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时间:2020-03-26
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1、[KLF4过表达对RAW264.7巨噬细胞和C2C12肌原细胞增殖的影响]巨噬细胞红蓝铅笔图 摘 要:为探讨Kruppel样因子4(Kruppel-likefaetor4,KLF4)过表达对RaW264.7巨噬细胞和C2C12小鼠肌原细胞生长的影响,采用脂质体转染KLF4的真核表达质粒于RaW264.7巨噬细胞和C2C12,细胞中,G418筛选阳性克隆,westernblotting鉴定高表达克隆;观察各转染细胞生长情况,CCk-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,凋亡百分率,发现与空质粒转染细胞相比
2、,KLP4过表达对Raw264.7巨噬细胞的生长曲线、细胞周期分布、凋亡百分率没有明显的影响,而C2C12细胞生长速度减慢,细胞凋亡百分率明显高于空载体组,上述结果表明KLF4基因对Raw264.7巨噬细胞增殖没有明显影响,而对C2C12细胞增殖起负调控作用。 关键词:KLF4;基因转染;R8w264.7细胞;C2C12细胞;细胞增殖 中图分类号:R361 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2007)03-0263-05 Kruppel样因子4(Kruppel-1ikefactor4,KLF4)
3、是Sp/Kdlppel样锌指转录因子家族的成员之一,这个家族目前已发现20多个成员,如Spl-4、KLPl-14等,Sp/Kruppel样因子是机体内一类具有重要功能的蛋白质,它们参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程,并与肿瘤等多种疾病有关,研究表明,KLF4在胚胎发育晚期及肠管分化终末期的上皮细胞中其表达均增高,提示KLF4具有抑制某些细胞增殖的功能,为了深入探讨KLF4的功能,本研究室建立了稳定高表达该基因的Raw264.7小鼠巨噬细胞株和C2C12小鼠肌原细胞株,在此建株过程中,我们发现转染KLF4对
4、上述两种细胞增殖的影响明显不同。 1 材料和方法 1.1 材料 Raw264.7巨噬细胞株购自上海细胞中心;C2Cn小鼠肌原细胞由本校细胞中心提供:DMEM及RPMI-1640培养基购自Gibeo公司;G418购自Promega;无支原体小牛血清,杭州四季青生物工程公司产:丙烯酰胺、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺购自Fluka公司;二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维素膜购自Promega公司;Lipo-feetamineTM2000、真核表达载体质粒pcDNA3.1购自Invitrogen
5、lifetechnologies公司:peDNA3.1-KLF4重组质粒本室构建;兔抗KLF4多克隆抗体购自SantaCruzBiotechnology;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司:CCK-8溶液由日本同仁化学株式会社提供。 1.2 方法 1.2.1 KLF4过表达细胞株的建立 利用脂质体介导的转染技术(根据Invitrogenlifetechnologies公司提供的转染操作说明书进行操作)将空载体pcDNA3.1和重组质粒pcDNA3.1-KL
6、F4导人Raw264.7和C2C12细胞中,根据本室以往所建立的方法筛选过表达细胞株。 1.2.2 免疫印迹分析 按《分子克隆实验指南》所载方法进行,用1×SDS加样缓冲液裂解细胞,收集细胞蛋白质,采用Bradford法进行蛋白定量。制备好的蛋白样品置,80℃冰箱保存备用,每泳道上样30μg蛋白,经10%SDS-PAGE(70V,120V分别电泳2h和4h左右)电泳后,电转膜至硝酸纤维膜,室温封闭后加入兔抗KLF4多克隆抗体,室温孵育2h,加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育1h,DAB显色,拍摄照片,记录试验结果。
7、 1.2.3 细胞形态观察 取各转染细胞于倒置显微镜下,观察其生长速度和形态改变,并逐日记录。 1.2.4 CCK-8法检测细胞的增殖 取生长状态良好的对数生长期各组细胞接种于96孔板(每孔1×104个细胞),每组接种5个复孔,在含10%新生小牛血清的条件下分别培养24h,48h及72h后加入CCK-8溶液10μL继续培养4h,将96孔板放人酶标仪,在450nm波长处测定各孔OD值。 1.2.5 流式细胞术检测 本实验由北京鼎国生物技术公司协助完成,分别接种等量的对数生长期的各组细胞于100mL培养瓶中,
8、每组5瓶,培养24h后,参考该公司流式细胞检测说明收集细胞,送北京鼎国生物技术有限公司进行流式细胞术分析。 1.2.6 统计学处理 数据以均数土标准差(x±s)表示,两组间比较用t检验分析,以P<0.05判断为有统计学意义。 2 结果 2.1 Westernblotting筛选高表达KLF4的细胞克隆 采用脂质体分别转染KLF
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