结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析

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1、结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析作者：苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓柯【关键词】结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA　　PreparationandantigenicityassayofrebinantprotEinsofMycobacteriumtuberculosis　　【Abstract】AIM:TocloneandexpresstheMr16×103andMr38×103protEInsofMycobacteriumtuberculosisinE.coli，andtocharacterizeits

2、antigenicityandspecificity.METHODS:TheMr16×103andMr38×103antigengenesplifiedfromMycobacteriumtuberculosisgenomeDNAbypolymerasechainreactionsandclonedintopGEX4T2expressionvectoraftersequencing.BL21strainofE.coliednchromatography.Theantigenicityandspecificityofpurifiedprote

3、insatedbyenzymelinkedimmunoabsorbantassay.RESULTS:TheBL21strainsofE.colig/L）andMr38×103（217mg/L）geneexpressionsafterinduction.ThesensitivityofMr16×103andMr38×103proteinstuberculosis.　　【Keytuberculosis；antigen；geneexpression；enzymelinkedimmunoabsorbantassay　　【摘要】目的：克隆表达结核分

4、枝杆菌Mr16×103和Mr38×103重组蛋白，测定其抗原性和特异性.方法：利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr16×103和Mr38×103抗原基因，经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性.结果：携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为42％和18％；Mr16×103和Mr38×103蛋白量分别为：688mg/L和217mg/L.其中Mr16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的

5、灵敏度为67.0％,特异性为100％,准确性为84.0％；Mr38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为79.8%,特异性为99%，准确性为89.7%.结论：以Mr16×103，Mr38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.　　【关键词】结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA　　【中图号】R378　　0引言　　结核病仍是目前危害全球人类健康的重要传染病，我国每年约有13万人因结核病而死亡.对结核病的实验诊断主要依据细菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培养周期长，达不

6、到快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方法，血清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈.我们利用基因工程重组方法，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的Mr16×103和Mr38×103蛋白，以Mr16×103和Mr38×103重组蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验测定两种抗原的反应性和特异性，以期证实其在血清学诊断中的价值.　　1材料和方法　　1.1材料结核分枝杆菌H37RV标准株（菌株号：ATCC27294）：购自卫生部国家菌种保存中心.E.coliDH5α，E.coliBL21由第四军医大学西京医院检验科保存；T4连接酶、

7、限制性核酸内切酶BamHⅠ,EcoRⅠDNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Vitagene公司；GST亲和层析柱GSTrapFF购自Pharmacia公司；pGEX4T2表达载体购自Pharmacia公司.　　1.2方法　　1.2.1结核分枝杆菌Mr16×103，Mr38×103抗原基因的PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv培养物经煮沸灭活，蛋白酶K消化过夜，经酚.氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA.通过PCR扩增Mr16×103，Mr38×103基因.Mr16×103抗原基因引物为：5′AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCG

8、TTCAG3′含BamHI酶切位点和起始密码子，5′TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3′含XohI酶切位点和终止密码子，预期扩增产物435bp.Mr38×10