无指盘臭蛙和山溪鲵皮肤及卵中3种生物活性多肽的分离鉴定和克隆

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1、南京农业大学博士学位论文无指盘臭蛙和山溪鲵皮肤及卵中3种生物活性多肽的分离鉴定和克隆姓名：韩曜平申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：夏德全;吴婷婷20060601中文摘要无指盘臭蛙及山溪鲵皮肤及卵中生物活性多肽的分离鉴定与克隆摘要两栖类动物属于一类可持续利用的自然资源，它们具有多种多样的科研及利用价值。此外，它们的组织中合有大量的分子结构特殊、功能复杂多样的生物活性物质，它们是有待于开发的资源宝库。中国拥有丰富的两栖类动物资源，共有284个种(亚种)，其中2／3是特有种类，它是我国生物资源的重要组成部分，也是人类的宝贵财富，对我国两栖类动物资源的开

2、发利用有很大的潜力。目前，已分离鉴定出许多具有各种生物活性的蛋白及多肽。我们收集分布于中国西南境内的2种常见的药用、食用两栖类：山溪鲵(Batrachuperuspachunii)及无指盘臭蛙(Ranagrahami)，并对这2种两栖类皮肤分泌液及其卵进行了如下一系列的生物活性筛选研究：(1)以发色底物对2种两栖类动物皮肤分泌液进行丝氨酸蛋白酶水解活性和丝氨酸蛋白酶抑制剂活性测定，山溪鲵皮肤分泌液无丝氨酸蛋白酶水解活性，无指盘臭蛙皮肤分泌液及卵匀浆液显示较强的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性；(2)2种两栖类皮肤分泌液具有较强的抗茵活性，而其卵匀浆液则无明显抗菌作用

3、；(3)2种两栖类的皮肤分泌液不具备出血活性，无指盘臭蛙卵匀浆液显示较弱的溶血活性，而山溪鲵卵匀浆液无溶血活性。(4)2种两栖类皮肤分泌液及其卵匀浆液对正常人血浆的复钙时间没有明显的影响，即它们对正常人血液没有明显的促凝和抗凝作用。进一步通过生物化学，分子生物学手段和研究方法，分别从2种两栖动物皮肤分泌液或卵匀浆液中，我们得到了3种生物活性多肤类或蛋白类物质，包括两个抗菌肽、两个丝氨酸蛋白酶抑制剂及fS-microseminoprotein样蛋白。并分别对这几类活性多肽类或蛋白类物质进行了进一步研究。通过SephadexG．50凝胶过滤、反相高压液相等生化

4、技术手段，从无指盘臭蛙皮肤分泌浪中得到两个具有广谱抗菌活性的抗菌肽．该两个抗菌雕k擀ggrahamin1andgrahamin2。Edman降解法测序结果grahamin1的氨基酸序列为GLLSGILGAGKNIVCGLSGLC；grahamin2的氨基酸序列为GLLSGILGAGKHIVCGLSGLC；快原予轰击质谱分析表明，grahamin1及grahamin2的分子量分别为1942Da和1965Da，结果与理论分子量(1942．5Da和1965．6Da)基本相符。grahamin1及grahamin2氨基酸序列比较分无指盘臭蛙和山溪鲵皮肤及卵中生物活

5、性多肽的分离鉴定和克隆析显示，两个抗菌肽只有一个氨基酸残基的差异，在他们的c．末端包含有蛙属动物共有的Ranabox区域；他们具有净电荷、碱性氨基酸数目、疏水性等抗菌肽的典型特征。同源性比较显示，纯化得到的两个抗菌肽与来源于黑斑蛙皮肤分泌液的nigrocins有66％的同源性；利用测序得到的N一末端氨基酸序列并参照其他蛙类编码抗菌肽的核苷酸序列设计引物，从无指盘臭蛙皮肤eDNA文库中克隆及筛选到两个cDNA序列。由这两个序列推导的氨基酸序列中包含了分离纯化得到的两个抗茵肽的氨基酸序列。综合以上信息，grahamin1及grahamin2属于包含一个内二硫键

6、的单链抗菌肽家族。通过分子筛、离子交换层析及反相高压液相色谱等分离纯化程序，从无指盘臭蛙卵的匀浆液中得到了两个表观分子量约为40kDa和14．4kDa的单链蛋白。它们分别被命名为RGETI一1和RGETI一2。RGET[一1对胰蛋白酶具有专一性的抑制活性，对胰蛋白酶的抑制常数为29．5nM。测得RGETI．1的N一末端部分氨基酸序列为KDRACKLSPDVGPCKAYMQRC。经BLAST搜寻比对，该蛋白与来源于加蓬湾蝮蛇(Biasgabonica)蛇毒腺液及棕色狗蜱(R厅ipicephalussanguineus)唾液腺的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂

7、分别有57％和87％的同源性，该蛋白的12～15氨基酸残基位点与典型的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂活性中心完全相同。结合其N．末端氨基酸序列BLAsT搜寻结果及性质，推测该蛋白属于Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。RGETI．2对胰蛋白酶．枯草杆菌蛋白酶及弹性蛋白酶具有抑制活性；对这三类酶的抑制常数分别为0．24uM、4．4nM开口0．637uM。酸碱稳定性及热稳定性分析显示，RGETI．1和RGETI一2在PH2．11及30℃．100℃的条件下，均能保持抑制剂活性，显示其潜在的应用价值。从山溪鲵(Batraehuperuspaehunii)皮肤匀

8、浆液中经过SephadexG-50凝胶过滤、AKTA嘧Resour