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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文新型壳聚糖对Ｏ型口蹄疫病毒样颗粒免疫效果影响Ｅｆｆｅｃ－ＴｈｅＩｍｍｕｎｅｔｏｆｔｈｅＮｏｖｅｌＣｈｉｔｏｓａｎｏｎＶｉｒｕｓＬｉｋｅ－－ＰａｒｔｉｃｌｅｓｏｆＯＳｅｒｏｔｙｐｅＦｏｏｔａｎｄＭｏｕｔｈＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ硕士研究生：朱向涛指导教师：马军武研究员．申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：兰州兽医研究所研究生院２０１７年５月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文新型壳聚糖对O型口蹄疫病毒样颗粒免疫效果影响TheImmuneEffectoftheNovelChitosanonVirus-LikeParticlesofOSerotypeFoot-and-MouthDiseaseVirus硕士研究生：朱向涛指导教师：马军武研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：兰州兽医研究所研究生院2017年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheImmuneEffectoftheNovelChitosanonVirus-LikeParticlesofOSerotypeFoot-and-MouthDiseaseVirusM.S.Candidate：ZhuXiang-TaoSupervisor：ProfessorMaJun-WuMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccinesandMolecularImmunologyChineseAcademyofAgriculturalSciencesMay2017 摘要口蹄疫是由口蹄疫病毒（Footandmouthdiseasevirus，FMDV）引起的一种急性、热性、高致病性的传染病，主要侵害偶蹄动物，如猪、牛、羊、骆驼等，其中牛最为易感。口蹄疫主要经呼吸道传播，以口腔黏膜、蹄部、鼻部和乳房皮肤出现水泡和溃烂为主要病理特征，给畜牧业生产以及全球贸易造成了巨大的经济损失。因此，有效防控口蹄疫并最终净化，是当前的研究方向之一。为了研究壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对VLPs的免疫增强作用，通过大肠杆菌表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs，利用壳聚糖季铵盐凝胶微球（ChitosanA）和加入白油后制成的混合乳液（ChitosanB）两种佐剂乳化疫苗免疫豚鼠，通过T淋巴细胞增殖试验、FMDV特异性抗体水平检测和攻毒后保护率验证壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的免疫效果；再次通过猪试验，检测FMDV特异性抗体水平、中和抗体水平、相关细胞因子水平以及攻毒后保护率情况，探究壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为佐剂是否能增强VLPs的免疫应答。这些试验初步证明，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球与ISA201常规佐剂一样，同O型口蹄疫VLPs配伍后诱导产生高水平的FMDV特异性抗体，但T淋巴细胞增殖效果要强于ISA201佐剂，且ChitosanB佐剂组增殖效果强于ChitosanA佐剂组，显示出壳聚糖季铵盐凝乳胶微球可增强体液免疫和细胞免疫应答；壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为O型口蹄疫VLPs疫苗佐剂可同时诱导Th1型和Th2型细胞免疫应答，发挥了更强、更广泛的细胞免疫应答；ChitosanB佐剂细胞免疫与体液免疫的增强作用要优于ChitosanA佐剂。本试验拓宽了FMDV疫苗佐剂的筛选范围，为其作为VLPs的免疫增强剂提供了新的思路与理论依据，因此壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂。关键词：FMDV，VLPs，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球，佐剂I AbstractFootandmouthdisease（FMD），causedbyafoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)，isanacute，febrile，highlypathogenicinfectiousdisease，whichmainlyaffectsclovenhoofedanimalssuchaspigs，cattle，sheep，camels，etc，cattleofwhomarethemostsusceptible.FMDismainlytransmittedthroughtherespiratorytract，andismainlycharacteredbythevesicularlesionandfesterontheoralmucosa，hoof，noseandskinofthebreast，causingenormouseconomiclossforlivestockproductionandglobaltrade.Therefore，theeffectivepreventionandcontroloffootandmouthdiseaseandthefinalclearance，isoneofthecurrentresearchdirections.Inordertostudytheimmuneeffectofthequaternizedchitosan-gelmicrospheresontheVLPs，theVLPsofOtypeFMDVwasexpressedbyEscherichiacoliandwaspurifiedandassembledinvitro.GuineapigswereimmunedbyVLPsemulsifiedbythequaternizedchitosanmicrospheres（ChitosanA）andwhiteoilmixedemulsion（ChitosanB）.UsingTlymphocyteproliferation，FMDVspecificantibodyleveldetectionandprotectionrateafterinfectionconfirmedtheimmuneeffectofthequaternizedchitosan-gelmicrospheresonFMDVLPs.Againthroughthepiganimalmodel，FMDVspecificantibodylevel，neutralizingantibody，cytokinesandprotectionrateafterinfection，verifywhetherthequaternizedchitosan-gelmicrospheresasadjuvantscouldenhancetheimmuneresponseofFMDVLPs.TheseexperimentsprovedthattheVLPsofOtypeFMDVemulsifiedbyboththequaternizedchitosan-gelmicrospheresandroutineadjuvantISA201inducedhighlevelFMDVspecificantibody.IntheproliferationofTlymphocytestheformerwasbetterthanthelatter，andtheChitosanBadjuvantgroupwasbetterthanChitosanAadjuvantgroup，showingthequaternizedchitosan-gelmicrospherescanenhancebothhumoralandcellularimmuneresponses.Thequaternizedchitosan-gelmicrospheresasVLPsvaccineadjuvantscaninduceTh1andTh2immuneresponses，playingastronger，moreextensivecellularimmuneresponses.TheenhancementeffectoftheChitosanBadjuvantissuperiortoChitosanAadjuvantinbothcellularimmunityandhumoralimmunity.ThisstudybroadenstheselectionrangeofFMDVvaccineadjuvantandprovidesanewideaandtheoreticalbasisforthequaternizedchitosan-gelmicrospheresasanimmunoenhancerofVLPs，thereforethequaternizedchitosan-gelmicrospheresisapotentialvaccineadjuvant.Keywords:FMDV，VLPs，QuaternizedChitosan-gelMicrospheres，AdjuvantII 目录摘要....................................................................................................................................IAbstract.................................................................................................................................II目录.................................................................................................................................III第一章引言.....................................................................................................................11.1口蹄疫病毒概述..........................................................................................................11.2病毒样颗粒概述..........................................................................................................11.2.1病毒样颗粒作为疫苗的优势...............................................................................11.2.2病毒样颗粒诱导免疫应答的分子机制...............................................................21.2.3VLPs在动物防疫中的应用.................................................................................31.2.4病毒样颗粒疫苗存在的问题..............................................................................41.3壳聚糖的应用..............................................................................................................5第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装.........................................................72.1试验材料......................................................................................................................72.1.1菌种、表达载体及抗体.......................................................................................72.1.2生物学试剂及主要试剂的配制...........................................................................72.1.3主要试验仪器与设备...........................................................................................82.2试验方法......................................................................................................................92.2.1O型FMDV衣壳蛋白VP0、VP3、VP1的原核表达......................................92.2.2目的蛋白的纯化...................................................................................................92.2.3免疫印迹试验（WesternBlotting）检测............................................................92.2.4VLPs的体外组装...............................................................................................102.2.5动态光散射试验（DynamicLightScattering，DLS）....................................102.2.6Bradford法测定O型口蹄疫VLPs蛋白含量..................................................112.3试验结果....................................................................................................................112.3.1目的蛋白的表达与纯化.....................................................................................11III 2.3.2O型口蹄疫VLPs体外组装及鉴定..................................................................122.3.3O型口蹄疫VLPs蛋白含量测定......................................................................132.4讨论............................................................................................................................13第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响...................153.1试验材料....................................................................................................................153.1.1蛋白和佐剂.........................................................................................................153.1.2病毒、细胞与试验动物.....................................................................................163.1.3试剂及耗材.........................................................................................................163.1.4主要仪器与设备.................................................................................................163.2试验方法....................................................................................................................173.2.1疫苗的制备.........................................................................................................173.2.2试验动物免疫及分组.........................................................................................173.2.3双抗夹心ELISA法检测豚鼠血清抗体水平....................................................173.2.4MTS法检测豚鼠T淋巴细胞增殖...................................................................183.2.5O型FMDV乳鼠毒复壮....................................................................................183.2.6O型FMDV豚鼠毒GPID50（50%Guineapiginfectiousdose）测定..........193.2.7豚鼠攻毒试验及临床症状观察.........................................................................193.3试验结果...................................................................................................................193.3.1FMDV特异性抗体水平变化.............................................................................193.3.2T淋巴细胞增殖试验..........................................................................................203.3.3O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒价...........................................................213.3.4豚鼠攻毒后临床症状观察.................................................................................213.3.5豚鼠攻毒保护试验.............................................................................................223.4讨论...........................................................................................................................22第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响.......................244.1试验材料....................................................................................................................24IV 4.1.1疫苗、病毒与细胞.............................................................................................244.1.2试验动物的筛选.................................................................................................244.1.3主要生物学试剂及耗材.....................................................................................244.1.4主要仪器与设备.................................................................................................254.2试验方法....................................................................................................................254.2.1试验动物的筛选与免疫.....................................................................................254.2.2FMDV特异性抗体检测.....................................................................................254.2.3FMDV中和抗体检测.........................................................................................274.2.4猪免疫后相关细胞因子测定.............................................................................284.2.5猪攻毒试验及保护率检测.................................................................................294.3试验结果....................................................................................................................304.3.1FMDV特异性抗体水平.....................................................................................304.3.2FMDV中和抗体水平.........................................................................................304.3.3细胞因子的检测.................................................................................................314.3.4猪攻毒后保护率.................................................................................................334.4结论............................................................................................................................33第五章全文结论...............................................................................................................35参考文献.............................................................................................................................36致谢.................................................................................................................................42作者简介.............................................................................................................................43V 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AMPAmpicillin氨苄青霉素BHK-21Babyhamsterkidney幼仓鼠肾细胞ConAConcanavalinA刀豆蛋白ACPECytopathiceffect细胞病变效应DLSDynamiclightscattering动态光散射试验DMSODimethylSulphoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇E.coliEscherichiacoli大肠埃希菌ELISAEnzyme-linkedimmunoadsordentassay酶联免疫吸附试验FBSFetalbovineserum胎牛血清FDAFoodandDrugAdministration美国食品药品管理局FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素FMDFootandmouthdisease口蹄疫HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验ILInterleukin白细胞介素IPTGIsopropylthio-β-galactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷MOIMultiplicityofInfection感染复数OIEOfficeInternationalDesEpizooties世界动物卫生组织OPDO-Phenylenediamine邻苯二胺PBMCPeripheralbloodmononuclearcell外周血单核细胞PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphatebufferedsalinewithTwen-20含吐温-20的磷酸盐缓冲液rpm/minRevolutionsperminute转数/分Odiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨SDS-PAGEelectrophoresis凝胶电泳TCID50TissueCultureInfectiveDose50半数组织培养感染量TMBTetramethylbenzidine四甲基联苯胺VLPVirus-LikeParticle病毒样颗粒VNTVirusneutralizationtest病毒中和试验WBWesternblotting蛋白质印迹法VI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1口蹄疫病毒概述口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV）属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，主要引起偶蹄动物的口腔黏膜、蹄部、鼻部和乳房等处皮肤出现水泡和溃烂。口蹄疫是一种急性、烈性、高度接触性传染病，猪、牛、羊、骆驼等都可感染，其中以牛最为易感，因此对畜牧业和国际贸易造成了巨大的经济损失。FMDV按血清型可以分为七种：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型，各血清型由多种亚型组成，且每个血清型之间无交叉免疫保护。其中O型在全球流行最为广泛。目前我国主要流行O型，但周边国家流行的A型、C型和Asia1型对我国造成严重威胁(GrubmanandBaxt.2004)，口蹄疫的防控形式不容乐观。为此，制定合理有效的防控政策以及研究新型疫苗是应对口蹄疫的重要手段。口蹄疫病毒粒子直径约为30nm，呈二十面体对称的球形，表面光滑，无囊膜。衣壳蛋白内，，，的基因组为单股正链RNA，长度约8500nt，包括5非编码区（5untranslatedregion，5UTR）、，，编码区（openreadingframe，ORF）、3非编码区（3UTR）和多聚腺苷酸（PolyA）尾部(EstebanDomingo.2003)。编码区基因可以分为P1区、P2区和P3区。其中，P1区分别编码VP4、VP2、VP3和VP1四种结构蛋白，VP4蛋白位于病毒衣壳的内部，其余三个结构蛋白位于衣壳蛋白的外部，且VP1结构蛋白是FMDV主要的抗原蛋白。P2区编码2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D七种非结构蛋白。其中3C是一种蛋白水解酶，促进病毒蛋白的水解。3D是一种依赖RNA的RNA聚合酶，在病毒基因组复制和转录中发挥作用(EstebanDomingoa.2002;Hanetal.,2015)。FMDV病毒耐低温，可在-50℃~70℃中保存数年；但是对酸碱敏感，pH＜6.5时，FMDV的衣壳蛋白就会解聚。1.2病毒样颗粒概述1.2.1病毒样颗粒作为疫苗的优势在控制病原体、预防人类和动物疾病方面，接种疫苗是一种最为经济有效的手段。目前，大多数批准上市的疫苗，都是通过传统的技术方法制得的弱毒疫苗和灭活疫苗。然而，新型的亚单位疫苗已经开始应用于预防动物疾病中。其中，病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs)因其固有的免疫原性和高度的安全性被认为是最有发展潜力的疫苗（NoadandRoy.，2003；Bachmannand，Jennings.，2010；DAoustetal.，2010；DouglasandYoung.，2006）。VLPs疫苗结合了全病毒疫苗和重组亚单位疫苗的许多优点，整合了两者的关键表位的免疫原性、安全性和保护性点位：（1）具有很好定义的几何形状和明显的均匀性，具有重复和有序的表面结构；（2）颗粒性和多价性；（3）保存了天然病毒的抗原构象；（4）安全，因为它们是绝对的非感染性和非复制性的候选蛋白；（5）在极端环境条件下，比水溶性抗原具有较高的稳定性；（6）可以作为外源抗原的表达载1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言体；（7）利于区分动物是自然感染还是疫苗接种。病毒样颗粒是具有简单几何特征的超分子组合体，通常呈二十面体或棒状结构，直径在25nm~100nm之间，与病毒颗粒本身的整体结构相似（(JohnsonandChiu.，2000)。这些蛋白质笼是由自然状态下多种结构病毒亚基内的力共同作用的结果。常见的VLPs主要是蛋白衣壳和包膜，利用重组表达系统能自发地自我组装成病毒样颗粒(GarceaandGissmann.，2004)。它们通常有一个或多个病毒蛋白抗原组成，其抗原性与感染性病毒或亚病毒颗粒相似(JenningsandBachmann.，2008)。就安全性而言，没有任何病毒核酸的病毒样颗粒，事实上完全失去了病毒的复制、插入、逆转、重组或再次装配能力，是没有任何风险的。VLPs疫苗无需使用具有传播能力的致病活病毒、且可以利用不同的表达系统制备（Roldaoetal.，2010；Vicenteetal.，2011b）。因此，与全病毒疫苗生产和管理相关的安全问题，如生产设备中散毒、出现逆转性突变体病毒、影响免疫力低下群体等都无需考虑（JenningsandBachmann.，2008）。1.2.2病毒样颗粒诱导免疫应答的分子机制VLPs表面的多价抗原位点和高度有序的结构可构成病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpattern，PAMPs）。这些结构模型大体上都是病原微生物独特的表面抗原，哺乳动物的免疫系统能够对这些排列的抗原作出应答。PAMPs能直接诱导先天性免疫传感机制(PlummerandManchester.，2011)，可被宿主细胞中的Toll样受体（TLRs）和其他模式识别受体（PRRs）识别。此外，由于具有高度重复性的表面构型，VLPs能够与B细胞受体交联膜免疫球蛋白分子（BCR）结合，引起B细胞产生强烈的应答反应（BachmannandZinkernagel.，1997）。在某些情况下，VLPs对B细胞的刺激，足可以引起产生T细胞依赖性的IgM抗体，因此VLPs可以作为不依赖于T细胞的B细胞抗原（Bachmannetal.，1993；Chackerianetal.，1999；Fehretal.，1998；kouskoffetal.，2000）。此外，PAMPs还可以被抗原递呈细胞（APCs）识别并摄取，随后递呈给适应性免疫应答细胞。VLPs由于特殊的颗粒和尺寸超出了PAMPs识别模式时，APCs可以有效地摄取整个VLPs而不是蛋白亚基，如树突状细胞（DCs）。能够被APCs摄取抗原取决于其不同的性质，如大小、形状、表面电荷等，其中抗原大小是最关键的因素。APCs能够摄取尺寸在20nm~3µm的病原体抗原（BachmannandJennings.，2010；ScheerlinckandGreenwood.，2006）。现已证明，DCs摄取抗原的最佳直径约为40nm（Fifisetal.，2004；Xiangetal.，2006），处在VLPs的粒径范围内。所有的VLPs都能够被DCs摄取与加工，与MHCII和MHCI类分子结合后进入交叉呈递通路，因此把VLPs作为“自我辅助”的抗原递呈系统（GrgacicandAnderson.，2006；Liuetal.，2000；LudwigandWagner.，2007；Yanetal.，2004）。然而，这一说法可能会被一些事实所反驳：一些VLPs候选疫苗需要佐剂来诱导有效的免疫应答，如HBV（hepatitisBvirus）组装成的VLPs等（Beesleyetal.，1990)。这表明，可以诱导不同免疫应答类型这一特性，是VLPs特有的，并受到多种因素的影响（Gedvilaiteetal.，2006；Goldmannetal.，1999）。总之，病毒样颗粒（VLPs）已被证明能诱导产生B细胞介导的免疫应答反应，并能有效地诱导CD4+T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答反应（Murataetal.，2003；Paliardetal.，2000；Schirmbecketal.，1996；Tissotetal.，2010），是任何疫苗的根本目标。免疫系统有多种机制来有力地应对病毒粒子（GrgacicandAnderson.，2006；SpohnandBachmann.，2008），2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言这可能是VLPs作为疫苗开发的基础。实际上，相对于单抗原疫苗，这意味着低剂量抗原足以引起类似的保护性反应。1.2.3VLPs在动物防疫中的应用在动物医学领域，尽管一些候选疫苗正在研究之中，如副黏病毒科新城疫病毒（NDV）的NP、M、F、HN蛋白组装成的VLPs处于动物试验阶段（McGinnesetal.，2010；Morrison.，2010），但是猪圆环病毒2型（PCV2）VLPs疫苗PorcilisPCV®（英特威国际公司，荷兰）已被批准并商业化（MenaandKamen.，2011）。PCV2属于环状病毒科，可导致断奶后仔猪多系统衰竭综合征，病理特征为体重减轻、消瘦，呼吸困难和腹泻，引起巨大的经济损失（SegalesandDomingo.，2002）。PorcilisPCV®是由PCV2的ORF2阅读框表达的衣壳蛋白组装成的VLPs，利用杆状病毒表达系统生产，佐剂是α-生育酚与液体石蜡的混合体。该疫苗具有安全和强免疫原性的特点，能有效预防PCV2感染。它能够诱导体液免疫和细胞免疫应答，一次肌肉注射后就能预防猪圆环病毒的田间毒株（Martellietal.，2011）。此外，对于不同基因型（1型和2型）和各种地理隔离毒株，它都能诱导广泛的免疫保护（Fortetal.，2008，2009）。对于相同的病毒，另一个类似的杆状病毒表达的亚单位疫苗Ingelvac®CircoFLEX（勃林格殷格翰公司，德国），已被批准（Fachingeretal.，2008）。它也是利用ORF2表达的衣壳蛋白，使用的佐剂是水性聚合物（ImpranFLEX®），但不知是否组装形成了VLPs。一些与猪病有关的病毒也被用于VLPs疫苗的研究中。首先研究是猪细小病毒（PPV），它是一种引起猪繁殖障碍的高度传染性病毒。PPV的VLPs（VP2蛋白）已应用于不同动物模型（利用不同的佐剂、一次肌肉免疫）。一微克剂量就有很强的免疫原性，能阻止病毒通过胎盘传播，防止母猪发生繁殖障碍（Antonisetal.，2006）。因此，细小病毒科被认为是适合生产VLPs疫苗的病毒家族。事实上，犬细小病毒（CPV）的VP2蛋白、番鸭细小病毒（DPV）的VPs蛋白、鹅细小病毒（GPV）的VPS蛋白和水貂肠炎病毒（MEV）的VP2蛋白都可作为候选疫苗。最近对鹅的初步研究显示，与灭活病毒和弱毒体内试验相比，GPV的VLPs与50%矿物油乳化后，皮下注射，就能诱导较高的中和抗体滴度（Juetal.，2011）。同样，先前对鸭的研究也显示，免疫DPV的VLPs后DPV特异性抗体和中和抗体水平与接种商业化的灭活疫苗相同（LeGall-Reculeetal.，1996）。此外，与商业化是常规疫苗相比，MEV的VLPs二免后也能引起高强度的抗体应答反应；有趣的是，受保护的水貂粪便中也不排泄MEV（Christensenetal.，1994）。此外，重组CPV的VLPs都是利用佐剂进行的一免和二免研究。用两种纯化的VLPs免疫犬，能够诱导产生中和抗体，足以使所有的免疫犬免受病毒的挑战（LopezdeTurisoetal.，1992；Salikietal.，1992）。最近报道了一个有趣的VLPs家禽疫苗（Morrison.，2010）。禽副粘病毒科新城疫病毒（NDV）可引起呼吸困难和或神经性疾病。NDV结构蛋白（NP、M、F和HN）形成的VLPs在小鼠中与紫外线灭活全病毒疫苗作比较。证明VLPs的免疫原性有效。采用ELISA法检测的特异性抗体水平以及NDV的VLPs免疫产生的中和抗体滴度都一样高甚至高于全病毒灭活疫苗免疫使用较多抗原产生抗体水平。此外，NDV的VLPs刺激T细胞反应的水平略高于常规疫苗（McGinnesetal.，2010）。另一个重要的发现是，NDV的VLPs也可以作为其他目标病原体肽序列的传递载体。在有囊膜的病毒中，首先想到的是流感病毒。因为本病是一种人兽共患传染病，是人类健康3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的主要威胁之一，而且涉及各种动物，主要是鸡、猪和马。流感病毒的病毒样颗粒（FLU-VLPs）在重组杆状病毒感染的细胞中生产、组装并释放到模拟病毒出芽过程的培养基中。FLU-VLPs整合了病毒表面糖蛋白（血凝素和神经氨酸酶），通常还有病毒其它结构蛋白，如基质蛋白M1和离子通道蛋白M2（Brunetal.，2011）。FLU-VLPs表明在没有佐剂情况下，经鼻内或肌肉途径可以提供保护性免疫（Kangetal.，2009b），这已经被广泛的报道了（D’Aoustetal.，2010；Haynes.，2009；Kangetal.，2009a，b）。目前，防治人类疾病的VLPs疫苗都处在不同的发展阶段，都在进行临床前的市场评价。乙型肝炎疫苗（Recombivax®和Engerix®）和人乳头状瘤病毒疫苗（Gardasil®和Cervarix®）已被批准商业化（Chackerian.，2007；Monieetal.，2008；Shietal.，2007）。在临床开发的VLPs疫苗包括几种类型，如自身代表靶抗原的VLPs以及将外源抗原呈递给免疫系统的VLPs（BachmannandJennings.，2004；Chackerian.，2007；GrgacicandAnderson.，2006；Roldaoetal.，2011；SpohnandBachmann.，2008）。VLPs疫苗在病毒方面获得了巨大的进步，如丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus），埃博拉病毒（Ebola）、拉沙病毒（Lassa），汉他病毒（Hantavius），马尔堡病毒（Marburg），非典型肺炎病毒（SARS）和基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus）(Brancoetal.，2010；Garroneetal.，2011；Lietal.，2010；Liuetal.，2011；Murataetal.，2003；PlummerandManchester.，2011；WarfieldandAman.，2011)。口蹄疫病毒（FMDV）的VLPs正处在快速的发展过程中，可以利用多种系统表达（Caoetal.，2009）。如利用毕赤酵母（Pichiapastoris）系统表达O、A、C和Asia1型四种FMDV的P1重组多聚蛋白，与MontanideISA50V佐剂乳化后免疫豚鼠，产生了特异性体液免疫应答，对豚鼠产生了保护（BalamuruganV.，etal.，2005）。此外，将Asia1型FMDV结构蛋白基因重组质粒转入大肠杆菌（Escherichiacoli）中，表达出VP0、VP3和VP1，在体外组装成VLPs，在豚鼠、猪和牛体内引起了高强度的FMDV特异性的抗体水平，可以对动物产生免疫保护（Hui-ChenGuoetal.，2013）。含有O型FMDV的VP1-2A-3C的编码序列的重组杆状病毒，感染Sf9昆虫细胞后表达目的蛋白，随着3C蛋白酶将结构蛋白水解后形成VLPs，在牛体内产生高水平的中和抗体滴度(B.MohanaSubramanian.，2012)。1.2.4病毒样颗粒疫苗存在的问题病毒样颗粒是上世纪80年代末开始被用作疫苗的（Stephenne.，1988）。尽管有漫长的历史，但迄今为止只有少数的VLPs疫苗在世界上是商品化的，且其他几个VLPs疫苗正在进行临床试验。尽管VLPs对人类和动物的多种病毒性疾病都有强有力的免疫，但是许多仍然只限于小规模的基础研究。目前，VLPs有限的适用性部分上是与一些技术和生产大粒径的VLPs相关。虽然已经生产出了许多病毒的病毒样颗粒，但不是所有的VLPs都能充当疫苗。即使许多概念已经被大量的临床前数据支持，如果某种VLPs的制造过程单一或成本高，那么它就不可能发展成为一种广泛使用的疫苗（Langeveldetal.，2001；Nicholasetal.，2002；Buckland.，2005）。通常能够大规模生产高质量的单个蛋白质组装成的VLPs。而在某些情况下，大规模生产结构复杂的VLPs却很困难（Cox.，2012；MenaandKamen.，2011；Roldaoetal.，2011)。此外，由于脂质囊膜固有的特性，囊膜VLPs的生产技术更为复杂（Roldaoetal.，2011）。然而，上述许多问4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言题都正在解决。预计在不久的将来，优化工具（如分子生物学、基因工程和系统生物学）的集成发展，将会解决几种类型VLPs大规模生产的问题（Vicenteetal.，2011a）。1.3壳聚糖的应用壳聚糖（Chitosan）又称脱乙酰甲壳素，化学名称为(1→4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是从甲壳类动物体内提取的一类由氨基葡萄糖组成的聚合物，在弱酸性水溶液中带正电，是壳聚糖有别于其他生物材料的一种特性（Giotraetal.，2015）。正是由于这一特征，壳聚糖与药物结合后，可以与其他阴离子化合物形成一个聚电解质复合物，组成一个呈递系统（AvadiM.Retal.，2010；FanWetal.，2012；ShuX.Zetal.，2001）。壳聚糖这种天然高分子具有生物相容性、安全性高和易降解性等特点，被作为许多药物的载体，应用于各种生物学领域。壳聚糖能够促进伤口的愈合。Chitosan被发现能通过调节免疫系统，来影响伤口愈合的所有步骤（HowlingG.Ietal.，2001）。它能吸引中性粒细胞和巨噬细胞到达伤口，控制纤维增生和上皮细胞的再生（IshiharaMetal.，2002）。抗微生物和止血作用也使Chitosan成为一种潜在的伤口愈合材料（PatruleaVetal.，2015）。此外，壳聚糖具有生物相容性、生物降解性、生物黏附性和较低的毒性，这使得它成为愈合伤口最好的材料。因此，将Chitosan与其它促进愈合的材料相结合，可以获得多功能的效果，从而在伤口愈合中起协同作用。有研究者证实了了壳聚糖膜与表皮生长因子（EGF）对止血和血管愈合的作用（LeeSetal.，2014）。与市场上的制剂相比，单独的壳聚糖膜和EGF-Chitosan膜在体内表现出类似的止血活性。然而，在组织学研究中，EGF-Chitosan膜却能显著促进血管愈合。因此研究人员建议，将EGF浸渍到壳聚糖膜上，并不会中断两者的相互作用，反而会对血管的愈合和止血起到协同作用。为验证其效果，Chitosan已经扩展到治疗不同类型的伤口，如糖尿病伤口（MouraL.I.Fetal.，2014）。Moura等人利用壳聚糖衍生物制备泡沫，5-甲基吡咯烷酮的壳聚糖（MPC），覆盖在伤口部位和帮助再生，从而治疗糖尿病的创口。神经降压素（NT）（BrunPetal.，2005），一种生物活性神经肽，加到Chitosan中可以显着降低伤口大小，提高伤口愈合。此外，Chitosan与其他制剂联合可以调节免疫反应，这在伤口愈合过程中也很重要。最近，壳聚糖作为佐剂在免疫调节中的作用也越来越受到人们的关注。如在研究氧化石墨烯（GO）作为一种潜在的疫苗佐剂时，加入壳聚糖（CS）制成GO-CS纳米佐剂，不仅减小了GO的尺寸，还使表面带上了正电荷和有更好的热稳定性，增加了GO-CS的生物相容性，使活化RAW264.7细胞、刺激多种细胞因子介导的细胞免疫反应（Tianyanetal.，2017）。该研究认为这是由于GO与壳聚糖的协同免疫刺激作用，认为GO-CS是疫苗和免疫治疗中的一种潜在佐剂。在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的小鼠中（BunsoonChoietal.，2016），通过流式细胞仪分析发现，壳聚糖与灭活的HSV-1结合治疗能显著增加小鼠体内CD4+T细胞的数量，而且DCs细胞和NK细胞的数量也比对照组显著增加，结果也再次表明壳聚糖是一种潜在的调节剂和免疫刺激剂，是一种很有应用前景的佐剂。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言自从2009年全球流感大流行时，科学家就强调需要一个有效的疫苗佐剂来作为流行性感冒病毒疫苗的佐剂。最近人们研究了多聚γ-谷氨酸/壳聚糖纳米凝胶（PC）作为流行性感冒病毒亚单位疫苗佐剂的可能性。PC纳米凝胶明显增强小鼠体内抗原特异性交叉呈递细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活动。与明矾佐剂相比，PC纳米凝胶佐剂组对甲型H1N1流感病毒（pH1N1）感染的小鼠防护效果大幅增加，也增加了血凝素的抗体滴度和CTL的活性，抵御了先前同源和异型[A/菲律宾/2/82（H3N2）]病毒的挑战。然而，用PC纳米佐剂的pH1N1疫苗免疫后，CD8+T细胞缺陷型小鼠不能抵抗不同亚型流感病毒的侵袭。试验中还观察到，使用PC纳米凝胶作为疫苗佐剂低剂量就能显着增强pH1N1疫苗的保护期。这些结果表明，PC纳米凝胶是一种很有前途的疫苗佐剂，几乎可以防止流感病毒的感染（JihyunYangetal.，2017）。另外，科学家也将壳聚糖纳米（PC）佐剂用于开发安全有效的黏膜疫苗佐剂，产生广泛的交叉保护作用预防季节性或新出现的流感病毒（ChowdhuryMYetal.，2017）。研究者将流感病毒中高度保守的基质蛋白-2（sM2）、血凝素融合肽（HA2）与常用的粘膜佐剂霍乱毒素亚单位A1（CTA1）和多聚谷氨酸（γ-PGA）-壳聚糖纳米粒（PCNPs）结合构成了一个黏膜流行性感冒病毒亚单位疫苗系统。sM2HA2CTA1/PCNPs系统是安全的，是一种能够作用于黏膜、天然的粘膜佐剂材料。sM2HA2CTA1/PCNPs粘膜给药能够在接种以及偏远部位大幅度提高系统免疫（IgG和IgA）抗体滴度，同时显著提高sM2或HA2特异性细胞介导的免疫反应。在BALB/c小鼠攻毒试验中，注射10M的LD50A/EM/Korea/W149/06（H5N1）、A/PuertoRico/8/34（H1N1），A/Aquaticbird/Korea/W81/2005（H5N2），A/Aquaticbird/Korea/W44/2005（H7N3）或者A/Chicken/Korea/116/2004（H9N2）病毒，重组sM2HA2CTA1/PCNPs佐剂预防不同致命的流感病毒亚型，为小鼠提供交叉保护且接种疫苗后保护期长达六个月。以壳聚糖这一生物可降解的纳米微颗粒作为疫苗佐剂有许多优势。首先，其纳米微球结构模拟天然病原体的形状与大小，可増强抗原递呈细胞（APCs）对抗原的摄取率；其次，可通过包埋或吸附的方式稳定地装载抗原蛋白，保护并维持抗原的生物活性，并对抗原具有缓释或控释作用，提高抗原的生物利用度；再者，颗粒型佐剂有利于将佐剂和抗原递呈至同一组的APCs，在细胞内有望帮助抗原越过溶酶体障碍直接进入细胞质，促进APCs的交叉递呈，使得外源性抗原通过MHCＩ类分子递呈至CD8+T细胞，促进抗原向淋巴细胞的递呈，产生Th1型细胞因子和细胞免疫反应；最后，壳聚糖微纳米颗粒表面有活性基团，具有刺激响应性，通过合理的设计可调节免疫应答的类型，提高抗原对异型病毒株的交叉保护力（王月琦.，2016）。6 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装O型口蹄疫病毒是口蹄疫病毒属、小RNA病毒科的成员之一。在所有七种口蹄疫病毒血清型中，O型在全世界范围内流行和分布最广，非洲北部、东欧、整个南美洲以及亚洲的大部分地区都有报道，严重威胁全球畜牧业旳发展(GrubmanandBaxt.2004)。灭活苗在制备过程中因设备安全性要求高、工艺复杂、花费大、毒株灭活不完全、有散毒的危险等缺点，因此病毒样颗粒疫苗被认为是口蹄疫病毒疫苗研究领域最具潜力的候选疫苗，利用基因重组技术合成并表达具有病毒抗原表位的病毒样颗粒能够诱导动物产生近乎病毒自然感染的免疫力，一直受到众多研究者的高度重视。随着分子细胞生物学的迅速发展，VLPs的蛋白表达系统不断完善，多种表达系统都可以有效表达VLPs，如大肠杆菌(E.coli)表达系统、酵母(yeast)表达系统、哺乳动物细胞（mammaliancells）表达系统、杆状病毒-昆虫细胞（baculovirus-insectcells）表达系统以及植物细胞（plantcells）表达系统等。虽然酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等真核表达系统能够表达结构复杂、表达后有糖基化、乙酰化、甲基化修饰过程的蛋白，利于体外正确组装，但是在制备病毒样颗粒过程中存在表达量低、花费大、生产工艺复杂等缺陷，故不适合规模化的生产和应用。大肠杆菌原核表达系统虽然缺乏外源蛋白的翻译后修饰功能且外源蛋白在大肠杆菌体内多以包涵体形式表达，但融合蛋白技术的应用实现了大肠杆菌体内外源蛋白的可溶性表达，促进了原核表达系统在病毒样颗粒研究领域的应用价值。FMDV衣壳蛋白VP0、VP3和VP1在体外具有自组装成病毒样颗粒的能力，故本试验选用O型分离株VP0、VP3和VP1编码区的重组表达大肠杆菌原核表达体系，体外组装成O型口蹄疫病毒样颗粒。2.1试验材料2.1.1菌种、表达载体及抗体含O型FMDV分离株VP0、VP3和VP1编码区的重组表达菌由本实验室保存，大肠杆菌BL21（DE3）-RIL表达菌株购于生工生物工程（上海）有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG二抗购自Sigma公司、O型FMDV的猪阳性血清由本实验室自制。2.1.2生物学试剂及主要试剂的配制培养细胞用的PBS、DMEM培养基、0.25%-EDTA胰酶、青霉素和链霉素均购自GibcoBRL公司（USA）；胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）购自Hydone公司（USA）；蛋白预染Marker购自全式金公司；蛋白酶抑制剂购自Invitrogen公司；硝酸纤维素膜购自AmershamBiosciences（ArlingtonHeights，IL，USA）公司；ECL底物发光试剂盒购自Thermo公司；镍亲和层析树脂购自GE公司。其他试验耗材和普通试剂均来自国内生产公司。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装（1）5×SDSrunningbuffer：取15.1gTris、94gGlycine和50mL10%（m/v）SDS溶于少量蒸馏水中，可稍微加热助溶，玻璃棒搅拌溶解后，用1.0mol/LNaOH调pH值为8.3，最后定容至1000mL。可配成备用，临用前稀释。（2）蛋白转印缓冲液：准确称取3.6gTris(MW=121.14)、17.28gGlycine，再加入200mL甲醇，最后定容于1000mL。（3）10×TBS缓冲液：准确称取24.2gTris、80.0gNaCl，先加入900mL蒸馏水，浓盐酸调pH至7.6后，定容于1L，室温保存备用。1L的1×TBS中加入0.5mL的Tween-20可配制成1×TBST。（4）LB培养基的配制：准确称取10g蛋白胨，5g酵母粉和5gNaCl溶于1000mL去离子水中，经高压灭菌后，冷却至室温，保存备用。2.1.3主要试验仪器与设备表2.1主要试验仪器与设备Table2.1Mainexperimentalinstrumentsandequipment仪器与设备公司蛋白电泳及转膜仪美国BIO-RAD公司核酸电泳仪北京六一仪器厂恒温水浴锅上海精宏试验设备有限公司大型落地式恒温冷冻摇床Thermo公司普通光学显微镜OLYMPUS（Tokyo，Japan）-80℃超低温冰箱Thermo公司脱色摇床北京六一仪器厂紫外分光光度计Thermo公司生物安全柜安泰公司CO2细胞培养温箱Thermo公司QL-902涡旋振荡仪海门市其林贝尔仪器制造有限公司超声波细胞粉碎机宁波新芝生物股份有限公司电热恒温水槽上海精宏试验设备有限公司酶标仪日本BIO-RAD公司Gel-DOCXR凝胶成像仪BIO-RAD公司（USA）MettlerAE160电子天平Mettler公司ZetasizerNanoZS90纳米粒径电位分析仪英国Malvern公司8 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装2.2试验方法2.2.1O型FMDV衣壳蛋白VP0、VP3、VP1的原核表达将本实验室保存的阳性重组质粒pSMK-VP0VP3和pSMK-VP1的共转化感受态细胞BL21（DE3）-RIL表达菌按1：100接种于新的、已高压灭菌的LB培养基，在恒温摇床上37℃、220rpm/min过夜培养。次日，再将过夜培养的表达菌按1：100重新接种到新鲜的、已高压灭菌的LB培养基中，于37℃、220rpm/min的条件下在大型摇床上培养至OD600值为0.6左右。取样5mL作为诱导前对照，其余菌液转16℃、220rpm/min条件下继续培养，并加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养12h-16h之后收集菌液，于4℃、4750rpm/min、30min离心沉积菌体，弃去上清。将菌体按1:50浓缩比例悬浮于BufferA（500mMNaCl，20mMTris-HCl，20mMImidazole，2mMDTT，0.05%TritonX-100，pH=8.4）中，用无菌塑料铲充分混匀后于冰上超声波处理7min，随后11500rpm/min、4℃离心15min，取上清，4℃保存备用。2.2.2目的蛋白的纯化本实验室构建的三种融合蛋白VP0、VP3和VP1的氨基末端均带有一个6×His标签和一个SUMO蛋白，采用Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白。将可溶性蛋白（上一步收集的上清）转移至预装有BufferA平衡后的Ni2+亲和层析树脂的层析柱中，放置在旋转仪上匀速、缓慢摇动，4℃结合1h，使目的蛋白与树脂充分结合。随后将层析柱竖直固定在铁架台上，反复过滤两次之后用10倍柱长体积约30mL的BufferA洗脱杂蛋白，紧接着用漂洗液（500mMNaCl，20mMTris-HCl，40mMImidazole，2mMDTT，0.05%TritonX-100，pH=8.4）洗脱与Ni2+柱非特异性结合的杂蛋白。最后用BufferB（500mMNaCl，20mMTris-HCl，500mMImidazole，2mMDTT，0.05%TritonX-100，pH=8.5）将目的蛋白洗脱，每次1mL，反复洗脱5~6次，每次都收集滤液样品，用于12%SDS-PAGE电泳观察洗脱和纯化效果。上述洗脱步骤所用的BufferA、漂洗液和BufferB需先在4℃冰箱预冷，所收集的滤液样品要注意低温保存。2.2.3免疫印迹试验（WesternBlotting）检测将上述各步洗脱下来、带有His-SUMO的融合蛋白各取10μL，加入5μL的5×SDSLoadingBuffer混匀后，依次制备20mL12%分离胶和5mL5%浓缩胶（如表2.2和2.3所示）进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，利用电泳湿转法将重组蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上。用封闭液（1×TBST配制成12%的脱脂奶粉）室温封闭1h，用1×TBST1:1000稀释O型FMDV的猪阳性血清（本实验室自制），室温孵育1h或者4℃轻摇振荡过夜。1×TBST漂洗3次后，加入1×TBST1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG二抗，室温孵育1h。1×TBST漂洗3次后于暗室中加入发光底物ECL反应液，在胶片下曝光，显影及定影固定后，观察杂质蛋白洗脱和目的蛋白表达情况。9 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装表2.2SDS-PAGE中12%分离胶制备Table2.2Preparationof12%separatinggelinSDS-PAGE溶液成分体积（mL）ddH2O7.930%丙烯酰胺溶液6.71.5MTris-HCl（pH8.8）5.010%SDS0.210%过硫酸铵溶液（APS）0.2TEMED0.008总体积（Total）20.00表2.3SDS-PAGE中5%浓缩胶制备Table2.3Preparationof5%stackinggelinSDS-PAGE溶液成分体积（mL）ddH2O3.430%丙烯酰胺溶液0.831MTris-HCl（pH6.8）0.6310%SDS0.0510%过硫酸铵溶液（APS）0.05TEMED0.005体积（Total）5.02.2.4VLPs的体外组装带有His-SUMO标签蛋白的酶切反应在8000MWCO的透析袋中进行。将收集到的SUMO融合蛋白和SUMO酶按100:1比例加入置于透析袋内，透析袋置于500mL组装Buffer溶液（250mMNaCl，20mMTris-HCl，20mMImidazole，2mMDTT，0.1%TritonX-100，pH=8.4）中，为促使酶切反应充分进行，整个缓冲体系应置于旋转仪上，4℃轻微旋转过夜，使口蹄疫衣壳蛋白在缓冲液中边酶切边组装。收集组装后的VLPs，利用SDS-PAGE来检验酶切效果。2.2.5动态光散射试验（DynamicLightScattering，DLS）将上述制备的VLPs用0.22μm的滤膜过滤酶切蛋白，除去大分子物质后用动态激光散射仪10 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装检测组装后VLPs颗粒的直径大小和均一度。2.2.6Bradford法测定O型口蹄疫VLPs蛋白含量试验中按照改良型的Bradford法蛋白浓度测定试剂盒对VLPs进行浓度测定。具体步骤如下：（1）稀释BSA（牛血清白蛋白）标准品：取1.5mLEP管用与待测蛋白样品相一致的稀释液按下表稀释BSA标准品（如表2.4）。表2.4BSA标准品的制备Table2.4PreparationofBSAstandard0123456蒸馏水（μL）10009509008508007507001mg/mLBSA（μL）050100150200250300BSA浓度（μg/mL）050100150200250300（2）选取酶标板上16个孔，分为标准组和样品组。（3）标准组：12个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入20μL相应浓度的BSA标准蛋白质浓度；对应编号为0、1、2、3、4、5和6号。样品组：剩余4孔，分为2个样品重复组，同一重复组标号相同。其中编号不同的两孔加入浓度不同的20μL样品稀释液。（4）各酶标孔加入200μLBradford工作液，迅速混匀。（5）室温25℃~30℃，反应5min后，以0号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的A595。（6）以标准组各孔A595平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在MicrosoftExcel软件中绘制标准曲线。（7）根据两个相同样品稀释液A595的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度，选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原蛋白质浓度。2.3试验结果2.3.1目的蛋白的表达与纯化本实验室前期通过查找O型FMDV的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列，构建阳性重组质粒pSMK-VP0VP3及pSMK-VPl。诱导成功表达后，为了增加融合蛋白的水溶性，在目的蛋白的氨基端插入一个SUMO蛋白。采用Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白时，又在氨基端增加6个重复的组氨酸（His）标签，以利于洗脱。其中His-SUMO标签蛋白大小为12KD，加入SUMO酶后，切掉SUMO蛋白与6个His标签，其目的蛋白大小分别为33KD、24KD、23KD，与口蹄疫衣壳蛋白的理论值相一致（图2.1）。11 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装（A）（B）图2.1目的蛋白凝胶电泳图。（A）为SDS-PAGE电泳图。M：Marker；1：酶切前融合蛋白；2：酶切后目的蛋白；（B）为WesternBlotting电泳图。M：Marker；1：酶切前融合蛋白；2：酶切后目的蛋白。Fig2.1WesternBlottingofptoteins.(A)M：Marker；Lane1：Pre-inducedproteins；Lane2：Thedigestedproteins；（B）M：Marker；Lane1：Pre-inducedproteins；Lane2：Thedigestedproteins；2.3.2O型口蹄疫VLPs体外组装及鉴定在选用Tris-HCl缓冲体系体外组装O型FMDV的VLPs中，利用NaCl溶液改变缓冲体系的离子强度，促进衣壳蛋白的体外组装。DLS结果显示，在缓冲液（500mMNaCl、40mMTris-HCl、1mMCaCl2，pH=8.0）条件下组装的VLPs，粒径在25nm~40nm处聚集，颗粒均一性良好（图2.2）。这说明VP0、VP3和VP1在体外正确组装组成VLPs。图2.2纳米粒度检测仪测到的VLPs体积百分比Fig2.2ThevolumepercentageofVLPsmeasuredbyDLS12 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装2.3.3O型口蹄疫VLPs蛋白含量测定利用改良型的Bradford法蛋白浓度测定试剂盒对VLPs进行浓度测定，首先稀释BSA标准品，绘制标准曲线（如图2.3）。根据BSA蛋白质标准曲线，计算纯化的O型口蹄疫VLPs的蛋白质浓度为1.05mg/mL。1.210.8595y=0.0016x+0.5583AR²=0.98070.6吸光度0.40.20050100150200250300350浓度（μg/mL）图2.3BSA蛋白质标准曲线Fig2.3StandardcruveoftheBSAprotein2.4讨论与真核表达系统相比，大肠杆菌表达体系具有培养简单、生产周期短、成本低廉等优点，是最简单和最便宜的方法，被用于规模化的表达病毒样颗粒。但是在大肠杆菌中所表达的外源蛋白只有少部分能够折叠成正确的构象，为了调高外源基因在大肠杆菌中的表达效率，许多科学家已经做了很多尝试，包括使用强的启动子如T7启动子、与分子伴侣蛋白共表达以及蛋白融合剂的使用等等。大肠杆菌表达的VP3和VP1蛋白多为包涵体形式，且在高温等环境时，包涵体的量会增多，本实验室在16℃条件下诱导表达，获得了纯度较高的目的蛋白。为了增加目的蛋白的水溶性，将可溶性SUMO蛋白插入在目的蛋白的氨基端，很好的解决了这一问题。VPO、VP3、VP1蛋白亚基氨基酸上含有二硫键，容易被强氧化剂破坏，使蛋白质不能组装成VLPs等高级结构。为此，我们在洗脱杂蛋白过程中加入还原剂，保护目的蛋白中的还原性巯基，提高了组装效率，也增强了目的蛋白的稳定性。此外，实验室前期已经证实，弱碱以及低浓度的Ca2+可作为组装体系的激活剂，促进衣壳蛋白的体外组装，故在组装缓冲液中加入咪唑和CaCl2，并调节pH为8.0。SDS-PAGE分析显示的目的蛋白条带与理论值相符，说明目的蛋白得到了正确的表达。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章O型口蹄疫病毒样颗粒的表达及体外组装WesternBlotting结果分析的目的蛋白条带大小正确。DLS显示组装成的VLPs粒径大小均一，都在25nm~40nm处聚集。利用本实验室自制的O型FMDV猪阳性血清做一抗，与纯化的目的蛋白反应，具有较好的抗原抗体反应性。这些目的蛋白的高效表达与正确组装，都为后续动物免疫试验提供了保障。但是本研究也可利用蔗糖密度梯度离心法进一步纯化制得的O型口蹄疫VLPs，在透射电镜下观察VLPs的粒径大小和组装的效率。另外，制得的VLPs免疫原性如何，还有待后续动物试验的验证。14 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响口蹄疫是一种主要由呼吸道传播、引起偶蹄动物急性、高度接触性的传染病。接种口蹄疫疫苗是预防口蹄疫的重要手段，通常在疫苗中加入佐剂来增强疫苗的免疫效果。常用的VLPs佐剂有不溶性铝盐佐剂[Al（OH）3和磷酸铝（AlPO4）]、油佐剂（MontanideISA206和ISA201）、油水乳佐剂（弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂）以及化学合成物质[细胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物Avridinem]。铝盐佐剂虽然可以激活Th2型细胞，产生较强的体液免疫应答，但是制备疫苗批次之间差异较大，且注射部位易出现红斑、肿胀和硬结（EBLindbland.，2004）；弗氏等油水乳佐剂含有致癌成分稠环芳烃，至今没有被FDA批准为合法佐剂；目前“即用型”ISA206与ISA201属于油佐剂，由可注射油和表面活性剂（甘露醇和油酸高度精炼成的乳化剂）组成，具有很强的免疫增强作用，属于经典的油乳佐剂，这种系列的佐剂简化了疫苗生产过程，但仍有不良反应的发生。因此，开发一种安全有效、可诱导多种免疫应答的新型佐剂迫在眉睫。壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是在壳聚糖季铵盐中加入乳酸、α、β-甘油磷酸二钠和石油醚制成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性以及生物降解性，因此可作为多肽、蛋白质、核酸等生物大分子的载体，是一种潜在的理想佐剂，被广泛用于疫苗等生物制品的研发中。本试验采用壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为FMDVLPs疫苗的分子佐剂。研究表明，壳聚糖可与模式识别受体Dectin-1和Toll样受体结合并激活免疫系统（ShakyaAK,NandakumarKS.，2013），因此以壳聚糖为主要原料的壳聚糖季铵盐凝乳胶微球有望增强VLPs的免疫原性。外源性抗原在某些佐剂的作用下从溶酶体中释放出来后，可通过内源性途径与MHCⅠ类分子结合并递呈给CD8+T细胞识别，实现交叉抗原递呈，从而可诱导有效的细胞免疫应答（DeKokerSetal.，2011）。我们通过免疫豚鼠，检测豚鼠体内FMDV特异性抗体水平、T淋巴细胞增殖、攻毒后发病及保护率情况，来评价壳聚糖季铵盐凝胶微球（ChitosanA）和加入白油后制成的混合乳液（ChitosanB）的佐剂效果，并与MontanideISA201VG佐剂进行比对，充分利用缺乏核酸的FMDV空衣壳VLPs能够模拟病毒粒子相似的免疫应答的特点，来检验壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂对O型FMDVLPs的免疫效果。3.1试验材料3.1.1蛋白和佐剂本实验室保存的VP0、VP3和VP1多质粒共转化、多抗性筛选的感受态细胞BL21（DE3）-RIL表达菌表达的O型FMDVVLPs，壳聚糖季铵盐凝胶微球（ChitosanA）和混合乳液（ChitosanB）两种佐剂由中国科学院过程工程研究所馈赠，MontanideISA201VG油佐剂购于法国SEPPIC公司。上述三种佐剂与VLPs进行疫苗乳化时，按照1:1体积配伍。15 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响3.1.2病毒、细胞与试验动物O型FMDVO/BY/CHA/2010乳鼠毒由OIE/中国国家口蹄疫参考实验室保存并提供，O型FMDVO/BY/CHA/2010（GenBank:JN998085.1）的细胞毒由本实验室保存。BHK-21细胞（幼仓鼠肾传代细胞）由本实验室保存。300g～400g普通级豚鼠100只，购自本所动物厂，免疫期间饲养于隔离间，攻毒试验在中国农业科学院兰州兽医研究所P3实验室进行。3.1.3试剂及耗材辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗豚鼠IgG二抗购于Sigma公司、MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，内盐]和伴刀豆，凝集素A（ConA）均购于美国Promega公司，DMEM、RPMI1640、Hanks液、EDTA-胰酶购于Gibco公司。10×红细胞裂解液购自BDBioscience公司。O型FMDV的兔抗血清标准品由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。细胞培养皿购自美国Coring公司，6孔板、12孔板、24孔板和96孔板购自德国Greinerbio-one公司，真空抗凝采血管（肝素钠）购于河北鑫乐科技有限公司，1mL、2mL、5mL注射器购自陕西海达医疗器械科技有限公司，乙醇、NaCl等均购自国内分析纯试剂。ELISA相关试剂的配制：（1）包被缓冲液（碳酸盐缓冲液，0.05M，pH=9.6）1.59g无水Na2CO3，2.93gNaHCO3，于蒸馏水中溶解并定容于1000mL。（2）PBST洗涤液8.0gNaCl，0.2gKCl，2.93gNa2HPO4，0.2gKH2PO4，先加入800mL蒸馏水溶解，再用1M的HCl调节pH值为7.2-7.4，定容至1L，最后加入0.5mL的Tween-20。（3）封闭液：含5%脱脂奶粉或者BSA的PBST溶液。（4）底物液取2.43mL0.1M的柠檬酸溶液和2.57mL0.2M的Na2HPO4溶液，加入蒸馏水5mL，再加入4mg的邻苯二胺（OPD），最后加入15μL的H2O2。底物液现用现配，并注意避光保存。（5）终止液（1MH2SO4）用量筒准确量取26.6mL98%浓H2SO4，缓慢加入到400mL蒸馏水中，最后定容至500mL。3.1.4主要仪器与设备CO2细胞培养温箱和-80℃超低温冰箱购自美国Thermo公司，4℃冰箱购自海尔集团，电热恒温水槽和恒温培养箱购于上海精宏试验设备有限公司，生物安全柜购自苏净安泰空气技术有限公司，普通光学倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1mL和5mL的移液器均购自德国Eppendorf公司，BIO-RAD-680酶标仪购自日本BIO-RAD公司，高速试管分散机购自德国IKA公司。16 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响3.2试验方法3.2.1疫苗的制备在无菌条件，将ISA201、ChitosanA和ChitosanB三种佐剂按1:1体积比，与制备好的O型口蹄疫VLPs抗原溶液进行乳化。控制好分散计的速度，缓慢将VLPs到加入到匀速转动的佐剂中，防止气泡的产生，直至完全乳化为止。吸取少许乳化液滴入盛有水的烧杯中，若乳化液在水面不扩散，说明蛋白与佐剂乳化完全，疫苗制备良好。3.2.2试验动物免疫及分组将豚鼠随机分为四组，6只/组，两后腿内侧肌内注射。根据2.3.3测得的蛋白浓度，按0.5mL/只疫苗注射剂量计算蛋白用量。各组注射试剂及剂量如表3.1所示。第一次免疫后四周进行二免，二免后第三周攻毒。每次免疫前采血，分离血清测O型FMDV血清抗体水平。表3.1动物免疫分组及用量Table3.1Groupsoftheanimalsandimmunizationdosage分组注射试剂第一次免疫剂量第二次免疫剂量豚鼠数（只）A组PBS0.5mL0.5mL6B组VLPs+ISA201100μg+1:1体积100μg+1:1体积6C组VLPs+ChitosanA100μg+1:1体积100μg+1:1体积6D组VLPs+ChitosanB100μg+1:1体积100μg+1:1体积63.2.3双抗夹心ELISA法检测豚鼠血清抗体水平（1）用碳酸盐包被液稀释O型FMDV的兔抗血清标准品至工作浓度（1:1000），50μL/孔加入到96孔板中，振荡，封板后4℃过夜。（2）1×PBST洗三次，最后一次在吸水纸上拍干。（3）用1×PBST将O型灭活的146S全病毒抗原1:7稀释后，50μL/孔加入到上述96孔板中，振荡，封板后37℃孵育1h。（4）1×PBST洗三次，最后一次在吸水纸上拍干。（5）在血清稀释板上，利用豚鼠血清稀释液将待检豚鼠血清1:32稀释后，50μL/孔加入到96孔板中，并加入阴阳性血清对照，振荡，封板，37℃孵育1h。（6）1×PBST洗三次，最后一次在吸水纸上拍干。（7）用1×PBST将兔抗豚鼠-HRP稀释1:1000倍后，50μL/孔加入到96孔板中，振荡，封板，37℃孵育1h。17 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响（8）1×PBST洗三次，最后一次在吸水纸上拍干。（9）50μL/孔的底物液加入到96孔板中，注意避光。振荡，封板，37℃孵育15min。（10）直接加入50μL/孔的终止液，终止反应。（11）立即用酶标仪检测A490值。3.2.4MTS法检测豚鼠T淋巴细胞增殖（1）豚鼠脾脏的分离用乙醚将豚鼠麻醉处死，75%乙醇浸泡3min，放置于无菌板上。在豚鼠左腹侧，用高压灭菌的手术剪刀和小镊子开口，取出脾脏，立即放入含有RPMI1640溶液（已加入1‰的青霉素和链霉素）的15mL离心管中。（2）豚鼠T淋巴细胞的分离用高压灭菌的小剪刀将脾脏剪碎，放入罩有200目尼龙滤网的小烧杯上，研钵研磨成糊状，吸取RPMI1640溶液将脾脏吹打下来，分装于2mLEP管中。4℃、1500rpm/min离心5min后弃去上清，加入1mL1×红细胞裂解液，室温静置5min。每个加入EP管10%FBS，4℃、1500rpm/min离心5min后弃去上清，10%FBS的RPMI1640溶液重悬后过200目尼龙滤网，即可获得豚鼠T淋巴细胞悬液。（3）ConA刺激T淋巴细胞增殖将T淋巴细胞悬液稀释100倍后，利用细胞计数板计数并算出细胞悬液浓度。最后将豚鼠T淋巴细胞铺于96孔板中，6×105/孔，150μL/孔，设12个重复孔，分为四组。加入0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的伴刀豆凝集素A（ConA）各10μL，每个浓度设三个重复。另设未加细胞的RPMI1640溶液作为空白对照组。将96孔板置于37℃细胞培养箱中培养48h。（4）酶标仪测定A490值取出96孔板，加入20μL/孔的MTS溶液，继续培养4h。最后用酶标仪测定A490值。MTS结果以刺激指数（Stimulationindex，SI）表示，SI计算公式为：ConA组A490−RPMI组A490值SI值=未刺激组A490−RPMI组A490值3.2.5O型FMDV乳鼠毒复壮用300g～400g的豚鼠对O型FMDVO/BY/CHA/2010乳鼠毒进行复壮，具体操作步骤如下：（1）取500mL新鲜的DMEM培养基（Gibco公司），用0.1M的NaOH溶液调节pH值到7.5~8.0。（2）从-80℃冰箱中取出O型FMDVO/BY/CHA/2010乳鼠组织毒，在生物安全柜中溶化后用无菌镊子取出适量的乳鼠胴体，用无菌滤纸吸干组织上的PBS-甘油溶液，称重。（3）将乳鼠组织放入无菌研钵中，用手术剪将其剪碎，加入少量的石英砂，按1:10（W/V）比例加入DMEM培养基，研磨至匀浆状态，移入灭菌的15mL离心管中。（4）4℃冰箱中静置过夜后，3000rpm/min离心15min，用移液器吸出病毒上清液，4℃保18 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响存备用。（5）10只300g～400g的豚鼠，8只接种O型FMDVO/BY/CHA/2010乳鼠毒，2只作为空白对照。豚鼠两后肢脚掌穿刺接种，0.4mL/只。病毒攻击后24h～96h内，观察后脚掌有泛白、干瘪、出现水泡症状的豚鼠，处死后收集水泡皮和水泡液，水泡皮放于含有50%甘油的DMEM溶液（pH为7.5~8.0）中，冻于-20℃冰箱。（6）将水泡皮与水液贴签：FMDVO/BY/CHA/2010，标好日期后-80℃保存备用。若此次豚鼠未出现严重的口蹄疫临床症状，可将FMDVO/BY/CHA/2010毒株再连续传代，直至豚鼠出现明显的症状，如行动困难、后脚掌肿胀、干瘪、大面积泛白、出现水泡、水泡皮破裂等，即可获得较强的豚鼠毒。3.2.6O型FMDV豚鼠毒GPID50（50%Guineapiginfectiousdose）测定取O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒10g，按3.2.5中（1）~（4）的步骤操作，获得病毒上清液。用DMEM溶液（pH为7.5~8.0）进行10倍比稀释，稀释度为10-2~10-6，接种20只300g～400g的豚鼠。每只豚鼠右后脚掌穿刺接种，每个稀释度接种4只，0.2mL/只，2只作为空白对照。96h内观察豚鼠发病情况，并做好记录。用Reed-Munch法计算O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒的半数感染量GPID50/0.2mL。3.2.7豚鼠攻毒试验及临床症状观察将第二次免疫后第三周的豚鼠全部转移至P3实验室饲养，适应2d后攻击100GPID50的O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒，右后脚掌穿刺接种，0.2mL/只。7d内观察豚鼠临床症状，并做好记录。豚鼠的保护程度可以分为3个等级：“不保护”表示两只后脚掌都出现水泡；“完全保护”表示不出现任何水泡现象；“部分保护”表示水泡仅产生于接种的单只脚。完全保护的豚鼠数（只）保护率（%）=×100%每组豚鼠总数（只）3.3试验结果3.3.1FMDV特异性抗体水平变化每组随机采三只豚鼠血，将豚鼠血清以1:32倍稀释后用双抗夹心ELISA法测定O型FMDV特异性抗体水平，并将抗体水平动态变化绘制折线图（如图3.1所示）。除PBS阴性对照组外，其他三种疫苗组豚鼠血清的FMDV特异性抗体水平在第一次免疫后（Weekspost-vaccination，WPV）第3周明显提高，且C组（VLPs+ChitosanA组）和D组（VLPs+ChitosanB组）诱导产生的抗体滴度分别是B组（VLPs+ISA201组）的1.5倍和1.2倍，说明壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够增强体液免疫效果。第四周时抗体水平都有所下降，但仍高于ISA201组。第二次免疫19 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响后，疫苗组抗体水平略有上升，且D组抗体水平在二免后第二周和第三周一直高于C组，第四周时C组抗体水平又上升。这可能混合乳佐剂ChitosanB，在细胞内不能快速释放抗原，具有一定的缓释作用，可持续地增强VLPs的免疫作用。图3.1双抗夹心ELISA检测豚鼠血清FMDV特异性抗体水平Fig3.1SpecificantibodyresponsestoFMDVdetectedbydoubleantibodysandwichELISAmethod3.3.2T淋巴细胞增殖试验在第一次免疫后四周（4WPV）和第二次免疫后三周（7WPV）时，各组随机采集一只豚鼠脾脏，获得豚鼠T淋巴细胞后，进行增殖试验。与对照组（PBS组）相比，三个疫苗组的脾脏T淋巴细胞均出现增殖现象，其中第一次免疫后四周时D组增殖效果最高（1.48倍），B组和C组增殖效果几乎相同（1.40倍）。第二次免疫后三周，与对照组相比，D组的增殖效果最明显，大于C组，B组增殖效果最小，分别为1.84倍、1.76倍和1.40倍（见图3.2）。这说明壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够增强O型口蹄疫VLPs对T淋巴细胞的刺激，促进T淋巴细胞增殖，增强细胞免疫应答，且ChitosanB佐剂免疫增强作用高于ChitosanA佐剂。图3.2ConA刺激豚鼠T淋巴细胞增殖反应（MTS法）Fig3.2TheeffectsofConAonproliferationofguineapigsTcells（MTSassay）20 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响3.3.3O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒价在中国农业科学院兰州兽医研究所P3动物舍进行豚鼠毒价测定试验，每天观察豚鼠脚掌发病情况，并作好记录（表3.2）。10-2剂量组中四只豚鼠两只后脚掌全部出现水泡（继发），10-3剂量组中有两只豚鼠发病，其中一只原位发病（单只接种脚掌发病），另一只豚鼠继发。根据Reed-Muench法测得O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒价为1个GPID50=102.5/0.2mL。表3.2O型FMDVBY/CHA/2010豚鼠毒价测定Table3.2DeterminationofGPID50forFMDVO/BY/CHA/2010inguineapigs病毒液稀释度发病（只）未发病（只）发病率（%）10-24（全部继发）010010-32（一只继发）25010-404010-504010-60403.3.4豚鼠攻毒后临床症状观察第二次免疫后第三周，将豚鼠转移至中国农业科学院兰州兽医研究所P3动物舍，适应一天后进行攻毒试验。根据3.3.3计算的豚鼠毒价，用新鲜、刚拆封的DMEM培养基（pH为7.6~8.0）稀释毒液，每只豚鼠注射O型FMDVO/BY/CHA/2010豚鼠毒剂量为100GPID50/0.2mL。连续观察1周，并做好记录。豚鼠攻毒后出现明显的症状，如行动困难、后脚掌肿胀、干瘪、大面积泛白、出现水泡、水泡皮破裂等，即为FMDV的临床症状（图3.3）。（A）（B）（C）图3.3豚鼠感染FMDV后脚掌发病症状。（A）疫苗组，完全保护；（B）疫苗组，部分保护；（C）阴性对照组，不保护。Fig3.3ThesymptomsofhindfootinguineapigsfromFMDVchallenge.（A）Vaccinegroups，completeprotection；（B）Vaccinegroups，partialprotection；（C）Negativecontrolgroup，noprotection.21 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响3.3.5豚鼠攻毒保护试验免疫后豚鼠攻毒保护率如表3.3所示。B组（VLPs+ISA201）与D组（VLPs+ChitosanB）疫苗保护率都达到了75%，C组为50%。其中，B组中有三只豚鼠全部保护，另外一只为部分保护，而D组中也有三只完全保护，但是另外一只为不保护，ISA201佐剂组保护率要高于壳聚糖季铵盐凝乳胶微球组，但是ChitosanB佐剂组的保护率比ChitosanA佐剂组高。表3.3免疫豚鼠攻毒保护率检测Table3.3ProtectionofguineapigsfromFMDVchallengeB组（VLPs+C组（VLPs+D组（VLPs+豚鼠编号A组（PBS）ISA201）ChitosanA）ChitosanB）1不保护完全保护部分保护完全保护2不保护完全保护完全保护完全保护3不保护部分保护不保护不保护4不保护完全保护完全保护完全保护保护率（%）0（0/4）75（3/4）50（2/4）75（3/4）3.4讨论理想的佐剂需要具备以下特点：安全可靠、毒副作用小、无免疫原性；结构成分及生物学特性稳定，具有较好的生物相容性，易在体内降解和清除；能有效诱导或增强细胞免疫和粘膜免疫应答等；价格低廉、易于贮存等（厍大亮等.，2011）。现在，被批准用于疫苗中的佐剂还比较少，如铝盐佐剂目前仍然是FDA唯一批准的人用注射疫苗佐剂，该佐剂虽然安全有效，能刺激体液免疫应答，但在促进细胞免疫应答能力相对较低，故需研发更为有效的新型佐剂。最近研究发现，壳聚糖在免疫应答中能够诱导辅助性细胞的活性，增强乳鼠抵抗FMDV的能力（DongLi.，2010）因此，本研究以壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为蛋白疫苗的佐剂，利用其良好的生物相容性、低毒性以及生物降解性等潜在疫苗的特性，与O型口蹄疫VLPs乳化后免疫豚鼠，脾脏T淋巴细胞增殖试验证实壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂组能够促进T淋巴细胞增殖，其增殖作用高于ISA201佐剂组，说明壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能诱导细胞免疫应答，且ChitosanB免疫增强作用高于ChitosanA佐剂；FMDV特异性抗体水平动态变化、免疫后攻毒以及攻毒后保护率等几个方面来验证ChitosanA和ChitosanB两种壳聚糖佐剂对O型口蹄疫VLPs的免疫效果。T淋巴细胞主要位于脾脏中，分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，前者被抗原和MHCⅡ类分子复合物激活，活化为辅助性T淋巴细胞（Th细胞），参与细胞免疫、体液免疫和炎症反应等应答反应；后者被抗原和MHCⅠ类分子复合物激活，活化为细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞），杀伤发生癌变的肿瘤细胞和被病毒感染的细胞等；两者共同作用，产生体液免疫和细胞免疫，清除入侵的病原体，保证动物机体各项生理活动的正常进行。壳聚糖季铵盐凝乳胶微球通过增强O型口蹄疫VLPs的免疫作用，促进了T淋巴细胞的增殖，产生体液免疫和细胞免疫，使动22 中国农业科学院硕士学位论文第三章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫影响物机体抵御FMDV的入侵。FMDV特异性抗体水平显示，一免后第三周，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂组产生较高的特异性抗体水平，且二免后，ChitosanB佐剂组能够长时间维持高水平抗体滴度，而ISA201佐剂直到加强免疫后，抗体水平才略高于ChitosanA佐剂组，说明油性佐剂适合诱导短期的免疫应答，整体而言免疫增强作用不如壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂。豚鼠攻毒试验中，ChitosanB佐剂组与ISA201佐剂组有相同的保护率，这些都初步说明了壳聚糖佐剂对O型口蹄疫VLPs具有免疫增强作用，且ChitosanB佐剂的免疫增强作用要好于ChitosanA佐剂。ISA201佐剂组的抗体水平与T淋巴增殖效果都不是最高的，但是其保护率却与ChitosanB佐剂组相同，可能与VLPs的免疫剂量有关。过量的蛋白免疫剂量会诱导大量的低亲和力的T细胞，不能与自身MHC结合，导致低亲和力的T细胞在发育的过程中被诱导凋亡，这称为阳性选择。阳性选择的作用使佐剂的种类显的不那么重要，但仍需要其他的试验方法进行研究判定，其壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对VLPs的免疫增强作用也需要大动物试验的验证。23 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响目前，对口蹄疫（FMD）流行的国家来说，接种疫苗是一种被广泛接受的策略，如利用化学灭活的病毒抗原来制备口蹄疫疫苗，与适当的佐剂乳化后免疫动物，达到预防口蹄疫的目的。为了开发安全有效的疫苗佐剂，我们通过大肠杆菌表达FMDV结构多肽，组装成病毒样颗粒（VLPs）空衣壳，保留结构蛋白的抗原性，与壳聚糖凝乳胶微球乳化后制成疫苗。前期通过豚鼠模型研究了壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的豚鼠免疫效果，初步得出了壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对VLPs具有免疫增强作用，且ChitosanB佐剂组的免疫增强作用效果要好于ChitosanA佐剂组。为了进一步验证上述结论，本章通过FMDV易感的大动物模型（猪模型），测定FMDV的特异性抗体水平、中和抗体水平、以及血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ含量和免疫后攻毒保护率等几个方面，再次探究与验证壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对VLPs具有免疫增强作用，检验壳聚糖季铵盐凝乳胶微球引起的体液免疫和细胞免疫，探究其增强VLPs免疫效果的可行性。4.1试验材料4.1.1疫苗、病毒与细胞本实验室保存的VP0、VP3和VP1多质粒共转化、多抗性筛选的感受态细胞BL21（DE3）-RIL表达菌表达的O型口蹄疫VLPs，MontanideISA201VG油佐剂购于法国SEPPIC公司，壳聚糖季铵盐凝胶微球（ChitosanA）和混合乳液（ChitosanB）两种佐剂由中国科学院过程工程研究所馈赠。O型FMDVO/BY/CHA/2010乳鼠毒由OIE/中国国家口蹄疫参考实验室保存并提供，O型FMDVO/BY/CHA/2010（GenBank:JN998085.1）的细胞毒和BHK-21细胞（叙利亚幼仓鼠肾细胞）由本实验室保存。4.1.2试验动物的筛选猪购自平凉市庄浪县绿恒养殖农民专业合作社，免疫前采血，用ELISA方法检验FMDV抗体，筛选18头抗体阴性猪。4.1.3主要生物学试剂及耗材DMEM、FBS（胎牛血清）和EDTA-胰酶购于Gibco公司。口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。猪血清IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ定量检测试剂盒购自美国R&DSystems公司。24 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响细胞培养皿购自美国Coring公司，6孔板、12孔板、24孔板和96孔板购自德国Greinerbio-one公司，真空抗凝采血管（肝素钠）购于河北鑫乐科技有限公司，1mL、2mL、5mL注射器购自陕西海达医疗器械科技有限公司，乙醇、NaCl等均购自国内分析纯试剂。4.1.4主要仪器与设备恒温培养箱、CO2细胞培养温箱和-80℃超低温冰箱购自美国Thermo公司，4℃冰箱购自海尔集团，电热恒温水槽购于上海精宏试验设备有限公司，生物安全柜购自苏净安泰空气技术有限公司，普通光学倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，10μL、20μL、100μL、200μL、1mL、5mL的移液器均购自德国Eppendorf公司，BIO-RAD-680酶标仪购自日本BIO-RAD公司，高速试管分散机购自德国IKA公司。紫外分光光度计购于Thermo公司。4.2试验方法4.2.1试验动物的筛选与免疫免疫前采集多头猪血清5mL，筛选FMDV阴性猪18头，打耳标，做好记录。按照2.3.3测得的蛋白浓度和3.2.1制备疫苗的方法乳化疫苗，将筛选好的18头阴性猪随机分为四组，PBS组（3头），VLPs+ISA201组（5头），VLPs+ChitosanA组（5头），VLPs+ChitosanB组（5头），2mL/只，100μg/只，耳后颈部肌肉注射。免疫四周后攻毒。每周采血后分离血清，测O型FMDV特异性抗体和中和抗体水平。4.2.2FMDV特异性抗体检测利用中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒测定猪血清中FMDV抗体水平，其步骤如下：（1）准备微量血凝板（U型或V型均可）5块（2）试剂准备a）包被缓冲液（pH9.6）：将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊粉末倒入100mL无离子水中溶解即可。4℃存放，1个月内有效。b）洗涤液（PBST）：将本试剂盒配备的25倍浓缩的PBST液（可能有结晶形成，用时微热溶化）用无离子水或者蒸馏水做1:25稀释（如果pH降低，务必用NaOH调至7.4）。c）底物溶液：取1片柠檬酸-磷酸盐片剂（本试剂盒配备）溶于100mL无离子水中，溶化后，取50mL溶液再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5mL/瓶或者10mL/瓶），-20℃避光保存。用前避光溶化，临用时每1mL上述溶液加10μL本试剂盒配备的3%的双氧水（H2O2）。注意务必加双氧水。（3）操作步骤a）用包被缓冲液稀释O型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:1000），在ELISA板上每孔加25 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响入50μL，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。b）抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不通的需要，选择下图4.1中的布局在抗原抗体反应板上操作，一块板可以定量检测10份样品抗体滴度。以图4.1为例，在U型血凝板上按50μL/孔量，用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50μL用PBST稀释到使用浓度的O型口蹄疫病毒抗原（1:4，即1份病毒抗原加3份PBST），病毒抗原对照孔加100μL。振荡混匀，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。123456789101112AS11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:4B1:161:641:8C1:321:128D1:641:256E1:1281:512病毒F1:2561:1024抗原G1:5121:2048对照H1:10241:4096图4.196孔酶标板样品布局图Fig4.1Samplelayoutofthe96holemicroplatec）用洗涤液（1×PBST）连续洗ELISA板5次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50μL，封板，37℃温育1h。d）同上，洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释O型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μL，封板，37℃温育1h。e）同上，洗板5次，甩干。用1×PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:1000），每孔加50μL，封板，37℃温育1h。f）同上，洗板5次，每孔加50μL底物溶液（务必要加双氧水，每10mL加100μL双氧水），37℃温育15min。每孔再加50μL终止液终止反应，立即在429nm波长下读取吸光值（D492nm值）。（4）结果判定a）试验认可度：每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA孔板，50μL/孔，病毒抗原对照D492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应小于1:8。b）病毒抗原对照平均D492nm值50%计算（临界值）：抗原对照是4孔，弃去最高和最低D492nm值，计算剩余2孔的平均D492nm值，再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照D492nm值。c）结果判定：以病毒抗原对照平均D492nm值的50%为临界值，被检血清稀释孔D492nm值大26 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的D492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照瓶平均D492nm值为1.2，则其50%为0.6。若某一待检血清在1:128时D492nm值为0.6，则该份待检血清的抗体滴度为1:128。若临界值处于两个滴度之间，如处于1:64与1:128之间，则抗体滴度取中间值为1:90。ELISA抗体效价≥1:128，判为O型口蹄疫抗体阳性。4.2.3FMDV中和抗体检测按照OIE指导手册，通过病毒中和试验（Virusneutralizationtest，VNT）来检测猪血清中的中和抗体效价。选择下图4.2中的布局在96孔板上操作（每块板可检测2份血清），其步骤如下：（1）试验试剂的预备：a）O型FMDV中和抗体阳性血清和阴性血清由本实验室自制。被检血清经56℃金属浴灭活30min，待用。b）新复苏的BHK-21传代细胞，传代培养细胞形态良好。c）病毒：O型FMDVO/BY/CHA/2010的细胞毒适应BHK-21单层细胞。细胞病变（Cytopathiceffect，CPE）时间稳定后，收获的病毒液测定病毒滴度（TCID50/0.1mL）后，分装于1.5mL的EP管，-70℃保存备用。d）配制新鲜的细胞维持液（VCM）：DMEM培养基中加入2%FBS，再加入1‰双抗混合配成。pH7.6~7.8，在中和试验中作稀释液用。e）配制新鲜的细胞培养液：DMEM培养基中加入10%FBS，再加入1‰双抗混合配成（pH7.4），培养细胞用。200TCID502TCID50阳性A血1:41:81:161:321:641:1281:256…………血清清毒……………………………对照性对……………………………照…………………正常20TCID500.2TCID50阴性B血1:41:81:161:321:641:1281:256细胞…………血清清毒…………………对照…………对照性对……………………………照…………………图4.2病毒中和试验样品布局图Fig4.2SamplelayoutoftheVNT（2）试验步骤：a）O型FMDVO/BY/CHA/2010的细胞毒滴度测定：将FMDV细胞毒液在96孔板上作10倍连续稀释，即10-1、10-2、10-3……10-11，每孔50μL病毒液，100μL细胞悬液（细胞悬液的浓度以在24h内长满单层为度），每个稀释度8孔。每块板的最后一列设8孔细胞对照，每孔补加50μL稀释液（不加病毒）。置于37℃、5%CO2温箱培养。24h、48h和72h后观察记录，72h27 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响后将板固定，并作常规染色[先用福尔马林溶液（10%甲醛）固定30min，然后再置于福尔马林溶液配制的0.05%亚甲蓝溶液中浸泡染色30min，然后将培养板用水冲洗]。未病变的细胞呈蓝色，病变细胞脱落或不着色。依据每个稀释度下8孔CPE情况，按Reed-Muench法计算病毒滴度（TCID50/0.1mL）。病毒工作液浓度为200TCID50/0.1mL。b）待检血清稀释：用细胞维持液在96孔培养板上从1:4开始作2倍连续稀释，依次为1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256，每个稀释度作4个重复，50μL/孔。c）病毒回归试验：将病毒工作液浓度（200TCID50/0.1mL）依次稀释为20TCID50/0.1mL、2TCID50/0.1mL、0.2TCID50/0.1mL，每个稀释度作4个重复，50μL/孔。补充细胞维持液50μL/孔。每次试验每块培养板都必须设立病毒回归试验。d）阳性和阴性血清对照各设4个孔，50μL/孔。每次试验每块培养板都必须设立阴阳性血清对照。e）血清毒性对照试验：以每份待检血清最低稀释倍数1:4设置，各设4个孔，50μL/孔。每次试验每块培养板都必须设立待检血清毒性对照。f）中和反应：在上述每孔中加入50μL的病毒工作液（200TCID50/0.1mL），与血清等量混合，封闭培养板，37℃温箱孵育1h。g）血清与病毒中和1h后，取出培养板，加入50μL/孔的细胞悬液（以24h内长满单层为度，一般为1×106~1.5×106个/mL），置37℃、CO2温箱中培养。对照孔体积不足150μL时，用稀释液补全体积。培养48h后，显微镜下作适当判断，72h固定染色。h）正常细胞对照：为避免培养板本身引起的试验误差，在每块培养板上均设立8孔不接病毒和血清的正常细胞对照，该对照应在整个试验中保持良好的生长状态，每孔50μL。每次试验每块培养板都必须设立正常细胞对照。（3）试验成立的条件：正常细胞对照在整个试验中一直保持良好的生长状态，染色后呈蓝色；阳性对照孔（病毒被中和）无CPE出现，染色后呈蓝色；阴性对照孔（病毒未被中和）出现CPE，染色不着色；病毒回归试验中，最高病毒滴度（200TCID50/0.1mL）孔细胞全部病变，最低病毒滴度（0.2TCID50/0.1mL）不出现或者可见少量细胞病变。这4组对照全部成立时，试验有效。否则，重新试验。（4）结果判定：被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性。用Reed-Muench法计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度为该份血清的中和抗体效价。当被检血清（在血清/病毒混合物中）最终滴度为1:45或更高者为阳性，最终滴度在1:16~1:32为可以需要重复试验，再次试验结果为1:16或更高时为阳性，滴度为1:16或更低时为阴性。4.2.4猪免疫后相关细胞因子测定猪免疫前以及免疫后每周采集血清，利用美国R&DSytems公司的猪血清定量ELISA检测试剂盒，检测血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量，现以IFN-γ为例，简要说明其操作步骤：（1）试剂准备：28 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响IFN-γ对照组设置：用1.0mL去离子水稀释IFN-γ对照品粉末，混匀后，4℃保存，备用。清洗液配制：用前先将25×清洗液放置室温5min，并震荡混匀。往洗瓶中（本实验室自备）加入40mL的25×清洗液，配制成1000mL的1×清洗液。4℃保存，备用。底物液配制：试剂A和试剂B（本试剂盒中提供）1:1体积混匀，操作中加入混合液120μL/孔。用前15min配制，随配随用，注意避光。4℃保存，备用。IFN-γ标准品的配制：在IFN-γ标准品粉末中加入2.0mL的稀释液RD6-3（本试剂盒提供），混匀，终浓度为2500pg/mL。取7个1.5mL的EP管，每管中加入300μL稀释液RD6-3，吸取300μL的2500pg/mL最高标准品浓度，进行2倍连续稀释，得到1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156pg/mL、78pg/mL、39pg/mL、0pg/mL（稀释液RD6-3）的标准品浓度梯度。（2）具体步骤：a）：将所有试剂和待检血清取出，室温放置5min。计算好样品孔数后，将多余的微孔板条去下，加入干燥剂后，密封保存，备用。b）：向ELISA板中加入50μL/孔的稀释液RD1-51。c）：将标准品梯度、对照组和待检血清样品加入到ELISA板中，100μL/孔，粘合带封板，水平摇床上室温孵育2h。记录好样品和标准品对应的位置。d）：弃去液体，用1×清洗液洗板5次，最后一次在洗水纸上拍干。e）：加入200μL/孔的IFN-γConjugate试剂（本试剂盒提供），粘合带封板后，在水平摇床上室温孵育1h。f）：弃去液体，用1×清洗液洗板5次，最后一次在洗水纸上拍干。g）：加入200μL/孔的链霉亲和素-HPR标记的IFN-γ（本试剂盒提供），粘合带封板后，在水平摇床上室温孵育30min。h）：弃去液体，用1×清洗液洗板5次，最后一次在洗水纸上拍干。i）：试剂A和试剂B（本试剂盒中提供）1:1体积混匀，配制底物溶液，加入混合液120μL/孔，室温孵育30min，注意避光。j）：直接加入120μL/孔的终止液（本试剂盒提供），轻摇混匀，终止反应。k）：30min内在酶标仪上检测OD450值。（3）待检血清浓度测定：以标准品梯度浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，得出标准曲线的线性回归方程式。根据样品的OD值，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为待检血清的实际浓度。4.2.5猪攻毒试验及保护率检测18头猪免疫第四周后转移至中国农业科学院兰州兽医研究所P3动物舍，隔离1天后，进行攻毒试验。耳后颈部肌肉注射1000LD50（50%infectivedose，LD50）O型FMDVO/BY/CHA/2010毒液（毒价前期已测定），1mL/头。每天观察记录，注意动物蹄部和吻突处有无水泡、蹄部温度以及动物行动情况，并计算保护率。猪发病情况为：口腔黏膜和蹄部等处皮肤发生水泡和溃烂，跛行，肘关节着地爬行等现象。29 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响4.3试验结果4.3.1FMDV特异性抗体水平猪免疫后每周采血，利用中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒测定猪血清中FMDV抗体水平（图4.3）。结果表明，与对照组相比，免疫组抗体水平在免疫后第2周时都显著增加，VLPs+ISA201组抗体水平增长幅度最大（2倍），抗体水平也最高。所有免疫组的抗体水平在第三周时达到最高，第四周时抗体水平都有所下降，且VLPs+ChitosanA组下降的最快。整个免疫过程中，VLPs+ISA201组抗体滴度都处于最高的水平。虽然在免疫后前三周，VLPs+ChitosanA组抗体水平都高于VLPs+ChitosanB组，但是VLPs+ChitosanB组抗体水平一直都在增加，且达到最高后水平几乎不变。因此，ChitosanB佐剂可以维持VLPs体液免疫应答的作用，比ChitosanA佐剂具有更好的应用前景。图4.3猪FMDV特异性抗体动态变化水平Fig4.3Dynamicchangeoftheantibodylevelinpigspostvaccination4.3.2FMDV中和抗体水平通过病毒中和试验（Virusneutralizationtest，VNT）来检测猪血清中的中和抗体效价（图4.4）。免疫后前二周与间接液相阻断ELISA检测的特异性抗体结果保持一致，免疫组中和抗体水平都升高，且ISA201佐剂组中和抗体水平最高。但是第三周时，ISA201和ChitosanA两个佐剂组中和抗体水平都有所下降，但是ChitosanB佐剂组中和抗体水平却显著升高，达到最高水平。第四周时，所有免疫组中和抗体水平都降低。从特异性抗体水平中和抗体水平可知，ChitosanB佐剂能更好地维持VLPs产生较高的抗体水平，具有较好的免疫增强作用，提高免疫动物抵抗FMDV的侵袭。30 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响图4.4猪免疫后中和抗体效价Fig4.4Neutralizingantibodytitersofthepigspostvaccination4.3.3细胞因子的检测猪免疫前以及免疫后每周采血并分离血清，利用美国R&DSytems公司的猪血清定量ELISA检测试剂盒，检测血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量（图4.5）。免疫后一周和四周时，IL-6含量在所有疫苗组中都有所升高，且ChitosanA和ChitosanB佐剂组中，含量能维持较高的水平；在ChitosanB佐剂组中，IL-8能在免疫后维持很高的水平（＞500pg/mL），ChitosanA次之；IL-10在免疫一周后，三个佐剂组中的含量都显著升高，第四周时，ChitosanA和ChitosanB佐剂组IL-10含量继续升高，但是ISA201佐剂组却下降；免疫一周后，IL-12的含量在所有的佐剂组中的含量都呈现升高的趋势，但只有ChitosanB佐剂组中IL-12含量在免疫后四周仍继续升高，保持较高的水平（＞2700pg/mL）。TNF-α的含量在ISA201和ChitosanB两个佐剂组中几乎不变，但是在ChitosanA佐剂组中却保持很高的水平，在第二周时达到最高值（＞500pg/mL）。在免疫后，IFN-γ的含量在ChitosanA和ChitosanB两个佐剂组中升高，且在ChitosanB佐剂中的含量最高，ISA201佐剂组不能诱导产生IFN-γ细胞因子。31 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响图4.5猪免疫后外周血细胞因子变化水平Fig4.5Changesofcytokinesinperipheralbloodinpigsafterimmunization32 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响4.3.4猪攻毒后保护率18头猪免疫后第四周转移至中国农业科学院兰州兽医研究所P3动物舍，隔离1天后，进行攻毒试验。猪发病情况为：口腔黏膜和蹄部等处皮肤发生水泡和溃烂，跛行，肘关节着地爬行等现象。每天观察记录，并计算保护率（表4.1）。ISA201佐剂组的猪均未发病，保护率为100%；ChitosanB佐剂组的保护率（60%）高于ChitosanA佐剂组（40%）。这初步说明，ChitosanB佐剂的免疫增强作用要好于ChitosanA佐剂，ChitosanB佐剂是一种更好发展前途的佐剂。表4.1猪免疫后保护率Table4.1Protectionrateofthepigspostvaccination分组动物编号发病部位保护天数保护率VLPs+ISA2013254未发病，保护10d5/5（100%）3261未发病，保护10d3918未发病，保护10d3284未发病，保护10d3218未发病，保护10dVLPs+ChitosanA3735左后脚首先潮红，跛行。3d2/5（40%）3787未发病，保护10d3732左后脚出现水泡4d3958左后脚出现水泡4d3933未发病，保护10dVLPs+ChitosanB3777未发病，保护10d3/5（60%）3231两只后脚以及右前脚出现水泡4d3292未发病，保护10d3937右后脚出现水泡，有液体渗出6d3743未发病，保护10d对照组3739右后脚出现水泡2d0/3（0）3800右前脚变红2d3359左前脚出现水泡2d4.4结论T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。根据成熟T细胞表面抗原标志，可将T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两大亚群，根据细胞因子产生和功能的不同，CD4+T细胞又可分为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要介导细胞内细菌及原虫的感染免疫应答，包括迟发型变态反应和活化细胞毒性T细胞（CTL），有助于杀伤胞内33 中国农业科学院硕士学位论文第四章壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs的猪免疫影响感染的细菌菌和病毒等微生物，Th1细胞分泌的代表性细胞因子为IFN-γ、IL-12和TNF-α，主要参与细胞免疫；Th2细胞主要介导细胞外多细胞寄生虫的免疫应答，刺激B细胞分泌抗体，包括特异性抗体和中和抗体，增强体液免疫应答，有利于抵御胞外菌感染，Th2分泌的特征性细胞因子主要是IL-4、IL-6和IL-10，主要参与体液免疫，两种细胞因子协同作用，共同发挥免疫学效应，保护机体抵抗外界病原体的侵袭。细胞因子检测结果显示，ISA201佐剂组主要诱导Th1型细胞因子，但却不能诱导IFN-γ的产生，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球可以同时诱导Th1型和Th2型免疫应答。此外，ChitosanA佐剂组主要诱导Th1型细胞因子，可以显著增强TNF-α的分泌水平；ChitosanB佐剂组可以同时诱导Th1型和Th2型两种免疫应答，但对TNF-α的诱导较弱，这可能是添加白油后使ChitosanB佐剂的分子特性改变的结果。但总体来说，ISA201佐剂相比，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为O型口蹄疫VLPs疫苗佐剂可同时诱导Th1型和Th2型混合型细胞免疫应答，对FMDV的入侵发挥更强、更广泛的细胞免疫应答。FMDV特异性抗体水平和中和抗体水平显示，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂能够与ISA201常规佐剂一样，增强VLPs诱导抗体的水平，但是效果要弱于ISA201佐剂。ChitosanB佐剂组高滴度的抗体水平维持的时间要长于ChitosanA佐剂组，这主要是ChitosanB佐剂组能产生Th2型细胞应答，相关因子活化并刺激B细胞分泌大量的抗体，故壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂具有双重免疫诱导机制，可同时增强VLPs疫苗的体液免疫与细胞免疫应答。壳聚糖季铵盐凝乳胶微球佐剂组的攻毒后保护率小于ISA201佐剂组（保护率为100%），但ChitosanB佐剂组的保护率（60%）却高于ChitosanA佐剂组（40%），这可能是由于不同微粒径的壳聚糖季铵盐凝乳胶微球诱导的免疫应答水平不一样，有研究表明粒径较小的微球有利于诱导高水平的免疫应答，所以还有待探究壳聚糖季铵盐凝乳胶微球粒径对免疫应答强度及应答类型的影响。34 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1、将实验室保存的VP0、VP3和VP1多质粒共转化、多抗性筛选的感受态细胞重组体，表达并纯化出了O型FMDV的衣壳蛋白，体外组装成病毒样颗粒（VLPs），并通过WesternBlotting和动态光散射仪（DLS）检测VLPs蛋白的条带大小、粒径以及均一度，证实O型口蹄疫VLPs得到正确的组装。2、壳聚糖季铵盐凝乳胶微球同ISA201常规佐剂一样，与O型FMDV的VLPs乳化后诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体，T淋巴细胞增殖效果要好于ISA201佐剂，且ChitosanB佐剂组增殖效果好于ChitosanA佐剂组，显示出壳聚糖季铵盐凝乳胶微球可增强细胞免疫和体液免疫应答。ChitosanB佐剂细胞免疫与体液免疫的增强作用要优于ChitosanA佐剂。3、与ISA201佐剂相比，壳聚糖季铵盐凝乳胶微球作为O型口蹄疫VLPs疫苗佐剂可同时诱导Th1型和Th2型混合型细胞免疫应答。35 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.厍大亮，李冬.新型兽用疫苗佐剂的研究进展[J].中国兽药杂志，2011，45（4）：44-48.2.王月琦.新型壳聚糖季铵盐凝胶微球作为流感疫苗佐剂的研究[博士学位论文].北京：中国科学院过程工程研究所，2016.3.AntonisA.F.，etal.Anovelrecombinantvirus-likeparticlevaccineforpreventionofporcineparvovirus-inducedreproductivefailure[J].Vaccine.2006.24(26):5481–5490.4.AvadiM.R.，etal.PreparationandcharacterizationofinsulinnanoparticlesusingchitosanandArabicgumwithionicgelationmethod[J].Nanomedicine-NanotechnologyBiologyandMedicine.2010,6(1):58–63.5.B.MohanaSubramanian.，etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)serotypeOvirus-like-particles(VLPs)vaccineandevaluationofitspotency[J].AntiviralResearch.2012,96(3):288–295.6.BachmannM.F.，etal.TheinfluenceofantigenorganizationonBcellresponsiveness[J].Science.1993.262(5138):1448–1451.7.BachmannM.F.，etal.Vaccinedelivery:amatterofsize,geometry,kineticsandmolecularpatterns[J].NatureReviewsImmunology.2010.10(11):787–796.8.BachmannM.F.，etal.Virus-Likeparticles:combininginnateandadaptiveimmunityforeffectivevaccination.In:Stefan,H.E.K.(Ed.),NovelVaccinationStrategies.Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.,2004.415–432.9.BachmannM.F.，etal.NeutralizingantiviralBcellresponses[J].AnnualReviewImmunology.1997.15:235–270.10.BalamuruganV.，etal.Protectiveimmuneresponseagainstfoot-and-mouthdiseaseviruschallengeinguineapigsvaccinatedwithrecombinantP1polyproteinexpressedinPichiapastoris[J].ArchivesofVirology.2005,150(5):967-79.11.BeesleyK.M.，etal.Expressioninyeastofamino-terminalpeptidefusionstohepatitisBcoreantigenandtheirimmunologicalproperties[J].Biotechnology(N.Y.).1990.8(7):644–649.12.BrancoL.M.，etal.Lassavirus-likeparticlesdisplayingallmajorimmunologicaldeterminantsasavaccinecandidateforLassahemorrhagicfever[J].VirologyJournal.2010,7:279.13.BrunA.，etal.Currentstrategiesforsubunitandgeneticviralveterinaryvaccinedevelopment[J].VirusResearch.2011,157(1):1–12.14.BrunP.，etal.Neuropeptideneurotensinstimulatesintestinalwoundhealingfollowingchronicintestinalinflammation[J].AmericanjournalofphysiologyGastrointestinalandliverphysiology.2005,288(4):G621–G629.15.BucklandB.C.Theprocessdevelopmentchallengeforanewvaccine[J].Nat.Med.2005.11(4Suppl):S16–S19.36 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光如斯，岁月如梭，转眼间三年的硕士研究生生活就要结束了，离校的时间也越来越近。遥想三年的研究生时光，经历了太多的痛苦与挫折，但同时也收获了许多的欢笑与成功。在这三年里，我不仅努力学习科学文化知识，阅读了许多与自己专业相关的文献，也积极学习各种试验操作技能，掌握了大量的试验方法和技巧。这些不仅使我加深了对科研的热爱，而且让我在面对困难时更加的自信与从容不迫。感谢我的导师马军武研究员对我生活和学习上的支持，使我安下心来坚定地进行试验。本论文的研究是在郭慧琛研究员和孙世琪研究员两位老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、思路构建、设计等各个方面，两位老师倾注了大量的心血。两位老师严谨求实的治学态度、兢兢业业的敬业精神以及孜孜不倦的工作作风，给了我深深的启迪，是我学习的楷模。在此，向以上三位老师致以衷心的感谢和崇高的敬意。在毕业论文完成之际，我要衷心感谢本实验室的张韵师姐、智晓莹博士、常燕艳师姐、郜原博士、杜平博士、魏衍全博士、茹嘉喜博士、董虎博士、韩世充博士、闫丹硕士、范许许硕士、李杰林硕士和宋品硕士，感谢他们对我耐心的指导和试验操作上的帮助。此外，也要感谢滕志东硕士、白满元硕士、李娇阳硕士、李淑萍硕士、党海霞师妹、栗康钰师弟对我试验上的帮助和支持。此外，也要感谢靳野老师、冯霞老师、吕律老师、宋娟师姐对我动物试验上的帮助；也要感谢兰州兽医研究所P3动物舍李克润等三位师傅不厌其烦的指导与帮助。最后，也要感谢2014级全班同学的关心和帮助，特别是毛乐娇、谷玲军、李春天以及我宿舍四位舍友的关心与帮助。在中国农业科学院兰州兽医研究所的两年里，帮助我的人很多，他们不仅给我了欢乐和笑语，更给了我迎接困难、勇敢挑战的勇气，使我在今后的学习和工作中更加坚定地向前进。本研究得到国家自然科学基金项目（31672592）、中央级科研院所基本科研业务费专项（1610312016002，1610312017010）和中国农业科学院青年英才计划项目等资金的支持，在此表示感谢。本论文是在中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室完成的。朱向涛2017年5月20日42 中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简介基本情况姓名：朱向涛性别：男出生年月：1989年10月籍贯：河南省洛阳市偃师市政治面貌：中共党员学习经历2010年9月~2014年7月，河南科技大学动物科技学院，获得农学学士学位2014年9月~2017年7月，中国农业科学院兰州兽医研究所，在读硕士研究生。攻读硕士学位期间发表论文1.DeyanGong,XiangtaoZhu,YuejunTian,Shi-ChongHan,MinDeng,AnamIqbal,WeishengLiu,WenwuQin,andHuichenGuo.Aphenylselenium-substitutedBODIPYfluorescentturn-offprobeforfluorescenceimagingofhydrogensulfideinlivingCells.Analyticalchemistry.2017,89(3):1801–1807.（IF=5.886）2.MinDeng,DeyanGong,Shi-ChongHan,XiangtaoZhu,AnamIqbal,WeishengLiu,WenwuQin,HuichenGuo.BODIPYbasedphenylthioureaderivativesashighlyselectiveMeHg+andHg2+ionsfluorescentchemodosimeteranditsapplicationtobioimaging.SensorsandActuatorsB:Chemical.243(2017),195–202.（IF=4.758）43
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