[ＫＬＦ４过表达对ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞和Ｃ２Ｃ１２肌原细胞增殖的影响] 巨噬细胞红蓝铅笔图.docx

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1、[ＫＬＦ４过表达对ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞和Ｃ２Ｃ１２肌原细胞增殖的影响]巨噬细胞红蓝铅笔图　　摘　要：为探讨Kruppel样因子4(Kruppel-likefaetor4，KLF4)过表达对RaW264.7巨噬细胞和C2C12小鼠肌原细胞生长的影响，采用脂质体转染KLF4的真核表达质粒于RaW264.7巨噬细胞和C2C12，细胞中，G418筛选阳性克隆，westernblotting鉴定高表达克隆；观察各转染细胞生长情况，CCk-8法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期分布，凋亡百分率，发现与空质粒转染细胞相比

2、，KLP4过表达对Raw264.7巨噬细胞的生长曲线、细胞周期分布、凋亡百分率没有明显的影响，而C2C12细胞生长速度减慢，细胞凋亡百分率明显高于空载体组，上述结果表明KLF4基因对Raw264.7巨噬细胞增殖没有明显影响，而对C2C12细胞增殖起负调控作用。　　关键词：KLF4；基因转染；R8w264.7细胞；C2C12细胞；细胞增殖　　中图分类号：R361　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0263－05　　　　Kruppel样因子4(Kruppel-1ikefactor4，KLF4)

3、是Sp/Kdlppel样锌指转录因子家族的成员之一，这个家族目前已发现20多个成员，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel样因子是机体内一类具有重要功能的蛋白质，它们参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程，并与肿瘤等多种疾病有关，研究表明，KLF4在胚胎发育晚期及肠管分化终末期的上皮细胞中其表达均增高，提示KLF4具有抑制某些细胞增殖的功能，为了深入探讨KLF4的功能，本研究室建立了稳定高表达该基因的Raw264.7小鼠巨噬细胞株和C2C12小鼠肌原细胞株，在此建株过程中，我们发现转染KLF4对

4、上述两种细胞增殖的影响明显不同。　　　　1　材料和方法　　　　1．1　材料　　Raw264.7巨噬细胞株购自上海细胞中心；C2Cn小鼠肌原细胞由本校细胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培养基购自Gibeo公司；G418购自Promega；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产：丙烯酰胺、N，N′2亚甲基双丙烯酰胺购自Fluka公司；二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维素膜购自Promega公司；Lipo-feetamineTM2000、真核表达载体质粒pcDNA3.1购自Invitrogen

5、lifetechnologies公司：peDNA3.1-KLF4重组质粒本室构建；兔抗KLF4多克隆抗体购自SantaCruzBiotechnology；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化学株式会社提供。　　　　1．2　方法　　1．2．1　KLF4过表达细胞株的建立　　利用脂质体介导的转染技术(根据Invitrogenlifetechnologies公司提供的转染操作说明书进行操作)将空载体pcDNA3.1和重组质粒pcDNA3.1-KL

6、F4导人Raw264.7和C2C12细胞中，根据本室以往所建立的方法筛选过表达细胞株。　　1．2．2　免疫印迹分析　　按《分子克隆实验指南》所载方法进行，用1×SDS加样缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，采用Bradford法进行蛋白定量。制备好的蛋白样品置，80℃冰箱保存备用，每泳道上样30μg蛋白，经10％SDS-PAGE(70V，120V分别电泳2h和4h左右)电泳后，电转膜至硝酸纤维膜，室温封闭后加入兔抗KLF4多克隆抗体，室温孵育2h，加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育1h，DAB显色，拍摄照片，记录试验结果。

7、　　1．2．3　细胞形态观察　　取各转染细胞于倒置显微镜下，观察其生长速度和形态改变，并逐日记录。　　1．2．4　CCK-8法检测细胞的增殖　　取生长状态良好的对数生长期各组细胞接种于96孔板(每孔1×104个细胞)，每组接种5个复孔，在含10％新生小牛血清的条件下分别培养24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL继续培养4h，将96孔板放人酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值。　　1．2．5　流式细胞术检测　　本实验由北京鼎国生物技术公司协助完成，分别接种等量的对数生长期的各组细胞于100mL培养瓶中，

8、每组5瓶，培养24h后，参考该公司流式细胞检测说明收集细胞，送北京鼎国生物技术有限公司进行流式细胞术分析。　　1．2．6　统计学处理　　数据以均数土标准差(x±s)表示，两组间比较用t检验分析，以P＜0.05判断为有统计学意义。　　　　2　结果　　　　2．1　Westernblotting筛选高表达KLF4的细胞克隆　　采用脂质体分别转染KLF