酸、热、氯仿、乙醚的耐受性结果Table2.1ThetoleranceofCDV-HLJ(11)strainforacid,heatchloroformandether病毒滴度TCID50/ml处理项目实验组对照组2.004.19酸处理10101.504.19热处理10100.904.19氯仿处理10101.504.19乙醚处理10102.3.3RT-PCR检测应用CDV特异性检测引物，以分离株CDV-HLJ(11)的RNA为模版进行RT-PCR扩增，结果显示出现1条430bp的电泳条带，与预期结果相同（见图2.3）。证明分离株为CDV，并将其命名为CDV-HLJ(11)。图2.2CDVH基因特异性引物扩增结果Fig.2.2AmplificationofCDV-HLJ(11)HgeneM:DL2000Marker;1:阳性对照;2:目的基因2.3.4免疫荧光检测正常的Vero细胞无荧光出现，接种病毒液的细胞出现特异性亮绿荧光（如图2.3）。16 AB图2.3Vero细胞免疫荧光Fig.2.3lmmunofiuoreseeneeteelmiqueoftheVerocellA:正常细胞；B:病变细胞A:Normalcell;B:Infectedcell2.3.5动物回归实验2.3.5.1貉（狐狸）体温变化貉子攻毒后体温有不断上升趋势，其中在第6天达到最高值41℃，随后略有下降，但不明显，在死亡前的第12天有出现小幅上升。对照组体温比较平稳，变化不大，如图2.4所示。狐狸攻毒后体温有不断上升趋势，其中在第13～14天达到最高值41℃，随后略有下降。对照组体温比较平稳，变化不大，如图2.5所示。42414039攻毒组38对照组体温(℃)373635123456789101112攻毒时间(d)图2.4攻毒组貉子与对照组体温变化Figure2.4BodytemperaturechangeofraccoondogsinoculatedandcontrolgroupwithCDV17 42414039攻毒组38对照组体温(℃)3736353412345678910111213141516171819202122攻毒时间(d)图2.5攻毒组狐狸与对照组体温变化Figure2.5BodytemperaturechangeoffoxesinoculatedandcontrolgroupwithCDV2.3.5.2貉攻毒病理变化攻毒第3天攻毒组脚掌有发红现象；攻毒第7天攻毒组都有厌食现象，粪便试纸条检测阳性；1号貉第8天有呕吐便血现象，第10天有吐血现象，第11天死亡；第11天2号貉死亡；3号貉第12天死亡。正常组精神和食欲没有出现异常反应。攻毒组犬瘟热试纸条检测均呈阳性。攻毒组貉死后剖检发现肺脏有明显的坏死；肝脏表面有出血点；脾脏肿大，有少量的出血点；直肠充气且有出血点（图2.6）。对照组貉器官正常。ABCD图2.6攻毒后貉各器官病变Fig.2.6OrgansofraccoondogsinoculatedwithCDVA.肺脏；B.肝脏；C.脾脏；D.直肠A.lung;B.liver;C.spleen;D.rectum2.3.5.2狐狸攻毒病理变化第10天，1号狐狸的粪便试纸条检测CDV阳性；第12～13天，攻毒组都出现食欲下降，精神萎靡不振；第17天1号狐狸不吃食，2号和3号狐狸拉稀；第19天2号狐狸死亡，第22天3号狐狸死亡，对照组食欲和精神状态没有出现明显变化。攻毒组犬瘟热试纸条检测均呈阳性。攻毒组狐狸死后剖检发现肺脏局部有坏死灶；膀胱有大量出血点；肝脏质18 脆有出血点；脾脏肿大（图2.7）。对照组狐狸器官正常。ABCD图2.7攻毒后狐狸各器官病变Fig.2.7OrgansoffoxesinoculatedwithCDVA.肺脏;B.膀胱;C.肝脏;D.脾脏A.lung;B.bladder;C.liver;D.spleen2.4讨论本实验中的犬瘟热病毒分离株CDV-HLJ(11)分离于黑龙江哈尔滨，是毛皮动物养殖的重点地区，黑龙江地区毛皮动物养殖场最初在在2009年出现貉源犬瘟热病毒疫情，造成大量貉出现厌食，便血症状，部分养殖场出现貉子死亡现象，造成了一定的经济损失。病料送到中国农业科学院特产研究所科技成果转化平台进行剖检，剖检发现肠道出现水肿，有出血点，肠壁皱褶，肠系膜淋巴结肿大，CDV胶体金试纸条检测肠内容物为强阳性。对CDV的分离鉴定是诊断动物是否感染犬瘟热的最行之有效的一种方法。但犬瘟热病毒具有囊膜，对外界环境的抵抗力弱容易灭活，零摄氏度以上感染力迅速丧失，并在高于32℃和紫外线下迅速被灭活，所以CDV的分离成功率并不[20]高。因此，要想成功分离CDV需要做大量的工作，反复不断地尝试。并且取[58]样部位、时间、病料处理方式等都会影响到CDV的分离成功率。通常认为发病动物的脾脏、肺脏和肝脏等脏器中犬瘟热病毒含量较高，一般作为犬瘟热病毒[59]分离的理想病料。有报道在发病动物的肠内容物或粪便中也成功分离出CDV。本实验采用的病料是发病动物的脾脏、肺脏和肝脏等病毒含量较高的部位，可以提高病毒分离成功率。[60]犬瘟热病毒能适应多种细胞的培养，如Vero细胞、MDCK细胞，而CDV在Vero细胞上增殖，病变时间早，病变明显，而且滴度与MDCK和CEF细胞中要[5]高，因此Vero细胞常作为分离犬瘟热病毒的理想细胞，国内外许多犬瘟热病毒[28]的成功分离也多利用Vero细胞。本实验同样选用Vero细胞，采用同步接毒的方法，成功分离出一株犬瘟热病毒，并命名为CDV-HLJ(11)。19 同时，分离培养过程中要注意无菌环境，防止造成污染，切忌反复冻融，避免病毒失活。CDV是RNA病毒，在处理病料时要在无RNA酶的条件下进行，病料处理后要立即接种Vero细胞。分离到的毒株CDV-HLJ(11)对貉子及狐狸攻毒发现，攻毒貉子狐狸都表现出体温升高，厌食及精神萎靡，最后直至死亡。攻毒貉子从攻毒第3天攻毒组脚掌有发红现象；攻毒第7天攻毒组都有厌食现象，肛门拭子检测阳性；1号貉第8天有呕吐便血现象，第10天有吐血现象，第11天死亡；第11天2号貉死亡；3号貉第12天死亡。正常组精神和食欲均未出现异常。攻毒组的貉子剖检后发现肺脏有明显的坏死；肝脏表面有出血点；脾脏肿大，有少量的出血点；直肠充气且有出血点。对照组貉子器官正常。第10天，1号狐狸粪便检测CDV阳性；第12～13天，攻毒组都出现食欲下降，精神萎靡不振；第17天1号狐狸不吃食，2号和3号狐狸拉稀；第19天2号狐狸死亡，第22天3号狐狸死亡，对照组食欲和精神状态没有出现明显变化。攻毒组狐狸剖检后，肺脏局部有坏死灶；膀胱有大量出血点；肝脏质脆有出血点；脾脏肿大。对照组狐狸器官正常。[61]一般动物攻毒发病到死亡的时间约为15d。本实验的攻毒貉子在11～12天时就出现了死亡，较报道的时间提前；而攻毒狐狸在攻毒后19天才出现死亡，较报道的时间延长。推测可能由于分离毒株来源于貉子，对貉子的致病力明显强于狐狸，是否CDV对不同宿主的致病力不同与病毒来源差异有必然联系，还需进一步验证。[62]CDV分离株在细胞上连续传代毒价提高但是毒力减弱，而本次研究中动物实验利用分离毒CDV-HLJ(11)的第3代细胞培养物进行攻毒，狐狸貉子均出现了明显的犬瘟热症状，说明CDV-HLJ（11）的3代细胞培养物致病力很强，但是CDV-HLJ(11)高代次培养物是否还具有高致病力还有待进一步验证。20 第3章H、F基因的克隆及序列分析H、F基因控制表达CDV的两个重要的囊膜糖蛋白，而H、F蛋白是诱导宿主产生中和抗体的主要免疫蛋白。在病毒侵入机体和刺激机体产生免疫保护性反[11]应中发挥重要作用。H基因极易发生遗传变异，这也导致了CDV产生不同的变异毒株，导致经常出现免疫失败的现象。对H基因的序列分析常常作为判断不同毒株之间的同源性的重要依据。本实验对分离毒CDV-HLJ（11）的H、F基因进行克隆及序列分析，以确定其与已知毒株的亲缘关系。3.1材料3.1.1主要试剂ExTaqDNA聚合酶、AMVRTase、DNAMarker（DL2000），柱式DNA胶回收试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）和TRIzolReagent提取试剂盒、RNA酶抑制剂（ribonucleaseinhibitor）购自Promega公司（美国），氨苄青霉素，十二烷基硫酸钠(SDS)，酵母浸出粉，氢氧化钠，冰醋酸，氯仿，异丙醇，乙醇，氯化钠，蔗糖等均为国产分析纯。3.1.2试剂的配置3.1.2.1LB液体培养基o胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水定容至1L，121C高o压灭菌20min，4C保存。3.1.2.2LB固体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，去离子水定容至1L，o121C高压灭菌20min，取出在无菌环境下铺平板。3.1.2.350×TAE的贮存液Tris24.2g，冰醋酸5.71mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)10mL，去离子水定容至100mL，工作浓度为l×TAE。3.1.3仪器BCD-272AY容声冰箱：广东科龙电器股份有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；WD-9405B型水平摇床：北京市六一仪器厂；HZQ-F100振荡培养箱：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；SW-OJ-2F洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜：苏州安泰空21 气技术有限公司；f16RXⅡ型立式冷冻离心机：HITACHI；WaterPurificationSystems：MILLIPORE；BioPhotometer:eppendorf；ALS1296型DNA扩增仪：BIO-RAD；小型制冰机：北京长流科学仪器公司；DYY-8C型电泳仪：北京六一仪器厂；imageQuant3000凝胶成像系统：GE。3.1.4克隆载体和受体菌pMD-18TSimpleVector为大连TaKaRa公司产品，受体菌大肠杆菌JM109购置宝生物公司。3.1.5病毒毒株病毒毒株为本次实验分离到的CDV-HLJ(11)株第3代细胞培养物。3.2方法3.2.1引物设计3.2.1.1H基因引物设计根据Genbank上发表的CDV3H基因序列依据保守区设计一对测序引物，测序长度为1879bp：上游引物：P1:5’-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3’，下游引物：P2:5’-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3’。由北京英俊生物公司合成。3.2.1.2F基因引物设计根据Genbank上发表的CDV3F基因序列依据保守区设计一对测序引物，预计扩增长度为2016bp。上游引物：P1:5'-GGACRTAGCAAGCCAACAG-3'，下游引物：P2:5'-CTACCTGAGCCCTAAGTTTTC-3'。由北京英俊生物公司合成。3.2.2病毒基因组RNA的提取同实验一。3.2.3RT-PCR3.2.3.1反转录o20uL反转录体系中，随机引物1μL，RNA5μL，70C加热10min，冰浴2～3min；再加5×Reversetranscription4μL，dNTP（10mmol/L）2μL，Ribonucleaseinhibitor（20U）1μL，MLV反转录酶1μL，DEPCH2O6μL，充分混合后低速离22 oo心，经42C60min，70C15min，冰上冷却后进入PCR反应。3.2.3.2PCR反应25μLPCR反应体系如下：成分用量模板3ul10×PCRbuffer2.5uldNTP2ulP10.5ul引物P20.5ulrTaq酶(5U/μl)0.25ulddH2O16.25ul反应程序为：95℃预变性5min：循环参数为:94℃30s,54℃30s,72℃1min,30个循环：72℃延伸10min。3.2.4凝胶电泳用1×TAE缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，加入1μL的溴化乙锭染料，取20μL的PCR扩增产物与5μL的溴酚蓝混匀，小心加到凝胶孔中，用110V电压进行电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果并与DNA分子量标准进行比较。3.2.5PCR产物的回收纯化参照北京全式金生物科技有限公司的DNA胶回收试剂盒的说明进行操作。具体步骤：(1)称取回收胶的重量。(2)加入胶重量3倍的凝胶溶解液：75℃水浴6min至完全溶解。(3)将凝胶溶解液移至吸附柱中：14℃2000r/min离心30s，弃掉收集管中的废液。(4)加入700μL漂洗液14℃2000g离心30s。(5)加入700μL漂洗液4℃12000g离心30s重复一次。(6)在4℃12000g离心lmin弃液。(7)将离心柱置一个新的离心管上加入30μL溶解缓冲液在室温放置lmin，在4℃12000g离心lmin。3.2.6目的基因与T载体的连接参照pMD18-T载体使用说明书将纯化的RT-PCR产物与pMD18-T进行连接。23 连接反应体系列表如下：成分用量5μL2×bindingBufferr5ulpMD18-Tlul纯化的PCR产物4ulTotal10ulo混匀后置于16C水浴中，过夜连接。3.2.7转化（1）取100μL大肠杆菌感受态细胞JM109，融化后置于冰上，加入连接产物，轻轻混匀后，冰浴30min。（2）42℃水浴中热休克90s，然后快速转移至冰上冰浴2min。加入800μL预热至37℃的LB液体培养基，37℃220rpm震荡培养lh。（3）将培养物以3500rpm离心3min，在无菌条件下弃掉大部分上清，再将沉淀混匀，均匀涂布于含有氨苄青霉素（60μg/mL）的LB琼脂培养板上。倒置平皿，于37℃温箱中静置培养8～12h。（4）然后挑取白色菌落在3～5mL在含有氨苄抗生素的LB液体培养基中8h。3.2.8H、F基因序列测定及分析将PCR鉴定阳性质粒送至宝生物公司测序并与发表在GenBank上毒株的H、F基因序列进行比对分析，利用DNAStar软件进行同源性及系统进化树分析，同时利用NetNGlyel.0Server在线软件预测分离株CDV-HLJ(11)H蛋白糖基化位点。3.3结果3.3.1H基因RT-PCR应用测序引物以分离株CDV-HLJ(11)的RNA为模版进行RT-PCR扩增，结果出现1条1879bp的电泳条带（如图3.1），与预期结果相同。24 图3.1H基因产物扩增电泳Figure.3.1PCRofHgene1:阳性对照;2:阴性对照;3:空白对照;4:目的基因;M:DL2000Marker3.3.2F基因RT-PCR应用测序引物以分离株CDV-HLJ(11)RNA为模版进行RT-PCR扩增，结果出现1条2016bp的电泳条带（如图3.2），与预期结果相同。图3.2F基因产物扩增电泳Figure.3.2PCRofFgeneM:DL2000Marker;1:阴性对照;2:目的基因25 3.3.3H基因序列分析3.3.3.1H基因的序列H基因的序列如下见附录1。3.3.3.2H基因序列同源性分析H基因的测序结果显示，其ORF全长1824bp,编码608个氨基酸。利用DNAStar软件对分离株CDV-HLJ(11)与GenBank上发表的24株CDV毒株的核酸序列进行同源性分析显示，与HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高，分别为99.9%、99.7%、99.6%，与StrainCDV3、Convacvaccinestrain的同源性最低为91.4%(见表3.1)。26 表3.1分离株HLJ(11)与参考毒株H基因片段核苷酸同源性比较Table3.1ThecomparimentofhomologyofHgeneofdifferentrelativevirusesstrainsinnueleotide3.3.3.3H基因序列遗传进化树分析应用DNAStar软件的Clustal方法对分离株CDV-HLJ(11)的H基因序列进行比对构建遗传进化树显示，（如图3.3），分离株CDV-HLJ(11)属于Asia-Ⅰ型。27 图3.3分离株CDV-HLJ(11)H基因核苷酸序列遗传进化树Fig.3.3PhyogenetictreeofCDV-HLJ（11）Hgene3.3.3.4分离株CDV-HLJ(11)H蛋白糖基化位点预测利用NetNGlyel.0Server在线软件预测分离株CDV-HLJ(11)H蛋白糖基化位点(见表3.2)。分离株CDV-HLJ(11)H蛋白糖基化位点在19～21位，149～151位，309～311位，391～393位，422～424位，456～458位，587～589位，603～605位，共存在8个在潜在的N-Glyc的糖基化位点。28 表3.2分离株H蛋白糖基化位点预测Table3.2CDV-HLJ(11)strainpredictedtheexistenceofHproteinN-GlycsitesSequencePositionPotentialJuryN-Glycresult119NST0.6827(9/9)++2149NFT0.7012(9/9)++3309NGS0.6709(9/9)++4391NQT0.6687(9/9)++5422NIS0.6012(8/9)+6456NGT0.3916(6/9)-7587NST0.3869(8/9)-8603NRS0.4082(8/9)-3.3.3.5分离株与参考毒的H蛋白的氨基酸位点分析29 30 31 32 图3.4CDV-HLJ(11)株与其它毒株H蛋白氨基酸序列比较Figure3.4ThecomparisionofHgeneofdifferentCDVstrainsinaa33 3.3.3.6分离株与参考毒的H蛋白抗原表位分析应用DNAStar软件对分离株与参考毒的H蛋白的抗原表位分析，显示疫苗株VaccinestrainJapan与其它野毒株在250位、300位、370-380位、400、440-450间抗原表位存在差异（见图3.5）。HLJ11Heb(09)2JL(07)2JL(07)3LN(04)1LN(04)234 VaccinestrainJapan图3.5分离株CDV-HLJ(11)H蛋白抗原表位分析Figure3.5TheantigenicindexofHproteinofCDV-HLJ(11)3.3.4F基因序列分析3.3.4.1F基因的序列F基因的序列见附录2。3.3.4.2F基因序列同源性分析利用DNAStar软件对分离株CDV-HLJ(11)与GenBank上发表的CDV毒株的核酸序列进行同源性分析，显示分离株CDV-HLJ（11）的F基因序列与野毒株HeB(07)1、JL(07)1最高，分别为98.9%、99.4%，与疫苗株Onderstepoort、GZ1最低，分别为91.4%、91.1%（见表3.3）。35 表3.3分离株CDV-HLJ(11)与相关病毒F基因片段核苷酸同源性比较Table3.3ThecompareimentofhomologyofFgeneofdifferentrelativevirusesstrainsinnueleotide3.3.4.3F基因核苷酸序列遗传进化树分析应用DNAStar软件的Clustal方法对分离株CDV-HLJ(11)的F基因序列进行比对构建遗传进化树显示(如图3.6)，分离株CDV-HLJ(11)属于野毒株，与疫苗株Ondersteoort亲缘关系较远。图3.6分离株CDV-HLJ(11)F基因核苷酸序列遗传进化树Fig.3.6PhyogenetictreeofCDV-HLJ（11）Fgene36 3.3.4.4分离株与参考毒的F蛋白氨基酸位点分析37 38 39 图3.7CDV-HLJ(11)株与其它毒株F蛋白氨基酸序列比较Figure3.7ThecomparisionofFgeneofdifferentCDVstrainsinaminoacids40 3.3.4.5分离株与参考毒的F蛋白抗原表位分析利用应用DNAStar软件对分离株与参考毒的F蛋白的抗原表位分析,见图3.8。HLJ（11）CDV3GZ1GZ2Onderstepoort图3.8分离株CDV-HLJ(11)F蛋白抗原表位分析Figure3.8TheantigenicindexofFproteinofCDV-HLJ(11)3.4讨论本实验从哈尔滨的某养殖场采集疑似犬瘟热病死的貉子的肝，肺等内脏，分离出一株CDV，并命名为CDV-HLJ(11)，对分离株H、F基因进行克隆和序列测定,获得了犬瘟热病毒H、F基因全长序列，H基因序列分析结果表明分离株41 CDV-HLJ(11)株与HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高，分别为99.9%、99.7%、99.6%，与StrainCDV3、Convacvaccinestrain的同源性最低为91.4%。系统进化树显示，CDV的H基因具有遗传多样性，但总体分为野毒株与疫苗株两个大的分支。目前依据H基因序列的分型有：Asia-Ⅰ型、America-Ⅰ型、Europeanwildlife、Europe、Arctic-like、Asia-Ⅱ、PDV、America-Ⅱ共7个基因[63][14]型。本实验的分离毒CDV-HLJ(11)在基因型上属于Asia-Ⅰ型。MASUDAM等认为CDV基因型与地理位置有关。而本实验结果则不是这样，分离毒CDV-HLJ(11)与HeB(071)、SD（071）亲缘关系较近，而与吉林，辽宁等地理位置较近的有关参考毒株的亲缘关系则较远。说明基因型与地理位置并无绝对关系。同时据此推测引起2011年下半年哈尔滨地区犬瘟热疫情的病毒可能来自河北及山东地区，但是其确切性还需进一步验证。F基因序列分析结果表明分离株CDV-HLJ(11)株野毒株HeB(07)1、JL(07)1最高，分别为98.9%、99.4%。系统进化树显示，分离株CDV-HLJ(11)位于野毒株分支上。通过H、F基因的比对结果发现，H、F基因的变异不同，CDV-HLJ(11)的H基因与河北，山东地区流行株的亲缘关系较近，而F基因与吉林地区的流行株的亲缘关系较近。基因型的不同是否会造成毒株的致病力的差异以及差异究竟有多大还需进一步研究。犬瘟热病毒的H蛋白存在多个N-Glyc的糖基化位点，一般疫苗株为3～4[64]个，野毒株为8～9个，其中309～411位的糖基化位点是野毒株必须的。H蛋白的糖基化位点对CDV的致病力有着重要的影响，去除糖基化位点后CDV就[15]会丧失毒力。CDV-HLJ(11)的H蛋白预测含有8个潜在的糖基化位点，其中含有309～411位的糖基化位点，与报道结果一致。对H蛋白糖基化位点的研究有助于深入了解CDV的致病机理，在去除野毒株的糖基化位点后，病毒的致病力会减弱，为研制疫苗提供了一种新的途径。自从2011年下半年以来，哈尔滨的数家养殖场都出现大量貉子感染犬瘟热的现象。发病动物使用的大多为Onderstepoort弱毒疫苗，部分使用的为Convac弱毒疫苗。通过实验发现分离毒与Onderstepoort，Convac的亲缘关系均较远，是否病毒发生变异，导致免疫失败还需进一步研究。一般认为在弱毒疫苗的免疫压力下，[64]CDV的基因变异会向着远离CDV疫苗株的方向发展，最终出现新的基因型。国外研究表明阿根廷已出现了与疫苗株变异较大的毒株，已免疫动物出现发病现[65]象也证实了这一点。犬瘟热病毒自发现以后，一直在不断进化，主要表现在新的抗原类型出现，进化、变异速度惊人，而基因的不断变异常常导致免疫失败的现象，引起许多学42 者的普遍关注。我国毛皮动物养殖量自90年初起逐年递增，随着养殖数量增加，相关疫病越发复杂，犬瘟热发病率也一直居高不下，严重影响我国毛皮动物养殖业快速发展。因此，针对目前我国犬瘟热不断流行的趋势，应对CDV进行分子生物学与流行病学调查研究，了解区域内发病及流行情况，抗原变异情况，加强对养殖场的监测，实时了解最新的情况，对犬瘟热预防和控制有着重要的意义。43 结论1．从哈尔滨貉养殖厂发病貉病料中利用Vero细胞成功分离出一株病毒，经鉴定为犬瘟热病毒。攻毒实验证明分离毒对狐狸，貉子有明显的致病性。2．分离毒株H基因与HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高，分别为99.9%、99.7%、99.6%，与StrainCDV3、Convacvaccinestrain的同源性最低为91.4%。F基因与野毒株HeB(07)1、JL(07)1最高，分别为98.9%、99.4%，与疫苗株Onderstepoort、GZ1最低，分别为91.4%、91.1%。，3．H基因进化树结果表明分离株CDV-HLJ(11)属于Asia-Ⅰ型。F基因进化树分析表明分离株与犬瘟热病毒强毒株位于同一分支。4．抗原表位预测分析分离毒CDV-HLJ(11)与Heb(07)、SD(07)的抗原表位一致，而与疫苗株的抗原表位差异较明显。44 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附录2F基因的序列ATGCACAACAAAATCCCCAAAAAATCCAAACCCCTGCCACACACCCGACAAGATCCCCTCCAACAACACAGCACCAGATCCACCGAGACCAAGACCTCCCAAGGACGATATAGCATAACATCGGCTCAGCGATCCACGTACCATAGTCCTCGAACATCGGACAGGCCCGTCCACTACATAATGAACAGGACCAGGTCTTGCAAGCAAACTAGCCACAGATCGGATAACATCCCGCCTCACAGAGACCACGAGGGTATCATCCATCACACACCAGAGAGTGTCACCCAAGGAGCGAGTTCCTGGTTCAAGAGGTGGCAATCCAATGCAACCAATGCAGGCTCTCAATGCACCTGGTTAGTCCTGTGGTGCATCGGAATAGCCAGTCTCTTTCTTTGTTCCAAGGCTCAGATACATTGGAATAATTTGTCAACGATTGGGATTATCGGAACTGACAGTGTCCATTATAAGATCATGACTAGGCCCAGTCACCAGTACTTGGTCATAAAACTAATGCCTAATGTTTCACTTATAGATAATTGTACCAAAGCAGAATTAGGTGAGTATGAGAAATTATTAAATTCAGTCCTAGAGCCAATCAACCAAGCTTTGACTCTAATGACCAATAATGTGAAGCCCCTACAGTCAGTAGGGTCAGGTAGGAGACAAAGGCGTTTTGCAGGAGTGGTGCTTGCAGGTGCAGCTTTAGGGGTGGCCACAGCCGCACAAATCACTGCAGGGATAGCTTTACATCAGTCCAACCTCAATGCTCAAGCAATCCAATCTCTGAGAACTAGCCTTGAACAGTCCAACAAGGCTATAGAAGAAATTAGGGAGGCAACCCAGGAAACCGTCATTGCTGTTCAGGGAGTCCAGGATTACGTCAATAATGAACTCGTCCCTGCTATGCAACATATGTCGTGTGAGTTAGTTGGGCAGAGATTAGGGTTAAAACTGCTTAGGTATTACACCGAGTTGTTGTCAATATTTGGCCCGAGTTTACGTGACCCTATTTCAGCCGAGATATCAATTCAAGCACTGAGTTATGCTCTTGGGGGAGAAATTCATAAGATACTTGAGAAGTTGGGGTATTCTGGTAATGATATGATTGCAATTTTGGAGAGTCGGGGGATAAAAACAAAAATAACTCATGTCGATCTCCCCGGGAAACTCATCATATTAAGTATCTCATACCCAACTTTATCAGAAGTCAAGGGGGTTATAGTCCACAGACTGGAAGCCGTTTCTTATAACATAGGGTCACAGGAGTGGTACACCACTGTCCCGAAGTATGTTGCAACTAATGGTTACTTAATATCTAACTTTGATGAGTCATCCTGTGTATTCGTCTCAGAATCAGCCATTTGTAGCCAGAACTCTCTGTACCCCATGAGCCCGATTCTACAACAATGCATTAGGGGCGATACTTCATCTTGTGCTCGGACCTTGGTGTCTGGGACTATGGGCAACAAGTTTATTCTGTCAAAAGGTAATATCGTTGCAAATTGTGCTTCTATACTATGTAAGTGTTATAGCACAAGCACAATTATCAATCAGAGTCCTGATAAGTTGCTGACATTTATTGCCTCCGATACCTGCCCACTGGTTGAAATAGATGGTGTAACTATCCAAGTTGGAGGGAGGCAATACCCTGATATGGTATACGAAAGCAAAGTTGCCTTAGGACCTGCTATAT51 CACTTGAGAGGTTGGATGTAGGTACAAATTTAGGGAACGCCCTTAAGAAACTGAATGATGCTAAAGTACTGATAGACTCCTCTAACCAGATCCTTGAGACAGTTAAGCGCTCTTCCTTTAATTTTGGCAGTCTCCTCAGCGTTCCCATATTAATCTGTACAGCTCTGGCTTTGTTGTTGCTAATTTACTGCTGTAAAAGACGCTACCGACAGACATTCAAGCATAATACTAAGGTCGATCCGACATTTAAACCTGTTTTGACTGGAACTTCGAAATCATATGTAAGATCACTCTGA52 攻读硕士学位期间发表论文郭抗抗,闫喜军,柴秀丽,张蕾,等.貉源犬瘟热病毒的分离鉴定及其H基因的序列分析[J].黑龙江畜牧兽医学报.（已录用，中文核心期刊）53 致谢本论文是在导师闫喜军研究员的精心指导下和关怀下完成的。无论是在选题、实验方案的设计和实施、还是在论文的撰写等方面，都渗透着导师的心血，在此向他表示最诚挚的感谢。特别感谢本课题组赵建军老师在实验的具体操作和实验思路方面给予的启发，以及张海玲老师、白雪老师、张蕾老师等在实验过程中给予的精心指导，在生活上给予的关怀照顾。各位老师在学术上实事求是的作风和一丝不苟的敬业精神给我留下深刻的印象，使我终身受益。感谢中国农业科学院特产研究所科研处的各位老师和同学在学习和实验中给予的帮助。感谢江苏科技大学生物与环境工程学院以及中国农业科学院蚕研所的各位领导与老师在学习与生活中给予的帮助。感谢研究生部的各位老师给予的关怀与帮助。在即将踏入社会之际，我要感谢同为10级研究生们，同学的深厚情谊我会终生怀念。54