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时间:2018-07-15
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1、细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法,前者比较温和,后者虽然产量高,但反应更剧烈,很有可能造成细胞中的DNA断裂。本文主要是介绍细胞的裂解方法以及实验过程中的方法探讨。裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA断裂。这两种方法(包括SDS和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA的断裂。一、机械裂解法主要有以下两种:1. 热休克(Th
2、ermalshock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezingandthawing),。原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20 ℃ 冰上进行,解冻可以在37、50、65或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。2. 超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声
3、时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。bead-beating也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小。二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性。主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的
4、核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:50mMTris-HClpH7.4(缓冲体系),150mMNaCl(等渗体系),1mMPMSF(强大的蛋白酶抑制剂),1mMEDTA(变性剂和稳定剂),5µg/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂),5µg/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂),1%Tritonx-100(破坏细胞),1%Sodiumdeoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1%SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M尿素,2M硫脲(可以
5、提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等。细胞裂解时间把握问题:孔板里细胞用PBS洗2次后,加入细胞裂解液,然后去测总蛋白含量和酶的活力,不知道细胞要裂解到什么程度?答:因为所用的细胞类型不一样,所以实验的条件也需要摸索,建议这样来做:加入细胞裂解液后,不同时间取样,以时间和总蛋白含量和酶的活力作曲线,这样就可以找到裂解的最佳时间,仅供参考。原核表达的细胞裂解问题:做原核表达,用BL21表达,之后如何裂解细胞才行呢?我的菌液只有300微升,说明书上用超声裂解细胞,但没给出具体做法,我们这只有大的探头,不好做,有什么好的办法么? 要是用超声裂解,要怎么做才行?我是超声1
6、5s间隔10s座4次。裂解不好,应该怎样改呀?!答:请试一试IFCC推荐法:1. 收集细胞悬液2. 4 ℃ 低温离心(3000rpm,5min)3. 弃上清,加入一定量PBS(200ul),轻轻吹打混匀,-20 ℃ 冷冻30min, 37 ℃ 解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液三、westernblot细胞裂解方法个人小结:过些天准备做westernblot,昨天就提前把细胞裂解了,提出蛋白来保存。一下是我做的方法,大家参考,可能有不正确的地方,希望大家指出来,谢谢!1. 取一瓶细胞(100ml的瓶子),PBS洗2次,胰酶消化,加入10ml培养
7、液,制备成细胞悬液;2. 将细胞悬液移入10ml离心管中,4 ℃ ,2500rpm,离心5min;3. 弃上清,加入预冷的PBS(即4 ℃ 存放的PBS)于离心管中,吹打,4 ℃ ,2500rpm,离心5min;弃上清,重复上述步骤一次;共洗细胞2次,充分洗掉培养液;4. 弃上清,加入200ul细胞裂解液(每1ml裂解液中加入10ulPMSF),置于冰上,裂解40min~1h;裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管,以使蛋白充分裂解;5. 取出离心管,于4 ℃ ,12000rpm,离心5min;6. 将上清移入EP管中,-20 ℃ 保存,即可。注:
8、本来应该在培养瓶或培养皿中裂解,但出于某种原因,我为
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