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分类号：密级：UDC：学号：T10411101092南昌大学同等学力申请硕士学位研究生学位论文抑制乙型肝炎病毒e抗原表达的中药研究TheStudiesonChineseHerbalMedicinewiththeInhibitionActivitiesagainsttheeAgExpressionofHepatitisBVirus白羽培养单位（院、系）：南昌大学医学院指导教师姓名、职称：刘金辉教授专业学位种类：基础医学硕士专业领域名称：病原生物学论文答辩日期：2016年5月答辩委员会主席：孙吉昌评阅人：2016年6月6日 学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师擦导下进行的研巧工作及取得的，研究成果。据我所知，餘了文中特剔加臥标注和致谢的地方外论文中不包含其他乂己经发表或撰每过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育轨一构的学栓或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贵献巧良在论文中作了明柏的说明并表示谢意，学位论文作者签名（手写）：签字曰期：八／《年各月＆日，二、学俭论文版捉使巧娱权ｆ本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学泣论文的规定，同蔥学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，免许＃或被査阅和借阅。本人授权南昌大学可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学泣论文。同时授权北京万方数据股餘有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕±学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按＂＂章程规定享受相关权益。、泣学位论文作者签名刮啼＊（手写）：＼１导师签名巧写）：刘《研签字曰期；＞，占年去月曰签字曰期；屋年＜月《曰６论文题目抑制型巧炎病韋ｅ抗原表达的中研究＾些＿＿＾６＾学号Ｔ１０４Ｈ１０１０９２论文级别博古口硕戈ｇ／院／系／所基础医学部专业Ｉ病原生物学Ｅ备—ｍａｉｌ注—■＂＂开□保密（向校学位办申请获批准为保密，年月是玄弄５ 摘要摘要乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）感染，以急、慢性肝损伤为主要临床表现，严重危害人类健康的一种传染性疾病。慢性乙型肝炎的发生发展与宿主的免疫应答、病毒的基因变异、环境以及遗传等诸多因素相关，如果长期得不到有效控制，慢性乙肝就极易发展为肝硬化和肝癌。目前国内外用于治疗慢性乙肝的药物以干扰素类及核苷类为主。这两类药物虽然通过不同作用机制对HBV产生一定的抑制效果，但其不足之处也不容忽视，比如核苷类药物引起的耐药、干扰素昂贵的价格以及不可避免的药物副作用等等。我国中医中药具有资源优势，中医治疗的理论体系也相对成熟，特别是在缓解慢性乙肝患者临床症状等方面，中药的治疗效果显著，然而，乙肝的防治重点依然是抗病毒，从中药中发掘有效的抗HBV药物及活性成分，具有潜在的研究价值。乙肝病毒基因组分为结构基因区及调节基因区两部分，结构基因区包括S、C、P和X四个开放读码框架，调节基因区则包括四个启动子（SPI，SPII，CP，XP）及两个增强子（EnhI，EnhII）。C基因在EnhII及CP调控下编码HBeAg和HBcAg两个重要病毒蛋白，HBeAg经氨基端和羧基端的剪切修饰后可分泌到肝细胞外，HBcAg则是组装病毒颗粒中衣壳的重要元件。目的构建由HBVEnhancerII+CP调控preC+C基因表达HBeAg的真核表达重组质粒，转染HepG2细胞，用中药处理转染细胞，观察中药对乙型肝炎病毒e抗原表达的抑制作用，从而筛选出具有抗HBV活性的中药。方法1、筛选出感染乙肝病毒儿童患者阳性血清一份，提取HBVDNA。2、PCR扩增HBV含EnhancerII+BCP+preC+C区域的DNA片段（HBV-C），电泳及胶回收纯化扩增产物。3、纯化后的目的基因HBV-C及质粒载体pBudCE4.1通过HindIII及XbaI双酶切，将目的基因HBV-C插入到质粒载体pBudCE4.1中，构建得到重组质粒HBV-C/pBudCE4.1。I 摘要4、通过文献筛选出45种单味中药，制备成水煎剂并稀释成4个剂量梯度备用。5、用脂质体瞬时转染的方式将HBV-C/pBudCE4.1导入人肝癌细胞HepG2。6、将制备好的中药处理HepG2细胞，利用ELISA法检测细胞培养上清液及裂解液中HBeAg的含量，HBeAg的表达量以OD值记录。7、数据用x±s表示。组间比较进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果质粒DNA测序显示表达质粒HBV-C/pBudCE4.1构建成功，质粒转染HepG2细胞后可成功表达HBeAg。抑制HBeAg表达的中药研究显示，与无中药处理的细胞对照组相比，4个剂量（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草处理的细胞培养上清液中HBeAg的含量均显著下降（P<0.01），且药物抑制效果呈现剂量-效应关系；4g/L槟榔、4g/L女贞子、2g/L阿魏、4g/L虎杖也显示使细胞培养上清液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01）；1g/L女贞子、4g/L的大黄、4g/L黄芪处理的细胞上清液中HBeAg的含量有一定下降（P<0.05）。与细胞对照组相比，4个剂量（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）剂量的白马骨及柴胡处理的细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），药物的抑制作用呈现剂量-效应关系；4g/L、2g/L、1g/L剂量的黄芩及毛鸡骨草使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），且呈现剂量-效应关系；4g/L阿魏使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01）。结论中药白马骨、黄芩、柴胡和毛鸡骨草中可能含有某些小分子成分，下调了HBV增强子II和核心启动子对前C区基因的表达启动，从而减低了乙型肝炎病毒e抗原的分泌量。关键词：中药；增强子；启动子；乙型肝炎病毒e抗原II AbstractABSTRACTHepatitisBisaninfectiousdiseasescausedbythehepatitisBvirusandisseriouslyharmfultohumanhealth,whosemainclinicalmanifestationsistheacuteandchronicdamagetoliver.ThedevelopmentofchronichepatitisBisrelatedwiththehostimmuneresponse,genevariationofthevirus,aswellasenvironmental,geneticandotherfactors.Iflong-termlackofeffectivecontrol,thechronichepatitisBcaneasilydevelopintothelivercirrhosisandlivercancer.DrugsforthetreatmentofchronicHepatitisBathomeandabroadismainlyinterferonandnucleoside.ThesetwokindsofdrugscanproducecertaininhibitioneffectsonHBVindifferentmechanisms.Itsshortcomingsarealsoeasytoignore.Forexample,Nucleosidedrugscancausedrugresistance,interferonisexpensiveandbothofthemcanleadtoinevitabledrugsideeffects.TraditionalChinesemedicineinourcountryhastheresourcesadvantageandthetheoreticalsystemofTCMtreatmentisalsorelativelymature.InalleviatingclinicalsymptomsinpatientswithchronicHepatitisB,Chinesemedicinetreatmenteffectisremarkable.However，thekeyofHepatitisBpreventionandcontrolisstillanti-virus.ChinesetraditionalmedicineisoneofthefeasiblewaytoexploreeffectiveantiHBV，whicharepotentialresearchvalue.HepatitisBvirus(HBV)genomeisdividedintotwoparts:structuralgenesandregulatorygene,thestructuralgeneareaincludingS,C,PandXfouropenreadingframes,regulategeneareaincludesfourpromoter(SPI,SPII,CP,XP)andtwoenhancer(EnhI,EnhII).UnderthecontrolofEnhIIandCP,Cgenecodestwoimportantviralproteins,HBeAgandHBcAg.HBeAgcanbesecretedtotheoutsideofthelivercellsaftermodifiedataminoandcarboxylend,HBcAgiscapsidcomponentsinvolvingassembleofvirusparticles.ObjectiveTherecombinantplasmidexpressingpreC+CgeneundercontrolofEnhancerII+BCPisconstructedandtransfecttheHepG2cells.ThetransfectedcellsIII AbstractaretreatedwithChineseherbalmedicinestoscreenthetraditionalChinesemedicinewithactivityangainstHBVeantigenexpression.Methods1.ExtractHBVDNAfromserumofachildpatientwithpositiveHBVinfection.2.AmplyHBVEnhancerII/BCP+preC+CareawithPCRmethodandpurifytheamplifiedHBVDNAproduct.3.InsertthepurifiedHBV-CtargetgeneintotheplasmidvectorpBudCE4.1toconstructetherecombinantplasmidHBV-C/pBudCE4.1.4.45kindsofsingleherbarescreenedbylookingattheliteraturetoprepareadecoctionanddiluteto4dosesgradientforspare.5.TransfecttherecombinantplasmidHBV-C/pBudCE4.1intoHepG2cellsbyusingtheliposometransienttransfectionmethod.6.UsethepreparedtraditionalChinesemedicinetotreattheHepG2cells;detectthelevelofHBeAginCellculturesupernatantandlysatesbyELISA;recordandanalysistheODdatabyusingtheSPSS19.0software.7.Thedataareexpressedinx±s.Comparisonbetweengroupisconductedbyttest.DifferencewasstatisticallysignificantwhenP<0.05isfound.ResultsTheDNAsequencingshowedthattherecombinantplasmidHBV-C/pBudCE4.1isconstructedsuccessfully.ComparedtothecellinthecontrolgroupwithouttheprocessingofthetraditionalChinesemedicines,in45kindsoftraditionalChinesemedicines,thecontentofHBeAginthecellculturesupernatant,whichwasprocessedthrough4doses（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）ofserissaserissoides,radixscutellariae,thorowaxandabrusmollishance,alldecreasedsignificantly（P<0.01）.Moreover,thecontroleffectofthemedicineappearedthedose-responserelationship.4g/Lofsemenarecae,4g/Lofligustrumlucidumait,2g/Lofferulaand4g/LofpolygonumcuspidatumalsodecreasedtheHBeAgcontentinthecellculturesupernatantsignificantly（P<0.01）.ThecontentofHBeAginthecellculturesupernatant,whichisprocessedthrough1g/Lofligustrumlucidumait,4g/Lofrhubarband4g/Lofradixastragali,decreasedtosomeextent（P<0.05）.IV AbstractComparedwiththecellinthecontrolgroup,thecontentofHBeAgincelllysates,processedthrough4doses(4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）ofserissaserissoidesandthorowax,decreasedsignificantly（P<0.01)andthecontroleffectofthemedicineappearedthedose-responserelationship.4g/L,2g/Land1g/LofradixscutellariaeandabrusmollishancedecreasedtheHBeAgcontentincelllysatessignificantlyandtheyappearedthedose-responserelationship.4g/LofferuladecreasedtheHBeAgcontentincelllysatessignificantly(P<0.01).ConclusionInthetraditionalChinesemedicinesserissaserissoides,radixscutellariae,thorowaxandabrusmollishance,somesmallmoleculesingredientsmaybecontainedtoinhibittheHBeAgexpressionbyregulatingHBVenhancerIIandcorepromoteractivities,thenreducethesecretionofthehepatitisbviruseantigen.Keywords:Chineseherbalmedicine;enhancer;promoter;hepatitisBviruseantigenV 目录目录第1章引言...............................................................................................................1第2章实验材料.........................................................................................................62.1基本材料.........................................................................................................62.2主要仪器.........................................................................................................62.3主要试剂.........................................................................................................7第3章实验方法.........................................................................................................93.1HBV-C/pBudCE4.1重组质粒的构建............................................................93.1.1HBV-C的引物设计与合成...................................................................93.1.2HBVDNA的提取.................................................................................93.1.3PCR扩增HBV-C基因..........................................................................93.1.4HBV-C基因回收纯化.........................................................................103.1.5HBV-C、pBudCE4.1的双酶切及产物回收......................................113.1.6HBV-C基因与pBudCE4.1质粒的连接............................................113.1.7大肠杆菌DH5α的转化......................................................................123.1.8重组质粒的抽提..................................................................................123.1.9重组质粒的鉴定..................................................................................133.2人肝癌细胞HepG2的培养..........................................................................133.2.1细胞复苏.............................................................................................133.2.2细胞传代.............................................................................................143.3药物实验.......................................................................................................143.3.1中药的制备..........................................................................................143.3.2细胞转染..............................................................................................143.3.3中药对HepG2细胞培养上清液中HBeAg的抑制实验..................153.3.4中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg的抑制实验..........................153.3.5ELISA检测HBeAg的含量...............................................................153.3.6统计分析..............................................................................................16第4章结果.............................................................................................................17VI 目录4.1HBV-C基因PCR扩增结果..........................................................................174.2HBV-C、pBudCE4.1双酶切产物鉴定结果................................................174.3重组质粒HBV-C/pBudCE4.1的酶切鉴定结果.........................................184.4重组质粒DNA测序结果..............................................................................194.5中药对HepG2细胞培养上清液中HBeAg的表达抑制作用....................194.6中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg的表达抑制作用............................24第5章讨论.............................................................................................................29第6章结论.............................................................................................................34致谢.........................................................................................................................35参考文献.....................................................................................................................36附录.......................................................................................................................40攻读学位期间的研究成果.........................................................................................44综述.......................................................................................................................45VII 缩略词表缩略词表缩略词英文中文ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷BCPBasiccorepromoter基本核心启动子bpBasepairs碱基对BSABovinealbumin牛血清白蛋白CHBChronichepatitisB慢性乙型肝炎ddH2ODoubledistilledwater去离子水DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EBethidiumbromide溴化乙锭ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验EnhIIEnhancerII增强子IIHBcAghepatitisBcoreantigen乙型肝炎病毒核心抗原HBeAghepatitisBeantigen乙型肝炎病毒e抗原HBsAghepatitisBsurfaceantigen乙型肝炎病毒表面抗原HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒HBVhepatitisBviruscovalentlyclosed乙型肝炎病毒共价闭合cccDNAcircularDNA环状DNAminminute分钟mlmilliliter毫升mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸ntnucleotide核苷酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应rpmrevolutionsPerminute转数/分钟SecSecond秒TAETris/acetateelectroPhoresis(buffer)Tris/乙酸电泳缓冲液TaqThermus-aquaticusDNA(Polymerase)耐热DNA聚合酶ugMicrogram毫克ulmicroliter毫升VVolt伏特VIII 第1章引言第1章引言乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）最早于1963年在澳大利亚土著人身上被发现，是一种具有特殊结构的嗜肝DNA病毒，人体感染乙肝病毒后可引起肝脏的急慢性炎性改变，而慢性乙型肝炎（CHB）更可发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。HBV具有传染性强、传播途径复杂、流行面广、发病率高、难以治愈等特点，它的存在已经对人类的生命健康构成了极大的威胁。据统计，全球每年约有100万人死于HBV感染的各种相关疾病，且该数字还在呈逐年递增的趋势。我国约有1亿人感染HBV，是乙肝病毒感染人数最多的国家，如何从各个环节有效地进行乙型病毒性肝炎的防治，是我们亟待解决的问题。HBV基因组全长约3.2kb，是部分双链的环状DNA病毒。双链中，长链为负链，其与病毒mRNA互补，具有HBVDNA的全部的遗传信息；短链为正链，因其3′端不固定，故其长度可变。HBV通过与肝细胞膜上的特异性受体结合，脱去包膜进入肝细胞内，感染肝细胞；而后在肝细胞胞浆内，HBV基因组的核衣壳脱去，HBVDNA进入肝细胞核，在HBVDNA聚合酶的作用下，以负链为模板延伸正链，修补基因缺口部分，形成共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA），再以cccDNA为模板，通过RNA聚合酶转录成各种不同功能的mRNA，其中前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA)具有HBVDNA的全部遗传信息，它可通过HBV逆转录酶及DNA聚合酶的作用形成子代部分双链环状DNA，进入到肝细胞核后继续HBVDNA的复制，也可最终装配成完整的HBV，释放到肝细胞外。HBV基因组具有结构基因和调节基因两部分，其结构基因区含S、C、P和X四个开放读码框架(openreadingframe,ORF)，各开放读码框架之间互有重叠，分别编码表面抗原（PreS1、PreS2及S）、核心抗原（PreC、C）、核酸聚合酶及X蛋白；而调节基因区则包括四个启动子（SPI，SPII，CP，XP）及两个[1]增强子（EnhI，EnhII）。HBVC区基因通过其开放读码框架内的第1个和第2个起始密码子序列划分为前C基因区及C基因区，分别位于nt1814-1900区域和nt1901-2450区域；基本核心启动子（basalcorepromoter，BCP）位于nt.1751–1769区域，BCP与1 第1章引言其上游的核心上游调节序列（CURS）共同构成核心启动子（corepromoter，CP）；增强子II（enhancerII，EnhII），位于nt.1636–1741区域，处于BCP上游，[2]与CURS部分重叠；EnhII通过激活其BCP的转录效率及转录功能，与BCP共同调控下游HBVC基因的表达：EnhII与BCP控制起始位点不同的两种3.5kbmRNA的转录，分别是preCmRNA和pgRNA；preCmRNA与核糖体作用后，从位于nt1814的第1个密码子起始翻译，合成乙型肝炎病毒e抗原（hepatitisBeantigen，HBeAg）的前体——前C蛋白,其含有全部的核心蛋白（hepatitisBcantigen，HBcAg）编码序列和HBeAg分泌所必需的信号引导序列；pgRNA由位于nt1901的第2个密码子起始翻译，合成核心抗原HBcAg，pgRNA可逆转录出HBV基因组DNA，参与病毒的复制。HBcAg和基因组DNA是病毒核衣[3-4]壳中的重要成分，是病毒感染细胞的关键。图1.EnhII/BCP/preC基因结构图HBeAg在调节HBVDNA的复制以及诱导机体的免疫耐受方面具有重要作用。一方面，HBeAg通过HBe/cAg抗原决定簇，诱导宿主免疫应答。另一方面，HBeAg又可抑制T细胞的细胞毒活性，使宿主对HBV产生免疫耐受；此外，由于HBeAg与HBcAg具有大量的共同序列，人在感染HBV后，HBeAg可转移肝细胞原本针对HBcAg产生的免疫攻击，引起细胞免疫耐受；HBeAg还可以通过胎盘屏障，抑制胎儿体内Th细胞的功能，导致新生儿阶段起，HBV就处于逃避免疫清除的状态；而在成年期，机体在长期免疫压力的作用下，易发2 第1章引言生前C区的基因变异，HBeAg的表达减低，病毒与机体免疫系统的相互作用更加复杂，使病情加重。HBeAg虽不是HBVDNA复制所必须的蛋白，但其随HBV的复制而增加，HBeAg阳性的HBV感染者较HBeAg阴性感染者具有更高的HBVDNA复制活力，其持续阳性也会增加慢性乙肝病人患肝硬化及肝癌[5]的风险，因此，临床上将HBeAg作为判断HBV活动性复制的指标之一，同时，HBeAg也是判断慢性乙肝药物疗效的重要指标。目前国内外临床上常用的抗HBV感染的治疗药物包括核苷（酸）类似物及细胞因子类药物。核苷（酸）类似物包括核苷类及核苷酸类药物，拉米夫定（lamivudine,LAM）、恩替卡韦（entecavir,ETV）和替比夫定（tebivudine,LdT）属于核苷类药物，阿德福韦酯（adefovirdipivoxil,ADV）和富马酸替诺福韦酯（tenofovirdisoproxilfumarate,TDF）属于核苷酸类药物。核苷（酸）类似物药物的主要作用机制是模拟天然核苷（酸）的结构，通过与ATP竞争性地嵌入乙肝病毒DNA链，抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶活性，终止DNA链的合成，从而抑制病毒复制。此类药物虽然起效快，但由于无法彻底清除肝细胞核内的[6]cccDNA，所以停药后极易出现反弹及耐药；细胞因子类药物主要指的是干扰素类，包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素(PEG干扰素)。干扰素类药物具有免疫调节和抗病毒的双重作用，其主要机制是通过与相应受体结合，促使抗病毒蛋白基因生成抗病毒蛋白，调节T淋巴细胞及B淋巴细胞的免疫功能，间接发挥其抗病毒作用，使病毒的复制、组装和释放受阻，产生广谱抗病毒疗效，但干扰素价格昂贵，副作用大，易导致白细胞及血小板减低、发热、皮肤瘙痒等[7]不良反应，且经干扰素治疗后的病人的长期有效率也不足50%。我国慢性乙型肝炎防治指南（2010年版），将普通干扰素、拉米夫定、阿得福韦酯、替比夫定和恩替卡韦列为抗HBV治疗的一线药物，并且为了使耐药的风险降至最低，推荐所用药物应具备强效性、低耐药性和高安全性；尽管如此，我国的用药情况并不乐观，除了部分医生由于用药不规范，病程早期即联合用药、单药序贯治疗及不合理换药等，导致病人出现耐药外，我国经济收入水平普遍偏低、医保用药受限，使病人对乙型肝炎治疗需要较长周期这一概念的认可度较差，接受治疗的过程依从性差，而出现自行停药或者随意换低价高耐药药物的情况，也是使得西药抗HBV治疗有一定困难的原因。我国自古以来就有中医治疗肝病的传统，几千年前的中医古籍《金匮要略》、《伤寒论》、《瘟疫论》、《千金方》等就记载了大量治疗肝病的经典方剂，如为3 第1章引言我们所熟知的“小柴胡汤”、“茵陈篙汤”、“大黄䗪虫丸”、“逍遥散”、“达原饮”、“芍药甘草汤”等，都一直被延用至今。中医治疗讲究望闻问切，辩证施治，相对西医而言，中医并不针对病原体，而是根据疾病的临床证候表现，按照中医理论划分病因，配伍用药治疗，中医认为乙肝多为湿热疫毒、肝郁脾虚所致，所以用药以清热、解毒、疏肝、健脾、利湿为主。随着现代中医学者们对HBV致病机制的深入了解，以及通过对中医治疗慢性肝炎临床效果的观察，不断地积累经验，优化经典、经验方剂的药物配伍，使用药更加变得有针对性。虽然中药在提高乙肝患者免疫力、降低血清生化指[8-9]标以及改善肝纤维化等临床症状方面确实取得了不错的效果，但对于乙肝防治的重点难点，国内外普遍认为依然是如何抗病毒，特别是如何彻底清除关键的HBVcccDNA。自20世纪80年代印度学者Thyagarajan研究发现苦味叶下珠具有抗乙肝病毒效果以来，从天然植物中进行有效抗乙肝病毒药物的筛选，一直都是国内外学者研究的热点问题。我国幅员辽阔，各类天然资源丰富，据统计，我国植物[10]来源、动物来源及矿物来源的中药材资源总共约有12000种，其中植物来源的中药占了约90%，而面对HBV复杂的基因结构及感染机制，如何利用中药资源，合理地筛选出具有抗HBV活性的中药，需要我们多层面、多途径、多靶点的进行药效学实验研究。中医临床用药一直以复方汤剂为主，其用药形式符合中医整体治疗的理念，但是复方汤剂成分复杂，制备过程也容易产生多种物理反应及化学反应，不利于研究人员对其有效成分进行科学系统分析。而单味中药是复方汤剂的组成基础，其成分相对单一，使用单味中药进行抗乙肝病毒的药效学实验，实验过程所受干扰相对较小，易于实验数据的分析；同时，有效抗HBV单味中药的存在也是下一步筛选有效抗HBV活性成分的前提。长远来看，从各层面对单味中药进行科学系统的分析，对充分利用我国中医药资源治疗乙肝具有重要的研究价值。本课题利用PCR法扩增HBVEnhancerII+BCP+preC+C区基因组序列，通过电泳分离目的基因HBV-C并进行DNA的回收与纯化，将纯化后的HBV-CDNA与质粒pBudCE4.1使用限制性内切酶HindIII及XbaI进行双酶切，酶切产物通过T4-连接酶连接，制备得到重组质粒HBV-C/pBudCE4.1，通过脂质体瞬时转染的方式将该重组质粒转染入人肝癌HepG2细胞，使用45种不同剂量的单味中药水煎剂处理HepG2细胞，观察药物对HepG2细胞分泌乙型肝炎病4 第1章引言毒e抗原（HBeAg）的影响，初步筛选具有抑制HBVEnhII及BCP活性，降低下游preC+C区基因的表达产物e-Ag的中草药。5 第2章实验材料第2章实验材料2.1基本材料2.1.1研究样本收集江西省儿童医院确诊感染乙肝病毒儿童血清标本一份。患者基本情况：男，6岁,HBsAg(+)、抗-HBs(-)、HBeAg(+)、抗-HBe(-)、抗-HBc(+)、HBVDNA(+)。2.1.2细胞株人肝癌细胞HepG2，由南昌大学微生物实验室传代保存。2.1.3质粒载体pBudCE4.1，由南昌大学微生物实验室构建保存。2.1.4菌株大肠杆菌DH5α，由南昌大学微生物实验室制备保存。2.1.5药物45种单味中药：白背根叶、鱼腥草、甘草、茯苓、白马骨、槟榔、羊蹄根、蒲公英、茵陈、溪黄草、积雪草、柴胡、老鹳草、毛鸡骨草、女贞子、苦参、半枝莲、黄芪、荔枝核、青蒿、益母草、黄芩、三尖杉、天花粉、石榴皮、阿魏、香薷、白芍、淫羊藿、连翘、莪术、黄连、大青叶、虎杖、一支蒿、白花蛇草、鸡血藤、王不留行、十大功劳、金钱草、大黄、扯根菜、金银花、绿茶、青钱柳。均购自江西省中医院药房。2.2主要仪器生物安全柜美国Thermo公司MultiskanMK3全自动酶标仪美国Thermo公司CO2细胞培养箱美国Nuaire公司PTC-200PCR仪美国MJ公司微量移液器德国Eppendorf公司EBA21/1004普通离心机德国Hettich公司6 第2章实验材料MS3basicIKA旋涡混合器德国IKA集团MDF-38IF超低温冰箱日本SANYO公司OlympusIX71倒置显微镜日本Olympus公司GL-16G型台式高速离心机中国上海安亭科学仪器厂AL-104电子天平中国上海恒刚仪器仪器有限公司电热恒温培养箱中国上海跃进医疗器械厂全自动立式电热压力蒸汽灭菌器中国上海博迅有限公司医疗设备厂电热恒温水浴箱中国上海医疗器械三厂恒温培养震荡器中国上海智城分析仪器制造有限公司DYY-6C电泳仪中国北京六一仪器厂DYCP-310N电泳槽中国北京市六一仪器厂VILBERLOURMAT自动凝胶成像仪中国艾拓思实验设备有限公司WD800型微波炉中国Galanz集团BC-163D立式冰箱中国Haier集团2.3主要试剂D6945PlasmidMiniKitII美国OMEGA公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒美国OMEGA公司RPMI1640培养基美国Gibco公司DMEM培养基美国Gibco公司小牛血清美国Gibco公司胰蛋白酶美国Gibco公司EasyTaqPCRSuperMix北京Transgen生物科技有限公司Trans2KDNAMarker北京Transgen生物科技有限公司Trans2KplusDNAMarker北京Transgen生物科技有限公司ddH2O北京Transgen生物科技有限公司T4DNA连接酶大连Takara宝生物工程有限公司HindIII大连Takara宝生物工程有限公司XbaI大连Takara宝生物工程有限公司BSA北京Solarbio科技有限公司7 第2章实验材料琼脂粉北京Solarbio科技有限公司EB染液北京Solarbio科技有限公司DNA提取液中山大学达安基因股份有限公司DNA浓缩液中山大学达安基因股份有限公司GT707脂质体转染试剂盒中国深圳伟通生物科技有限公司乙型肝炎病毒e抗原酶联免疫试剂盒中国北京新兴四寰生物技术有限公司8 第3章实验方法第3章实验方法3.1HBV-C/pBudCE4.1重组质粒的构建3.1.1HBV-C的引物设计与合成为合成目的基因HBV-C，根据HBVEnhancerII+BCP+preC+C区基因序列，使用primerpremier5.0软件设计扩增及测序引物各一对，并由上海invitrogen公司合成。引物序列如下：引物名称引物序列（5′—3′）位置扩增引物IF3CCCAAGCTTGGAGACCACCGTGAACGC1607-1627nt（下划线部分为酶切位点HindIII）扩增引物IR3TGCTCTAGAGCAGGAATACTAACATTGA2461-2445nt（下划线部分为酶切位点XbaI）测序引物BFGAACCCACTGCTTACTGGCT609—629nt测序引物BRGGTATGCAGATTCAGATCCT760—741nt3.1.2HBVDNA的提取将该儿童样本血清及试剂盒中的阴性对照血清各50µl分别加入到0.5ml无菌EP管中，再各加入50μlDNA浓缩液，振荡数秒混匀；室温下12000rmp离心10min，弃上清；于沉淀中分别加入20ulDNA提取液，振荡数秒混匀，12000rmp离心10s；封口，置100℃恒温水浴箱10min；12000rmp离心5min，吸取上清液于无菌EP管中，4℃保存备用。3.1.3PCR扩增HBV-C基因（1）PCR反应体系:HBVDNA3ulIF32ulIR32ulPCRMastermix25ulddH2O18ul9 第3章实验方法Total50ul（2）PCR反应循环条件：预变性94℃5min变性94℃45sec退火55℃45sec35cycles延伸72℃90sec再延伸72℃10min（3）PCR产物电泳于三角烧瓶中加入0.5g琼脂粉及50mlTAE缓冲液煮沸，室温冷却到65℃左右后加入0.5ug/mlEB1ul混匀，配制成1%琼脂糖凝胶；待凝胶冷却凝固后进行点样1ul/孔，确认点样孔朝向负极，150mA/120V电泳30min；产物与标准Trans2KDNAMarker条带进行比较，于凝胶成像仪中观察结果。3.1.4HBV-C基因回收纯化⑴电泳结束后，戴保护镜，于紫外灯下切下目的条带，放入1.5ml离心管管中；⑵分别称取装有目的条带的离心管以及空离心管的重量，相减求出目的条带凝胶块的重量，并近似地确定其体积（以1mg=1ul计算）；⑶加入等倍凝胶体积的BindingBuffer，将混合物置于60℃水浴，每隔2-3分钟混匀一次，直至凝胶完全融化；⑷将700μl凝胶溶液转移入HiBindTMDNA柱子，并把柱子装在一个干凈的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去滤液；⑸将柱子套回收集管中，加300μlBindingBuffer至HiBindTMDNA柱子中，室温下，10,000×g离心1min，弃去滤液；⑹将柱子套回收集管中，加入700μlSPWWashbuffer至HiBindTMDNA柱子中，室温下，10,000×g离心1min，弃去滤液。此步骤需重复三次；⑺弃去滤液，将柱子重新套回收集管中，13,000×g离心2min，以甩干柱基质残余的液体；⑻将柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入50μl洗脱液，13,000×g10 第3章实验方法离心1min，得到的上清液即为纯化的DNA产物，-20℃保存。3.1.5HBV-C、pBudCE4.1的双酶切及产物回收利用限制性内切酶HindIII及XbaI对目的基因HBV-C的PCR产物及质粒载体pBudCE4.1进行双酶切反应，反应体系如下：（1）目的基因酶切体系：’目的DNA6ulHindIII2ulXbaI2ulBufferM4ulBSA4ulddH2O22ulTotal40ul37℃恒温箱反应5h（2）质粒酶切体系：pBudCE4.1DNA7ulHindIII1.5ulXbaI1.5ulBufferM3ulBSA3ulddH2O14ulTotal30ul37℃恒温箱反应5h（3）双酶切产物电泳及回收将双酶切产物用1%琼脂糖凝胶，150mA/120V电泳30min，然后进行产物凝胶回收（实验过程参看本章节3.1.3及3.1.4），并分别检测目的基因及质粒的浓度。3.1.6HBV-C基因与pBudCE4.1质粒的连接通过T4DNA连接酶将HBV-C基因插入pBudCE4.1质粒中，连接体系如下：pBudCE4.12.0ulHBV-C4.0ul10×LigationBuffer2.5ulT4DNALigase1.0ulddH2O15.5ul11 第3章实验方法Total25ul16℃孵育12h3.1.7大肠杆菌DH5α的转化⑴将前期通过CaCl2法制备的感受态大肠杆菌保菌管1支，从-80℃超低温冰箱中取出，并置于冰中溶解；⑵使用无菌移液器将100ul感受态菌液吸入无菌管中，之后加入10ul连接产物并轻轻旋转混匀，冰浴30min；⑶接着于42℃的循环水浴中，热激1min，再快速冰浴2min；⑷加入500ulSOC培养液，于恒温震荡培养器中37℃培养2h；⑸取出后将菌液4000×g低速离心30s，弃上清；⑹取沉淀涂布在SOB（zeocin）平板上，待菌液被吸收后倒置于37℃培养箱培养16h；⑺观察菌落，分别挑取单个可能阳性菌进行菌落PCR鉴定，初步判断其是否含有目的条带；⑻挑取阳性单个菌落加入到含有10mlSOB（zeocin）培养液的无菌离心管中，37℃剧烈振荡过夜，-80℃常规菌液保种。3.1.8重组质粒的抽提⑴将带有重组质粒的大肠杆菌接种于10mlLB/抗生素培养液中，37℃剧烈震荡过夜；⑵将菌液室温下10000×g离心1min，弃上清，收集沉淀；⑶加入250µlSolutionI/RNaseA混和液，漩涡振荡重悬细菌；⑷往重悬混和液中加入250µlSolutionII，轻轻颠倒混匀4-6次；⑸室温下10000×g离心10min；⑹转移上清液至套有2ml收集管的HiBindMiniprepColumn(II)中，室温下10,000×g离心1min，弃去滤液；⑺把柱子装回收集管，加入500µlHBBuffer，室温下10000×g离心1min，弃去滤液；12 第3章实验方法⑻把柱子装回收集管，加入700µlDNAWashBuffer，室温下10,000×g离心1min，弃去滤液（重复此步骤一次）；⑼弃去滤液，把柱子装回收集管，13000×g离心空柱2min以甩干柱子基质；⑽把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入50µlElutionBuffer到柱子基质中，静置1-2min，13000×g离心1min洗脱出DNA。3.1.9重组质粒的鉴定3.1.9.1重组质粒的酶切鉴定（1）为确定重组质粒是否构建成功，将重组质粒用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，酶切位点见附录图A，酶切反应体系如下：HBV-C/pBudCE4.14ulHindIII1ulXbaI1ulBufferM2ulddH2O12ulTotal20ul37℃恒温箱反应5h（2）将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过与标准Trans2KplusDNAMarker条带进行比较，观察实验结果。3.1.9.2重组质粒基因序列的测定将重组质粒连同测序引物送往上海invitrogen生物科技有限公司进行测序，将所获得的基因序列导入Chromas软件，分析结果。3.2人肝癌细胞HepG2的培养3.2.1细胞复苏⑴由液氮中取出冻存的HepG2细胞管，于37℃水浴中，迅速轻轻晃动，1min内使其溶解成细胞悬液；⑵用70%酒精棉球消毒后打开细胞冻存管，用1ml吸管轻轻吸出细胞悬液到细胞培养瓶中，将已经37℃预热的RPMI1640培养基（含10%灭活的新生小牛血清）加入细胞培养瓶，轻轻吹打混匀；13 第3章实验方法⑶将细胞培养瓶放入37℃，5%CO2培养箱中培养；⑷观察细胞贴壁情况，及时更换培养液，然后进行常规培养。3.2.2细胞传代⑴细胞生长的汇合度达到85%左右时，将传代细胞用PH7.2的无菌PBS液冲洗3次，加入lml0.25%的胰蛋白酶消化液，置37℃，5%CO2培养箱中消化1-2min；⑵于倒置显微镜下观察细胞形状，当细胞收缩变圆时，吸出消化液，加入完全培养液终止消化，并用移液枪轻轻吹打成细胞悬液；⑶将细胞悬液移入带盖无菌刻度离心管，1000rpm离心4min，弃上清，加入完全培养液反复吹打均匀；5⑷细胞计数后，用完全培养液将细胞调整至密度为1×10/ml的单细胞悬液，以每孔1ml接种于24孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱培养24h。3.3药物实验3.3.1中药的制备将所有中药分别用小钢磨粉碎，用电子天平准确称量50g，加入1000ml容量的三角烧瓶，第1次用10倍量约500ml去离子水浸泡过夜，加热至沸，改用文火煎煮1h，用8层无菌纱布过滤；第2次滤渣用8倍量去离子水文火煎煮1h，同法过滤；第3次用8倍量去离子水文火煎煮1h，同法过滤；合并三次滤液水浴浓缩后放凉至室温，定容后调制成20g/L剂量的药液，分装密封后高压灭菌（103.4kPa，121.3℃，20min），-20℃冰箱保存备用。3.3.2细胞转染转染前2小时，将细胞培养基换成无双抗、无血清的DMEM培养基；每0.5ug的重组质粒HBV-C/pBudCE4.1以及每1.5ul的GT707脂质体转染试剂分别用20ul无双抗、无血清的DMEM培养基稀释，室温静置5分钟，然后将GT707脂质体稀释液滴加到重组质粒HBV-C/pBudCE4.1稀释液中，轻轻混匀，室温14 第3章实验方法孵育15分钟，获得42ul脂质体重组质粒复合物。将复合物加入到含有细胞和完全培养基的24孔板中，轻柔混匀，于37℃，5%CO2培养箱中继续培养5小时后更换RPMI1640完全培养液，继续培养48小时。3.3.3中药对HepG2细胞培养上清液中HBeAg的抑制实验将前期定容制备好的中药分别用完全培养液稀释成4个剂量梯度（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）备用；将实验分成3组：细胞对照组、中药组、空白组，中药组于每孔HepG2细胞中分别加入配制好的4个剂量梯度的中药及细胞培养液各0.25ml，细胞对照组及空白组每孔加入细胞培养液0.5ml，每组均设3个复孔；37℃，5%CO2培养箱培养48h后收集细胞上清液，-20℃冻存待测。3.3.4中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg的抑制实验对3.3.3中每孔去上清后的HepG2细胞立刻加入0.5ml0.25%的胰蛋白酶进行消化，37℃，5%CO2培养箱中静置1min，之后加入RPMI1640完全培养液，用移液枪轻轻吹打成细胞悬液；将细胞悬液移入带盖无菌刻度离心管中，4℃低温离心（3000rpm，4min）弃上清，加入0.5mlPBS轻轻吹打均匀，于-20℃冷冻1h，37℃水浴解冻；为使细胞彻底裂解破碎，上述冷冻-解冻步骤需重复三次；收集细胞裂解液，-20℃冻存待测。3.3.5ELISA检测HBeAg含量⑴将收集好的细胞上清液及细胞裂解液于室温下复溶；⑵取一定数量的预包被酶联板，每板均设空白对照1孔，阴、阳性对照各2孔。各孔依次加入待测样本50ul及阴、阳对照50ul，每孔各加入酶结合物50ul（空白对照孔不加），混匀，贴上不干胶条，37℃温育30min；⑶弃去反应孔内液体，将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后注满各孔，静置10-20s，甩掉洗涤液，重复洗板5次，拍干；⑷依次在每孔加显色剂A液、B液各50ul，混匀，37℃避光显色15min。⑸依次在每孔加终止液50ul，混匀；⑹用酶标仪对空白孔调零，以450nm/630nm双波长分别测定细胞培养液15 第3章实验方法及细胞裂解液中HBeAg各孔的OD值，药物对HBeAg的抑制百分率(%)=(对照孔OD-试验孔OD)/对照孔OD×100%。3.3.6统计分析采用SPASS19.0软件进行t检验分析，数据用x±s表示，抑制率计算为负数的用“-”表示。组间比较进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。16 第4章结果第4章结果4.1HBV-C基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳后，通过将特异性条带与标准Trans2KDNAMarker条带进行比较，发现PCR所扩增目的基因HBV-C在800bp左右出现目的条带，符合预期（见图4.1）。图4.1HBV-C基因的PCR产物的鉴定Fig4.1IdentificationofPCRproductofHBV-CM1:Trans2KDNAMarker;C:PCRProductofHBV-C4.2HBV-C、pBudCE4.1双酶切产物鉴定结果HBV-C及pBudCE4.1分别用HindIII、XbaI酶切，其产物电泳后通过与标准Trans2KplusDNAMarker条带进行比较，可见一条800bp左右的HBV-C17 第4章结果条带及一条4600bp左右的质粒pBudCE4.1条带，结果如下（见图4.2）：图4.2HBV-C、pBudCE4.1双酶切产物鉴定Fig4.2IdentificationofPCRproductofHBV-CandpBudCE4.1bydoubleenzymedigestionM2:Trans2KplusDNAMarker;C:PCRProductofHBV-C;P:PlasmidspBudCE4.1digestebyHindIIIandXbaI4.3重组质粒HBV-C/pBudCE4.1的酶切鉴定结果如图4.3所示，将之前挑取的两个可能的阳性菌落进行质粒提取后的产物电泳，通过与标准Trans2KplusDNAMarker条带进行比较，两个都显示在800bp及4600bp处均出现特异性条带，提示重组质粒HBV-C/pBudCE4.1构建成功。18 第4章结果图4.3重组质粒HBV-C/pBudCE4.1的酶切鉴定Fig4.3IdentificationofrecombinantplasmidHBV-C/pBudCE4.1M2:Trans2KplusDNAMarker;C/P1、C/P2：RecombinantplasmidHBV-C/pBudCE4.1digestedbyHindIIIandXbaI4.4重组质粒DNA测序结果采用Chromas软件对所测序列进行阅读，结果（见附录图B）显示所测序列含有HBVEnhancerII+BCP+preC+C区完整的DNA序列，未见文献报道的与致病有关的突变位点，序列两端可见HindIII及XbaI酶切位点，提示重组质粒HBV-C/pBudCE4.1构建成功。preC+C的DNA序列翻译的氨基酸序列正确，与HBeAg及HBcAg的氨基酸序列一致。4.5中药对HepG2细胞培养上清液中HBeAg的表达抑制作用表4.1显示，通过与无中药处理的细胞对照组相比，45种中药中，4个剂量（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草处理后的细胞培养上清液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），且药物作用剂量越高，HBeAg含量越低，药物抑制效果呈现剂量-效应关系（见图4.4）；4g/L槟榔、419 第4章结果g/L女贞子、2g/L阿魏、4g/L虎杖也显示使细胞培养上清液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），1g/L女贞子可使细胞培养上清液中HBeAg的含量有一定程度下降（P<0.05），但槟榔、女贞子、阿魏、虎杖4个剂量梯度之间的作用效果比较，并未提示有明显的剂量-效应关系（见图4.5）；此外，4g/L的大黄、黄芪处理的细胞上清液中HBeAg的含量也有一定下降（P<0.05）；其余中药水煎剂各剂量与细胞对照组相比，对细胞培养上清液中HBeAg表达量的影响均未见明显差异（P>0.05）；此外，药物在4g/L的相同剂量下，对HepG2细胞上清液中HBeAg的有效抑制率（见图4.6），白马骨（73.9%）>黄芩（64.5%）>柴胡（56.1%）>毛鸡骨草（32.8%）>槟榔（13.2%）>女贞子（11.6%）>大黄（9.9%）>虎杖（9.0%）>黄芪（6.2%）。表4.145种中药水煎剂对细胞上清液中HBeAg的抑制作用剂量/OD值抑制率剂量/OD值抑制率药物药物-1-1g·lx±s%g·lx±s%细胞对细胞对-1.133±0.024--1.133±0.024-照照41.216±0.017-41.773±0.012-白背根11.232±0.028-21.657±0.017-鱼腥草叶11.261±0.019-11.684±0.018-0.51.319±0.020-0.51.558±0.013-42.012±0.031-41.483±0.021-22.257±0.015-21.542±0.019-甘草茯苓11.984±0.016-11.571±0.016-0.52.447±0.015-0.51.646±0.016-****40.296±0.01373.940.984±0.01413.2**20.412±0.01563.621.137±0.013-白马骨槟榔**10.457±0.01359.711.110±0.0162.0**0.50.499±0.01956.00.51.108±0.0242.241.128±0.0100.441.489±0.021-21.130±0.0170.321.462±0.012-羊蹄根蒲公英11.141±0.014-11.549±0.026-0.51.139±0.013-0.51.628±0.014-41.396±0.016-41.821±0.013-21.557±0.015-22.359±0.024-茵陈溪黄草11.563±0.011-12.500±0.044-0.51.885±0.014-0.52.486±0.011-20 第4章结果**41.761±0.015-40.497±0.01656.1**21.725±0.012-20.552±0.01551.3积雪草柴胡**11.969±0.017-10.680±0.01940.0**0.52.222±0.020-0.50.885±0.01521.9**41.296±0.048-40.761±0.01232.8**21.472±0.035-20.894±0.01221.1老鹳草毛鸡骨草**11.671±0.013-10.991±0.01412.5**0.51.793±0.019-0.51.022±0.0249.8**41.002±0.02011.642.689±0.015-21.149±0.019-22.613±0.012-女贞子苦参*11.064±0.0136.112.419±0.010-0.51.419±0.015-0.52.572±0.011-*41.647±0.010-41.063±0.0176.221.632±0.015-21.107±0.0112.3半枝莲黄芪11.628±0.012-11.120±0.0141.10.51.555±0.015-0.51.128±0.0200.441.251±0.012-41.528±0.010-21.264±0.008-21.330±0.011-荔枝核青蒿11.124±0.0140.811.441±0.019-0.51.139±0.012-0.51.339±0.013-**41.390±0.023-40.402±0.01764.5**21.312±0.045-20.477±0.01957.9益母草黄芩**11.297±0.013-10.661±0.01641.7**0.51.370±0.019-0.50.707±0.01537.641.307±0.022-41.389±0.023-21.350±0.017-21.412±0.017-三尖杉天花粉11.501±0.026-11.439±0.013-0.51.569±0.015-0.51.628±0.021-41.893±0.016-41.213±0.009-**21.952±0.015-21.006±0.03111.2石榴皮阿魏12.260±0.019-11.110±0.0272.00.52.685±0.011-0.51.336±0.013-41.660±0.012-41.528±0.010-21.634±0.032-21.480±0.017-香薷白芍11.791±0.014-11.441±0.018-0.51.723±0.024-0.51.329±0.013-淫羊藿42.001±0.013-连翘41.883±0.017-21.918±0.015-22.017±0.015-21 第4章结果11.757±0.023-11.921±0.013-0.51.698±0.019-0.51.998±0.020-41.432±0.027-41.389±0.011-21.477±0.016-21.362±0.012-莪术黄连11.461±0.016-11.539±0.014-0.51.590±0.020-0.51.508±0.022-**41.307±0.016-41.031±0.0219.021.312±0.015-21.239±0.013-大青叶虎杖11.450±0.019-11.290±0.020-0.51.835±0.015-0.51.337±0.016-42.261±0.012-41.820±0.011-22.444±0.018-21.930±0.020-一支蒿白花蛇草12.411±0.014-12.141±0.018-0.52.822±0.024-0.52.238±0.019-42.016±0.013-41.663±0.017-22.112±0.014-21.927±0.011-鸡血藤王不留行12.439±0.019-12.110±0.014-0.52.499±0.024-0.52.254±0.010-42.165±0.017-41.600±0.016-十大功22.240±0.019-21.632±0.012-金钱草劳12.541±0.009-11.849±0.010-0.52.549±0.015-0.51.880±0.007-*41.021±0.0149.941.089±0.0173.9*21.059±0.0136.521.102±0.0122.7大黄扯根菜11.100±0.0142.911.119±0.0101.20.51.136±0.012-0.51.128±0.0160.441.746±0.012-41.146±0.010-21.994±0.018-21.152±0.017-金银花绿茶11.980±0.014-11.227±0.018-0.52.132±0.023-0.51.259±0.013-42.006±0.015-22.399±0.013-青钱柳12.458±0.009-0.52.402±0.014-***与细胞组对照，P<0.01，P<0.0522 第4章结果图4.4：白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草对HepG2细胞上清液中HBeAg含量的影响图4.5：槟榔、女贞子、阿魏、虎杖对HepG2细胞上清液中HBeAg含量的影响23 第4章结果图4.6：相同剂量下9种中药对HepG2细胞上清液中HBeAg有效抑制率比较（4g/L）4.6中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg的表达抑制作用表4.2显示，与细胞对照组相比，4个剂量（4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L）的白马骨及柴胡处理的细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），药物的抑制作用呈现剂量-效应关系；4g/L、2g/L、1g/L剂量的黄芩及毛鸡骨草使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01），药物的抑制作用呈现剂量-效应关系；白马骨、柴胡、黄芩、毛鸡骨草4种药物的作用效果比较见图4.7；此外，4g/L阿魏也可以使细胞裂解液中HBeAg的含量显著下降（P<0.01）；其余40种中药4个剂量的药物对HepG2细胞裂解液中HBeAg的表达均未见明显的抑制作用（P>0.05）；相同剂量4g/L时，药物对HepG2细胞裂解液中HBeAg的有效抑制作用（见图4.8）：白马骨（49.0%）>柴胡（41.0%）>毛鸡骨草（25.3%）>黄芩（18.4%）>阿魏（9.0%）。表245种中药水煎剂对细胞裂解液中HBeAg的影响剂量/OD值抑制率剂量/OD值抑制率药物药物-1-1g·lx±s%g·lx±s%细胞对细胞对-0.936±0.019--0.936±0.019-照照白背根41.124±0.013-鱼腥草41.083±0.008-叶21.152±0.010-21.117±0.012-11.157±0.013-11.121±0.014-24 第4章结果0.51.169±0.011-0.51.148±0.016-40.999±0.013-41.080±0.017-21.067±0.014-21.102±0.015-甘草茯苓11.121±0.009-11.111±0.017-0.51.332±0.015-0.51.106±0.019-**40.477±0.01749.041.063±0.020-**20.591±0.01536.921.005±0.010-白马骨槟榔**10.713±0.02023.811.122±0.014-**0.50.778±0.02116.90.51.246±0.11-40.953±0.010-41.009±0.031-20.940±0.011-21.143±0.012-羊蹄根蒲公英10.948±0.014-11.205±0.013-0.50.938±0.013-0.51.328±0.011-40.997±0.016-41.321±0.014-21.012±0.015-21.359±0.013-茵陈溪黄草11.080±0.022-11.400±0.014-0.51.215±0.019-0.51.436±0.012-**41.222±0.014-40.552±0.02241.0**21.274±0.024-20.702±0.01825.0积雪草柴胡**11.391±0.019-10.815±0.01912.9**0.51.378±0.016-0.50.869±0.0197.2**40.904±0.0133.440.699±0.01625.3**20.987±0.026-20.761±0.01818.7老鹳草毛鸡骨草**11.158±0.013-10.845±0.0159.70.51.277±0.017-0.50.901±0.0113.741.109±0.017-41.389±0.010-21.131±0.009-21.303±0.011-女贞子苦参11.164±0.016-11.279±0.010-0.51.240±0.011-0.51.454±0.013-41.101±0.016-40.905±0.0123.321.153±0.027-20.900±0.0123.8半枝莲黄芪11.286±0.019-10.909±0.0162.90.51.295±0.015-0.50.911±0.0132.541.323±0.018-41.220±0.014-21.364±0.012-21.349±0.017-荔枝核青蒿11.559±0.014-11.335±0.019-0.51.476±0.011-0.51.409±0.013-**益母草41.358±0.007-黄芩40.764±0.01618.425 第4章结果**21.467±0.015-20.800±0.02014.5**11.625±0.017-10.860±0.0158.10.51.698±0.019-0.50.911±0.0192.741.502±0.013-41.044±0.016-21.423±0.027-21.108±0.006-三尖杉天花粉11.611±0.016-11.227±0.011-0.51.702±0.012-0.51.415±0.020-**41.101±0.014-40.852±0.0149.021.132±0.021-21.119±0.013-石榴皮阿魏11.238±0.017-11.284±0.018-0.51.229±0.010-0.51.267±0.012-41.161±0.012-41.145±0.006-21.294±0.005-21.219±0.017-香薷白芍11.281±0.013-11.471±0.022-0.51.352±0.011-0.51.520±0.013-41.288±0.008-41.563±0.025-21.292±0.015-21.557±0.020-淫羊藿连翘11.330±0.016-11.640±0.016-0.51.334±0.012-0.51.597±0.013-41.435±0.011-41.289±0.017-21.501±0.007-21.292±0.012-莪术黄连11.548±0.009-11.360±0.010-0.51.711±0.014-0.51.371±0.012-41.127±0.010-41.111±0.015-21.150±0.015-21.143±0.021-大青叶虎杖11.064±0.006-11.176±0.014-0.51.113±0.011-0.51.338±0.016-41.551±0.012-41.228±0.016-21.568±0.012-21.270±0.011-一支蒿白花蛇草11.621±0.014-11.411±0.013-0.51.808±0.009-0.51.523±0.015-41.334±0.019-41.000±0.013-21.533±0.015-20.967±0.027-鸡血藤王不留行11.550±0.012-11.023±0.014-0.51.681±0.023-0.51.146±0.011-十大功41.372±0.019-金钱草41.212±0.010-劳21.400±0.015-21.224±0.015-11.438±0.022-11.373±0.011-26 第4章结果0.51.605±0.013-0.51.528±0.014-40.910±0.0152.840.895±0.0144.420.897±0.0174.220.934±0.0130.2大黄扯根菜10.903±0.0133.510.950±0.014-0.50.914±0.0142.40.50.942±0.012-41.261±0.013-40.920±0.0091.721.344±0.006-20.931±0.0130.5金银花绿茶11.491±0.021-10.982±0.011-0.51.600±0.017-0.51.117±0.014-41.204±0.010-21.258±0.024-青钱柳11.414±0.018-0.51.493±0.016-***与细胞组对照，P<0.01，P<0.05图4.7：白马骨、柴胡、毛鸡骨草、黄芩对HepG2细胞裂解液中HBeAg含量的影响27 第4章结果图4.8：相同剂量下5种中药对HepG2细胞裂解液中HBeAg有效抑制率的比较（4g/L）28 第5章讨论第5章讨论5.1HBeAg、HBcAg的结构与功能HBVC基因区开放性阅读框内的两个起始密码子，能分别编码p25、p22、p21和p17四种不同的蛋白。p25蛋白(含212aa，分子量为25kDa)，又称前C蛋白，是HBeAg的前体，由preCmRNA经第1个起始密码子翻译合成。p25蛋白通过其N-末端含有19个氨基酸的前导肽引入细胞内质网，经信号肽酶切[11]去该段前导肽后，形成中间产物p22蛋白。p22蛋白包含28至150个氨基酸，[12]由未剪切的一段信号肽与富含鱼精蛋白样精氨酸残基组成，p22蛋白在分泌腔膜中被蛋白水解酶切除掉了C-末端33个氨基酸序列后，形成可溶性的成熟[6]蛋白p17，p17经修饰而分泌到细胞外，即HBeAg（HBeAg/p18）。p21蛋白(含183aa，分子量为21kDa)，即HBcAg(HBcAg/p21)，由HBVC基因区开放性阅读框内的第2个起始密码子合成。HBcAg位于Dane颗粒的核心，是病毒的核衣壳蛋白，具有高度免疫原性。HBcAg先是通过其N末端结构域（N-terminaldomain，NTD）的二硫键连接形成二聚体结构，然后二聚体[13，14]自发组装成亚单位的核衣壳，接着HBcAg的C-末端结构域(C-terminaldomain，CTD)通过与pgRNA结合，使pgRNA逆转录形成双链环状的DNA基[15]因组，在蛋白激酶磷酸化的CTD的作用下，180个亚单位的核衣壳与DNA基因组、DNA聚合酶一起组装成正20面体结构的成熟核衣壳。HBcAg参与RNA包装、DNA合成、识别包膜蛋白、病毒成熟及病毒释放等过程，对病毒的复制与装配起着重要作用。作为HBV的核心成分，HBcAg是反应HBV存在及HBVDNA复制的直接标志，但由于HBcAg只存在于Dane[16]颗粒内部，细胞外几乎没有游离的HBcAg，故血清中不易检出，HBeAg与HBcAg具有75%的共同序列，是HBcAg的可溶性降解产物，HBcAg通过二硫键连接形成的独特二级结构，使HBeAg的抗原表位完全不同于HBcAg，也使HBeAg无法形成蛋白颗粒，所以HBeAg不能被组装进病毒颗粒，而分泌致细29 第5章讨论胞外。在感染病毒肝细胞的胞浆内，HBeAg与HBcAg可同时表达，特别是在病毒复制活跃的急性乙肝感染者中，它们的表达具有一致性，但检测肝细胞胞浆内HBcAg的表达，主要通过对肝组织进行免疫组化染色来完成。HBeAg作为慢性乙型肝炎（CHB）患者重要的血清标志物（HBVserummarkers,HBV-M）之一，其由阳转阴发生血清学转换，不管是自发的还是通过药物治疗实现的，都标志着HBVDNA复制的下降，肝炎活动趋于缓解，CHB患者继续发展为肝硬化、肝癌、肝衰竭的几率减低。5.2实验对象及实验方法的选择乙肝病毒发生突变，是由于其RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，导致碱基对错配所致，成人乙肝感染者长期处于慢性持续感染状态，较易发生病毒自然变异以及由于免疫压力下的免疫应答所致的变异。HBV的突变最常见于核心启动子（BCP）区、前C/C基因区及前S/S基因区，而核心启动子区及前C[17-19]区的突变易从转录及翻译水平下调HBeAg的表达，因此，为使干扰因素尽可能减低，本实验选取的是相对处于HBV感染免疫耐受期的儿童血清作为研究样本。药物对乙肝病毒表达产物HBeAg作用研究的实验方法中，早期多采用药物与乙肝患者HBeAg阳性血清的直接反应，通过检测药物作用前后血清中HBeAg浓度的变化来判断药物的作用效果，现已较少使用。目前国内外应用比较广泛的实验模型中，体内实验多采用嗜肝DNA病毒感染的动物模型作为研究对象，如感染DHBV阳性鸭模型、HBV转基因小鼠模型、感染HBV的灵长类动物模型等。动物模型可有效的评价药物在机体内的代谢过程，有利于对药物有效活性成分的筛选，但动物模型的感染模式虽与人感染HBV的模式类似，却无法完全替代HBV在人体内复制和持续感染的全过程。而部分灵长类动物模型如黑猩猩、恒河猴模型等，虽然其感染的基因类型、感染后机体的免疫反应过程以及血清学、病理组织学的改变等都与人类高度相似，但其来源困难，且受经费及伦理等因素限制，也无法进行大规模实验研究。此外，由于动物模型的建立以及体内实验的研究时间都相对较长，根据HBeAg在机体内表现的生物学特性，难以避免存在HBeAg自然转阴的情况，这会对实验结果的分析产生一定程度地干扰；体外实验细胞模型中，使用来源最广的是人肝源性细胞，其中，常用的30 第5章讨论有人肝癌HepG2.2.15细胞株和人肝癌HepG2细胞株，以及人肝癌SMMC7721[20]细胞株、人肝癌Huh7细胞株、人肝癌QSG7701细胞株等。HepG2.2.15细胞株由两个头尾相连的HBVDNA全基因重组质粒转染HepG2细胞株，再经G418筛选得到，其不仅含有HBVDNA全基因组，还能在体外长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg、Dane颗粒及部分复制中间体，但由于HepG2.2.15细胞无法反映药物有效成分具体对乙肝单个基因片段的作用，故本实验仍然选取HepG2作为实验细胞，构建由乙型肝炎病毒基因组增强子II、核心启动子及其下游C区基因组成的具有完整转录单元的HBV基因组序列（EnhancerII+BCP+preC+C），并将该序列目的基因HBV-C瞬时转染入HepG2细胞，通过观察药物作用HepG2细胞前后，目的基因HBV-C所表达的产物HBeAg浓度的变化，初步探讨药物对此基因组序列中调控元件的影响作用。5.3药物实验结果的分析本课题前期通过查找国内外相关文献，从中医临床能有效治疗慢性乙肝的中药复方、体内外实验研究显示具有抗HBV活性的中药或有效成分、以及对其他病毒（如人免疫缺陷病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒等）显示有抑制效果而未见对HBV有相关报道的中药等几个方面进行文献收集，整理筛选出45种单味[21-36]中药进行实验研究，分别是：白背根叶、鱼腥草、甘草、茯苓、白马骨、槟榔、羊蹄根、蒲公英、茵陈、溪黄草、积雪草、柴胡、老鹳草、毛鸡骨草、女贞子、苦参、半枝莲、黄芪、荔枝核、青蒿、益母草、黄芩、三尖杉、天花粉、石榴皮、阿魏、香薷、白芍、淫羊藿、连翘、莪术、黄连、大青叶、虎杖、一支蒿、白花蛇草、鸡血藤、王不留行、十大功劳、金钱草、大黄、扯根菜、金银花、绿茶、青钱柳。实验结果发现，白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草制备的水煎剂作用HepG2细胞后，能显著下调细胞培养上清液及细胞裂解液中HBeAg的表达，且药物随着剂量梯度的变化，作用效果呈现剂量-效应关系，相对另外几种有效药物，数据更易被认可。我们分析，白马骨、黄芩、柴胡、毛鸡骨草可能通过煎煮过程，释放出了某些化学小分子，这些小分子被细胞吸收后，阻断了HBVEnhII和BCP与相应的转录因子以及RNA聚合酶的作用，从而下调了PreCmRNA转录水平，抑制了HBeAg的表达。近30年来，国内外研究者已经通过药物实验筛选出了近百种具有抗HBV31 第5章讨论活性的中药及天然药，对这些药物所具有的有效抗HBV活性成分的研究也正陆[37]续开展。左国营等通过对相关文献进行统计分析，将这些药用植物的活性成分大致归纳为木脂素类、植物多酚类、生物碱类、萜类、黄酮类、香豆素类及[38]多糖类等几大类，而金龙飞等也通过对65种抗乙肝病毒中草药的化学成分进行测定，分析得出这些药物的有效成分包括脂环族羧酸、芳香族羧酸、蒽醌类、黄酮类、植物鞣质、生物碱及蛋白质等。本课题经实验得出的4种对HBeAg有抑制效果的中药中，白马骨，又称六月雪，茜草科植物，多以根入药，有清热、解毒、利湿的功效，是民间常用于治疗肝炎的药物。从白马骨中分离并鉴定的主要化学成分包括：齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、松脂素、丁香脂素、[39-41]麦迪奥脂素、橄榄脂素、胡萝卜苷、D-甘露醇、牡荆素等。有研究显示，白马骨的水提物在体外实验中能显著抑制HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV[29]HBsAg及HBeAg的表达；黄芩，唇形科植物，以根入药，有清热燥湿、解毒、凉血安胎等功效。黄芩在临床上的应用价值主要包括抗菌、抗病毒、抗肿[42-44]瘤、抗氧化、抗过敏等多个方面，对其研究较多的化学成分为黄酮类化合物，包括黄芩苷、黄芩素，以及汉黄芩苷、汉黄芩素等，其中汉黄芩素及黄芩苷有[30][45]较为肯定的体外抗HBV效果。此外，黄芩还含有β-谷甾醇、苯甲酸、多糖、黄芩酶、挥发油、萜类、微量元素等成分；柴胡，伞形科植物，按性状不同可将柴胡分为“北柴胡”与“南柴胡”，柴胡有疏散解热，舒肝升阳的功效，[46-48]其化学成分包括柴胡皂苷、挥发油、黄酮类、多糖和植物甾醇等，其中主要的活性成分为柴胡皂苷和挥发油。柴胡皂苷的结构为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，它可从保护肝细胞、抑制肝纤维化、抗HBV病毒及增强免疫等多个途[49]径发挥防治乙肝的作用；鸡骨草，豆科植物，以全草入药，分为鸡骨草和毛鸡骨草，鸡骨草化学成分包括皂苷、黄酮类、相思子碱、大黄酚、大黄素甲醚、[50，51]甾醇化合物、氨基酸、胆碱、蒽醌类、糖类等，而毛鸡骨草成分主要含有[52，53]三萜皂苷、脂肪酸、甾体、异黄酮等。鸡骨草具有保护肝脏、抗菌、抗炎、增强免疫力等功效，有研究显示，毛鸡骨草的含药血清显示在体外有较好抑制[54]HBsAg、HBeAg及HBVDNA复制的功效，而醇提液对HepG2.2.15细胞[32]表达的HBsAg及HBeAg有一定抑制效果。综上所述，我们有理由推断，这些中药中分离出的一种或多种化学小分子成分，可能就是阻断HBVEnhII、BCP与相应的转录因子及RNA聚合酶作用的关键成分，而这种阻断作用是通过某些小分子具有相似结构能竞争性结合某32 第5章讨论些位点，还是通过与某些物质直接产生一系列化学作用而达成的，有待进一步实验加以验证。33 第6章结论第6章结论1.成功构建了表达HBeAg的重组质粒HBV-C/pBudCE4.1。2.重组质粒HBV-C/pBudCE4.1转染HepG2细胞成功表达了HBeAg。3.重组质粒HBV-C/pBudCE4.1转染的HepG2细胞经中药处理后，筛选出了具有抑制HBeAg表达活性的中药。4.本研究初步建立了筛选抗HBeAg药物的模型，为开展相关研究奠定了基础。5.初步发现白马骨、黄芩、柴胡和毛鸡骨草等中药中可能含有某些活性小分子成分具有干扰HBVEnhII和BCP的转录活性与相应的转录因子和RNA聚合酶的作用，下调了PreCmRNA转录水平，从而减低了HBeAg的表达量。34 致谢致谢值此论文完成之际，衷心感谢我的导师刘金辉教授一直以来给予我的谆谆教诲、悉心指导以及无微不至的关怀与帮助!导师渊博的专业知识、敏锐的洞察力、严谨的治学态度，以及精益求精的学术风格，都令我受益匪浅。导师是我终生学习的楷模，其高尚的品格以及对科研无私的奉献精神，将激励我不断进取。在此，学生衷心祝福导师：愿导师阖家欢乐，幸福安康！衷心感谢南昌市第三医院检验科胡锦辉、李清祥两位主任，在读研期间对我的指导和支持，其实验室提供的先进仪器及设备，为实验的顺利进行提供了保障。衷心感谢南大微生物教研室的应颖老师、邹淑慧师妹、夏芳娜师妹以及其他师兄弟姐妹在实验期间给予我的无私帮助和鼓励，这份友谊我将永远铭记在心。感谢我的家人在精神上给予我的巨大支持，正是他们默默无闻的奉献才使我能够顺利完成学业，实现自己的梦想!最后，向参加本文评阅和答辩的各位专家致以最诚挚的感谢！白羽2016年5月35 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综述综述中医药抗乙肝病毒实验研究进展白羽（综述），刘金辉（审校）关键词：中药乙肝病毒引言乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus）引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病，具有传染性强、流行面广和发病率高的特点。HBV的持续感染是造成乙肝慢性化的主要原因，慢性乙肝最终可发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。据统计，全世界每年因急慢性HBV感染而死亡的人数约有100万，且有逐年递增的趋势，但迄今为止，仍然没有一种能确切有效地清除乙肝病毒的特效药物出现。目前国内外临床上广泛用于治疗乙型肝炎的药物有细胞因子类药物及核苷类药物。细胞因子类药物中最常用药物为干扰素，其机制是通过与相应受体结合，促使抗病毒蛋白基因生成抗病毒蛋白，间接发挥其抗病毒作用，使病毒的复制、组装和释放受阻，进而产生广谱抗病毒疗效，但干扰素价格昂贵，使用时需符合明确的适应症，且易导致白细胞减低、发热、贫血等副作用；核苷类药物以拉米呋定为例，其主要作用机制是通过竞争性掺入乙肝病毒DNA链，抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶活性，从而终止DNA链的合成，使病毒的复制受到抑制，但此类药物短期治疗无法彻底清除病毒，停药后也易出现DNA继续复制导致耐药。我国中医治疗肝病历史悠久，中药来源广泛，相比西药价格低廉，且治疗期间病人依从性好、药物不良反应少。多年以来的临床实践及研究表明，中药在降低乙肝病人血清胆红素、血清转氨酶、抗肝纤维化以及改善临床症状等方面均取得了不错的疗效，但到目前为止，乙型肝炎研究及治疗的重点、难点问题归根结底仍是如何有效抗病毒。此外，由于人体感染HBV后，Th1型免疫应答低下，导致细胞因子抗病毒作用减弱，以及Th2型免疫亢进，使得机体对病毒抗原免疫耐受，最终导致HBV慢性持续性感染等免疫应答失衡也是影响慢性45 综述乙肝发生的重要机制，故本文仅针对近几年来中药抗HBV及调节免疫机制等实验相关研究进行简要综述。1中药复方传统中医讲究辨证治疗，以病因病机和相应的中医证候作为针对目标，即只针对中医相应的“证”而不针对西医固定的“病”，中医认为慢性乙肝病因多为湿热疫毒、肝郁脾虚，故用药多以清热、解毒、疏肝、健脾、利湿等配合应用，如古籍《金匮要略》中具有疏通经络、破淤生新、缓中补虚之功效的“大黄䗪虫丸”，《伤寒论》中具有和解少阳之功效的“小柴胡汤”及具有清热利湿、解毒退黄之功效的“茵陈篙汤”，《太平惠民和剂局方》中具有疏肝解郁、养血健脾之功效的“逍遥散”等都是治疗肝病具有良好药效且一直延用至今的经典方剂。而现代中医则是利用科学的理念和方法，根据临床需要，不断地对既有经典方剂及经验方剂加以改进，使复方中药物的配伍更加合理有效。1.1新加达原饮达原饮出自古籍《瘟疫论》，由槟榔、厚朴、芍药、黄芩、甘草、草果、知[1]母7味药组成，具有开达膜原，辟秽化浊之功效。王礼凤等通过长期对乙型肝炎治疗的临床经验，在达原饮的基础上加入叶下珠、厚朴、柴胡、丹参、姜黄、僵蚕、灵芝、甘草、蝉蜕制得新加达原饮。研究发现新加达原饮在最大无毒浓度8.0mg/ml以下时，对作用72h及144h后HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg均有较好抑制作用(P＜0.05，P＜0.01)，且呈现明显的剂量-效应关系；几个较高药物浓度组对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg的抑制率也要优于阳性对照拉米夫定，提示新加达原饮有显著体外抗HBV作用，有一定的临床推广价值。1.2补肾健脾方补肾健脾方由仙灵脾、杜仲、黄芪、印度叶下珠、丹参、积壳等14味药组[2]成，郑颖俊等用补肾健脾方治疗慢性乙肝患者，治疗48周时实验组血清HBVDNA转阴率、HBVDNA定量较基线下降值及HBsAg较基线下降值均显著高46 综述于对照组，而Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平显著高于对照组，Th2类细胞因子IL-4、IL-10水平则显著低于对照组，故分析其有可能是通过恢复特异性T细胞免疫功能来发挥抗HBV作用的。1.3芍药甘草汤芍药甘草汤出自《伤寒论》，由芍药、炙甘草组成，有益阴和血，柔肝止痛[3]之功效。戴瑛等从芍药甘草汤中提取出有效成分群——芍甘多苷，并对其进行研究。在体外试验中，芍甘多苷对HBV转染的HepG2.2.15细胞表达的HBsAg、HBeAg及HBV-DNA均显示出明显的抑制作用；而体内试验中，芍甘多苷可使感染DHBV鸭血清中的DHBVDNA及DHBsAg滴度显著降低，且停药后7天后仍有一定抑制效果。1.4凉血滋肾益气颗粒凉血滋肾益气颗粒是由黄芪、叶下珠、地黄、山茱萸、牡丹皮等13味中药[4]制成的复方颗粒冲剂。鲁艳平等将研究对象随机分为两组，两组均进行常规西医保肝降酶治疗，治疗组加用凉血滋肾益气颗粒，对照组加用中药颗粒安慰剂，实验研究发现治疗组HBV-DNA水平下降幅度及HBeAg阴转率与对照组相比有显著性意义(P＜0.05)；治疗组对提高树突状细胞表达IL-12的水平及淋巴细胞亚群提高CD4+、降低CD8+的水平也有显著性意义(P＜0.05)，由此反应出凉血滋肾益气颗粒能够通过提高慢性乙肝患者机体免疫应答机制，达到抑制HBV的作用。1.5HH胶囊[5]HH胶囊由黄连、赶黄草、虎杖、甘草等多味中药组成，张传涛等通过利用HepG2.2.15细胞进行体外试验，发现HH胶囊不仅可以有效地降低培养上清中HBsAg、HbeAg及细胞内外的HBVDNA水平，进一步的研究还提示了其抗HBV作用机制很可能是通过调控JAK-STAT信号转导通路，增强2.2.15细胞内抗病毒蛋白2'5'-寡腺苷酸合成酶、RAN依赖蛋白激酶及其mRNA表达水平有关。47 综述1.6肃毒星肃毒星注射液含龙胆苦甙、小檗胺和腺苷三磷酸酶等成分，是治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的有效药，能够降低HIVDNA载量、提高CD4+T细胞数量。[6]研究显示某些抗病毒药物具有广泛抗病毒效果，故姚伟明等将肃毒星亦作用于乙型肝炎病毒，观察其是否具有抗HBV活性，研究发现肃毒星对HBV野生株和ETV耐药突变HBV株细胞内HBVDNA的抑制率分别达到80.83%和65.18%，且对两种细胞分泌HBsAg、HBeAg也均有较好抑制作用，其抑制效果甚至强于核苷类药物，具有潜在的应用价值。我们对于中药复方的研究，既要注重其中医整体治疗的观念，也要利用药物化学、药理学、细胞生物学、分析化学等多学科理论，从微观角度对其有效药物活性成分进行筛选并对其作用机制进行系统性分析，使其得以充分发挥多途径、多层次、多靶点给药的治疗优势。而中药复方的组合形式由天然药物复方汤剂向化学成分复方制剂甚至是复方靶向制剂的转变，也是中医药持续发展并真正走向国际化研究进程的有效途径之一。2单味中药及有效成分单味中药抗乙肝病毒作用机制的研究是中医复方治疗乙肝用药的基础，也是进一步开发中药抗HBV有效活性成分或中药单体化合物的理论依据。近30年来，我国研究者已经通过药物实验筛选出了近百种具有抗HBV活性的中药，而从多个层面均有研究,且作用效果较为肯定的有柴胡、苦参、叶下珠、黄芪、大黄、猪苓、水芹、甘草、白马骨(又名六月雪)、扯根菜等。其中叶下珠中的多酚类成分、苦参中的苦参碱、黄芩中的黄芩素等是较为肯定的具有抗HBV活[7]性的有效化学成分。左国营等通过对国内外天然药物抗HBV相关文献进行统计分析，将有效活性成分大致归纳为木脂素类、植物多酚类、生物碱类、萜类、[8]黄酮类、香豆素类及多糖类等几大类，而金龙飞等也通过对65种具有抗乙肝病毒活性中草药进行化学成分进行测定并对其分析，认为抗HBV中草药中主要的有效成分为脂环族羧酸、芳香族羧酸、蒽醌类、黄酮类、植物鞣质、生物碱及蛋白质。48 综述2.1壮药汗衣台汗衣台为防己科植物皱波青牛胆的藤茎，具有清热排毒、消炎止痛等功效,[9]在我国广西壮族民间用其治疗HBV取得了较好的效果。廖丹等研究发现不同剂量的汗衣台对HepG2.2.15表达HBsAg、HBeAg及HBVDNA的复制均有显著抑制作用，且药物剂量为500-800g/mL时对HBsAg的抑制及100-800g/mL时对HBeAg的抑制甚至明显高于同剂量的拉米夫定及干扰素,研究结果提示汗衣台的抗HBV作用模式既不同于干扰素也不同于拉米夫定，推测其可能的机制是直接干扰乙肝病毒抗原的组装以及造成病毒颗粒成熟障碍来达到抗病毒效果的。2.2半枝莲[10]半枝莲一般以其全草入药，具有清热解毒、利尿消肿的功效。周凌凌等研究发现半枝莲水煎液及醇提液对HepG2.2.15细胞表达HBsAg及HBeAg均有一定的抑制作用(P＜0.01)且呈量效关系，水煎液细胞毒性较醇提液小，但醇提液抑制作用优于水煎液，进一步分析其原因可能是由于半枝莲水煎液中主要成分是能够提高人体免疫功能的多糖类成分，而醇提液中主要化学成分为黄酮类化合物如野黄芩苷、汉黄芩素等，这类成分已证实有一定的抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用。2.3天花粉[11]天花粉为葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥根，2002年应国红等选取了180种中草药与HBsAg强阳性的乙肝患者血清直接作用，通过ELISA法检测HBsAg浓度，以综合药效指数(SEI)来判断药效，筛选出8种有效药天花粉、香薷、茴香油、益母草、钻骨龙、桑椹子、鬼羽箭以及蛇莓，其中天花粉和香薷为高效药,但此后几乎没有相关文献或研究进一步证实天花粉具有抗HBV功效。[12]2012年陈佳等通过体外试验研究发现天花粉水提物及醇提物均能明显抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌，其水提物的治疗指数高于醇提物。此项研究对天花粉抗乙肝病毒提供了有价值的实验依据，对其推断的可能的有效成分天花粉蛋白也值得我们后续深入研究。49 综述2.4青钱柳青钱柳属于双子叶植物纲胡桃科植物，具有一定降血糖、降血脂及抗氧化、[13]抗肿瘤功效。韦京辰等对青钱柳醇提物三氯甲烷部位Fr.2组分进行研究，选取最高浓度200mg/L发现对HepG2.2.15细胞表达HBsAg及HBeAg的抑制率可达75.58%、96.99%，IC50值分别为103.63mg/L、1.60mg/L，TI＞2，提示青钱柳提取物Fr.2组分毒性低、治疗指数高，有较好的抗HBV研究价值。2.5甲基阿魏酸蝉翼藤(SecuridacainappendiculataHassk．)为远志科远志族五味藤属植物，具有抗炎、抗肿瘤及抗病毒活性。甲基阿魏酸(meth-ferulicacid，MFA)是从蝉翼藤的根茎中分离提取的单体成分，其结构为3，4-二甲氧基肉桂酸。MFA[14][15]在体外作用HepG2.2.15细胞及体内作用感染DHBV麻鸭模型的实验中均表现出了较好的抗病毒效果，是具有潜在开发价值的单体成分。2.6太白楤木总皂苷太白楤木为楤木属五加科植物，有抑制肝星状细胞核因子κB活性[16-17]及抗肝纤维化的作用。崔大江等在体外研究中发现，太白楤木总皂苷对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸有一定抑制作用，且细胞毒性较低；而对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制效果与拉米夫定相似。2.7芒果苷芒果苷是芒果中的一种多酚类化合物,具有免疫调节、抗炎、抗病毒等作用。[18-19]邓家刚等人的课题组前期已经发现芒果苷对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg及动物实验中感染鸭体内的DHBV-DNA均有显著抑制作用，近期研[20]究则显示，通过表皮生长因子(EGF)干预后，芒果苷在体外能抑制2.2.15细胞中B-arrestins的过度磷酸化，推断这是其抗HBV和免疫调节的作用机制之一，而另一机制则可能是通过抑制2.2.15细胞MAPK信号转导通路中JNK蛋白及[21]其下游转录因子AP-1的活性，从而来降低HBV的转录与表达的。50 综述2.8花青素花青素是一类广泛存在于植物中的酚类化合物，有一定抗氧化、抗肿瘤及[22]抗菌作用。王者令等发现葡萄原花青素能使HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中的HBsAg和HBeAg有一定程度降低。而杨奎真在体外试验中发现蓝莓花青素对慢性乙肝患者血清中的HBeAg也具有类似的抑制作用。2.9苯丙氨酸二肽类化合物苯丙氨酸二肽类化合物(Phenylalaninedipeptidecompounds，PDC)，又名替芬泰(Tifentai，TFT)，是苗药马蹄金中分离出的二肽衍生物,其母体为马蹄金素。[23]刘青川等发现PDC对感染鸭乙肝病毒的北京雏鸭血清中及肝细胞中[24]DHBV-DNA均有显著抑制作用，且停药后反弹作用低于拉米夫定。王盼丽等也通过实时荧光定量PCR法检测发现PDC对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA有显著的抑制作用。2.10中国圆田螺多糖（polysaccharideofCipangopaludinachinensis，PCC)中国圆田螺俗称螺蛳、田螺，在我国有广泛分布，中国圆田螺多糖则通过[25]碱提醇沉法从中提取出来。PPC在刘小燕等先前的研究中显示出了较好的体外抗HBV活性，而后其团队又通过感染鸭乙肝病毒麻鸭模型发现PPC对鸭血清中DHBV-DNA、DHBsAg及DHBeAg的表达有明显抑制作用，且抑制作用[26]在停药5d后无反跳现象。多糖类化合物一直是国内外研究较多的抗HBV化合物，其大多具有增强患者细胞及体液免疫功能,打破免疫耐受状态,达到清除病毒的目的,而且还具有一定促肝细胞再生功能。近年来的研究方向已经从植物多糖转向动物多糖，有报道提示的有效抗HBV多糖类成分还有扇贝多糖，河蚌多[27-29]糖，彩虹明樱蛤多糖等。2.11雷公藤红素存在于雷公藤属及南蛇藤属植物中的天然活性成分，有蛋白酶体抑制剂作[30]用，可抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡。张欣蕊等研究发现雷公藤红51 综述素可有效抑制转基因小鼠原代肝细胞HBV的复制及HBsAg的表达，并推测其机制可能是其作为蛋白酶体抑制剂与宿主泛素蛋白酶体系统相互作用的结果。2.12其他[31]张玉强等通过对31种中草药醇提物进行筛选，发现槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草这五种药物具有一定抗HBV功效，其对HBeAg的治疗指[32]数分别达到2.8、26.9、12.1、5.2、20.8。吉守祥等对28种藏药进行体外抗HBV实验筛选，发现余甘子粗提物在细胞无毒浓度下作用9d后，HepG2.2.15细胞表达HBeAg与HBsAg水平与对照组相比分别下降了41%和28%证实其具[33][34][35]有较好的抗HBV活性。此外，大叶蛇葡萄、蒙药肋柱花、茅莓也具有一定抗乙肝病毒作用。3存在问题尽管多年来中药在治疗乙肝方面已经取得了巨大的成绩，但也仍然存在诸多方面的问题。目前中医临床使用最广泛的用药形式依然是复方汤剂，复方汤剂煎煮的过程易使配伍中各药物相互产生复杂的物理及化学变化甚至产生新的化合物，而实验室研究依然多是对有效复方汤剂配伍中的单味中药逐一地、单独地进行化学成分分析，这是临床治疗与实验室研究相矛盾的地方，是迫切需要解决的问题，这直接关系到我们通过对各种单味中药进行分离而得出的所谓的可能有效活性成分是否与临床上显示有治疗效果的复方汤剂中的有效成分是否具有一致性。此外,在抗乙肝病毒中药筛选的常用实验方法中，体外实验应用最多的是能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒的HepG2.2.15细胞，但药物在体外抗HBV实验中显示有抑制效果的浓度，在体内却很难达到，且药物也无法反映其在机体内药代动力学过程。另外，由于HepG2.2.15细胞内所含基因组为HBVDNA全基因组，其实验结果也无法反映出药物有效成分具体对单个基因片段的作用。而体内实验多采用嗜肝DNA病毒感染的动物模型来进行研究，常用的有感染DHBV阳性鸭模型、HBV转基因小鼠模型、可感染HBV的灵长类动物52 综述模型等，前两种其感染模式虽与人类感染HBV类似，但也不可能完全替代HBV在人体内复制和持续感染的全过程。而灵长类动物模型如黑猩猩、恒河猴模型等，虽然其感染的基因型、机体对病毒的免疫反应过程、血清学及病理组织学改变等都与人类高度相似，但其来源困难，且受经费及伦理等因素限制，也无法进行大规模实验研究。虽然国内从80年代初期就开始大规模地对抗乙肝中药进行筛选研究，前期也取得不错的成果，但基于对文献的搜集和统计发现，近几年来中药作用乙肝病毒的相关实验研究仍多是关于其保肝降黄以及改善肝纤维化等缓解患者临床症状，或是中药复方联合西药治疗，证实其有一定辅助增强干扰素或核苷酸类药物抗病毒效果的作用，而中药直接抗乙肝病毒作用的实验研究进展仍然相当缓慢，造成这种情况的可能原因是从中药复方到单味中药、再从单味中药到其内在活性成分的研究是一个长期的、连续地、需要多学科参与、高经费投入、系统性研究的过程，而由于中、西医的治疗理念不同，部分中医临床医师只盲目地追求中药对乙肝患者直观地临床治疗效果，而缺乏对药物的有效成分及作用机制的研究，甚至因为种种原因夸大某些中药有根治乙肝的功效，提供错误信息，使其他研究者无法从其所谓的有效中药复方中筛选出有价值的单味药及活性成分。中医西医研究理念的脱节，是国内中药抗乙肝病毒实验研究无法按照国际标准进行大样本、多中心、高质量、随机对照进行研究的主要原因，故其结果无法得到严谨的系统性评价，阻碍了中医药研究成果真正地走向国际。4展望值得一提的是，近年来从少数民族医药治疗乙型肝炎病毒的验方中筛选出[34][9]了不少具有抗HBV活性的民族中药，如蒙药肋柱花、壮药汗衣台、藏药余[32][23-24]甘子、苗药马蹄金等，故我们研究中医中药不应局限于传统的汉族文化医药，更应该借鉴少数民族药物治疗乙型肝炎的宝贵经验，不断地为我国抗HBV中药的开发提供新选择、新思路、新希望。参考文献[1]王礼凤,李长秦,冯海杲,等.新加达原饮对HepG2.2.15细胞表达HBsAg、HBeAg的影响53 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