鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响

《鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号Ｒ４密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５４＾ｔ硕士学位论文（专业学位）鞘内注射Ｒｅｅｌｉｎ重组蛋白对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响研究生姓名：邓思敏指导教师、职称：旷昕副教授专业学位类别（领域）：临床医学（麻醉学）研究方向：神经病理性疼痛所在学院一：南华大学第临床学院二〇—八年五月 ？名爹论文题目鞘内注射Ｒｅｅｌｉｎ重组蛋白对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响论文作者签名：雜、吖＾指导棚签名：＾ｉｙｊ—论文评阅人１：草中成，副教桴，硕导，ｋ华太学疾学院评阅人２：顾洪丰，副教授，硕导，南华太学民学院答辩委员会主席：杨全凤，教桴，博导，湖南省肿瘤民院委员一１：唐小卿，教棬医院，博导，南华大学附属第委员２：田绍玄，教枵，硕导，南华大学医学院委员３：王德明，教授，硕导，南华大学附属第二医院委员４：遭濱湘，丰仵疾师，衡阳市中心医院答辩日期：２０１８年５月１８日 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年乂月＃日＾南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博／硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文，本论文的研究内容不得以其它单。本论文的研究成果归南华大学所有位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，ｇ卩：学校有部权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享论受相关权益。同意授权中国科学信息技术研宄所将本学位论文收录到《中国学位解文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，密后适用该授权。作者签名：年，月沭日导师签名：年ｙ月４日 本研究由国家自然科学基金资助（NO81300971） 鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响摘要目的探讨鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤（chronicconstrictioninjury，CCI）模型中大鼠疼痛行为学及脊髓水平Reelin信号通路下游蛋白Dab1磷酸化、星形胶质细胞的活化及TNF-α表达的相关性研究。方法鞘内置管成功的SD雄性大鼠54只，无运动功能障碍，体重250-400g，年龄8-10周，随机数字表法分成三组，Sham组（假手术+鞘内注射PBS）（n=18)，CCI组（坐骨神经结扎+鞘内注射PBS）(n=18)，RELN组（坐骨神经结扎+鞘内注射Reelin重组蛋白）(n=18)。RELN组与CCI组采用4-0羊肠线结扎右侧坐骨神经建立慢性疼痛模型，Sham组予以暴露坐骨神经但不结扎。RELN组于CCI术后第10天鞘内注射Reelin重组蛋白5μl(0.01μg/μl)，其余组给予5μlPBS溶液。记录CCI术前1天，术后1、4、7、10、11、12、13、14、15、17、21天大鼠右侧后足底痛行为学指标，包括热缩足潜伏期（pawwithdrawalthermallatency,PWTL）和机械缩足阈值（pawwithdrawalmechanicalthreshold,PWMT）。分别于给药后1小时，给药后3天处死大鼠，取右侧腰膨大部位脊髓背角，采用免疫组化、Westernblot方法检测Dab1磷酸化、GFAP、TNF-α的表达情况。结果（1）术前各组大鼠的基础PWMT和PWTL无明显区别。Sham组大鼠前后PWTL和PWTL无明显差异；CCI组大鼠从术后第1d开始各时间点PWMT和PWTL均低于Sham组（P<0.05）,且持续至术后第21d。RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1h、1、2、3、4、5d大鼠的PWMT和PWTL明显增加（P<0.05）。（2）免疫组化的结果I 与Westernblot的结果显示，与Sham组相比，CCI组手术侧大鼠脊髓背角Dab1磷酸化的表达明显减少（P<0.05），术后第10d、13d脊髓背角GFAP、TNF-α的表达上调。与CCI组相比，RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1小时、给药后3d大鼠右侧脊髓背角p-Dab1表达明显增加（P<0.05）,大鼠脊髓背角GFAP、TNF-α的表达明显减少（P<0.05）。结论鞘内注射Reelin重组蛋白可以缓解神经病理性疼痛，其机制可能与其抑制脊髓背角星形胶质细胞的活化及TNF-α的表达有关。关键词：神经病理性疼痛；Reelin；慢性压迫性损伤；星形胶质细胞；TNF-αII EFFECTOFINTRATHECALINJECTIONOFREELINRE-COMBINANTPROTEINONCHRONICNEUROPATHICPAININRATSSiminDeng(Anesthesiology)DirectedbyXinKuangAbstractObjective:Toinvestigatethecorrelationbetweenintrathecalinjec-tionofReelinrecombinantproteinandchronicsciaticnervecompressioninjuryinratswithpainbehaviorandspinalcordReelinsignalpathwaydownstreamproteinDab1phosphorylation,astrocyteactivationandex-pressionofTNF-α.Methods:MaleSprague-Dawleyratswithsuccessfulintrathecalcatheterization,withoutmotordysfunction,weighing250-400g,aged8-10weeks,wereenrolledinthisstudy.Themethodofrandomdigitaltablewasdividedintothreegroups:Shamgroup(sham-operation+intrathecalinjectionofPBS)(n=18)、CCIgroup（Sciaticnerveligation+intrathecalinjectionofPBS)(n=18)andRELNgroup(Sciaticnerveligation+intrathecalinjectionofReelinrecombinantprotein）(n=18).ThechronicpainmodelwasestablishedinRELNgroupandCCIgroupwith4.0liga-tionofrightsciaticnerve.ThesciaticnervewasexposedbutnotligatedinShamgroup.TheRELNgroupreceivedintrathecalinjectionofreelinre-combinantprotein5μl(0.01μg/μl)onthe10thdayafterCCI.Therestgroupwasgiven5μlPBSsolution.Thepainbehavioroftherighthindplantaroftheratswasrecorded1daybeforeand1、4、7、10、11、12、13、14、15、16、17、21dayafterCCI.Theseincludepawwithdrawalthermallatencyandmechanicalfootcontractionthresholdpawwithdrawalmechanicalthreshold.Theratswerekilledat1hourafteradministrationIII and3daysafteradministration.Thedorsalhornofspinalcordwastakenfromtherightsideoflumbarenlargementtobeusedtodetecttheexpres-sionofDab1phosphorylated、GFAPandTNF-αbyimmunohistochemicalWesternblotmethod.Results:（1）TherewasnosignificantdifferencebetweenthebasicPWMTandPWTLineachgroupbeforeoperation.Fromthefirstdayafteroperation,theexpressionofPWMTandPWTLintheCCIgroupwaslowerthanthatintheShamgroup(P<0.05),andlasteduntilthe21stday.AfterintrathecalinjectionofReelinrecombinantprotein,thePWMTandPWTLwereincreasedsignificantlyat1hour、1、2、3、4、5dayafterintrathecalinjectionoftherecombinantReelinprotein(P<0.05).（2）TheresultsofimmunohistochemistryandWesternblotshowedthat，comparedwithShamgroup,theexpressionofDab1phosphorylationinspinaldorsalhorndecreasedsignificantly(P<0.05)onthe10thand13thdayafterCCIoperation,andtheexpressionofGFAP、TNF-αinthespinaldorsalhornwasup-regulated.ComparedwiththeCCIgroup,theexpressionofDab1phosphorylationinthedorsalhornofspinalcordwassignificantlyin-creasedinRELNgrouponthe1hourand3dayafterintrathecalinjection(P<0.05),theexpressionofGFAPandTNF-αinthedorsalhornofspi-nalcorddecreasedsignificantly(P<0.05).Conclusion:IntrathecalinjectionofReelinrecombinantproteincanrelieveneuropathicpain,anditsmechanismmayberelatedtotheinhibi-tionoftheactivationofastrocytesandtheexpressionofTNF-αinthedorsalhornofspinalcord.Keywords:NeuropathicpainReelinChroniccompressiveinjuryAstrocyteTNF-αIV 主要英文缩略语索引缩略词英文全称中文全称CCIchronicconstrictioninjury慢性压迫性损伤DRGdorsalrootganglia背根神经节GFAPglialfibrillaryacidicprotein胶质纤维酸性蛋白IODintegralopticaldensity光密度ICAM-1intercellularcelladhesionmolecule-1细胞间粘附分子-1ITintrathecalinjection鞘内注射PWMTpawwithdrawalmechanicalthreshold机械缩足阈值PWTLpawwithdrawalthermallatency热缩足潜伏期RELNRecombinantReelinReelin重组蛋白VCAM-1vascularcelladhesionmolecule1血管粘附因子-1V 目录摘要......................................................IAbstract.................................................III主要英文缩略语索引........................................V第一章绪论...............................................1第二章材料与方法.........................................52.1材料...............................................52.1.1试剂...........................................52.1.2仪器...........................................62.2方法...............................................72.2.1实验动物.......................................72.2.2鞘内置管模型制备...............................72.2.3制备CCI模型..................................72.2.4实验分组.......................................82.2.5疼痛行为学检测.................................82.2.6鞘内给药.......................................92.2.7免疫组化.......................................92.2.8蛋白免疫印迹杂交法（WesternBlot）.............10第三章结果..............................................133.1大鼠行为学观察和痛阈值变化........................133.1.1大鼠行为学观察................................133.1.2CCI组大鼠行为学变化..........................133.1.3鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠行为学的影响......153.2CCI术后大鼠脊髓水平Reelin下游蛋白p-Dab1表达减少，鞘内注射Reelin重组蛋白后增加p-Dab1的表达.................17 3.3CCI术后大鼠脊髓水平GFAP表达增加，鞘内注射Reelin重组蛋白可减少GFAP的表达...................................183.4CCI术后大鼠脊髓水平TNF-α表达增加，鞘内注射Reelin重组蛋白可减少TNF-α的表达..................................20第四章讨论..............................................21第五章结论..............................................25参考文献.................................................27综述.....................................................33致谢.....................................................41 第一章绪论神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP)是临床上较为常见的但较难治疗的慢性疼痛性疾病，主要是外周或中枢神经系统出现了病变亦或是功能紊乱而引起的疼痛，一般由毒物、外科手术、感染、代谢性疾病、自身免疫性疾病、神经受压或创伤和癌症等等原因所致；其特征性的表现为痛觉异常、痛觉过敏甚至自发性疼痛[1,2]。有研究称，欧洲有百分之二十的慢性疼痛患者属于神经病理性疼痛[3]。神经病理性疼痛常呈现为慢性化病程，往往是在神经损伤愈合后或者炎症消退后，持续数月甚至数年，且治疗效果差，费用高昂，且给患者的身心带来极大地影响，容易出现抑郁、焦虑等症状，严重影响患者的生活质量[4]。Reelin是一种大分子的细胞外基质糖蛋白,存在于几乎所有的脊椎动物内，主要作用于中枢神经系统的发育和正常功能的维持，如调节胚胎神经元发育过程中神经元的发生和迁移，突触的形成与结构调节和其功能的性质，出生后维持神经元的可塑性，神经－肌肉联系的控制以及神经传递[5]。Reelin受体有三种高亲和力的受体，它们分别是载脂蛋白E受体2（ApoER2）、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)和α3β1整合素。Reelin与上述受体结合后，诱导Dab1酪氨酸磷酸化，从而激活下游信号通路发挥作用[6]。Reelin表达异常被发现常与许多神经系统疾病相关，如阿兹默海病、精神分裂症和双向情感障碍等[7]。我们的前期研究发现，在CCI慢性疼痛大鼠模型中，脊髓水平的Reelin表达明显下降，而鞘内注射（intrathecalinjection）Reelin基因干扰慢病毒，使得热缩足潜伏期和机械缩足潜伏期出现显著下降，说明Reelin参与神经病理性疼痛的发生，但其具体机制尚不明确。近年来的研究表明，神经病理性疼痛的发展可能与神经系统或炎症免疫及免疫样神经胶质细胞的活性有关，还可能与免疫细胞来源的细胞因子相关[8]。胶质细胞约占大脑和脊髓总细胞总数的百分之七十[9]，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞等。以往人们认为中枢神经胶质细胞的作用仅仅是神经营养支持和免疫保护。最近的研究还指出其在疼痛发生、发展中有一定的作用。神经损伤或炎症后,外周和中枢的神经胶质细胞迅速活化,并释放大量的炎性因子,参与神经病理性疼痛发生和维持[10]。胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是胶质细胞的主要成分之一，属细胞骨骼蛋白，是胶质细胞的主要骨架成分,通常把GFAP认为是星形胶质细胞的一种标志性蛋白。在多种急、慢性疼痛模1 [11][12]型，如神经结扎模型、分支损伤模型、三叉神经损伤模型等中均可观察到脊髓星形胶质细胞的活化及胶质纤维酸性蛋白GFAP的显著增加。GFAP缺乏的小鼠在周围神经损伤后通常会产生类似疼痛的行为，在周围神经损伤后6周后给予GFAP反义寡核苷酸治疗可以逆转这种疼痛[13]。在病理性疼痛刺激下，星形胶质细胞特异性标志物GFAP的水平显著增加，被激活的胶质细胞释放神经活性物质,如过氧化物、EAAs、前列腺素、白三烯等。上述物质作用于突触后背角痛觉传递神经元,增强其敏感性及反应性，产生持续性疼痛。胶质细胞受到激活后还会释放前炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，这些炎症介质能够进一步激活胶质细胞，同时与神经元上的受体结合，增强神经元的活性。这些因子除了本身具有较强的致痛作用，还能促进致痛物质（如P物质和缓激肽）的分泌。星形胶质细胞还会增强胶质细胞和巨噬细胞吞噬髓鞘的作用，导致痛觉过敏的发生，并通过细胞间缝隙连接偶联形成的网络结构以钙振荡或钙波的形式引起痛觉播散。神经损伤后，在损伤部位、背根神经节（dorsalrootganglia,DRG）、脊髓的非神经元细胞，释放多种炎症介质参与调节伤害性信息的传递。在受损神经,出现免疫细胞浸润并对神经病理性疼痛的早期启动发挥重要作用[14,15]。神经损伤后，肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞等免疫细胞所产生的炎性级联反应，以及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，是神经病理性疼痛形成和持续的关键因素，这些免疫细胞通过释放大量炎性介质，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等[16]，最终导致疼痛的产生。杨瀚杰等[17]的研究表明，在脑缺血模型中，NF-kB被激活，Reelin基因缺失的小鼠在脑缺血后表现出神经再生功能障碍，且梗死面积增加。使用NF-KB抑制剂后，NF-KBp50显著降低，Reelin蛋白表达上调，TNF-α表达减少。Li等[18]人认为，VLDLR基因敲除上调炎症反应因子ICAM-1（细胞间粘附分子1）及IL-18的表达，活化MAPK/Akt/NF-kB信号通路。此外，VLDLR基因敲除小鼠的视网膜中，TNF-α、eNOS、COX2的表达增加，NF-κB和HIF-1α的水平也是明显升高的[19]。极低密度脂蛋白受体是Wnt信号通路的负调控因子[20]，而Wnt信号通路则介导炎症反应[21]及NF-κB的激活[22]。ApoE通过ApoER2/VLDLR信号通路使巨噬细胞从MI促炎表型转换成M2抗炎表型，从而发挥抗炎作用，而ApoER2/VLDLR又是Reelin的最主要的受体。ApoE的缺乏可加重星形胶质细胞的损伤，2 同时，ApoE基因敲除可导致小鼠脑部IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达增加。在人结肠癌Caco-2细胞中，单克隆抗-α3整合素抗体导致整合素α3β1的活化，抑制IL-1的表达[23]从而抑制IL-1诱导的IL-6、IL-8的表达以及MCP-1的分泌[24]，在肠上皮中同样也有此作用[25]。Barr,L.等人的研究表明，整合素α3β1的表达降[26]低与小细胞肺癌的侵袭性和转移性和预后不良有关。在人肺癌细胞中，整合素α3沉默上调CDKs（细胞周期蛋白依赖激酶）和NF-κB以及Bcl-2的表达，从而促进细胞增殖[27]。与野生型相比，出生后2天NF-κBp50亚基缺乏的小鼠皮质中BLBP(放射状胶质细胞发育过程中的标志物)和Reelin的表达水平是上调的[28]。这种作用可能与Notch1活化有关[29]。脓毒症时人和小鼠中中性粒细胞整合素α3β1表达上调，然而在不严重的非感染性SIRS中，没有观察到明显的α3β1表达上调。α3β1缺乏的中性粒细胞可以减少TLR诱导的炎症反应。整合素α3β1的抑制剂可以减少中性粒细胞浸润和小鼠脓毒症的致死率，α3β1高表达的中性粒细胞中IL-6mRNA、IL-10mRNA的表达明显上调，TNF-αmRNA轻微上调。因此，在感染性炎症中α3β1整合素成为中性粒细胞的募集和活化的重要黏附受体[30]。在外周血中，Reelin促进血管粘附因子-1（VCAM-1）以及细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达以及增加白细胞血管内皮粘附作用。而Apoer2基因敲除siRNA可以预防Reelin的这种促进作用。Reelin还诱导IkBα的磷酸化从而使NF-kB的活性增加[31]。在CCI大鼠模型中，大鼠脊髓水平Reelin的表达减少，且这种变化与疼痛的程度呈正相关，表明Reelin表达变化可能对慢性压迫性神经痛的产生或发展有重要意义。在外周神经水平，神经损伤后，施万细胞可产生大量的Reelin并起到修复神经髓鞘和抑制神经性疼痛的作用，Reelin基因敲除小鼠脊髓背角浅层的神经元发生明显的排列异常且对热痛和机械刺激的敏感性表现出异常，而Reelin及Reelin的三个高亲和力受体ApoER2、VLDLR和α3β1整合素可以调节GFAP及相关炎症因子的表达。综上所述，我们认为Reelin可能通过调节星形胶质细胞的活化及炎症因子的表达参与神经病理性疼痛的发生。本实验通过鞘内注射Reelin重组蛋白上调Reelin的表达，观察大鼠行为学的变化以及星形胶质细胞、炎症因子的变化情况，探讨Reelin参与神经病理性疼痛的机制。3 4 第二章材料与方法2.1材料2.1.1试剂名称公司/货号10%水合氯醛上海化学试剂公司异丙醇上海化学试剂公司无水乙醇上海化学试剂公司RIPA裂解液（强）康为世纪BCA蛋白浓度测定试剂盒康为世纪彩色预染蛋白markerProteintech超敏化学放光显色试剂盒康为世纪脱脂牛奶康为世纪5XSDS-PAGEloadingbufferAuragene羊抗兔二抗ProteintechGAPDHProteintechAnti-Phospho-Dab1(Tyr220)(3327)CSTRecombinantMouseReelinProtein(3820)R&DSystemsAnti-GFAP(WL0836)万类生物Anti-TNF-α（60291-1-Ig）Proteintech枸橼酸钠缓冲溶液武汉百浩天生物聚合物增强剂广州深达生物酶标抗鼠/抗兔聚合物广州深达生物DABDako苏木素迈新试剂Tris康为世纪APS康为世纪SDS康为世纪TEMED康为世纪Tween-20康为世纪5 名称公司/货号丙烯酰胺康为世纪甘氨酸康为世纪2.1.2仪器名称公司vonfrey纤维丝Stolting公司热痛刺激仪BME-410C中国医学科学院生物工程研究所4-0羊肠线上海浦东金环公司电泳槽北京六一电泳仪北京六一转膜仪北京六一旋涡混合器其林贝尔磁力搅拌器荣华精密PH计雷磁电动玻璃匀浆器新芝紫外/可见光分光光度计PerkinElmar公司精密分析天平Mettler公司医用净化工作台吴江市净化设备总厂-80℃超低温冰箱Sanyo公司Tip头（10μL、200μL、1000μL）长沙艾杰生物移液枪（10μL、200μL、1000μL）大龙仪器PE-10导管福州赛思生物水平摇床北京六一仪器厂恒温摇床金坛台式冷冻高速离心机鑫奥酶标仪Thermo低速离心机长沙鑫奥96孔细胞培养板Costar6 2.2方法2.2.1实验动物6-8周SD雄性大鼠，体重250-400g，购买于长沙天勤公司，五只一笼，昼夜节律正常，室温22°C左右，自由摄食、取水。适应环境一周。2.2.2鞘内置管模型制备在CCI术前三天行鞘内置管。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3g/kg）麻醉后，取俯卧位，妥善固定四肢于手术台上，用注射器将腰部垫高充分暴露，剃去颈部及腰部毛发，络合碘消毒三遍，L6平行于两侧髂棘连线，以L3、L4为中点平行于脊柱做一长约1cm纵行切口，沿棘突周围钝性分离双侧肌肉，用丝线固定两侧肌肉充分暴露L3、4间隙，继续钝性分类间隙周围肌肉筋膜组织，用眼科剪剪去L4棘突上缘，间隙内椎板上可见一小圆孔；选用去掉尖端的25G注射器针头沿小圆孔刺入，刺破硬脊膜及黄韧带，观察到大鼠有甩尾动作。退出针头，沿该破口轻柔置入PE-10导管约2cm左右，方向朝头侧，与脊柱纵轴平行；导管置入时大鼠有持续甩尾并可见清亮脑脊液流出；若置管不顺利，可用止血钳夹住L3棘突向上提起后再用镊子夹住导管置入。将导管固定在肌肉筋膜上，并通过皮下引到颈部穿出，预留约2cm，妥善固定，生理盐水冲洗后封管。冲洗伤口，间断缝合肌肉、筋膜及皮肤。再次用络合碘消毒，涂抹红霉素软膏，合适环境复苏，术后单笼饲养。术后连续3天腹腔注射青霉素12万U/只预防感染。术后第2天，经导管注入2%利多卡因20ul，30s内出现双下肢软瘫、尾巴下垂，30分钟内自行恢复则视为置管成功。2.2.3制备CCI模型腹腔注射10%水合氯醛（0.3g/kg）麻醉后，参照Bennet和Xie的方法制作慢性压迫性神经病理性疼痛（CCI）模型：大鼠取俯卧位，固定四肢于手术台上，取大鼠右后肢，剃毛后消毒铺巾，选择与股骨平行的右股骨下方约lcm处作为切口，钝性分离股二头肌间隙的肌肉，充分暴露坐骨神经，将坐骨神经与周围组织轻轻分离。坐骨神经分为三支，用含铬4.0羊肠线结扎神经起始处即分叉上方约2mm，共4道，每道间隔约1mm，松紧度判断标准为打结时见小腿肌肉轻微颤动；盐水7 反复冲洗伤口，间断缝合肌肉筋膜和皮肤。假手术组予充分暴露坐骨神经，但不予结扎，余手术步骤同前，所有手术均由一人操作。术毕将大鼠安放于干净温暖环境，自由摄食饮水，单笼饲养，造模当天腹腔注射青霉素12万U/只预防感染。2.2.4实验分组鞘内置管成功无下肢感觉运动功能障碍的SD大鼠共54只，随机数字表法分为3组：CCI+Reelin组（RLEN组，n=18），CCI+PBS组（CCI组，n=18），假手术+PBS组（Sham组，n=18）。2.2.5疼痛行为学检测CCI术前3天每天将大鼠置于测试箱中适应环境30分钟，CCI造模前1天测量疼痛行为学痛阈值指标，并与术后1，4，7，10，11，12，13，14，15，17，21天测量大鼠机械缩足阈值（PWMT）及热缩足潜伏期（PWTL）。行为学测定时间为08：00-18：00。2.2.5.1机械缩足阈值测定取单格为20cm×20cm×25cm大小的透明有机玻璃盒，底部为孔径为1cm×1cm的铁丝网，玻璃盒离地30cm，大鼠可自由活动。将SD大鼠置入玻璃盒中，使其适应环境约30min，待其梳毛、探索动作停止后开始测量。用VonFrey纤维丝垂直刺激大鼠右侧足底（一般为肉垫中心部位），力度应使得纤维丝弯曲成S形，持续时间约8秒，若大鼠出现提足躲避或舔舐则视为阳性反应。根据Tal[32]及Zhao[33]的方法，从2.0g按升序的顺序，每组VonFrey纤维丝刺激5次，若出现3次及以上阳性的最小纤维强度则视为该鼠的机械缩足阈值，最大刻度为15g。2.2.5.2热缩足潜伏期测定按Hargreaves法[34]测量大鼠热缩足潜伏期。将SD大鼠置于20cm×20cm×25cm大小的透明有机玻璃盒，底部为3mm厚度的有机玻璃板，玻璃板距离地面约36cm,大鼠可自由活动。将SD大鼠置入玻璃盒中，使其适应环境约30min，待其梳毛、探索动作停止、足底张开后开始测量。用BME-410C型热辐射刺激仪照射大鼠右侧足底固定区域，测量期间热辐射刺激仪焦距和光强度固定不变，将最长照射时间设置为29s以防止大鼠灼伤。测量时大鼠出现提足、舔舐、甩足等行为则视为阳性反应，记录出现阳性反应的时间；若29s仍为阴性则记为29s。重复测量5次，每次间隔5分钟以上，5次的平均值则视为该鼠的热缩足潜伏期。8 2.2.6鞘内给药于CCI造模后第10天鞘内注射Reelin重组蛋白。两人合作，一人固定大鼠于俯卧位，消毒PE-10导管，剪开封口，可见清亮脑脊液流出，将微量注射器连接于导管前端按组别注射药物。RLEN组注射Reelin重组蛋白5μl（0.01μg/μl，共300nmmol/L），注射时速度缓慢，待药物完全推入后，用另一微量进样器抽取10μl生理盐水冲管，立即用打火机封口；CCI及Sham组鞘内注射PBS5μl，生理盐水10μl；方法同RLEN组。2.2.7免疫组化2.2.7.1取材行为学检测后，重组蛋白注射后1小时，3天处死大鼠，立即取出腰膨大L4-5节段，迅速置于10%福尔马林内。2.2.7.2包埋1）固定：10%福尔马林过夜。2）冲洗：金属网中流水冲洗30min。3）梯度脱水：酒精：50%，2小时→70%，2小时→95%，1小时→100%，1小时×2次。4）透明：二甲苯20分钟×3次。5）浸蜡、包埋：透明组织块置于准备好的石蜡中，置于溶蜡箱保温。组织块全部被石蜡完全浸没后进行包埋：将已溶化的石蜡倒入事先准备好的容器中，快速夹取已浸透石蜡的组织块，待其冷却、凝固。6）切片。2.2.7.3免疫组化1）石蜡切片脱蜡至水：（染色前应置于60℃恒温箱1小时）：①二甲苯I、II，各10分钟。②梯度酒精：100%，2分钟→95%，2分钟→80%，2分钟→70%，2分钟。③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。2）加入过氧化物酶阻断剂：3%H2O2，室温10分钟（避光）；蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。3）抗原修复：枸橼酸钠缓冲液，盖过切片，放入高压锅内煮沸，上汽3分钟后取下阀门缓慢冷却；PBS：5分钟，2次（置于摇床）。9 4）正常血清封闭：滴加5%牛血清，37℃孵育15分钟，吸去多余液体。5）滴加一抗：滤纸吸干，滴加一抗，37℃孵育2小时；PBS洗涤5分钟，2次（置于摇床）。6）滴加二抗，37℃孵育30分钟。PBS洗涤5分钟，2次（置于摇床）。7）滴加SAB复合物，37℃孵育30分钟。PBS洗涤5分钟，2次（置于摇床）。8）DAB显色，镜下观察显色情况，约5min自来水冲洗。9）苏木素复染约30秒，自来水冲洗。10）自来水冲洗返蓝，15分钟。11）梯度酒精脱水：80%，2分钟→95%，2分钟→100%，2次，5分钟。12）二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5分钟。13）封片：中性树胶封片，晾干。2.2.7.4图像分析采图使用的是Scopeimage9.0，免疫组化分析采用IPP6.0软件。所测得积分光密度（Integralopticaldensity，IOD）表示蛋白表达强弱。2.2.8蛋白免疫印迹杂交法（WesternBlot）2.2.8.1样品制备1）取大约0.02g组织，PBS冲洗组织后，置于匀浆器中，加入200ulRIPA裂解液后冰上研磨。2）冰上，蛋白裂解30分钟。3）4℃，12000rpm离心15min。（提前开离心机预冷）。4）取上清液分装转移倒0.5ml的离心管中，保存于-20℃。2.2.8.2蛋白浓度检测10 1）稀释BSA标准品管号稀释液用量（μl)标准品用量（μl)最终浓度(μg/μl)A01002000B2002001000C200200(从B管中取)500D200200(从C管中取)250E200200(从D管中取)125F400100(从E管中取)25G200002）根据样品个数，按A：B=50:1的比例配制适量的BCA工作液，混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。3）微孔检测（检测范围：20-2000μg/ml）。4）分别将20μl稀释好的BSA标准品添加于96孔板的微孔中，每个测定重复三次。5）加5μl待检测样品到96孔板中，稀释至20μl。6）各孔均加入之前制备好的200μlBCA工作液，37℃孵育30min。7）测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。仅供下一步实验作为参考。2.2.8.3Westernblot（一）电泳1）按说明书比例配置10％分离胶，灌胶后，用异丙醇封胶。2）静置20-40min，当异丙醇和胶之间出现折射线时，倒去胶上层异丙醇并蒸馏水冲洗干净后用吸水纸吸干。3）按说明书比例配置5％的浓缩胶，将剩余玻璃槽注满浓缩胶后立即将梳子插入。4）配置电泳样品，根据每个样品总蛋白上50μg-100μg计算所需上样量，每孔上样量应一致，与5*loadingbuffer充分混匀，沸水浴煮5min。5）加入足够的现配电泳仪后开始上样，上样时应缓慢避免气泡产生，然后开11 始电泳。浓缩胶电泳电压设置为80V，约30min，分离胶电泳电压为120V，约90min。待溴酚蓝至胶底部时终止电泳。（二）转膜1.取12张滤纸和1张PVDF膜，与需要转膜的区域大小差不多即可。将PVDF膜置于甲醇中完全浸湿约10秒，然后转移到转膜缓冲液中。2.顺序要求是滤纸，PVDF膜，胶，滤纸，依次放好，每放置一层用玻璃棒将中间的气泡赶走。3.盖上仪器，接通电源，转膜200mA，2h。4.拔下电源，取出PVDF膜放入1*TBST中冲洗，时间约为5min。（三）封闭将膜放入装有TBST配制的5%脱脂牛奶的器皿中，室温孵育2小时。（四）一抗孵育用1*TBST将一抗按照一定比例稀释（GAPDH1：2000proteintech；GFAP1：1000万类生物；TNF-α1：1000proteintech；p-Dab11：500CST），将PVDF膜与稀释好的一抗一起放入杂交袋中，4度孵育过夜。孵育结束，1*TBST洗3次，每次10min。（五）二抗孵育用1*TBST将二抗按照一定比例稀释（HRP标记的兔二抗1：5000Proteintech），将PVDF膜与稀释好的二抗一起放入杂交袋中，室温孵育90min。孵育结束，1*TBST洗3次，每次10min。（六）显色/曝光ECL显色曝光：将试剂A和试剂B以1：1的体积比混匀，加入发光液与膜充分结合约3min，用吸水纸吸干，在暗盒内曝光数秒至数分钟；显影冲洗。2.2.8.4结果分析以GAPDH内参，使用ImageJ软件分析。2.2.9统计学处理实验数据采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，所有结果均以P<0.05认为差异有统计学意义。12 第三章结果3.1大鼠行为学观察和痛阈值变化3.1.1大鼠行为学观察CCI术后各组大鼠伤口愈合良好，一般情况可，进食、饮水状况与术前基本相同，毛发光泽度可，体重轻度下降。手术侧后肢稍外翻，行走时悬空不敢触地，跛行，站立时左侧负重。假手术组手术侧与健侧下肢行为学和形态无明显区别。3.1.2CCI组大鼠行为学变化3.1.2.1CCI术后大鼠热缩足潜伏期（PWTL）明显下降术前各组大鼠的热缩足潜伏期相比无明显差异，Sham组大鼠前后PWTL无明显差异；CCI组大鼠的PWTL从术后第1天开始与术前基础值相比，均有明显下降，且持续至术后第21天，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组相比，CCI组大鼠术后第1、4、7、10、11、12、13、14、15、17、21天的PWTL均有显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3.1）。CCISHAM2826#*24##*#**#*22##**20#**##18#*#**16Pawwithdrawalthermallatency(s)14-11471010(it1h)111213(it3d)14151721DayafterCCI(d)图3.1Sham组与CCI组各个时间点PWTL的变化注：与术前相比，CCI组大鼠的PWTL从术后第1天开始显著下降，且持续至术后第21天，#P＜0.05；与Sham组相比，CCI组大鼠术后第1、4、7、10、11、12、13、14、15、17、21天的PWTL均有显著下降，*P＜0.05。13 3.1.2.2CCI术后大鼠机械缩足阈值（PWMT）明显下降术前各组大鼠的机械缩足阈值相比无明显差异，Sham组大鼠前后PWMT无显著差异；CCI组大鼠的PWMT从术后第1天开始与术前基础值相比，均有显著下降，且持续至术后第21天，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组相比，CCI组大鼠术后第1、4、7、10、11、12、13、14、15、17、21天的PWMT均有显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3.2）。CCISHAM161412*#10*#*##*#8*#**#*#*#*#6*#*#4Pawwithdrawalmechanicalthreshold(g)2-11471010(it1h)111213(it3d)14151721DayafterCCI(d)图3.2Sham组与CCI组各个时间点PWMT的变化注：与术前相比，CCI组大鼠的PWWT从术后第1天开始显著下降，且持续#至术后第21天，P＜0.05；与Sham组相比，CCI组大鼠术后第1、4、7、10、*11、12、13、14、15、17、21天的PWWT均有显著下降，P＜0.05。14 3.1.3鞘内注射Reelin重组蛋白对大鼠行为学的影响3.1.3.1鞘内注射Reelin重组蛋白增加热缩足潜伏期（PWTL）术后1、4、7、10天两组大鼠PWTL与术前基础值相比均有显著下降，两组间比较无统计学差异。从术后第10天（即给药后1小时）开始，与CCI组相比，RELN组手术侧PWTL显著增加，且持续到术后第15天，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后第17、21天两组之间PWTL无显著差异（P>0.05）（见图3.3）。RELNCCI28**26****2422201816Pawwithdrawalthermallatency(s)14-11471010(it1h)111213(it3d)14151721DayafterCCI(d)图3.3RELN组与CCI组各个时间点PWTL的变化注：与CCI组相比，术后第10天（给药后1小时）开始，RELN组手术侧PWTL*显著增加，且持续到术后第15天，P＜0.05。15 3.1.3.2鞘内注射Reelin重组蛋白增加机械缩足阈值（PWMT）术后1、4、7、10天各组大鼠PWMT与术前基础值相比均有显著下降，两组间比较无统计学差异。从术后第10天（即给药后1小时）开始，与CCI组相比，RELN组手术侧PWTL显著增加，且持续到术后第15天，差异有统计学意义（P＜0.05），术后第17、21天两组之间PWMT无显著差异（P>0.05）（见图3.4）。RELNCCI1614**12****10864Pawwithdrawalmechanicalthreshold(g)2-11471010(it1h)111213(it3d)14151721DayafterCCI(d)图3.4RELN组与CCI组各个时间点PWMT的变化注：与CCI组相比，术后第10天（给药后1小时）开始，RELN组手术侧PWMT显著增加，且持续到术后第15天，*P＜0.05。16 3.2CCI术后大鼠脊髓水平Reelin下游蛋白p-Dab1表达减少，鞘内注射Reelin重组蛋白后增加p-Dab1的表达Westernblot结果显示：与Sham组相比，CCI组术后第10天（即给药后1小时）、术后第13天（即给药后3天）大鼠右侧脊髓背角水平Reelin下游蛋白p-Dab1表达显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。与CCI组相比，RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1小时（即CCI术后第10天）、给药后3天（即CCI术后第13天）大鼠右侧脊髓背角水平Reelin下游蛋白p-Dab1表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3.5）。AB图3.5各组大鼠脊髓背角p-Dab1的表达情况注：A：Westernblot检测各组大鼠右侧脊髓背角p-Dab1的表达；B：各组大鼠右侧脊髓p-Dab1/GAPDH比值结果。与Sham组相比，#P＜0.05；与CCI组相比，*P＜0.05。17 3.3CCI术后大鼠脊髓水平GFAP表达增加，鞘内注射Reelin重组蛋白减少GFAP的表达免疫组化结果显示：阳性表达呈棕黄色，定位于细胞质。与Sham组相比，CCI组术后第10天（即给药后1小时）、术后第13天（即给药后3天）大鼠脊髓背角光密度值显著增加，阳性细胞增多，胞体变大、突起增长、染色加深，差异有统计学意义（P＜0.05）；RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1小时（即CCI术后第10天）、给药后3天（即CCI术后第13天）大鼠脊髓背角光密度值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）(见图3.6)。AB图3.6各组大鼠脊髓背角免疫组化GFAP的表达情况注：A：免疫组化观察各组大鼠右侧脊髓背角GFAP的表达，箭头指示为阳性细胞（×400）；B：免疫组化IOD值结果。与Sham组相比，#P＜0.05；与CCI*组相比，P＜0.05。18 Westernblot结果显示：与Sham组相比，CCI组术后第10天（即给药后1小时）、术后第13天（即给药后3天）大鼠脊髓背角GFAP蛋白表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1小时（即CCI术后第10天）可显著减少GFAP的表达（P＜0.05），给药后3天（即CCI术后第13天）仍能减少GFAP的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）(见图3.7)。AB图3.7各组大鼠脊髓背角GFAP的表达情况注：A：Westernblot检测各组大鼠右侧脊髓GFAP的表达；B：各组大鼠右侧脊髓GFAP/GAPDH比值结果。与Sham组相比，#P＜0.05；与CCI组相比，*P＜0.05。19 3.4CCI术后大鼠脊髓水平TNF-α表达增加，鞘内注射Reelin重组蛋白减少TNF-α的表达Westernblot结果显示：与Sham组相比，CCI术后第10天（即给药后1小时）、术后第13天（即给药后3天）大鼠手术侧脊髓中TNF-α表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），RELN组鞘内注射Reelin重组蛋白后1小时（即CCI术后第10天）可显著减少TNF-α的表达（P＜0.05），给药后3天（即CCI术后第13天）仍能减少TNF-α的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）(见图3.8)。AB图3.8各组大鼠脊髓背角TNF-α的表达情况注：A：Westernblot检测各组大鼠右侧脊髓TNF-α的表达；B：各组大鼠右侧脊#*髓TNF-α/GAPDH比值结果。与Sham相比，P＜0.05；与CCI组相比，P＜0.05。20 第四章讨论疼痛是器官或组织受到外界损伤时的预警机制，疾病与疼痛相伴而生，而持续的慢性疼痛会给患者的身心带来极大的痛苦。神经病理性疼痛属于慢性疼痛，它是由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱而引起的。目前神经病理性疼痛的发病率逐年升高，其病程长与预后差的特点给临床治疗带来了极大地困难，严重影响人们的生活质量。自Yaksh[35]等人在1976年发明大鼠鞘内置管技术后，鞘内置管为疼痛的研究提供了极大的便利，其可以使药物绕过血脑屏障，能更加深入的研究脊髓水平各种药物的镇痛作用。该置管方法使得导管在大鼠蛛网膜下腔走形约7-9厘米，缺点主要是易出现导管打折、损伤脊髓等情况，对大鼠创伤大、术后瘫痪率、死亡率高等。而大鼠胸段置管法能有效的减少脊髓损伤、脑脊液漏以及定位不确定等缺点，但其设备要求高，操作过程复杂，因而没有广泛应用。改良的腰部置管法[36]因其在蛛网膜下腔内走形距离少，没有切除椎板，可以有效的避免上述缺点，增加置管成功率及大鼠存活率，虽然易受大鼠活动影响导致导管脱出，但妥善固定可有效避免上述情况的出现。本研究采用CCI作为疼痛模型。CCI是一种经典的神经病理性疼痛模型，其机制是用铬制羊肠线结扎使大鼠的坐骨神经干使其神经水肿，从而有选择的破坏有髓纤维。但是传递疼痛的细纤维仍然保存，是模拟外周神经损伤和炎症导致疼痛的发生。CCI模型术后一到两天，大鼠便开始出现痛觉过敏，此外该模型损伤小，操作方法简单，模型稳定。Reelin是细胞外基质分泌型糖蛋白，位于人类染色体7q22上，存在于大部分的脊椎动物中。以往的研究表明，Reelin参与神经元细胞迁移的终止及神经元细胞的增殖调控。近年来发现，Reelin在脊髓背角也有表达，Reelin的信号通路在不同组织中参与各种复杂生物学功能，Reelin基因缺失小鼠，在脊髓背角第I-III板层神经元的定位异常，并出现对疼痛的异常反应，而这些板层则是外周伤害性感受器传入纤维Aδ以及C传入的主要部位。Reeler小鼠痛阈值的改变表明Reelin可能参与脊髓水平的疼痛反应的调节。我们的前期研究也发现，在成年大鼠CCI模型诱导神经病理性疼痛后，脊髓背角中的Reelin从CCI术后第4天开始出现表达的减少，CCI术后第7天至第28天内Reelin的表达明显减少，且与痛阈值的21 变化程度呈正相关[37]。鞘内注射Reelin基因的RNA干扰慢病毒可以沉默脊髓背角Reelin基因，抑制Reelin蛋白的表达，而同时，大鼠手术侧的机械缩足阈值和热缩足潜伏期出现明显下降[38]。MALabouesse[39]等人发现，将Reelin重组蛋白直接注射到小鼠内侧前额叶皮质能增加Reelin下游蛋白Dab1的磷酸化。在Rogers[40]等人的研究中，侧脑室注射Reelin重组蛋白后，可以引起海马组织在15min时p-Dab1表达明显升高，3小时内上述蛋白仍持续升高，至注射后5d恢复基础水平，而海马组织内的Reelin的表达变化趋势也是如此；这些变化可以引起树突状棘密度增加、海马CA1区长时程增强，且侧脑室注射Reelin重组蛋白能提高小鼠的空间记忆和学习能力。Dab1是Reelin的下游蛋白，Reelin与其受体结合后，激活src家族的酪氨酸激酶，然后磷酸化Dab1的酪氨酸残基(主要是Tyr-220和Tyr-232)[41]，进而激活下游信号通路发挥作用。因此，本实验发现鞘内注射Reelin重组蛋白后，脊髓背角Dab1磷酸化（Tyr-220）的表达增加，表明RELN注射到鞘内后激活Reelin下游通路发挥作用。而鞘内注射RELN后，可以观察到在注射后1h、1、2、3、4、5d大鼠的机械痛阈值及热痛阈值均明显增加，注射后7、11d后注射RELN组与CCI组两组的痛阈值基本相同，考虑是鞘内注射RELN后激活了Reelin下游通路发挥作用从而减轻了疼痛的发生，而注射第7d后两组痛阈值无明显区别可能与RELN表达降低至基础水平有关。本实验证明了鞘内注射Reelin重组蛋白可以减轻神经病理性疼痛的发生。炎症因子和胶质细胞的活化对神经病理性疼痛的产生和维持发挥关键的作用。在病理状态下，星形胶质细胞激活，数目增加，体积增大，分支增加，GFAP（星形胶质细胞的标志性蛋白）表达增强[42]。星形胶质细胞的激活在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥十分重要作用，在大鼠L5脊神经结扎模型中，与假手术组相比，术后3d、7d、14d模型组GFAP阳性蛋白在脊髓背根神经节的表达都有不同程度的增高。在Allen's打击法脊髓损伤模型中，模型组术后3d、7d、14d，损伤区域神经胶质纤维酸性蛋白表达明显增加。当神经损伤时，小胶质细胞和星形胶质细胞活化增值，释放的炎性因子如TNF-α、IL－1β、神经生长因子及脑源性神经营养因子等在疼痛的发展中起着重要的作用[10]。而星形胶质阳性细胞在脊髓背角中也主要表达于I、II板层中，在CCI模型中，外周神经损伤后，GFAP蛋白表达量明显增加，且GFAP阳性细胞数增加，形态上的主要变化为细胞变大、突22 起增长；而鞘内注射GFAP的抑制剂能明显减轻神经病理性疼痛的发生。因此本研究选择CCI术后第10天、第13天取材，检测脊髓背角GFAP的表达，此时GFAP变化较为明显，本实验也证明CCI模型中脊髓背角GFAP表达明显增加。TNF-α属于配体或受体蛋白超家族，普通情况下，在神经组织中，有着相对较低的TNF-α表达，CCI术后的神经病理性疼痛模型中，脊髓背角的TNF-α表达明显增加；促炎症因子的级联反应是从TNF的激活开始，随之是IL-1β的激活，进而是IL-6的释放[43]。在炎症反应中，TNF-α参与调节白细胞的活化、成熟等过程，此外，还参与了释放细胞及趋化因子、形成活性氧和NO中间产物等。外周以及中枢的固有细胞在神经损伤或发生炎症使可以通过活化后从而释放TNF-α，然后导致内皮细胞的激活，可以大量的合成以及释放促炎细胞因子和趋化因子，还能够导致细胞表面黏附分子的表达增加，导致神经损伤周围出现循环中的炎症细胞的募集，募集的炎症细胞激活后能够进一步释放炎性介质，导致瀑布式的炎症反应的形成，或直接或间接的痛觉传导通路神经元的活化，导致神经病理性疼痛的形成。TNF-α可以直接作用于神经组织，使其细胞受刺激后能释放更多的致痛物质；此外，TNF-α还能作用于其他细胞导致更多促炎介质的释放，形成正反馈作用。且疼痛的程度与TNF-α的表达呈正相关。鞘内注射外源性TNF-α能引起痛觉过敏的发生；抑制TNF-α的表达能明显减轻疼痛的发生。TNF-α启动了细胞因子激活的级联反应，在神经损伤及炎症的早期阶段起着重要的作用。考虑TNF-α是炎症级联反应的关键因子，炎症瀑布式反应是从TNF-α开始，因而本实验选择TNF-α作为炎症因子的检测指标，本研究也证明，CCI疼痛模型中，脊髓背角TNF-α的表达明显增加。Reelin有三种高亲和力受体，ApoER2、VLDL-R和α3β1整合素。近年的研究表明Reelin的三种受体均可参与免疫调节过程，调节GFAP及炎症因子的表达。在本研究中，我们选择在第10天痛阈值较低的时候鞘内注射Reelin重组蛋白，考虑到Reelin重组蛋白注射后15min开始起效，3小时效果仍然增加，注射后第5天恢复基线水平；因而选择在注射后1小时及注射后3天取材检测相应指标。本研究表明，与Sham组相比，CCI术后第10天（给药后1小时）、第13天（给药后3天），CCI模型中大鼠脊髓背角的GFAP及TNF-α的表达均明显增加；而鞘内注射RELN后，可观察到脊髓背角的GFAP及TNF-α较CCI组有明显下降，23 表明RELN组缓解病理性疼痛可能与鞘内注射RELN后减少GFAP及TNF-α等神经炎症的表达有关。本研究证明鞘内注射Reelin重组蛋白可以有效缓解神经病理性疼痛，其机制可能是其抑制脊髓背角星形胶质细胞的活化及炎症因子TNF-α的表达。但Reelin具体是如何调节星形胶质细胞及TNF-α的表达过程仍需进一步深入研究。24 第五章结论鞘内注射Reelin重组蛋白可以减轻神经病理性疼痛；其机制可能与其抑制脊髓背角星形胶质细胞的活化及TNF-α的表达有关。25 26 参考文献[1]LemaMJ,FoleyKM,HausheerFH.Typesandepidemiologyofcancer-relatedneuropathicpain:theintersectionofcancerpainandneuropathicpain[J].Oncolo-gist,2010,15(2):3-8.[2]SałatK,JakubowskaA,KuligK.Zucapsaicinforthetreatmentofneuropathicpain[J].ExpertOpiniononInvestigationalDrugs,2014,23(10):1433-1440.[3]LeadleyRM,ArmstrongN,LeeYC,etal.ChronicdiseasesintheEuropeanUn-ion:theprevalenceandhealthcostimplicationsofchronicpain[J].HospiceJour-nal,2012,26(4):310-325.[4]MehraM,HillK,NichollD,etal.Theburdenofchroniclowbackpainwithandwithoutaneuropathiccomponent:ahealthcareresourceuseandcostanalysis[J].JournalofMedicalEconomics,2012,15(2):245-252.[5]TeixeiraCM,KronMM,MasachsN,etal.Cell-autonomousinactivationofthereelinpathwayimpairsadultneurogenesisinthehippocampus[J].JournalofNeu-rosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2012,32(35):12051-12065.[6]FatemiSH.Reelinglycoprotein:structure,biologyandrolesinhealthanddisease[J].MolecularPsychiatry,2010,10(3):251-257.[7]TeixeiraCM,MartínED,IgnasiS,etal.OverexpressionofReelinPreventstheManifestationofBehavioralPhenotypesRelatedtoSchizophreniaandBipolarDisorder[J].NeuropsychopharmacologyOfficialPublicationoftheAmericanCol-legeofNeuropsychopharmacology,2011,36(12):2395-2405.[8]OhSH,SoHJ,LeeHY,etal.Urinarytrypsininhibitorattenuatesthedevelop-mentofneuropathicpainfollowingspinalnerveligation[J].NeuroscienceLetters,2015,590:150-155.[9]PhdRVM,MsDMT,VogelL,etal.TheRoleofGliaandtheImmuneSystemintheDevelopmentandMaintenanceofNeuropathicPain[J].PainPracticetheOffi-cialJournalofWorldInstituteofPain,2010,10(3):167-184.[10]LiuF,YuanH.Roleofgliainneuropathicpain[J].FrontiersinBioscience,2014,19(5):798-807.27 [11]RomerosandovalA,ChaiN,NutilemcmenemyN,etal.AcomparisonofspinalIba1andGFAPexpressioninrodentmodelsofacuteandchronicpain[J].BrainResearch,2008,1219(2):116-126.[12]GosselinRD,SuterMR,JiRR,etal.Glialcellsandchronicpain[J].Neurosci-entistAReviewJournalBringingNeurobiologyNeurology&Psychiatry,2010,16(5):519-531.[13]KimD,FigueroaKW,LiKW,etal.ProfilingofDynamicallyChangedGeneExpressioninDorsalRootGangliaPostPeripheralNerveinjuryandACriticalRoleofInjury-InducedGlialFibrillaryAceticProteininMaintenanceofPainBe-haviors[J].Pain,2009,143(1-2):114-122.[14]ThackerMA,ClarkAK,MarchandF,etal.Pathophysiologyofperipheralneu-ropathicpain:immunecellsandmolecules[J].Anesthesia&Analgesia,2007,105(3):838-847.[15]AustinPJ,Moalem-TaylorG.Theneuro-immunebalanceinneuropathicpain:Involvementofinflammatoryimmunecells,immune-likeglialcellsandcytokines[J].JournalofNeuroimmunology,2010,229(1–2):26-50.[16]ClarkAK,OldEA,MalcangioM.Neuropathicpainandcytokines:currentper-spectives[J].JournalofPainResearch,2013,6(6):803-814.[17]杨瀚杰,李光勤,陈帅,etal.吡咯烷二硫代氨基甲酸对大鼠脑缺血后神经功能的影响[J].重庆医科大学学报,2016,(1):28-33.[18]LiC,HuangZ,KingsleyR,etal.Biochemicalalterationsintheretinasofverylow-densitylipoproteinreceptorknockoutmice:ananimalmodelofretinalangi-omatousproliferation[J].2007,125(6):795-803.[19]ChenY,HuY,MoiseyevG,etal.Photoreceptordegenerationandretinalinflam-mationinducedbyverylow-densitylipoproteinreceptordeficiency[J].Microvas-cularResearch,2009,78(1):119-127.[20]ChenY,HuY,LuK,etal.VLDLreceptor,anegativeregulatoroftheWNTsig-nalingpathwayinchoroidalneovascularization[J].JournalofBiologicalChemistry,2007,2(1):12-19.28 [21]LeeDK,NathanGR,TrachteAL,etal.ActivationofthecanonicalWnt/beta-cateninpathwayenhancesmonocyteadhesiontoendothelialcells[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2006,347(1):109-116.[22]DeTF,RacaudSC,ChicanneG,etal.AcrosstalkbetweentheWntandthead-hesion-dependentsignalingpathwaysgovernsthechemosensitivityofacutemye-loidleukemia[J].Oncogene,2006,25(22):3113-3122.[23]StulicM,LubinFD,O'donnellPM,etal.Effectofthealpha3beta1integrinontheIL-1stimulatedactivationofc-JunN-terminalkinase(JNK)inCACO-2cells[J].Cytokine,2007,37(2):163-170.[24]LiG,LubinFD,McgeeDW.alpha3beta1integrininducedsuppressionoftheCaco-2epithelialcellIL-1signalingpathwayleadingtoNF-(kappa)Bactivation[J].CellularImmunology,2004,231(231):30-39.[25]LubinFD,SegalM,McgeeDW.Regulationofepithelialcellcytokineresponsesbythealpha3beta1integrin[J].Immunology,2003,108(2):204-210.[26]BarrL,CampbellS,Bs,DangC.Associationofthedecreasedexpressionofal-pha3beta1integrinwiththealteredcell:environmentalinteractionsandenhancedsoftagarcloningabilityofc-myc-overexpressingsmallcelllungcancercells[J].CancerResearch,1999,58(23):5537-5545.[27]YoonHJ,ChoYR,JooJH,etal.Knockdownofintegrinα3β1expressionin-ducesproliferationandmigrationofnon-smallcelllungcancercells[J].OncologyReports,2013,29(2):662-668.[28]BoniniSA,MastinuA,MaccarinelliG,etal.CorticalStructureAlterationsandSocialBehaviorImpairmentinp50-DeficientMice[J].CerebralCortex,2016,26(6):2832-2849.[29]BoniniSA,FerraritoninelliG,UbertiD,etal.NuclearfactorκB-dependentneu-riteremodelingismediatedbyNotchpathway[J].JournalofNeuroscience,2011,31(31):11697-11705.[30]LermanYV,LimK,HyunYM,etal.Sepsislethalityviaexacerbatedtissueinfil-trationandTLR-inducedcytokineproductionbyneutrophilsisintegrinα3β1-dependent[J].Blood,2014,124(24):3515-3523.29 [31]DingY,HuangL,XianX,etal.LossofReelinprotectsagainstatherosclerosisbyreducingleukocyte-endothelialadhesionandlesionmacrophageaccumulation[J].ScienceSignaling,2015,9(419):29.[32]TalM,BennettGJ.Extra-territorialpaininratswithaperipheralmononeuropa-thy:mechano-hyperalgesiaandmechano-allodyniaintheterritoryofanuninjurednerve[J].Pain,1994,57(3):375-382.[33]ZhaoX,TangZ,ZhangH,etal.AlongnoncodingRNAcontributestoneuro-pathicpainbysilencingKcna2inprimaryafferentneurons[J].NatureNeurosci-ence,2013,16(8):1024-1031.[34]HargreavesK,DubnerR,BrownF,etal.Anewandsensitivemethodformeasur-ingthermalnociceptionincutaneoushyperalgesia[J].Pain,1988,32(1):77-88.[35]YakshTL,RudyTA.Chroniccatheterizationofthespinalsubarachnoidspace[J].Physiology&Behavior,1976,17(6):1031-1036.[36]XuF,LiT,ZhangB.Animprovedmethodforprotectingandfixingthelumbarcathetersplacedinthespinalsubarachnoidspaceofrats[J].JournalofNeurosci-enceMethods,2009,183(2):114-118.[37]李晶金.慢性压迫性神经痛大鼠脊髓水平Reelin的表达变化[D];南华大学,2014.[38]阳巧云.鞘内注射Reelin基因干扰慢病毒载体对大鼠慢性神经病理性疼痛的研究[D];南华大学,2015.[39]LabouesseMA,LassalleO,RichettoJ,etal.Hypervulnerabilityoftheadolescentprefrontalcortextonutritionalstressviareelindeficiency[J].MolPsychiatry,2017,22(7):961-971.[40]RogersJT,RusianaI,TrotterJ,etal.Reelinsupplementationenhancescognitiveability,synapticplasticity,anddendriticspinedensity[J].Learning&Memory,2011,18(9):558-564.[41]BallifBA,ArnaudL,ArthurWT,etal.ActivationofaDab1/CrkL/C3G/Rap1pathwayinReelin-stimulatedneurons[J].CurrentBiology,2004,14(7):606-610.[42]HenningJ,StraussU,WreeA,etal.Differentialastroglialactivationin6-hydroxydopaminemodelsofParkinson’sdisease[J].NeuroscienceResearch,2008,62(4):246-253.30 [43]HorváthG,GölöncsérF,CsölleC,etal.CentralP2Y12receptorblockadeallevi-atesinflammatoryandneuropathicpainandcytokineproductioninrodents[J].NeurobiologyofDisease,2014,70(100):162-178.31 32 综述神经炎症与神经病理性疼痛的研究进展摘要：各种原因造成的神经系统损伤或功能障碍使全世界数百万人罹患神经性病理性疼痛，严重影响生活质量。在神经病理性疼痛发生、维持方面，人们开始逐渐意识到炎症因子等所发挥的作用，本文以病理性疼痛为切入点，充分研究了神经炎症反应在其中所发挥的作用。关键词：病理性疼痛，神经炎症，免疫若外周或中枢神经系统出现了病变亦或是功能紊乱，此时就会出现神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP)[1]，表现为痛觉异常亦或是过敏，而有些情况下疼痛则表现为自发性。过去由于血脑屏障的作用，中枢神经系统被认为是免疫豁免区，但近年来，研究表明，周围神经系统损伤可破坏血脑屏障，此后外周免疫细胞将进入，该过程主要由单核细胞趋化蛋白-1介导[2]。若组织出现了损伤的情况，将激活神经膜附近的内皮细胞等，分泌出多种免疫物质，比如NO等，后者会实现对循环免疫细胞的诱导，这样其将转移到中枢神经系统中，最终导致免疫炎症的出现[3]，进而诱发了神经病理性疼痛。其机制大致阐述如下：1.神经炎症反应的定义其可以理解为神经以及免疫系统间所存在的一种相互作用。原来的观念认为NP是指单一的神经元损伤导致的；有研究指出，外周及中枢神经系统中的非神经细胞也表现出一定的作用[4]。若外周和中枢神经系统存在着严重的炎症，神经胶质细胞被激发，由此产生多种细胞因子、黏附分子和趋化因子，增加表面抗原的表达，增强神经系统的免疫级联反应，导致神经炎症反应[5]。2.胶质细胞与神经病理性疼痛在大脑和脊髓细胞中，胶质细胞数量非常多，比重大约是70%，传统观念认为，胶质细胞主要的作用有两个，一个是营养支持，还有个是免疫保护，而最新研究还指出其在疼痛发生、发展中有一定的作用。33 2.1小胶质细胞该细胞属于一种免疫效应细胞，其作为巨噬细胞普遍存在于中枢系统中，能够实现免疫防御。周围神经损伤后，胶质细胞增殖为促炎或效应表型，释放各种促炎介质[6]，表达免疫分子，在病理性疼痛中发挥着一定的作用。在NP模型中，将有着更多的小胶质细胞标志物表达。为了实现对痛觉超敏的有效控制，可以将小胶质细胞抑制剂注射到鞘内，这意味着其在疼痛诱导中有一定的作用[7]。在NP中，小胶质细胞发挥作用的机制难以确定。在病理条件中，若是初级传入纤维，在这种状况中无法实现神经递质的释放，脊髓背角痛觉传递神经元PC等，基于此实现对小胶质细胞的有效激活，与此同时，其还会实现炎性因子的释放，对初级传入及二级神经元构成突触产生作用，此时会对中枢敏化过程产生一定的影响[8]。IL-1β、TNF-α可以实现对小胶质细胞中受体的有效激活，为实现小胶质细胞合成，完成较多细胞因子的释放，这种情况下就需要激活MAPK通路[9]。小胶质细胞能够对前列腺素E2、NO合成进行诱导，对炎症因子表达进行诱导，在神经病理性疼痛中表现出一定的作用，此时主要基于p38MAPK信号通路的激活来实现[10]。研究指出，若综合了三磷腺苷以及激活小胶质细胞，这样就可以实现对电压依赖钙通道的激活，在中枢及外周神经疼痛发生机制中发挥一定的作用[11]。2.2星形胶质细胞在生理状态下，星型胶质细胞通过调控细胞外离子与神经递质浓度，维持神经元微环境稳态、调节突触功能。而在病理状态，星形胶质细胞激活，其数目、体积、分支及GFAP（星形胶质细胞的标志性蛋白）表达均有不同程度的增加[12]。脊髓星形胶质细胞激活在一定程度上影响了疼痛发生以及维持[13]。分析急慢性疼痛模型可以了解到，若激活了脊髓星形胶质细胞，此时就会产生越来越多的GFAP。GFAP缺乏的小鼠在周围神经损伤后通常会产生类似疼痛的行为，给予GFAP反义寡核苷酸治疗可以逆转这种疼痛[14]。这意味着在神经病理性疼痛中，星形胶质细胞表现出一定的作用。在病理性疼痛领域，需要更加深入的研究星形胶质细胞作用机制；若出现的胶质细胞疼痛刺激，此时将实现激活胶质细胞，完成神经活性物质的有效释放，其对突触后脊髓背角痛觉传递神经元会产生一定的作用，此时将有着更高的敏感性，同时有着更强的反应性,出现病理性疼痛。胶质细胞激活后，释放前炎性细胞因子,下游激活胶质细胞，与神经元上的受体结合，增强其活性[15]。上述因素让疼痛物质更多的分泌，而在胶质细胞以及巨噬细胞方面，将34 发挥着更大吞髓鞘作用，进而诱发痛觉超敏，由细胞间隙连接耦合形成的网络结构以钙振荡或钙波的形式引起疼痛播散[16]。星形胶质细胞将释放IL-1β等，让突触后NMDA受体以及AMPA受体更积极进行突触传递，在神经元细胞膜中，将有更多受体表达。通过d-丝氨酸的释放，进一步激发NMDA受体功能，这样就可以打开钙通道，合成NO以及PGE2，让疼痛相关神经元有着更高的兴奋性。研究指出，星形胶质细胞存在与神经元紧密关联性，胶质细胞突起将突触周围进行包围[17]，让星形胶质细胞进一步活化，同时还让神经元进一步敏化，在慢性疼痛中，将逐渐实现脊髓背角正反馈过程，级联放大疼痛信号，使其迁延不愈[9]。3.细胞因子与神经病理性疼痛Oh[18]等的研究表明，NP的发展与神经炎症免疫、免疫样胶质细胞、活化、免疫衍生细胞因子相关。若出现了神经损伤，胶质细胞对TNF-α等进行激活，然后将其释放，在NP发展中很关键[19]。慢性疼痛以及炎性状态中，若脊髓有着更多的IL-1β表达，其将实现对神经生长因子合成的诱导，对炎症部位肥大细胞进行激活，从而实现5-羟色胺与组胺的释放，让感受器有着更高的敏感性，同时还实现了痛阈的控制等[20]。IL-1β作用下让浅表背角神经元有着更高的兴奋性，对初级传入神经进行诱导，这样可以产生P物质等，让中枢进一步实现敏化，同时还实现了疼痛的诱导。另，IL-1β对突触后甘氨酸受体进行了上调处理，在脊髓背角浅层中，将进一步加强抑制性γ-氨基丁酸能神经元甘氨酸突触长时程，而甘氨酸突触增强引起外周炎症，可引发NP[21]。TNF-α属于配体或受体蛋白超家族。普通情况中，在神经组织中，有着相对较低的TNF-α表达，若为机械损伤，短时间内TNF-α升高[22]。神经损伤后，通过TNFR1上调，TNF-α与其结合可使p38MAPK信号通路开放，诱导痛觉过敏发生[23]。Zhang等人[24]指出，在大鼠红核中，TNF-α基于NF-ΚB，ERK及p38对疼痛进行诱发。IL-6作为促炎症因子，其主要由胶质细胞等产生。有研究称，促炎症因子的级联反应首先是从TNF的激活开始，然后是IL-1β的激活，随后是IL-6的释放[25]。外周神经若出现了受损，脊髓水平IL-6及IL-6受体将有着更高的表达，对Janus激酶实现了激活，除此之外，还实现了对其信号转导途径以及转录激活子细胞通路实现了激活，从而实现了信号传递，若阻断，将实现对超敏性疼痛的有效控制[26]。35 4.趋化因子与神经病理性疼痛趋化因子是小分子分泌蛋白。CCL2特异性地在炎症部位集中了单核细胞。生理状态下，CCL2表达于DRG，NP中可出现CCL2在DRG神经元中表达的增加[27]。CCL2对DRG、CCR2进行作用，基于此对疼痛敏感性进行控制。研究指出，若神经出现了损伤，在背角神经元和星形胶质细胞中，CCR2将会上调表达，CCL2的作用下，将进一步促进谷氨酸释放,使得NMDA及AMPA对II层神经元进行诱导的内向电流更强。将CCL2注射到鞘内，实现对ERK磷酸化的诱导[28]。这意味着，在中枢敏化和慢性疼痛调节中，CCL2/CCR2的作用主要实现对星形胶质细胞–神经元相互作用进行介导，以及促进脊髓小胶质细胞的激活[29]。CXCL1在功能层面类似IL-8。在外周,单核、成纤维以及内皮细胞实现了激活，完成CXCL1的释放；如果是在脑组织中,CXCR2在神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞中进行表达。若神经出现了损伤，此种状况中，神经元及星形胶质细胞将极快的上调CXCL1[30]。在神经损伤诱导的NP中，CXCR2表达增加。而CCL2和CXCL1在星形胶质细胞的表达上调可继发于TNF-α的表达上调[5],这意味着，在疼痛初期，CCL2和CXCL1主要实现对星形胶质细胞及小胶质细胞作用的介导。CX3CL1是另一种研究较多的趋化因子。CX3CL1在脊髓和DRG神经元均有表达；CX3CR1在DRG神经元附近胶质细胞中进行表达,同时还实现在脊髓小胶质细胞中的表达。在神经损伤及炎症后,CX3CL1的总表达无明显改变，而DRG中的膜结合形式的CX3CL1在脊神经结扎会明显减少[31]。各种证据表明CX3CL1参与小胶质细胞的激活，这意味着CX3CL1和CX3CR1会作用于神经元与小胶质细胞间信息传递。同时，在神经病理性疼痛中，趋化因子基于对神经元–胶质细胞间作用的控制来发挥作用[31]。5.免疫细胞与神经病理性疼痛研究指出，在神经病理性疼痛中，免疫细胞及分子有一定的作用。施万细胞是外周神经纤维髓鞘形成细胞，神经损伤后，施万细胞产生促炎性介质，引起神经末梢轴突损伤；让免疫细胞在损伤部位集中[32]。血脑屏障被免疫细胞、受损神经轴突分泌的血管活性物质等破坏，使神经组织周围聚集了更多的免疫细胞[33]，肥大细胞中促炎症介质非常多，极容易诱发神经病理性疼痛。神经损伤后，组胺、蛋白酶及部分细胞因子的释放来源于肥大细胞的脱颗粒现象。炎性细胞集中后，36 释放出炎性介质，从而实现了对初级痛觉神经元的有效敏化。神经初期损伤的阶段，巨噬细胞在受损神经附近分布，同时还释放出一些促炎性介质，让末梢感觉神经元出现了敏化的情况。Kiguchi等人发现大鼠周围神经损伤后，巨噬细胞侵入DRG内，并表达IL-6因子[34]。IL-1等会趋化巨噬细胞，在神经病理性疼痛中，主要基于释放TNF-α、IL-6来参与[35]。在脊髓组织及DRG中，若出现了邻近神经损伤，此时将出现更多T淋巴细胞。血脑屏障被损坏，T细胞将转移到中枢组织中，此时，MHC-2、协同刺激分子、中枢系统小胶质细胞在此时会出现一定的作用，作为T淋巴细胞在NP发生中作用的机理[36]。6.结语相关研究持续深入，在对病理性疼痛进行治疗时，传统靶点为神经元，比如阿片类镇痛药等,但这些药物的中枢系统相关的副反应,如恶心、嗜睡及疼痛耐受等,使得这类药物的应用受到限制。近年来发现胶质细胞抑制剂、神经炎症的抑制剂、抗炎细胞因子等可减轻动物模型病理性疼痛[37]，给神经病理性疼痛治疗提供新方向。但神经炎症及神经免疫反应的具体发生发展过程尚不明确，给靶向治疗带来了困难，因此，有必要对神经炎症及神经免疫反应进行全方位研究，提升靶向的效果，为更好的治疗病理性疼痛提供一个新方向。参考文献[1]SałatK,JakubowskaA,KuligK.Zucapsaicinforthetreatmentofneuropathicpain[J].ExpertOpiniononInvestigationalDrugs,2014,23(10):1433-1440.[2]EcheverryS,ShiXQ,RivestS,etal.Peripheralnerveinjuryaltersblood-spinalcordbarrierfunctionalandmolecularintegritythroughaselectiveinflammatorypathway[J].JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuro-science,2011,31(30):10819-10828.[3]MoalemG,TraceyDJ.Immuneandinflammatorymechanismsinneuropathicpain[J].BrainResearchReviews,2006,51(2):240-264.[4]GaoYJ,JiRR.TargetingAstrocyteSignalingforChronicPain[J].Neurothera-peuticstheJournaloftheAmericanSocietyforExperimentalNeurotherapeutics,2010,7(4):482-493.[5]JiRR,BertaT,NedergaardM.Gliaandpain:Ischronicpainagliopathy?[J].Pain,2013,154(Suppl1):S10-S28.37 [6]CalvoM,BennettDL.Themechanismsofmicrogliosisandpainfollowingpe-ripheralnerveinjury[J].ExperimentalNeurology,2012,234(2):271-282.[7]RaghavendraV,TangaF,DeleoJA.InhibitionofMicroglialActivationAttenuatestheDevelopmentbutNotExistingHypersensitivityinaRatModelofNeuropathy[J].JournalofPharmacology&ExperimentalTherapeutics,2003,306(2):624-630.[8]WatkinsLR,MilliganED,MaierSF.Spinalcordglia:newplayersinpain[J].Pain,2001,93(3):201-205.[9]GaoYJ,JiRR.Chemokines,neuronal-glialinteractions,andcentralprocessingofneuropathicpain[J].Pharmacology&Therapeutics,2010,126(1):56-68.[10]CrownED.Theroleofmitogenactivatedproteinkinasesignalinginmicrogliaandneuronsintheinitiationandmaintenanceofchronicpain[J].ExperimentalNeurology,2012,234(2):330-339.[11]MasudaT,OzonoY,MikuriyaS,etal.DorsalhornneuronsreleaseextracellularATPinaVNUT-dependentmannerthatunderliesneuropathicpain[J].NatureCommunications,2016,7:12529.[12]HenningJ,StraussU,WreeA,etal.Differentialastroglialactivationin6-hydroxydopaminemodelsofParkinson’sdisease[J].NeuroscienceResearch,2008,62(4):246-253.[13]RenK.Emergingroleofastrogliainpainhypersensitivity[J].JapaneseDentalScienceReview,2010,46(1):86-92.[14]KimD,FigueroaKW,LiKW,etal.ProfilingofDynamicallyChangedGeneExpressioninDorsalRootGangliaPostPeripheralNerveinjuryandACriticalRoleofInjury-InducedGlialFibrillaryAceticProteininMaintenanceofPainBe-haviors[J].Pain,2009,143(1-2):114-122.[15]MilliganED,WatkinsLR.Pathologicalandprotectiverolesofgliainchronicpain[J].NatureReviewsNeuroscience,2009,10(1):23-26.[16]HanssonE,ZügnerR.[Canchronicpainandspreadingofpainbeinducedviagli-almechanisms?Newhypothesesonthegeneratorsmaintainingprotractedpainconditions][J].Lakartidningen,2005,102(47):3552,3555-3556,3558.[17]VolterraA,MeldolesiJ.Astrocytes,frombraingluetocommunicationelements:therevolutioncontinues[J].NatureReviewsNeuroscience,2005,6(8):626-640.38 [18]OhSH,SoHJ,LeeHY,etal.Urinarytrypsininhibitorattenuatesthedevelop-mentofneuropathicpainfollowingspinalnerveligation[J].NeuroscienceLetters,2015,590:150-155.[19]LiuF,YuanH.Roleofgliainneuropathicpain[J].FrontiersinBioscience,2014,19(5):798-807.[20]TenderGC,LiYY,CuiJG.Theroleofnervegrowthfactorinneuropathicpaininhibitionproducedbyresiniferatoxintreatmentinthedorsalrootganglia[J].Neurosurgery,2013,73(1):158-165.[21]ChirilaAM,BrownTE,BishopRA,etal.Long-termpotentiationofglycinergicsynapsestriggeredbyinterleukin1[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(22):8263-8268.[22]ChoiBM,LeeSH,AnSM,etal.Thetime-courseandRNAinterferenceofTNF-α,IL-6,andIL-1βexpressiononneuropathicpaininducedbyL5spinalnervetransectioninrats[J].KoreanJournalofAnesthesiology,2015,68(2):159-169.[23]DellaroleA,MortonP,BrambillaR,etal.Neuropathicpain-induceddepres-sive-likebehaviorandhippocampalneurogenesisandplasticityaredependentonTNFR1signaling[J].BrainBehavior&Immunity,2014,41(1):65-81.[24]ZhangQ,WangJ,DuanMT,etal.NF-κB,ERK,p38MAPKandJNKcontributetotheinitiationand/ormaintenanceofmechanicalallodyniainducedbytumorne-crosisfactor-alphaintherednucleus[J].BrainResearchBulletin,2013,99:132-139.[25]HorváthG,GölöncsérF,CsölleC,etal.CentralP2Y12receptorblockadeallevi-atesinflammatoryandneuropathicpainandcytokineproductioninrodents[J].NeurobiologyofDisease,2014,70(100):162-178.[26]DominguezE,MauborgneA,MalletJ,etal.SOCS3-mediatedblockadeofJAK/STAT3signalingpathwayrevealsitsmajorcontributiontospinalcordneu-roinflammationandmechanicalallodyniaafterperipheralnerveinjury[J].JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2010,30(16):5754-5766.[27]JeonSM,SungJK,ChoHJ.Expressionofmonocytechemoattractantprotein-1anditsinductionbytumornecrosisfactorreceptor1insensoryneuronsintheven-39 tralrhizotomymodelofneuropathicpain[J].Neuroscience,2011,190(36):354-366.[28]GaoYJ,ZhangL,SamadOA,etal.JNK-inducedMCP-1productioninspinalcordastrocytescontributestocentralsensitizationandneuropathicpain[J].JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,2009,29(13):4096-4108.[29]ThackerMA,ClarkAK,BishopT,etal.CCL2isakeymediatorofmicrogliaactivationinneuropathicpainstates[J].EuropeanJournalofPain,2009,13(3):263-272.[30]LiH,XieW,StrongJA,etal.SystemicAnti-inflammatoryCorticosteroidRe-ducesMechanicalPainBehavior,SympatheticSprouting,andElevationofPro-inflammatoryCytokinesinaRatModelofNeuropathicPain[J].Anesthesiol-ogy,2007,107(3):469-477.[31]ZhuangZY,KawasakiY,TanPH,etal.RoleoftheCX3CR1/p38MAPKpath-wayinspinalmicrogliaforthedevelopmentofneuropathicpainfollowingnerveinjury-inducedcleavageoffractalkine[J].BrainBehavior&Immunity,2007,21(5):642-651.[32]NicotraL,LoramLC,WatkinsLR,etal.Toll-LikeReceptorsinChronicPain[J].ExperimentalNeurology,2012,234(2):316-329.[33]CalvoM,DawesJM,BennettDL.Theroleoftheimmunesysteminthegenera-tionofneuropathicpain[J].LancetNeurology,2012,11(7):629-642.[34]KiguchiN,MaedaT,KobayashiY,etal.Thecriticalroleofinvadingperipheralmacrophage-derivedinterleukin-6invincristine-inducedmechanicalallodyniainmice[J].EuropeanJournalofPharmacology,2008,592(1–3):87-92.[35]BasranA,JabeenM,BingleL,etal.RolesofneutrophilsintheregulationoftheextentofhumaninflammationthroughdeliveryofIL-1andclearanceofchemo-kines[J].JournalofLeukocyteBiology,2013,93(1):7-19.[36]HuP,MclachlanEM.Macrophageandlymphocyteinvasionofdorsalrootgan-gliaafterperipheralnervelesionsintherat[J].Neuroscience,2002,112(1):23-38.[37]GaoYJ,JiRR.Chemokines,neuronal-glialinteractions,andcentralprocessingofneuropathicpain[J].Pharmacology&Therapeutics,2010,126(1):56-68.40 致谢时光荏苒，岁月如梭，一眨眼，三年的研究生生活即将进入尾声。回顾这三年，有曲折、迷茫，有困惑、难过，更多的却是奋斗和收获，不由得心生留念，然而更多的是感激。首先要感谢我的导师旷昕教授对我学业以及生活上无微不至的关心，旷昕老师传授的不仅仅是专业知识，更是教导我如何做人；旷昕老师高尚的品格、渊博的知识，严谨的工作态度，以及生活中平易近人的人格魅力更对我影响深远。在此谨向旷昕老师致以诚挚的敬意和深深的感激！感谢科室的胡啸玲老师、李玉成老师、刘文捷老师、郭立平老师、彭庆明老师、李祥老师等及其他老师对我临床学习与操作的指导和生活上的关心！感谢彭良玉老师在科研实验上给予我的指导和帮助，从课题选择、实验方案的制定，到实验操作过程的具体指导，以及论文的写作，都倾注了彭老师大量的心血。感谢我的家人，在我读研期间对我的理解和支持，感谢我的师兄师姐以及师弟师妹们对我无私的帮助和陪伴。最后，我要感谢论文评审各位专家教授，感谢你们提出的珍贵意见。41