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《卵巢癌抗独特型单链抗体6b11scfvmgm-csf融合蛋白的构建、表达及活性测定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定解剖学报2000年第3期第31卷论著作者:刘蓓 崔恒 冯捷 叶雪 李艺 曹善津 葛华 付天云 姚煜 钱和年单位:刘蓓(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044);崔恒(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044);冯捷(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044);叶雪(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044);李艺(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044);曹善津
2、(北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心,北京 100044)关键词:卵巢癌;重组融合蛋白;抗体;抗独特型;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;包涵体 【摘要】 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv和鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM),以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应,为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据。 方法 用DNA重组技术,将mGM-CSF连于单链抗体6B11ScFv羧基末端,构建重组质粒pET30-6B11mGM,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,以包涵体形式获高效表达,
3、超声破碎细菌细胞获得包涵体,用8mol·L-1尿素溶解包涵体后直接稀释复性,SDS-PAGE分析蛋白纯度,ELISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。 结果 复性蛋白纯度达90%以上。采用氧化型谷胱甘肽(GSSG)浓度为1mmol·L-1,还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为5mmol·L-1,10℃复性48h,复性率达36%。表达的融合蛋白分别能与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合,并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖。 结论 以包涵体表达的融合蛋白6B11
4、mGM保留了两种蛋白的活性,为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础。 【中图分类号】 R392.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-226THECONSTRUCTION,EXPRESSIONANDACTIVITYEXAMINATIONS OF6B11ScFv/MURINEGM-CSFFUSIONPROTEINLIUBei,CUIHeng,FENGJie,YEXue,LIYI,CAOShan-jin,GEHua,FUTian-yun,YAOYu,QIANHe-nia
5、n (GynecologicOncologyCenter,People'sHospital,BeijingMedicalUniversity,Beijing 100044,China) 【Abstract】 Objective Toconstructexpressionvectorwhichexpressesfusionproteinofantiidiotypicsinglechainantibody6B11ScFvandmurineGM-CSF(6B11mGM)forobservingitspossi
6、bleimmunereactionsinvivo.Methods UsingDNArecombinanttechniques,themurineGM-CSFcDNAgenewasrecombinedto6B11ScFvandtheywereclonedintoexpressionvectorpET-30a(+)toproduceinsolubleprotein.Inclusionbodiescollectedafterthebreakageofbacteriathroughsonicationweresubj
7、ectedtorepeatedlywashing.Inclusionbodiessolubilizedintheresenceof8mol·L-1ureaweredilutedwithrenaturationsolutionssothatfoldingprocesscouldbeinitiated.ThepuritywasexaminedbySDS-PAGE,ELISAandcellproliferationassaywereusedtodeterminetheactivitiesoffusionprotei
8、n.Results 6B11mGMfusionproteinswereobtainedwithapurityofover90%.Theoptimumconditionswere1mmol·L-1and5mmol·L-1fortheconcentrationsofGSSGandGSH,respectively,with48hoursat10℃asrenaturedtime.Fusionproteinc