ctgf反义rna对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

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1、CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响【关键词】血管平滑肌细胞结缔组织生长因子细胞增殖细胞迁移反义RNAAbstract：ObjectiveTospecificallydoigrationofVSMC.MethodsPrimaryVSMCsethod.Anti-senseRNAtechniqueigrationofVSMCinedbyMTTandscratchassay.ResultsTransferofpcDNA3.1(+)-CTGF(-)couldspecificallydoigrationofVSMCigrationofVSMCsbydecreasi

2、ngthephosphorylationofAkt.Keyoothmusclecell(VSMC);connectivetissuegroigration;anti-senseRNA动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)始于血管内膜损伤［1］。在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞(vascularendothelialcell，VSMC)进一步激活，大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC

3、还可迅速合成胶原等细胞外基质［2］，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功能上发生了变化，最终导致了AS的形成［3］。结缔组织生长因子(connectivetissuegroRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义［5］。本课题旨在探讨CTGF在AS中对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响提供实验依据。1材料与方法1.1实验材料1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)

4、质粒由辽宁医学院科学实验中心构建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗体，ECLTM显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(美国SantaCruz公司);Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司);低糖DMEM培养基(美国Gibco公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯产品。霍晓川，等：CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报2008年2月，29(1)1.2实验方法1.2.1VSMC的培养和鉴定处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10min。无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开

5、血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37℃、5%CO2的培养箱培养倒置培养2h，待组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用0.125%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌α肌动蛋白(α-actin)免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。选3～5代对数生长期VSMC进行实验。1.2.2实验分组取培养第3～5代的VSMC细胞30瓶（5×104／mL），随机分为３组：反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。分别实施

6、pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染、空白脂质体转染以及空白处理。1.2.3pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%～60%后，加入含有4μgpcDNA3.1(+)-CTGF(-)的转染复合物，置于37℃，5%CO2培养箱孵育。4h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37℃，5%CO2培养箱孵育48h后，备用于指标检测。1.3指标检测1.3.1C长至次融合后，给予相应干预因素后，无血清DMEM培养24h，使细胞统一于G0期，加入700μＬ预冷的改良RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl，50mmol/L，

7、pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1.0mmol/L;PMSF，1.0mmol/L;Leupeptin，2.0μg/mＬ)裂解细胞，冰浴30min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10000g4℃离心15min，上清液即为细胞提取物，保存样品于-20℃备用。BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检测总蛋白浓度。按分子克隆的操作进行免疫印迹杂交测定:取样本30μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。1:500稀释的抗CTGF多抗杂交4℃过夜，1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二