重组DNA技术(交)

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1、第十四章重组DNA技术主讲教师：张涛重组DNA技术的发展简史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉第一节重组DNA技术的相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体宿主细胞一、克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为

2、克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。重组DNA技术实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学(r

3、ecombinantDNAbiotechnology)，又称为基因工程（遗传工程）。二、工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶碱性磷酸酶DNA聚合酶Ⅰ末端转移酶TaqDNA聚合酶反转录酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接碱性磷酸酶切除末端磷酸基合成双链DNA聚合酶ⅠcDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53

4、聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGG分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修

5、饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GCATGCCGTACGNcoⅠCGGTACCATGGC+CCATGGGGTACCHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口GTCCAG同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。

6、（来源不同的同一种限制性内切酶）GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA同裂酶（isoschizomer）识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称为同裂酶（isoschizomer）。XmaⅠSmaⅠCCCGGGGG

7、GCCCCCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC++CCCGGGGGGCCC第二节重组DNA技术的基本原理一、基本程序目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程二、重组DNA技术步骤1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（一）目的基因的获取化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序

8、列推测可能的DNA序列组