重组DNA技术III

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1、六、重组DNA技术的应用ApplicationofRecombinantDNATechnology（一）重组蛋白的生产ProductionofRecombinantProtein目的：大量生产与人类生活密切相关的蛋白质，以用于食品、医疗等行业生长激素胰岛素白细胞介素干扰素凝血因子VIII等等表达系统组成基因/外源DNA序列表达载体强启动子；核糖体结合位点(SD序列)；终止子选择标记；复制子表达宿主蛋白质表达的基本程序1、目标基因克隆入表达载体，获得表达质粒。2、表达质粒导入宿主细胞。3、目标基因在宿主中

2、的表达。4、目标蛋白的分离、纯化。常见表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统体外翻译系统动物/植物表达系统（转基因动物/植物）常见表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统体外翻译系统动物/植物表达系统（转基因动物/植物）大肠杆菌表达系统表达目标蛋白质的首选表达系统。已表达了数百种重组蛋白：人胰岛素，IFN-α2，生长激素等等。特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低。缺点：翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等。致热原的影响：内毒素

3、。大肠杆菌表达系统启动子：1、受IPTG诱导Tac(trp-lac)：Pharmacia公司的pKK223-3质粒Trc(trp-lac)：Pharmacia公司的pTrc99A质粒Lac：pUC,pTZ，pSK，pBluescript，pGEM等表达的蛋白通常与β-半乳糖苷酶氨基端融合T7噬菌体启动子：pET系统2、受温度变化诱导λ噬菌体PL启动子：受温度敏感型阻抑物cIts857调控商品化大肠杆菌表达系统pETsystemandpETBlue™system：Novagen公司是原核蛋白表达中应用最多的系

4、统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌目前共有包括36种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。pBAD表达系统：Invitrogen公司可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度QIAexpressExpressionSystem：Qiagen公司大肠杆菌表达系统融合表达融合表达目的：目标蛋白附着于已知酶功能和/或抗原组成的结构域，便于标记与分离。靶蛋白与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特

5、定的细胞区。运载蛋白能保护靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶解作用。运载蛋白可改善靶蛋白的溶解性，防止形成不溶性包含体。融合方式：6×HisTag融合－半乳糖苷酶融合trpE融合蛋白谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合硫氧还蛋白（Trx）融合麦芽糖结合蛋白（MBP）融合碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列大肠杆菌表达系统融合表达融合表达目标蛋白的释放：1、化学裂解法：特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基。溴化氢（Met-）、BNPS-3－甲基吲哚、羟胺等。问题：裂解位点的特异性低和可能对目标蛋白

6、产生不必要修饰。2、酶解法：反应条件温和，具有高度的特异性。Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。问题：成本高，反应时间长，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。3、IMPACT系统(inteinmediatedpurificationwithanaffinitychitin-bindingTag)特点：由枯草杆菌来源的几丁质结合域（5kD，chitinbindingdomain，用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件intein组成一个双效的fusiontag。in

7、tein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，释放出与之相连的目的蛋白。优点：融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusiontag的精确切割。缺点：含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统。大肠杆菌表达系统目标蛋白溶解性现象：外源蛋白在大肠杆菌中过量表达时，常形成不溶性的包含体。好处：有利于易被降解蛋白质的表达。方便纯化。缺点：操作复杂，需经变性复性过程。产量不稳定，可能无生物活性。用盐酸胍或尿素变性溶解包含体中的蛋白质。透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠复性。解决不溶性的办法：低温表达降低表达

8、水平选择不同的宿主菌融合表达利用含有原核信号肽的载体进行表达。对真核分泌蛋白尤其有效。常见表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统体外翻译系统动物/植物表达系统（转基因动物/植物）酵母表达系统酵母具有微生物和真核生物的双重特点：1、基因背景了解清楚，生长迅速，非常适于大规模发酵。2、具有真核细胞对翻译蛋白的加工及修饰过程：如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工。表达产