《体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为胰岛样结构的初步探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＾户曲産种乂＃ＧｕａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙ学号：２０１１２００１５ＸＶ＾＾ＩＣＡ＾硕±学位论文－．．Ｖｒ－体外诱导骨髓源间充质干细胞分化’兴膜岛样结构的初步探讨吴丽情导师姓名：陈维平专业名称：人体解剖与组织化胎学申请学位类型：学术学位答辩委员会主席：李中华答辩委员会委员：谢小薰谢丹尼何少健莫发荣二〇—五年五月 原剑巧声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｌ乂标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得广西医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均＆在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：秦厮殘签字日期Ｗ许＆月曰７学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：在校期间论文的知识产权属广西医科大学。学校有权保存论文的电子和纸质文档，可Ｌ乂借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可Ｌ乂采用影印、复印或其它手段保存、汇编本论文，学校可Ｌ乂向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查閑和借阅。同意广西医科大学可ＬＸ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定。学位论文作者签《：＾贏术ｉ导师签字￣曰＊签字期：７〇１５年６月３曰签字曰年月曰Ｉ＾ 个人简历基本情况姓名：吴丽情性别：女民族：汉族出生年月：１９８７．８籍贯；江西政治面貌；党员学习工作经历２００５－．９２０１０６．广西中医药大学本科２０１１－．９２０１５．６广西医科大学研究生研究生期间科研经历２０１－１．９２０１５．６体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨由广西自然科学基金（２０１２ＧＸＮＳＦＡＡ０５３１２６）资助本人参与实验２０－１１．９２０１３．６定向诱导间充质干细胞向也化细胞方向分化过程中Ｎｋｘ２．５的表达由广西自然科学基金１２ＧＸＮＳＦＡＡ０５３１２６）（２０资助本人参与实验 目录一、英文缩略词１二、中文摘要２Ｈ、英文摘要４四、论文６１前５８２材料与方法８３结果２６４讨２９５誠４０６存在问题与展望４１７附？４２五、参考文献４９六、综述部分５４Ｅ文５４参考文献６５心致谢７０八、攻读学位期间发表的学术论文７１４ 体外语导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文英文缩略词英文缩写英文全称中文全称ＡＬＰａｌｋａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅｐｐ碱性磯酸酶。＿ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍＢＭＭＳＣｓ骨髓源间充质干细胞６６Ｕｓ’’ＤｕｌｂｅｃｃｏｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓＤＭＥＭＤ氏改良Ｅａｇｌｅ培养基ｍｅｄｉｕｍＤＴＺＤｉｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｚｏｎｅ双硫腺ＤＭＳＯＤｉｍｅｔｈｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ二甲ｙ基亚讽ＥＰｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量离也管ＦＢＳＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ胎牛血清４－－ｄ－－（２Ｈｙｒｏｘｙｅｔｈｙ）１ｈ。Ｊｅｐｅｓ．／艺基派嗦乙橫酸钢＾ｐ巧ｅｒａｚｍｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉＧ－－－３ｉｓｏｂｕｔｌ１ｍｅｔａｎｔｈｎｅ－－－旧ＭＸｙｈｙｌｘｉ３异了基１甲基黄嘿岭Ｓ化ｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓ址ｎｅ憐酸盐缓冲鞭ＰＣＲＰｏｌｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ聚合酶链反应ｙ漠化乙钻ＥＢＥｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅＰＳＣＰａｎｃｒｅａｓｓｔｅｍｃｅｌｌ膜腺干细胞１ 体夕悔导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨摘要ＢＭ－ＭＳＣｓ目的；探讨诱导跨胚层分化为膜岛样结构的方法；探究诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ分化为膜岛样结构的可行性，并初步建立相关的实验室技术方法。－方法：优化ＢＭＭＳＣｓ的培养体系，建立骨髓源间充质干细胞系；选用第二ＢＭ－ＭＳＣｓ１ｌ：Ｉ尼克醜胺组０％ＦＢＳＯｍＭ尼克醜代分两组诱导，含、胺的ＤＭＥＭＢＭ－ＭＳＣ高糖液培养ｓＩＩ：；膜腺组织裂解液组用膜聪组织裂解液配－ｓ。２制条件培养液培养ＢＭＭＳＣ诱导个月，观察细胞形态变化，诱导后民Ｔ－ＰＣ民检ｉｎｓｕｌｉｎＷ双硫踪染色对细胞团进行初步鉴定，；测基因的表达膜岛素免疫组织化学染色方法检测细胞团内膜岛素阳性细胞；Ｍａｌｌｏｒｙ染色区分细胞团内不同膜岛细胞。ＢＭ－ＭＳＣｓ。结果：集落分布，单个大核，折光透亮在连续诱导培养过程ｌ中：Ｏｄ出１９ｄ，①尼克酷胺组诱导现细胞聚集；诱导聚集的细胞增多形成细胞团；诱导的细胞团表面未有被膜包裹；ＤＴＺ染色可见细胞团中央部－ｓｕｌｉｎａｌｌｏ分染成栋红色，民ＴＰＣ民证明诱导细胞ｉｎ基因表达；Ｍ巧染色仅见１细胞团内淡黄色的类目细胞。②膜腺组织裂解液组：诱导３ｄ细胞成团；诱导４７ｄ形成有被膜包裹的细胞团。ＤＴＺ染色可见细胞团染色，其中大部－分呈掠红色，部分成猩红色；民ＴＰＣ民证明诱导细胞ｉｎｓｕｌｉｎ基因表达，免疫组织化学染色可见踪色的膜岛素阳性细胞，Ｍａｌｌｏｒｙ染色可见细胞团周围呈黄色的类ａ－目细胞及中央呈红色的类细胞。结论：适宜条件下ｉＢＭＭＳＣｓ可跨胚层分化形成族岛样结构。膜腺组织裂解液能更好的模拟微环２ 体外语导膏髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位洽文境－ＭＳＣｓ形ａ，诱导ＢＭ成由类细胞与类Ｐ细胞组成的，且有被膜包裹的膜岛样结构。关键词：骨髓源间充质干细胞、尼克醜胺、膜腺组织裂解液３ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０＂届硕±学位洽文ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＳＴＵＤＹＯＦＩＮＤＵＣＴＩＯＮＡＮＤＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＯＦＢＯＮＥＭＡＲＲＯＷＭＥＳＥＮＣＨＹＭＡＬ－ＬＩＫＥＳＴＥＭＣＥＬＬＳＩＮＴＯＩＳＬＥＴＳＴＲＵＣＴＵＲＥＩＮＶＩＴＲＯＡＢＳＴＲＡＣＴ－ＭＳＣｓｄＯｂｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｎｄｕｃｉｎＢＭｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｊｐｇ－－ｉｓｌｅｔｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇＢＭＭＳＣｓｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔ－ｉｎｔｏｉｓｌｅｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｌａｂｏｒａｔｏｒ，ｐｙｙ化ｃｈｎｏｌｏａｎｄｍｅ也ｏｄｓ．ｇｙ化ｅ－Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｄｏｐｔｉｎｇｍｅ化ｏｄｏｆｎａｔｕｒａｌｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏ打ｔｏｓｅａｒａｔｅＢＭＭＳＣｓｐｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｌｌｏｗｔｈｅｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｃｅＵｓｗｉｔｈｔｈｅｍｅ化ｏｄｏｆ山ｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｒｅｎｔ，ｃｕｌｔｕｒｅｈｅｉ－ＭＳＣｓｗａｓｓｅｉｎｔｏｔｗｏｉｉ．ＴｓｅｃｏｎｄａｒｙｇｅｎｅｒａｔｏｎＢＭｐａｒａｔｅｄｎｄｕｃｔｏｎｒｏｕｓ；ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｒｏｕａｎｄａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｌｓａｔｅｒｏｕ．Ｗｉｔｈｔｗｏｍｏｎｔｈｓｇｐｇｐｐｙｇｐｏｆ化ｅｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍａｒａｔｉｏｎｔｈｅｍｏｒｈｏｌｏｉｃａｌｐ，ｐｐｇｃｈａｎｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｒｏｕｓ．ＤＴＺｓｔａｉｎｉｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｇｇｐｇｐｙｉ－ｉｗｉｄｅｎｔｆｙｔｈｅａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｔｈｅｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｅｎｅａｓｐｐｇｄｅ－ｔｅｒｍｉｎｅｄｂ民ＴＰＣ民．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｓｔａｉｎｉｎｗａｓｕｓｅｄｔ；ｏｄｅｌ；ｅｃｔｙｙｇｉ－－ｗｈｅ也ｅｒｎｓｕｌｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｘｉｓｔｅｄｉｎ化ｅｉｓｌｅｔｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ａｎｄ－Ｍａｌｌｏｉｙｓｔａｉｎｉｎｗａｓｕｓｅｄ化ｉｄｅｎｔｉｅｋｉｎｄｓｏｆａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｅｌｌｇｆｙ也ｐｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｒｕｓｕｌｔ：Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｓａｍｅｆｅａｔｈｅｒｏｆｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｓｉｎｌｅｙｇｌａｒｅｎｕｃｌｅａｒａｎｄｒｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｈｉｎｉｎｂｒｉｌｌｉａｎｔｌ．Ａｆｔｅｒ化ｅｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｇｇｙｐ，４ 体外诱导賈髓源间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文ｉｎｔｈｅｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｒｏｕａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌＯｄａｓｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｅａｎｔｏｇｐ，ｙ，ｇａｔｈｅｒ．Ａｆｔｅｒ１９ｄａｓｉｎｄｕｃｔｉｏ打化ｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌａｒｅａｔｉｏｎｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｙ，ｇｇｇ，化ｅｓｔｅｍｃｅｌｌｆｏｒｍｅｄｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ａｎｄ化ｅｃｅｌｌｄｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｎｏｔａｃｋａｅｄｏｆｐｇｃａｐｓｕｌｅ．ＩｎｔｈｅｃｅｎｔｒｅｏｆｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒＤＴＺｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｂｒｏｗｎｒｅｄ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆ－ｄｉｎｅｄｉｉＲＴＰＣ民ｅｔｅｒｍｔｈｅｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｍＲＮＡｏｆｎｄｕｃｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｐ，Ｍａｌｌｏｒｓｔａｉｎｉｎｗａｓｆａｉｎｔｅｌｌｏｗ．Ｗｈｉｌｅｉｎｔｈｅａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｌｓａｔｅｒｏｕｙｇｙｐｙｇｐ，ａｆｔｅｒ３１ｄａｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｍｅｄｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓａｆｔｅｒ４７ｄａｓｙ，，ｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｈｅｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅａｃｋｅｄｗｉｔｈｃａｓｕｌｅ．Ｔｈｅｆｏｒｍｅｄｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓ，ｐｐＤＴＺｓｔａ－ｉｎｉｎｗａｓｉｎｄｉｎｍｏｓｔａｒｔｏｆｔｈｅｉｓｌｅｔｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗａｓｉｎｂｒｏｗｎｒｅｄｇｙｇ，ｐ，－ａｓｍａｌｌａｒｔｗａｓｉｎｓｃａｒｌｅｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆ民ＴＰＣ民ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｅＣｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｉｐｉｎｓｕｌｉｎｍＲＮＡｏｆｉｎｄｕｃｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｓｔａｉｎｉｎｔｈｅｙｇ，－ｔｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｌｕｓｅｒｓｗａｓｉｎｂｒｏｗｎ．ＷｈｉｌｅａｆｔｅｒＭａｌｌｏｒｓｔａｉｎｉｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｒｅｙｇ，ｄｒｅ巧ｅｄｉｎｔｏｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｕｒ，ｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒｅｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｒｅｒｅｄ，ｐｅｒｉｐｈｅｒｙｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｒｅｆａｉｎｔｅｌｌｏｗ．ｙ－ＭＳＣｓｃｏｕ－Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ；ＴｈｅＢＭｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｉｓｌｅｔｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｕｎｄｅｒａｒｏｒｉａｔｅｃｏｎ姐ｔｉｏｎｉ打ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｌｓａｔｅｉｍｉｔａｔｅｄｔｈｅｐｐｐｐｙｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｐａｎｃｒｅａｓ，ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｅｒｅ－ｗｈ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｉｓｌｅｔｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄａｌｉｋｅｃｅｌｌｉｎ，－ｗ化ｅｃｅｎｔｅｒｏｆ化ｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ目ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｏｆ化ｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉ化ｇ，ｃｏｍｐｌｅｔｅｃａｓ山ｅ．ｐＫＥＹＷＯＲＤＳ；ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｂｍｃｅｌｌｓｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｙ；；ａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｌｓａｔｅｐｙ；５ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文Ｗ—Ｉ—刖吕糖尿病是威胁人类生命健康的重要疾病，其发病率逐年上升，在发达？国家糖尿病可达到２％日％，且呈现年轻化，在我国糖尿病患病率己呈较高水平，与中等发达国家的水平相当。糖尿病患者由于自身免疫系统损坏了膜岛目细胞（Ｉ型）或者由于膜岛素抵抗（ＩＩ型），使机体不能有效利用葡萄糖一，从而导致系列并发症产生，是糖尿病的主要死亡原因。目前治疗糖尿病的方法是口服降糖药及注射膜岛素，但血糖控制并不理想，常出现。低血糖症状或血糖偏局的情况为持续有效的控制血糖，减少并发症及提高生活质量，寻找朕岛替代治巧是组织王程在治疗糖尿病的新方法，即通过体外诱导干细胞形成膜岛素分泌功能的细胞Ｗ代偿机体内目细胞不足或’。功能受损干细胞的来源主耍有胜胎干细胞，及脉带血、Ｗｈａｒｔｏｎｓ胶冻及其他的成体组织等获得的多能干细胞。（ＢＭ－ＭＳＣｓ）作为中胚层来源的多骨髓间充质干细胞能干细胞，是存在于骨髓中的非造血干细胞，具有自身储备、易获取的优势；而且能稳一、定扩增、多系分化、具有高度分化潜能，在定的环境条件下可向内中－ＭＳＣｓ、外Ｈ个不同胚层分化。ＢＭ既可Ｗ避免胚胎干细胞的伦理道德问题－ＭＳＣｓ能够避免资源可巧局限性及同种异体移；同时自体来源的ＢＭ。植排斥反应；是体外获得功能膜岛的最具发展前景的种子细胞２００３年Ｗｌａｎｕｓ等首次证实了大鼠来源的ＢＭ－ＭＳＣｓ可分化为分泌膜岛素的细胞，而存在Ｗ往干细胞诱导分化的同样问题，如分化效能低、诱导后细胞膜岛素释放水平低。通过多能干细胞获得具有分泌膜岛素功能的细胞已被广泛研究，但诱＂＂导方法尚未统一，且诱导条件尚不成熟，微环境诱导学说指出，决定干细胞分化的转录因子及启动因子可能存在于干细胞生存的微环境中，＂＂、即干细胞盡中，包括壁盡细胞细胞外基质和来源于壁盡细胞的可溶性因子等，在特定的微环境中ＭＳＣｓ通过与其他细胞、细胞基质及各种细６ 体外语导骨跑源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文胞因子、激素的相互作用，引起调控干细胞分化的某些关键基因表达。化学试剂诱导是体外模拟膜腺发育过程中所需的营养因子，Ｚｈａｎｇ等阶段性化学因子诱导方法体外诱导胎儿ＢＭ－ＭＳＣｓ分化形成膜岛素分泌细Ｗ胞。Ｘｕ等在生长因子的基础上添加提取的膜腺组织裂解液，提高了糖尿病鼠体内膜岛素释放量，指出了膜腺组织裂解液可能通过旁分泌途径释放细胞因子作用的结果。本实验在课题组研究的基础上－ＭＳＣｓ跨，探讨ＢＭ胚层分化为膜岛样结构的方法－ＭＳＣｓ分化；采用巧克酷胺定向诱导方法，ＢＭ形成了膜岛素分泌细胞，未形成膜岛样结构；使用异种来源的兔膜腺组织裂解液，体外诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ分化形成了由类ａ及类目两种膀岛细胞组成及表面有被膜，包裹的膜岛样结构－ＭＳＣｓ跨胚层分化为膜岛结构的形。初步探讨了ＢＭ态变化特点，为体外获得膜岛样结构提供实验依据，初步建立了相关的实验室技术方法。７ 体外巧导育髓Ｉ间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕货位论文材料与方法１．实验材料１．１实验动巧一ＳＰＦ（ｓｅｃｉｆｉｃａｔｈｏｅｎ－ｆｒｅｅ无特定病原菌ＳＤ）级ｐｐｇ，周龄乳鼠，购自广西医科大学实验动物中也。１．２主要试剂１．２．１ＤＭＥＭ培养基（低糖、高糖）ＷＩＳＥＮＴ公司１．２．２ＦＢＳＷＩＳＥＮＴ公司１．２．３ＰＢＳ粉剂Ｓｏｌａｒｂｉｏ１．２．４青霉素华北制药１．２．５链霉素山东鲁抗１．２．６ＨＥＰＥＳＳｏｌａｒｂｉｏ１．２．７０．巧％膀酶ＷＩＳＥＮＴ公司１．２．８４％多聚甲酵Ｓｏｌａｒｂｉｏ１．２．９地塞米松Ｓｉｇｍａ１．２．１０维生素ＣＳｉｇｍａ－１．么１１Ｐ甘油磯酸钢Ｓｉｇｍａ１．２．１２异了基甲基黄嚷岭Ｓｉ卵ａ日１．２．３引哄美辛Ｓｉｇｍａ１．２．１４膜岛素Ｓｉｇｍａ１．２．１５ＤＮＡｍａｒｋｅｒ上海ｉｎｖｉｔｒｏｅｎｇ公司１．２．１６５ＸＴＢＥ电泳缓冲液上海生物工程１．２．１７ＰＣＲ引物序列内参－ａｃ：０ｔｉｎ－－上游引物：５ＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧ３８ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文５－－下游引物：ＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＴＣＧＧＴＣ３扩增片段长度为３３０ｂｐｉｎｓｕｌｉｎ：－－上游引物；５ＴＣＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧ３－ＧＴＣＴＧＡ－下游引物；５ＡＧＧＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴ３扩增片段长度为２６化ｐ上引物由上海ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司合成。ｇ１．２．１８逆转录试剂盒Ｔａｋａｒａ１．２．１９抗；即用型鼠抗人族岛素单克隆抗体武汉博±德－１．２．２０生物素链霉卵白素免疫组化检测试剂盒中杉金桥试剂；３％＆〇去离子水２Ａ－试剂；封闭液正常Ｈ羊血清工作液试剂Ｂ：二抗工作液（ＩｇＧ／Ｂｉｏ）－Ａ／ＨＲＰ试剂Ｃ：辣根酶标记的链霉素卵白素工作液（Ｓ）１．２．２１ＤＡＢ显色试剂盒福州迈新试剂Ａ；ＤＡＢ缓冲液（２０Ｘ）Ｘ试剂Ｂ；ＤＡＢ底物（２０）试剂Ｃ；ＤＡＢ色原（２０Ｘ）１．２．２２碱性磯酸酶试剂盒南京建成１．２．２３盐酸、乙醇、二甲苯、异丙醇、中性树胶国产分析纯试剂１．３实验主要仪器设备１－．３．１ＨＦｓａｆｅ超净工作台上海１．３．２Ｃ〇２恒湿培养箱孔ｅｒａｉｏＦｏｒｍａ１．３．３倒置相差显微镜Ｏｌｙｍｐｕｓ１．３．４台式离也化北京医用离也机厂１．３．５冰箱青岛海尔９ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０。届硕±学位论文１．３．６低湿高速离必机Ｓｍａｉｇ１．３．７高压灭茜消毒锅ＴＯＭＹ１．３．８ＰＣＲＢＩＯＭＥＴＲＡ基因扩增仪１．３．９ＵＶＩ凝胶成像分析系统Ｏｌｙｍｐｕｓ１．３．１０可见分光光度计上海－１．３．１１ＴＳ２型脱色摇床江苏１．３．１２电泳仪、电泳槽北京１．３．１３超纯水仪器Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ１．３．１４１０００、２００、１００、２．５叫微量加样枪Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ１．３．巧精密电子天平常熟双杰测试仪器厂１．３．１６电热蒸馈水器上海亚荣生化１．３．１７玻璃匀浆管上海１．３．１８眼科剪、解剖剪、显微剪、有齿摄等苏州医疗１．３．巧电热恒温水浴锅上海－１．３．２０隔水式电热３７Ｃ恒温培养箱上海１．４试剂配制１．４．１ＰＢＳ缓冲液’ＰＢＳ一００ｍｌ４取粉剂袋，５Ｈ蒸水充分溶解，Ｃ冰箱储备。使用前用Ｈ蒸水１：３比例稀释，窩压灭菌后使用。１．４．２青霉素液配制青霉素针剂１支（８０万Ｕ），溶解于８０ｍｌ生理盐水，配成浓度为１ｍｌ的ＥＰ管中－Ｕ／ｍｌ的浓缩液，分装入１，每只１ｍｌ２ＣＴＣ万，保存。使用前常温解冻，终浓度为：ｌＯＯＵ／ｍｌ。１．４．３链霉素液配制１０ 体外巧导＃§ＩＭ司觸干细胞々化为廣窜样瓣的初步騰２０。屆硕±学位论文链霉素针剂１支（ｌ．Ｏｇ）１００ｍｌ的生理盐水，配，溶解于成浓度为‘－１０Ｌ的浓缩液至１．５ｍｌｍｌ２０Ｃｇ／，分装的ＥＰ管，每只１，保存备用。使用前常湿解冻，终浓度为；Ｏ．ｌｇ／Ｌ。１．４．４ＨＥＰＥＳ配制液其分子量为２３８．３１，称取２３．８３ｇ粉剂溶解于１００ｍｌ已离巧的无菌Ｈ蒸水中，配成浓度为ｌＯＯｍｍｏｌ／Ｌ的浓缩蔽０．２２ｕｍ滤器过滤后，分装入－１．５ｍｌ的郎管中，２（ｒＣ保存备用。使用终浓度为ｌＯｉｍｎｏｌ／Ｌ。１．４．５ＷＩＳＥＮＴ胎牛血清°－４－进口原装胎牛血清Ｃ解冻后，直接分装至１０ｍｌ小青瓶，２（ＴＣ冰箱保存，使用前常温解冻。１－．４．６低糖ＤＭＥＭａＤＭＥＭ）基础培养基维森特５００ｍｌ原装进口培养基，超净工作台内紫外光线照射Ｉｈ，分别°分装到１００ｍｌ圆瓶内，每瓶约９０ｍｌ，４Ｃ冰箱保存备用。１．４．７５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液（低糖）配制Ｌ－ＤＭＥＭ９２ｍｌ培养基ＦＢＳ５ｍｌ一ｍｍ方Ｕ／ｌ青霉素１ｌｌＯｇ／ｍｌ链霉素１ｍｌｌｍｏｌ／１ＨＥＰＥＳ浓缩液１ｍｌ’’４Ｃ冰箱储存。使用前，水浴温箱内３７Ｃ复温后使用。１．４．８５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液（高糖）配制Ｈ－ＤＭＥＭ基９２ｍｌ培养ＦＢＳ５ｍｌ一ｍｍ万Ｕ／ｌ青霉素１ｌｌＯｇ／ｍｌ链霉素１ｍｌｌｍｏｌ／１ＨＥＰＥＳ浓缩液１ｍｌ１１ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０。届硕掛位论文°－４Ｃ冰箱储存；使用前，水浴湿箱内３７Ｃ复温后使用。＝１．４．９膜酶；ＰＢＳ１：１配制°口－维森特原装进０．２５％膜酶１００ｍｌ，４Ｃ冰箱解冻后，Ｗ膜酶：‘ＰＢＳ＝ｍ－１：１体积比稀释，分装至１．５ｍｌ邸管中，每只１ｌ，２０Ｃ冰箱保存备用；使用前常温解冻。＇１．４．１０尼克醜胺的配制其分子量为１２２．１３，称取１２．２１３ｇ尼克醜胺溶解于１００ｍｌ的Ｈ蒸水，配成浓度为Ｉｍｏｌ／Ｌ的浓缩液，０．２２Ｕｍ滤器过滤后，分装入１．５ｍｌ的ＥＰ一管中，每只ｌｍｌ２（ＴＣ保存备用。使用终浓度为ｌＯｍｍｏｌ／Ｌ。，１．４．１１双硫腺储存液（ｌＯｍｇ／ｍｌ）称取４ｍｇ双硫腺溶于４ｍｌ二甲基亚讽（ＤＭＳＯ）配成储存液，混匀后－．ＳｍｌＥＰ管中，每只１ｍｌ２（ＴＣ储存备用。分装至ｌ；使用前，用ＰＢＳ１：１００稀释，现配现用。－－１．４．１２焰红甲苯胺蓝橘黄Ｇ混合液首先称取２．５ｇ磯锥酸充分溶解于１００ｍｌＨ蒸水中，后再依次加入一２一一．５甲苯胺蓝、２．５Ｇ、４．Ｏ红ｇｇ枯黄ｇ焰；般等种染料溶解后加后°种，混匀后４Ｃ冰箱储存备用。１：００．４．１３１１稀释的膜岛素抗体取１１的膜岛素抗体原液与１００叫的ＰＢＳ混匀稀释，现配现用。１．４．１４成骨诱导剂配制：－８（１）ｌ〇ｍｏｌ／ｌ地塞米松：分子量３９２．４６ｌＯＯｍ１ｍｌ无水乙醇后，ｇ溶于稀释于ｌＯＯｍｌＨ蒸水中，此时浓度２．５４８Ｘｌ（Ｔｍｏｌ／ｌ，分装入已高压好的－１．５ｍｌＥＰ管中，每只１ｍｌ，２（ＴＣ保存备用Ｏｕ１２５ｍｌ；取上述ｌ溶于的Ｈ°－蒸水中．ＳｍｌＥＰ２０Ｃ保存备用１，再分装于ｌ管内，每只１ｍｌ，，此时浓度－９Ｘｌ〇ｍｏｌ／ｌ；取第二次稀释的１ｍｌ溶于１００ｍｌ含有５％ＦＢＳ的＾ＤＭＥＭ培养基中。１２ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛＾勾的初步探讨２０。届硕±学位论文（２）５０ｉ／ｍｌ抗坏血酸０．Ｉｇ溶２０ｍｌ，＾ｇ；于无菌＾蒸水中分装于°ＥＰ－ｌＭ５％ＦＢＳ的心１．５ｍｌ管中，２０Ｃ避光保存。取１ｍ１０（，每只１ｍｌ溶于ＤＭＥＭ培养基中。－（３）ｌＯｍｍｏｌ／ｌ目甘油磯酸纳；分子量２１６．０４，称取０．２１６充分溶解－ＤＭＥＭ培养基中于１ｍｌ无菌兰蒸水，加入１００ｍｌ含有５％ＦＢＳ的Ｌ。１．４．巧０．１％Ｓ茜素红配制：－ＨＣ－ｌｍｏｌ／１ｔｒｉｓｌ（ＰＨ６．８），称取０．Ｉｇ茜素红溶于０．ｌｍｏｌ／１ｔｒｉｓＨＣＬ１．４．１６成脂诱导剂配制：（１）０．巧畔ｉ〇ｍ地塞米松；分子量３９２．４６，ｌＯＯｍｇ溶于无水乙醇，加入？ｌＯＯｍｌＨ蒸水中稀释，此时浓度２．日４８Ｘｌ（Ｔｍｏｌ／ｌ；取１ｍｌ溶于１００ｍｌ含套有５％ＦＢＳ的ＬＤＭＥＭ培养基中。（２）２００１〇１／１消炎痛３５７．７９，０．溶于１ｍｌ的畔：分子量称取ＤＭＳＯ中，此时溶度为ｌｍｍｏｌ／１，取２０Ｕ１溶于１００ｍｌ含有５％ＦＢＳ的心ＤＭＥＭ培养基中。（３）０．５ｍｒｎ〇ｍ异Ｔ基甲基黄嘿岭ａＢＭＸ）：分子量２２２．资４，ｌＯＯｍｇ溶于９０叫ＤＭＳＯ溶液中，取１０叫溶于１００ｍｌ含有５％ＦＢＳ的＾ＤＭＥＭ培养基中。（４）１０腿／ｍｌ族岛素：巧ｍｇ膀岛素完全溶于１ｍｌＳ蒸水中，缓慢滴加３５％ＨＣＬ２．５ｍｌ，溶度的稀溶液中，至粉末完全溶解，约定容至分装至－１．５ｍｌＥＰ管２ＣＴＣ储存备用；取其中１００叫溶解液至溶于１００ｍｌ含有５％低糖ＤＭＥＭ培养基中。１．４．１７油红染液配制：称取化５ｇ油红溶解于１００ｍｌ异两醇，滤纸过滤后避光保存；使用前染料与蒸溜水３：２体积稀释，现配现用。２实验嫌２－ＭＳＣ．１ＢＭｓ分离培养及扩增方法１３ 体外巧导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文２－．１．１ＢＭＭＳＣｓ取材方法一（１）ＳＤ，无菌条件下处死新生周齡乳鼠１只，有齿摄及解剖剪分离两侧股骨及腔骨，剪去骨表层大部分肌肉等组织，后置于盛有无菌低糖ＤＭＥＭ培养基的小青瓶中。（２）转移至超净工作台内操作，经低糖ＤＭＥＭ培养基冲洗两遍，将股骨皿内一及腔骨转移至盛有低糖ＤＭＥＭ培养基中的培养，眼科剪进行进步的精细分离，去除表面的血管及神经。（３）用１ｍｌ无菌注射器抽吸适量低糖ＤＭＥＭ培养基搁滑管壁，于长骨的两侧骨垢端抽取骨髓，抽吸皮为均匀，操作时动作缓慢，压力切不可过大。抽吸后注射器内的骨髓悬液缓慢推出至盛有含５％ＦＢＳ低糖ＤＭＥＭ培养液的离也管中，避免产生气泡。（４）（ｉｎ４ｍｉｎ）抽吸完毕后，离也管６００ｒｐｍ／ｍ，离也，吸管沿管壁吸去？上清液，离也沉淀内加入约６８ｍｌ含５％ＦＢＳ的低糖ＤＭＥＭ培养液，轻柔吹打数次混匀后室温静置约２５ｍｉｎ。？（５）静置后吸管沿管壁内悬液界面依次下降，吸去上层４６ｍｌ悬液。向离也管内剩余２ｍｌ细胞悬液内加入适量的５％ＦＢＳ的低糖ＤＭＥＭ培养液，２置于轻柔吹打混匀后接种至２５ｃｍ培养瓶内密度ｌＯＶｍｌ３７Ｔ：，；调整细胞，体积分数５％Ｃ０；培养箱内。（６）２化３ｄ培养后首次全量换液，Ｗ后视细胞生长情况约每小量换液。么１－ＭＳＣｓ的．２ＢＭ传代？一（１）细胞生长达到细胞瓶底总面积的７０％８０％，可见两种细胞形态，一，呈集落样分布，细胞折光性好，胞浆饱满种是梭形；另种是球形，附于梭形细胞之上，此时即可传代，Ｗ提供更多的ＭＳＣｓ生长空间。＝（２）用吸管吸出全部培养液２ｍｌ膜酶：ＰＢＳ１：１体积比消化显微，加入镜下观察细胞消化状态。待大部分细胞开始收缩，少许细胞漂浮时及时加入等体积５％邱Ｓ的ＬＤＭＥＭ终止消化。１４ 体外语导脅齡原间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文（３）拍打细胞培养瓶瓶底，将瓶内细胞悬液吸出转移至新的培养瓶中，°１：２Ｐ１３７Ｃ５％Ｃ０原瓶继续培养、传代比例为，此时细胞状态记做；、２培养箱内继续培养。？（４）第二代培养数天，瓶内细胞生长达到瓶底总面积的７５％８５％，可继续上述方法进行传代（操作同上）。２－ＭＳＣｓ．２ＢＭ冻存及复苏２－．２．１ＢＭＭＳＣｓ的冻存？（１）细胞生长达到瓶底总面积的７５％８５％，可冻存细胞储存备用。°＝（２）Ｊ：９操净工作台内，ｙｌ甘油；血清１体积比配制冻存液，置于４Ｃ冰箱预冷待用。？（３）消化细胞）（４），步骤同干细胞传代培养（３。（４）离也（１０００ｒ／ｍｉｎ５ｍｉｎ）收集细胞沉淀，加入适量冻存液后吹打混，Ｘ７０匀，制成细胞悬聽调节密度１１个／ｍｌ。（５）每２．０ｍｌ冻存管加入约１．５ｍｌ细胞冻存悬聽旋紧盖子口胶，封封口－，依次标记好。°－－（５）４ｒ平衡放置３０ｍｉｎ２０Ｃ８〇ｒ超低温冰箱冻存管，然后放６０ｍｉｎ，过夜，次日转移到液氮中长期保存。２－．２．２ＢＭＭＳＣｓ的复苏°（１）调节恒温水浴箱温度为４０Ｃ。（２）从液氮中取出冻存管后立即投入４（ＴＣ水浴箱内，并不断摇动冻存管使之近速蘭化（约４５巧，不超过Ｉｍｉｎ），当留有少量冰晶时可从水浴箱中取出。－（３）转移至超净工作台ＤＭＥＭ，将融化的细胞悬液移至装有含１０％ＦＢＳ的Ｌ，ｌＯＯＯｉｎｉ培养液的离也管中ｒ／ｍ，离也５ｍｎ，弃去上清液，细胞沉淀加入新鲜的含１０％ＦＢＳ的ＬＤＭＥＭ培养液，吹打制成细胞悬液。５？（４）调整细胞密度为ＩＸ１〇１（／／ｍｌ，接种于培养瓶中培养。１５ 体外语导膏髓源间禍干细胞分化为膜岛样娜的巧步殺寸２０１５届硕±学位论文（５）次日全量换液。Ｗ后视细胞生长状态和培养液颜色变化调整为每兰天小量换液。？（６）待细胞生长至瓶底面积７５％８５％时，可重复上述操作进行传代。２－ＭＳＣｓ．３ＢＭ多向分化潜能鉴定２．３．１成骨诱导？么３－．１．１诱二ＭＳＣｓ导方法：选用第代ＢＭ，细胞密度达到培养瓶７０８０％，吸管吸去培养液，加入预先配制好的成骨诱导液，每３天小量换？觀诱导４５ｗ。２．３．１．２鉴定成骨细胞：（１）碱性磯酸酶染色：ａ诱导４ＰＢＳ冲一周后，弃去培养液，洗两次后，用试剂固定液约５ｍｉｎ。蒸溜水洗緣后待染；ｂ二＝添加碱性磯酸酶解育液，试剂（Ａ）：试剂二（Ｂ）２０：１（预热°３７ＴＯ，于３７Ｃ避光赔育巧ｍｉｎ，勿洗；Ｃ加入试剂四（２％硝酸钻水溶液）染色日ｍｉｎ；ｄ？蒸馈水洗２３次，每次２ｍｉｎ；ｅ加入试剂五（１％硫化钱水溶液）处理Ｉｍｉｎ；ｆ流水冲洗数分钟，ｇ加入试剂六复染３０ｓ，用蒸溜水洗后在虽微镜下观察。（２）茜素红Ｓ染色：ａ诱导５６ｄ，吸出全部培养液，加入ＰＢＳ漂洗两次；°ｂ用４％多聚甲酵３７Ｃ固定２０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涂两次；°Ｃ向培２ｍＳ？养瓶内加入约ｌ配置好的茜素红染液，３７Ｃ染色５ｌＯｍｉｎ；ｄ弃掉染液后加入适量的ＰＢＳ漂洗２次，每次２ｍｉｎ。ｅ瓶内加入约１ｍｌＰＢＳ缓冲液。，倒置显微镜下观察、拍照１６ 体外巧导畳敵源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０１５届硕±学位论文２．３．２成脂诱导？２－．６．２．１诱导方法二ＢＭＭＳＣｓ，细７５：选用第代胞密度达到培养瓶８５％，吸管吸去培养液，加入预先配制好的成骨诱导液，每３天小量换２？３ｗ。液，诱导２．３．２．２油红０染色成脂鉴定；ａ诱导约３ｗ，吸出全部培养液；ＰＢＳ洗２遍。ｂ用４％多聚甲醇固定２０ｉｎｉｎ，ＰＢＳ洗緣２遍，每次Ｉｍｉｎ；Ｃ加入现配制的油红染聽染色巧ｍｉｎ；ｄＰＢＳ洗３次，每次Ｉｒａｎｉｎ；倒置显微镜下观察，拍照。－２．４定向诱导ＢＭＭＳＣｓ暫＇２．４．１尼克酌胺诱导组（１）诱导试剂配制：包括ｌＯｍｍｏｌ／１尼克醜胺１ｍｌ、体积分数１０％胎牛血清１０ｍｌ、低糖ＤＭＥＭ培养基８７ｍｌ、青霉素１万单位１ｍｌ、ｌＯｇ／ｍｌ链霉素１ｍｌ。（２）尼克醜胺定向诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ二－ＭＳＣｓ生长良好第代ＢＭ，吸去培养液，加入上述配制的尼克酷胺化学诱导剂，连续培养２个月，每Ｈ天小量换液，定期观察细胞形态变化，拍照记录。２．４．２膜腺组织裂解液诱导组（１）族腺收集？，雌雄不分．日化２％取成年兔子，体重约１ｇ，固定于兔子固定箱内；戊己比妥钢予每公斤１．５ｍｇ经耳缘静脉注射，注射器抽吸约１０ｍｌ空气，再次经耳缘静脉注射、空气栓塞处死后，剪刀大致剪去腹部体毛，Ｗ７５％酒精喷洒消毒，消毒后剪刀沿腹部正中线靠胃的部位剪开，暴露上腹部；沿着胃窦下部，摄子找到十二指肠乳头，由胆管及膜管共同汇合处处，向右沿着汇入的膜管翻开胃后壁找到膜头，膜尾右侧连接脾处，綴子夹起膜１７ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文腺组织，剪刀剪除（过程避免剪到大的血管、血管破裂可模糊取材视°ＳＤＭＥＭ－２０Ｃ冻存野），ＰＢ漂洗后，放入盛有低糖液的试管中，。（２）膜腺组织裂解液制备°取出已冻存的膜腺组织，４Ｃ解冻，綴子夹起适量至盛有低糖ＤＭＥＭ液培养皿漂洗，后转移至小青瓶中弯剪剪碎，加入无血清的ＤＭＥＭ培养液一？稀释剪碎后的膀腺组织至定稀释溶度，吸取３４ｍｌ至玻璃匀浆器内研磨（于冰盒上操作，手动完成，毎次研磨时间控制在３０ｍｉｎ内），研磨后管转移研磨后的组织浆液至一次性试管见膜腺组织成奶油样沾管壁，；吸°°４Ｃ离必（３０００ｒ／ｍｍ，ｌＯｍｉｎ）；吸取清液至ｌ．ＳｍｌＥＰ中，ＥＰ管４Ｃ低湿下ｌＯＯＯＯｒ／ｍｍ高速离也ｌＯｍｉｎ。吸取离也后ＥＰ管内的上清液至已高压消毒－２一的ＥＰ管中，（ＴＣ冻存解冻后的裂解液次性用完。；（３）膜腺組织裂解液定向诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ二－ＭＳＣｓ１％选第代生长良好的ＢＭ，加入体积分数约膜腺组织裂解液，约每Ｈ天Ｗ含有１０％ＦＢＳ的レＤＭＥＭ小量换液，及补加适量的膜腺组织裂解液，连续诱导２个月，定期观察细胞形态变化，拍照记录。２．４．３诱导形成的细胞团鉴定２．４．３．１双硫膝染色鉴定（１）待间充质干细胞分化为细胞团后，弃去瓶内培养液，ＰＢＳ漂洗２次，每次Ｉｍｉｎ；°（２）加入２ｍｌ４％多聚甲酸固定液３７Ｃ，固定２０ｍｉｎ；（３）固定过程中，配制双硫踪染液，用ＰＢＳ稀释１００倍双硫踪储存液，配成工作染液。（４）固定完后吸出瓶内的多聚甲醒固定液，加入ＰＢＳ洗緣２次，每次Ｉｍｉｎ；。巧）加入已配制好的工作液，于３７Ｃ水浴温箱内染色１５ｍｉｎ；（６）Ｐ蛇洗涂３次。，每次Ｉｍｉｎ，倒置显微镜下观察并拍照１８ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０。届硕位论文２－．４．３．２ＲＴＰＣ民检测ｉｎｓｕｌｉｎ表达对ＢＭ－ＭＳＣｓ诱导２３ｄ尼克酷胺诱导及膜腺组织裂解液（）后进行族岛素目的基因检测，第二代培养的骨髓间充质干细胞为阴性对照，Ｗ未添加ｃＤＮＡ模板的反应体系为空白对照。①引物设计与合成－ａｃ从ＮＣＢＩ基因文库中查找到小鼠ｉｎｓ山ｉｎ和ｐｔｉｎ基因的ｃＤＮＡ序列，应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物：ｉｎｓｕｌｉｎ：上游引物－－；５ＴＣＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧ３下游引物－ＧＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴ－３；５蛋扩增片段长度为２６化Ｐ－ａｃｔ内参：Ｐｉｎ－ＴＣＴ－上游引物：５ＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧ３－－下游引物；５ＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＣＧＣＴＣＧＧＴＣ３扩增片段长度为３３０ｂｐＩＵ上引物由上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成②ＲＮＡ提取ａ将两组诱导后的培养瓶中的细胞膜酶消化加ｉｎ，转移至离也管中离、屯（ｌＯＯＯｒｍ／ｍｉｎ，４ｍｉｎ），收集沉淀。用ＰＢＳ冲洗２化每次Ｉｍｉｎ；离也ｐ后（ｌＯＯＯｒｐｍ／ｍｉｎ，４ｍｉｎ）弃ＰＢＳ上清液，加入ＩｍＵｒｉｚｏｌ试剂，纔匀后静置？５ｍｉｎ；加入２００叫氯仿，翻转混合，猛烈振摇１０ｓ，冰浴放置２細ｉｎ。°ｂ邸管４Ｃ离也（１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ），吸取上清液至１．５ｍｌ的ＥＰ管中．５ｍｌ异，，加入０丙醇混匀漂洗ＲＮＡ沉淀。１９ 体外诱导骨跑ｉ间充质干细胞分化为膜岛样结巧的初步探讨２０。届硕±学位论文’ＣＥＰ管４Ｃ离也（１２０００ｒｐｎｉ／ｍｉｎ，ｌＯｍｉｎ），弃去上清液后加入７００叫７５％艺醇（ＤＥＰＣ水ＲＮＡ配制），祸旋振荡，漂洗沉淀。°ｄ邸管４Ｃ离也（１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ）弃去上清液后加入７００＾７５％‘一ｍ上清液乙醇重新漂洗次。再次４Ｃ离也１２０００ｒ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ）弃去，吸（ｐ净管壁上残留的液体。ｅ室温静５？－置ｌＯｍｉｎ，使ＲＮＡ沉淀恰好干燥，１ＭＤＥＰＣ水溶解，８（ＴＣ保存备用。ＲＮＡ纯度检测：取４Ｊ｜总ＲＮＡ提取液，Ｈ蒸水稀释１００倍于分光光度（汁测定２６０ｎｒａ和２８０ｎｍ波长处的吸光度（０〇和０〇２８），ＲＮＡ的浓度２６。。二Ｘ４０Ｘ（鸣心１）ＯＤ２ｍ稀释倍数（１００倍）。同时计算０〇２５〇和〇〇２８。的比值（ＯＤ。／０〇），若两者比值大于１．８而小于２．０，说明提取的ＲＮＡ纯度ｍ２ｇ。一商，蛋白质和ＤＮＡ残余少，可用于下步的逆转录反应。ｆ１．５％琼脂糖凝胶的制备；称取琼脂糖０．３ｇ，加入盛有２０ｍｌｌＸＴＢＥ缓冲液烧杯中，混匀后微波炉加热至凝胶完全溶解。室温冷却至６（ＴＣ左右，加３？．５，混匀后倒入插好梳子的制胶板中入漠乙化锭０叫，凝胶厚度为５ｍｍ，凝结后即可使用。ｇ总ＲＮＡ完整性检测：取仙总ＲＮＡ提取聽１．５％琼脂糖凝胶（含滨化乙锭）电泳，加入电泳缓冲液ＩｘＴＢＥ，设置电泳条件００Ｖ，７５ｍＡ，；１３０ｍｉｎ，电泳后紫外投射仪观察，观察２８Ｓ和１能两条ＲＮＡ带，如果条带一显示清晰，说明提取的总ＲＮＡ完整，可用于下步的逆转录反应。③ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡａ冰上充分溶解ｃＤＮＡ合成试剂盒中相关试剂及ＲＮＡ。２０ 体外巧导骨髓源间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文ｂ取ＰＣ民管，冰上依次加入下试剂；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｉ８（０．５ｎｇ／叫）叫、ＲＮＡ°５叫，ｌＯｍｍｏｌ／１ｄＮＴＰ２ｉｌ，加ＤＥＰＣ水补至巧（：艘育５ｍｉｎ，立即放冰＾上；依次加入Ｗ下试剂５ＸＭ－ＭＬＶ反应缓冲液４叫核酸酶抑制剂１叫（２５Ｕ／＾ｉｌ）２ｌｐｌＯｍｍｏｌ／１ｄＮＴＰＭ－ＭＬＶ１００Ｕｊ叫反转录酶（／ｌ｜）°ｃ漏匀后４Ｃ微离也（１０００ｒ／ｍｉｎ，１５ｓ）。Ｉ°°ｄ逆转录反应程序设定：置ＰＣＲ管于ＰＣＲ仪中，巧Ｃ放置１０ｍｉｎ，４２Ｃ解°°ＣＯｍ－育化７０僻育ｌｉｎ，后冰上骤冷，即得到总ｃＤＮＡ，２０Ｃ储存备用，共逆转录兰个标本。④ｃＤＮＡ质量检测－ａｃｔ用Ｐｉｎ引物扩增ｃＤＮＡ检测所合成ｃＤＮＡ的质量，其中骨髓间充质ｃＤＮＡ干细胞模板的反应体系为阴性对照，ＵＪＩ未添加ｃＤＮＡ模板的反应体系为空白对照。取ＰＣＲ管，冰上依次加Ｗ下试剂，巧叫ＰＣＲ反应体系为；ｃＤＮＡ叫２ｘＰＣ艮ｍｉｘ，。１１２．５ｕｌ－ｐａｃｔｉｎ引物上游３－ａｃｔｉｎ引物下游叫（ＤＥＰＥ水９．５叫２１ 体外诱导晉随源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探巧２０。届社学位论文将上含反应体系的ＰＣＲ管置于ＰＣ民仪中，设定反应程序如下；‘９４Ｃ预变性５ｍｉｎ°９４Ｃ变性４５ｓｅｃ．°５５Ｃ退火４５ｓｅｃ■３５）扩増个循环°７２Ｃ延伸５０ｓｅｃＪ巧ｒ°末端延伸５ｍｉｎ，４Ｃ保存，。－⑤ＲＴＰＣＲ检测ｉｎｓｕｌｉｎｍＲＮＡＵｌｃＤＮＡ为模板，在反应体系中加入目的基因ｉｎｓｕｌｉｎ基因引物，设定反应参数，进行引物的扩增，Ｗ骨髓间充质干细胞ｃＤＮＡ模板的反应体系为阴性对照，未添加ｃＤＮＡ模板的反应体系为空白对照。取ＰＣＲ管，冰上依次加入Ｗ下试剂，２５山ＰＣ民反应体系为：ｃＤＮＡ１叫Ｘ２ＰＣＲｍｉｘ１２．５＾１ｉｎｓｕｌｉｎ引物上游，ｌｗ＿ｉｎｓｕｌｉｎ引物下游１ｊｌ｜ＤＥＰＣ水９．５叫将含上反应体系的ＰＣＲ管置于ＰＣＲ仪中，设定反应程序如下：°９４Ｃ预变性５ｍｉｎ°９４Ｃ变性４５ｓｅｃ°５５Ｃ退火４５ｓｅｃ＞．扩增３５个循环，７２Ｃ５０ｓｅｃ－延伸°°ｉＣ－７２Ｃ５ｍｎ４结束ａｃｔｉｎ为，ｌ＾ｐ延伸加时，内参照。⑥扩増产物的检测２２ 体外诱导骨跑原间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文取扩增产物１０叫，加漠龄蓝６扣混匀，加样于含邸的１．５％琼脂糖凝１００Ｖ７５ｍＡ３０ｍｉｎ。胶中进行电泳，电泳条件为：，，漠化艺锭显色，扩增产物条带用凝胶成像分析系统分析照相。２．７．３．３Ｍａｌｌｏｒ染色ｙ（１）间充质干细胞分化为膜岛样细胞团后，弃去瓶内培养液，郎Ｓ洗緣２次，每次Ｉｍｉｎ；°（２）加入２ｍｌ４％多聚甲醇固定液，３７Ｃ固定２０ｍｉｎ；（３）ＰＢＳ２，固定液弃去，洗緣次每次Ｉｍｉｎ；－－（４）加入２ｍｌ焰红甲苯胺藍橘黄Ｇ混合液．Ｏ、（焰红４ｇ甲苯胺蓝２．５ｇ、枯黄Ｇ２．５ｇ、憐铅酸２．５ｇ、蒸傭水１００ｍｌ），染色ｌＯｍｉｎ；（５）吸去染液后ＰＢＳＰＢＳ，加入漂洗数次去除瓶内浮色；瓶内加入缓冲液于倒置显微镜下观察。２．４．３．４族岛样结构制作成石蜡切片（１）膜腺裂解液诱导８ｗ，骨髓间充质干细胞分化为较多有完整被膜＝包裹的数个族岛样结构，吸去瓶内培养液，加入２ｍｌ膜酶；Ｐ蹤１：１消化Ｉｍｉｎ，使瓶底内组织结构松脱，加入等量含有邱Ｓ培养液终止消化；（２）用细胞ｒ子伸入瓶内，倒置显微镜下操作，动作轻柔，使组织结构松脱漂浮起来。吸管吸取悬液至离也管内离也（ｌ〇〇〇ｒ／ｍｉｎ５ｍｉｎ），，收集族岛样结构沉淀。（３）固定弃去离也管内上清液后４％。，加入多聚甲酸固定过夜（４）脱水将固定液弃去，用细针松动贴管壁的细胞团沉淀，摄子夹至小青瓶中，小青瓶内依次加入不同浓度的乙醇溶液，进行梯度脱水（７５％、９０％艺醇溶液各訊，９５％艺醇溶液脱水２ｈ，１００％乙醇溶液脱水１．加）二二甲巧）透明依次加入１００％乙醇：二甲苯１；１溶液２０ｍｉｎ，苯溶液１５ｍｉｎ，至组织块透明。２３ 体外语导骨敵源间充质干细胞公化为膜巧样结构的初步探巧２０：１５届硕±学位论文’Ｃ（６）透蜡将透明后的组织块放入６５恒温箱液蜡中化，使组织块完全侵入至蜡液中。（７）包埋将烙化的石蜡倒入容器内，用綴子夹取经过透蜡的组织－块，至容器底部，待石蜡表面完全凝固后，立即放入４Ｃ冰箱至蜡块全部凝固。（８）切片调整好切片机和蜡块，用１０１１ｍ厚度将蜡块切成蜡片。？（９）铺片将蜡片放入湿水中，用小綴子沾水后夹取蜡片放入４５°‘４８Ｃ的温水中一４０，待蜡片展平后再铺于另清洁的载玻片上，置于Ｃ湿箱烘干，隔天取出。２－．４．３．５石蜡切片苏木精伊红染色（肥染色）（１）二甲苯Ｉ、ＩＩ脱蜡，逆酒精梯度复水，切片滴加苏木素染液，染色５ｍｉｎ；（２）１％切片入自来水漂洗去浮色，盐酸酒精分化Ｉｓ后水洗，自来水藍化５ｍｉｎ；（３）切片入伊红染缸内，染色３０ｓ；４（）水洗后，顺次酒精浓度（７０％、８０％、９０％、％％、１００％）脱水，？各级约１２ｓ；二甲（５）苯Ｉ、ＩＩ溶液透明；（６）封片，滤纸吸去切片周围多余的二甲苯，滴加适量中性树胶，盖玻片封固后观察、拍照。２．４．３．６膜岛素免疫组织化学染色（１）冰箱取出已制备的石蜡切片，４（ＴＣ干燥环境下预热ｌＯｍｉｎ，去除切片表面的水雾；（２）二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化（１００％、９５％、８０％、７５％）；一＝６（３）配制定量的巧樣酸盐抗原修复液（ＰＨ），将切片放入方槽内，量取适量修复液盛于小方槽中，修复液没过整张切片置于；后将方槽２４ 体外语导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样结巧的初步探巧２０。届硕±学位论文放于少量自来水内的高压锅中，盖上高压锅盖，进行高压修复。加热至开一始喷气时，断开电源，自然冷却段时间后去取出方槽，室温冷却至常湿后取出玻片；ＰＢＳ漂洗两次，每次Ｉｍｉｎ；？（４）滴加３％Ｈ２０２去离子水，室温赔育５ｌＯｍｉｍ消除内源性过氧化物酶活性；（５）郎Ｓ漂洗３次，每次Ｉｍｉｎ；？巧ｍ（６）滴加Ａ液（山羊血清封试液），３７Ｃ解育１０ｉｎ，封闭非特异性着色，勿洗；一＝（７）解育过程中配制抗工作液（膜岛素抗原：阳Ｓｌ：１００）；（８）取出切片后ＰＢＳ漂洗３次，每次Ｉｍｉｎ；９一（）切片分两组操作：实验组滴加抗工作液，对照＾加ＰＢＳ缓°Ｃ°冲液；３７脾育化后，转入４Ｃ冰箱解育过夜；＂（１０）取出切片，ＰＢＳ漂洗；滴加Ｂ薇切片３７Ｃ解育２０ｍｉｎ；（１１）ＰＢＳ漂洗３次，每次Ｉｍｉｎ；２－（１）滴加Ｃ液（链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶），ａｒｃ赔育，１５ｍｉｎ；（１３）？８８漂洗３次，每次１１１１地？（１４）滴加ＤＡＢ显色剂，约３日ｍｉｎ；自来水充分漂洗；（巧）切片自然瞭干后，滴加适量的中性树胶封片；（１６）显微镜下观察，拍照。２５ 体外诱导脅随源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕ｔ学位论文结果ＢＭ－ＭＳＣｓ１、细胞系的建立ＢＭ－Ｃｓ１．１ＭＳ的原代培养和传代培养原代培养：经过自然沉降法分离骨髓内间充质干细胞，差速贴壁培养２４ｈ后，全量换液去除未贴壁的杂质细胞；培养４如镜下可见细胞小集落样分布，少数成纤维细胞贴壁展开，中间可见数个单个大核、折光透亮的球－ｉｌａ４ｄ形细胞，散在较多折光的亮点细胞（Ｆｇ）。培养，可见Ｈ角形、梭形细胞贴壁展开，胞浆饱满，同时球形细胞数量增加，细胞形态清晰、折－ｉｂ光透亮，细胞核单个大、圆、亮（Ｆｇｌ）；？二６７ｄ传代培养；原代第代培养，培养瓶内细胞数量达到总面积的？二７０８０％时，即可进行传代，第代培养４ｄ，可见球形细胞富集度高，单一－ｉ个大核、折光透亮、形态均，集落分布（Ｆｇｌｃｄ）。第Ｈ代培养４ｄ，仍＂＂可见球形细胞串样増殖分裂象，胞浆饱满；少数球形细胞出现拉丝样分化（Ｆｉ＾ｅｆ）。ｇ－ＭＳＣｓ的１．２ＢＭ多向分化潜能鉴定１．２．１成骨诱导实验通过成骨诱导Ｗ鉴定干细胞的多向分化潜能，加入成骨诱导液＂＂Ｉｗ后，内可见单个大核、球形的细胞扩増，出现对称分裂象，球形细一胞形态开始变化，拉长成梭形，变化后的细胞直径、长度大小不，胞质＂２－ａ分布不均，端端相接巧ｉｇ。随着诱导时间的延长，细胞分化形成树）＂枝样交错相连的结构２－ｂ（Ｆｉ后期细胞连接开始断开，球形细胞聚集增ｇ）；－Ｆ－多ｉ２ｃ；诱导５５ｄ，分化形成圆形或楠圆形细胞团（Ｆｉ２ｄ，肉眼观察到（ｇ）ｇ）培养瓶底许多针尖大小的白色颗粒物。对成骨诱导形成的产物，进行茜素红染色，可见细胞团外层红色阳性Ｆ－染色ｉ２ｅ。取成骨诱导后１５ｄ细胞进行ＡＬＰ染色后，可见细胞胞质中（ｇ），２６ 体外巧导音随源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０巧届硕±学位论文一黑色的细小颗粒，，在密集度反应强烈处细胞着色内着色程度不，颗粒Ｆ－ｆ物沉积多（ｉｇ２）。１．２．２成脂诱导在成脂诱导过程，诱导３ｄ可见部分球形细胞聚集、漂浮；随着诱导时间的延长，成脂诱导液培养７ｄ，部分球形细胞呈贴壁展开，拉丝样分化，随着诱导时间的延长，贴壁展开的细胞表面形成细小脂滴样细ｄ－胞；诱导１６，可见聚集増大的脂滴油红０红色阳性染色（Ｆｉｇ２ｇ。）２－ＭＳＣｓ、定向诱导ＢＭ２－．１尼克敌胺诱导ＢＭＭＳＣｓ形态变化观察尼克醜胺诱导后，干细胞的形态变化特征。诱导前干细胞主要呈＂球形，细胞立体感强、单个大核、折光透亮，少数细胞呈梭走，胞浆饱Ｆ－觀集落分布ｉ３ａ。换用含尼克酷胺的诱导液培养后２ｄ，可（ｇ）；①诱导３－ｂ４ｄ见球形细胞聚集，部分细胞贴壁展开巧ｉ，贴壁分化细胞ｇ；②诱导）一增多，折光度较前降低集的球形干细胞进，；聚步分化出现成团的趋势Ｆ－ｉ３ｃ诱导ｌＯｄ，干细胞贴壁分化形成Ｈ角形或星形样细Ｉｆｉ，细胞Ｈ（ｇ）；⑤＂＂一Ｆ－两个起呈小簇样聚集（ｉ３ｄ④诱导１９ｄ，随着诱导时闻的推移ｇ）；Ｆ－聚集的细胞增多，可见聚集形成了细胞团ｉ３ｅ２３ｄ，可（ｇ）；⑤诱导见形成的细胞团数量增多，细施团体积增大，镜下观察到细胞团由多个细胞聚集一组成３－ｆ４５ｄ，表面未有被膜包裹（Ｆｉｇ）。⑧诱导后，形成的细胞团进步分化，观察见培养瓶内形成的细胞团数量增多，细胞团大小未明显改变，部分细胞团悬浮在培养液中，表面未有被膜包裹。２－．２族腺组织裂解液诱导ＢＭＭＳＣｓ形态变化－ＭＳＣｓ集落分布加入膀腺组织裂解液诱导前，培养瓶内的ＢＭ，细胞主要为球形，单个大核、折光透亮；少数呈梭形，胞浆饱满。换用含有膜腺组织裂解液的条件培养液后：①诱导８ｄ，可见球形细胞出现扩增，出现＂＂＂＂－串样对称等分裂象Ｆｉ４ａ；少数球形干细胞拉丝样延长（ｇ）；②诱导２７ 体外语导骨敵原间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步探讨２０。届硕±学位洽文２８ｄ一，球形干细胞形成类折光呈浅紫色、透亮的细胞，细胞球形、大小－不等ｉ４ｂ。３１山可见折光透亮的细胞扩增后聚集，密集分布（Ｆｇ）③诱导４－ｃ３７ｄ－成团巧ｉｇ）。④诱导，团内细胞出现向多个细胞团分化的趋势（Ｆｉｇ４ｄ４７ｄ－。，形成数个大小不等ｉ４ｅ）⑤诱导、被膜包裹的细胞团巧ｇ）；⑥诱导５２ｄ，见细胞团由大量细胞组成，细胞体积小，单个核，圆形或備圆Ｆ－ｉｆ形，胞浆比例大（ｇ４）。３诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ形成的细胞团裝定３．１双硫膝染色鉴定结果３．１．１尼克醜胺组：２３ｄ尼克醜胺诱导，可见细胞团内散在，形成的细胞团进行双硫踪染色Ｆ－少数细胞掠黄色染色（ｉ３４５ｄ双硫腺染色，可见ｇｇ）；延长诱导时间，诱导细胞困趋中也部分栋红色染色巧３－ｈｉｇ），染色强度较前增加。３．１．２族腺组织裂解液组；诱导２１ｄ，形成的细胞团双硫膝染色，可见被膜包裹的细胞团全部染一色，细胞团不同区域染色深浅不，大部分呈栋红色，细胞团左上部分可４－见ＤＴＺ染色与正常族岛染色相似，染成猩红色（Ｆｉｇｇ。）３－．２ＲＴＰＣＲ检测结果３．２．１总ＲＮＡ纯度检测结果；提取的各组总ＲＮＡ，分光光度计检测后计算各组ｏＤｍ。／〇〇。８。，结果均一？２．８．０之间步实验的在１，表明提取的各样品总ＲＮＡ纯度高，满足下要求，可进行后续实验。３．２．２总ＲＮＡ完整性检测结果：提取尼克醜胺与膜腺组织裂解液诱导后细胞总ＲＮＡ，经１．５％琼脂糖５－ａ凝胶电泳，可清晰观察到巧Ｓ、２８Ｓ两条带（Ｆｉ，表明提取的总ＲＮＡｇ）完整性好一，可进行下步逆转录实验。３．２．３ｉｎｓｕｌｉｎ表达结果２８ 体外诱导骨黯源间充质干细胞分化为膜皂样结构的巧步探巧２０。届硕±学位论文由琼脂糖凝胶电泳结果可见，定向诱导前、尼克酷胺诱导组及膜腺组－ａｃ－织裂解液诱导组，均检测到内参ｐｔｉｎ在３３０ｂｐ条带处恒定表达巧１３５１＞Ｄ、Ｅ、Ｆ）。尼克醜胺组；２３ＲＴ－ＰＣ民可检２化ｂｐ诱导天测到诱导后细胞在电泳条带处ｉｎｓｕｌｉｎ基Ｆ－－因的表达（ｉｇ５ｂＢ。）膜腺组织裂解液组；２３天ＲＴ－ＰＣＲ２６５ｂｐ诱导也检测到诱导后细胞在电泳条带处ｉｎｓｕｌｉｎ基因的表达（Ｆ５－－Ｃｉｇｂ。）３．３族岛素免疫组织化学染色结果膜腺组织裂解液诱导５２ｄ后，收集细胞团制成石蜡切片，普通ＨＥ染一色观察切片组织的般形态结构，可见细胞团内多个染紫色的细胞核，细－胞团由多个细胞组成（Ｆｉ４ｉ。膜岛素免疫组织化学染色，可见细胞团内ｇ）Ｆ－踪色阳性染色的膜岛素阳性细胞ｉ４。（ｇｊ）３．４Ｍａｌｌｏｒｙ染色结果？，：３．４．１尼克醜胺组；诱导５４ｄ，Ｍａｌｌｏｒｙ染色Ｗ区分细胞团内不同的膜岛样细胞，可见细－胞团染成浅黄色ｉ３ｉ。，未有不同染色的膜岛样细胞巧ｇ）３．４．２膜腺组织裂解液绍：诱导５０ｄ，细胞团Ｍａｌｌｏｒｙ染色，可见细胞团内周围细胞胞浆染成黄色的类０细胞，占细胞团比例少；细胞团中央细胞染红色的类ａ细胞，占细Ｆ－胞团比例的大部分ｉ４ｈ（ｇ）；２９ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文讨论近年来一，膜岛细胞或膜腺移植取得了些巧效，但仍存在供体短缺及免疫排斥两大问题。干细胞向膜岛方向分化，主要报道的干细胞来源的有Ｗ胚胎干细胞脉带间充质干细胞等－ＭＳＣｓ跨胚；而中巧层来源的ＢＭ层Ｗ分化为族岛素分泌细胞的分化效能低，常用的诱导方法有化学物质诱导Ｗ－ＭＳＣ、转基因诱导ＢＭｓ向膜岛方向分化过程中干细胞形态变化特征少有报道ＢＭ－ＭＳＣｓ向，探讨诱导膜岛方向分化的成熟诱导方法是组织工一直努力研究的重点程中。ＢＭ－ＭＳＣｓ的－随着人们对大量的研究，目前普遍被人认可的ＢＭＭＳＣ—ｓ形态有两种种体巧小，细胞核比例大，胞质内的细胞器稀少，这种细胞为较幼稚的细胞，处于未分化或分化较低的状态，具有干细一胞的特征种细胞体积大于前者，成纺锥形，核呈不规则形，；另胞质内含有丰富的高尔基体、粗面内质网及游离核蛋白体，能够分泌生长因子支４５？－持自身生长或分化。机体内干细胞极少，约１／１〇１〇ＢＭＭＳＣｓ，具有干一一细胞的般特性，在稳态的培养过程中可爆发性扩增，这特性为获得富足数量的干细胞用于体外诱导提供了可能。１－ＭＳＣｓ的培养及鉴定．ＢＭ１－．１ＢＭＭＳＣｓ培养的间充质干细胞培养条件严格，易受培养环境，如细胞的密度，优势细胞种类等的影响李鲁生等实验比较后得出，通过全骨髓培养法分离原代细胞主要呈聚集样生长，而通过密度梯度离也法分离的原代细胞呈单个、散在生长。有学者指出，球形形态的干细胞具有更强的可塑性。考虑骨髓间充质干细胞的跨胚层分化需要分离扩增出一类具有高效潜能的干细一类单个大核胞。建立骨髓间充质千细胞的培养体系，扩增、培养、球３０ 体外语导骨齡顆间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文形、折光透亮的形态的干细胞。自然沉降的方法是通过骨髓内各种细胞的密度的不同，对抽吸后骨髓一２０？巧ｍ细胞粗略分离的种方法。通过实验摸索，自然静置时间在ｉｎ之？间，离也后细胞沉淀重悬体积在６８ｍｌ，沉降后的最底层约２ｍｌ，可分离一类单个大核、折光透亮集落分布的球形细胞。分析自然沉降的方法的优一方面减少了相当数量的细胞点主要有①，降低细胞密度防止接触性抑一制；③另方面，自然成降后去除离也管２ｍｌＷ上的悬液，减少了其他杂质＂＂细胞的种类，避免环境依赖分化致间充质干细胞的分化，为干细胞一、个相对纯净的环境后续培养扩增营造了。通过成降时间的对比，离也后Ｗ含有５％ＦＢＳ的低糖ＤＭＥＭ液重悬细胞沉绽，Ｉ低糖的培義环境是公认的间充质干细胞的生长需求ＩＩ血清浓度体积分数在５％左右，干细胞的稳态性佳。高浓度血清在早期培养阶段快速促进体细胞等的繁殖，培养瓶内空间减少一方面高浓度血清培养可诱导干细，形成杂质优势细胞群；另Ｕ３３０％ＦＢＳ胞的分化、不利于建立干细胞稳定的扩增体系，如体积分ｉ低糖｜ＤＭＥＭ陪养？３４ｄ即可出现核分裂象，细胞贴壁分化形成体细胞系，通过实验摸索体积分数５％ＦＢＳ既可Ｗ满足干细胞生长需求，也出现球形干细胞的扩增分裂象，可形成干细胞稳定扩増的培养体系。采用自然成降的方法，—定程度上获得较纯化的骨髓间充质干细胞可Ｗ，细胞稳态扩增，分布均匀。传代后细胞透亮均匀、可见扩增分裂象，细胞集落增大，形成了稳定的扩增培养体系。与其他文献报道的间充质获得细胞形态不同，形成的间充质干细胞多为Ｈ角形一、梭形、呈麦穗样分布，本实验培养获得的单形态干细胞为球形，细胞单个大核、立体感强、折光透亮。考虑球形的干细胞是未分化干细胞的原始形态，在未分化的潜能程度及可塑性优于干细３１ 体外读导脅髓源闻充质干细胞分化为膜岛的初步探巧２０。届硕±学位论文胞的其他形态。因此，也更利于跨胚层向膜岛方向分化，为后期定向诱导提供了良好的干细胞种子。－１．２ＢＭＭＳＣｓ的鉴定ＢＭ－ｓＭＳＣ的鉴定尚无特异性掠识，目前常用的鉴定方法有①形态学特点③多向分化潜能⑤流式细胞仪检测的细胞表面标记。课题组已经建立了稳定的骨髓间充质干细胞培养体系一，并已经对这类多向分化潜能的干细胞进行了成骨、成脂、表面标志等鉴定。我们对逸一培养体系进行优化，本实验采用自然沉降法分离，差速贴－ＭＳＣｓ壁培养的ＢＭ，显微镜下观察到细胞皇球形，单个大核、折光透一亮，集落分布。通过成骨、成脂诱导鉴定细胞这类细胞具备可塑性。茜素红与巧结节结合染成红色．４）；ＡＫＰ碱性磯酸检测是在碱性环境（甜９中－ｙＡ簇离子作为激活剂，目甘油磯酸钢水解出的磯酸与辑益结合形成磯酸巧，再与硝酸钻作用形成磯酸钻，硫化胺作用磯酸钻后形成黑色硫化钻ＢＭ－ＭＳＣ沉淀ｓ。，诱导１５ｄ后ＡＬＰ可见细胞胞质内黑色颗粒成脂诱导后观察见少数的球形干细胞贴壁分化及成脂滴样，考虑诱导时间短的缘故；油红０作为脂溶性染解，可洛解于脂肪细胞使组织或细胞内甘油Ｈ醋等中性脂肪特异性着色。成骨、成脂诱导后结果，形成油红染色的红色脂瀉证实了获得的这类球形干细胞具有分化潜能的活性，为后期实验诱导提供了可靠的ＢＭ－ＭＳＣｓ种子细胞。＂，，２．微环境诱导蒋性Ｗ早在１９７８年有学者就开始探讨脾细胞增殖与造血干细胞之间关＂＂系。目前关于壁衾说法多种，可能由细胞、细胞外么间的结构如细胞外基质组成一；具体包括有单个细胞类型或整套相互作用的细胞組成，及干细胞家系Ｗ外的其他细胞系。它们是分，或者来自干细胞派生的细胞群泌细胞表面因子的来源，包括有Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ＦＧＦ（纤维母细胞生长因３２ 体外诱导脅髓源间充质干细胞巧化为膜岛样结陶的初步探巧２０。届硕鮮位论文子）、ＥＧＦ（表皮生长因子）、ＴＧＦ（转化生长因子）、ＳＧＦ（干细胞因＂＂子）Ｗ及趋化因子等形成的壁衾微环境，具有控制干细胞的扩增、自＂＂我更新、生存等作用。干细胞的分化命运由壁衾微环境决定，首先干＂＂细施需要依赖特殊的微环境支持赖生存，其次壁蠢在控制细胞反馈Ｗ过程中也起到媒介作用。Ｄｕｖｉｌｌｉｅ等通过细胞间质改变Ｎｇｎ３表达Ｗ调控＂＂目细胞增殖和分化，影响干细胞向膜岛方向分化。Ｋｉｍ等在壁衾环境诱导学说也指出细胞间质与上皮细胞么间的相互关系在膜腺祖细胞的扩增中起重要作用－ＭＳＣｓ。在ＢＭ条件培养液中加入化学因子或其他生物分一＂＂＂＂子，定程度的改变了干细胞的壁盡微环境，是微环境诱导的实践原理。Ｉ３－ｓ．尼克醜咳诱导ＢＭＭＳＣ巧克醜胺是－ＡＤＰ核糖合成酶抑制剂，具有抑制去乙酷化酶活性，阻止目细胞糖脂毒性反应，能够抗氧化、提高葡萄糖代谢、促进族岛细胞增殖及成熟ｆｗ。使用巧克醜胺ｙＪｌ诱导肝脏干细胞及前体细胞分化为腺避。尼克芽醜胺也作为ＧＬＰ受体激动剂促进离糖诱导分化的细胞聚集、加快膜岛样细胞团的形成，能够增加膜岛细胞分化的数量及促进分化细胞的成熟。其中高糖环境诱导也是重要因素，高糖可１＾改变６细胞膜离子通道的状态、后Ｕ＂ｏ？动干细胞向膜岛方向分化，Ｓｒｉａ等通过实验摸索血糖浓度在２０３０ｎｉＭ＇能够刺激ｕａｗ６细在体内外増殖效果最佳；相关报道己证实高糖促进基因＋ＰＤＸ－（、ＰｄｘＶＰ１６）转染后细胞的膜岛素分泌、储存和释放。在高糖诱导液中加入尼克敵胺可Ｗ维持细胞对荀萄糖的敏感性，尼克醜胺又作为促分化剂促进千细胞形成细胞团。－ＭＳＣ诱导后ＢＭｓ出现形态改变，细胞聚集、部分贴壁伸展形成兰角形、星形样后小簇样聚集，随着诱导培养时间延长，细胞聚集增多形成细３３ 体外诱导晉链源阁巧质干细胞公化为膜岛的巧步探巧２０。屆硕±学位论文胞团。Ｗ双硫膝染色对细胞团初步鉴定，双硫膝因可与膜岛细胞胞浆颗粒巧３－内的锋离子馨合，染色后可见少部分染成掠黄色（ｇｇ），此时诱导形成的细胞团内分泌功能较差，正常膜岛细胞是深色猩红色染色，细胞团染色浅宜少部分染色；延长尼克醜胺诱导时间，诱导４５ｄ可见形成的细胞团ＤＴＺＦ－ｉ３ｈ染色大部分呈踪红色（ｇ），染色强度及染色范围较前增加，细一胞团的内分泌功能活跃増加－ＰＣ民进。民Ｔ步证实了诱导后细胞ｉｎｓｕｌｉｎ基５－ｂｒ因的表达（Ｆｉｇ）。Ｍａｌｌｏｙ染色对细胞团内的膜岛细胞进行鉴定，细胞团染成淡黄色，未见有不同染色的膜岛样细胞。因此－，通过尼克酷胺高糖诱导ＢＭＭＳＣｓ分化形成了膜岛素分泌细胞一，未形成膜岛样结构。尼克醜胺诱导是种简单、快速、有效经济的化学试剂诱导方法，相比较使用附加基因操控诱导方法更容易控制。Ｃｚｕｂａｋ等在两部诱导方法中，添加膜腺生长微环境所需的营养因子，首先将骨ｎｅｓ一髓间充质干细胞诱导成ｔｉｎ阳性细胞，然后再将这类细胞添加膜岛发育过程中所需的生物因子最后形成膜岛素分泌细胞。这类化学试剂诱导是可Ｗ提窩多能干细胞的编程效应，在功能上取代转录因子外生效应，支持纯化学海合物诱导方法可改编细胞分化程序ｔ２３３。类似的诱导实验在国内ＵＷ学者李艳华实验报道，骨髓间充质干细胞从长梭形变化为多角形及后期的聚集成团。－ＭＳＣｓ的差算性比较尼克醜胺诱导ＰＳＣ与ＢＭ。课题组前期从膜腺中分离了一类单个大核、折光透亮、球形，Ｎｅｓｔｉｎ阳性表达的ＰＳＣ，细胞形态类似于本实验骨髓中获得的间充质干细胞。在相同的诱导条件下，诱导不同胚层来源的干细胞后结果存在明显的差别。从下几个方面可分析；①细胞团形态比较－，ＢＭＭＳＣｓ诱导后形成的多个细胞聚集组成的细胞团，细胞团表面凹西不平，周围无被膜包裹。ＰＳＣ诱导后汇聚形成细胞３４ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为演卸的初步探巧２０。届硕±学位论文团，细胞团体积大，细胞团表面平整，周围有完整被膜包裹。③细胞团ＤＴＺ－ＭＳＣｓ形成的细胞团部分着色染色比较，ＢＭ，虽然延长诱导时间，细胞团的染色深度较前增加，而仅中也部分染色；ＰＳＣ形成的细胞团全部染色，诱导３ｗ即可见ＤＴＺ染色细胞团呈栋红色。因此，不同来源干细胞在诱导条件及诱导时间相同的情况下，骨髓来源的间充质干细胞分化后膜岛素分泌的强度较低ｌｌｏｒ。⑤Ｍａｙ染色比较，对不同膜岛细胞鉴别主要依赖膜岛细胞胞浆颗粒染色不同－。早在１９３１年Ｂｌｏｏｍ等首次使用Ｍａｌｌｏｒｙ－ｈａ化ｉｄｅｎｉｎａｚａｎＡ、Ｂ、ＤＳ染色法对人的膜岛进行区另［Ｊ，观察到种不同ａ一的族岛细胞。柳洁等对ＭｌｌｏｒｙＨ色法染色进步优化后，方法简便，Ｓ操作简单－ＭＳＣｓ形成的细胞团，族岛内细胞显色清晰。ＢＭ攀色后只见淡黄色的类６细胞，并未有不同膜岛细胞；ＰＳＣ形成细胞团可见两种膜岛细ａ胞，细胞团中间部分的６样细胞及周围的样细胞，细成结构上与正常膜－ＭＳＣｓ诱导后形成了膜岛素分泌细胞岛相似。④诱导结果比较，ＢＭ；ＰＳＣ诱导后形成的是膜岛样结构，膜岛样细胞团，细胞团内鱗胞具有分泌族岛素功能。通过实验结果总结，不同胚层来源的干细胞尼克醜胺诱导后，诱导结果是不同的ＢＭ－ＭＳＣｓＰＳＣ的。考虑原因有①跨胚层向膜岛方向分化与同胚层分化是不同基因复杂调控的结果。②尼克酷胺诱导试剂尚不能模拟膜－ＭＳＣｓ分化为膜岛样结构腺生长微环境诱导ＢＭ，需要更适宜的化学或细胞因子诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ跨胚层分化。４－．膜朦组织裂解液诱导ＢＭＭＳＣｓ２００７年Ｃｈａｎｇ等指出体外微环境和内在基因共同决定干细胞的分化－ＭＳＣｓ向，微环境在ＢＭ膜岛方向起重要作用。干细胞表达多细胞谱系的ｍＲＮＡ，多向分化潜能的干细胞在特定微环境中伴随有生理环境改变３５ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。居硕±学位洽文ＵＷ－ＭＳＣｓ仅形成了可分化为指定细胞类型。由于使用麽克醜胺诱导ＢＭ膜岛素分泌细胞，形成了细胞聚集成团而周围未有被膜包裹，而且诱导形成＂＂的细胞菌数量少，形成细胞团的效率低。Ｆｅｉ等在２０１４年研究报道指出受损膜岛细胞分泌的转录蛋白影响干细胞增殖及分化－，可通过ＢＭＭＳＣｓ分化为膜岛样细胞团途径达到修复膊岛的目的。在２０１１年，课题组前期李琴等通过也肌级织裂解液模拟了微环境－ＭＳＣｓ分，成功诱导ＢＭ化为具有自律搏动的私肌组织样结构。这些数据和结果给了实验研究重要ＢＭ－ＭＳＣ？启示，在膜腺微环境中ｓ跨Ｋ层分化结果是怎样其他学者Ｃｈｅｎ＂３Ｕ＂－ＭＳＣｓ与－等请Ｏｈ等通过ＢＭ成熟膜岛共培养途径，成功诱导ＢＭ＂５３ｓＭＳＣ分化形成了騰岛素分泌细胞，体内实验也证实大鼠膜岛移植增强受损小鼠膜腺目细胞的增殖及促进膜岛素分泌改善糖尿病症状。我们在膜腺组织裂解液培养过程中观察到ＢＭ－ＭＳＣｓ诱导后与麽克醜胺细胞形态变化明显不同。诱导８ｄ可见球形干细胞的大量扩增、聚集，伴有…少数拉丝样分化导２８ｄ－ＭＳＣｓ分化形成ＢＭ；诱类折光透亮的细胞，诱导３１ｄ细胞４７ｄ可扩增后聚集成团，诱导见形成的细胞团周围有被膜包裹，细胞团内大量体积小细胞组成－、细胞团表面平整（巧ｇ４ｆ）。ＤＴＺ染色可见形成的细胞团大部分呈掠红色，少部分与正常膜岛染色相似呈猩红色一Ｆ－－ｉ４艮ＴＰＣ反也进ｎｓｉｄｎ〇）；步检测到诱导后细胞ｉｉ基因表达ｇｇ；形成的细胞团数量多，制成石蜡切片Ｗ免疫组织化学染色观察到踪色阳性染色的膜岛素阳性细胞。可见膜腺组织裂解液模拟膜腺微环境，除了能够提供干细－胞稳定的生长环境干细胞扩增－ｓ、聚集，也能成功启动ＢＭＭＳＣ向膜岛方向的分化。膜岛样细胞团Ｍａｌｌｏｒｙ染色可见不同染色的膜岛样细胞：染淡黄色的类目细胞数量少，位于细胞团周边；染红色的类ａ细胞为主，位于细胞团中央（巧４－ｈ）ｇ。３６ 体外语导晉髓源间充质干细胞分化为廣岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文－ＭＳＣｓ形因此，膜腺组织裂解液体外诱导ＢＭ成了由不同类膜岛细胞组。１３成的具膜岛素分泌功能的膜岛样结构，结构周围被膜包裹在２０年，ＬＷ义ｅ等也使用膜腺组织裂解液诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ，结果报道形成了膜岛素分泌细胞，，该实验获得的梭形贴壁的间充质干细胞诱导后聚集靠披而未形成膜岛样结构，干细胞的形态变化及诱导结果与本诱导实验不同，分析原一－因可能为：ＢＭＭＳＣｓ、本实验获得的是类高度可塑性的，细胞球形单个大核，此类形态的间充质干细胞为幼稚型干细胞，处于未分化或较低的分。化状态，具有干细胞的典型特征，具有更大的分化潜能特性ＢＭ－ＭＳＣ递异性比较膜腺组织裂解液与尼克酷胺两种方法诱导。①细：胞形态变化的不同膜腺组织裂解液诱导干细胞扩增，可见扩增分裂象；一ＢＭ－ＭＳＣｓＢＭ－ＭＳＣｓ分化形成了类透亮细胞扩增后成团；尼克醜胺诱导一未见明显扩增，细胞贴壁分化后呈小簇样聚集，后进步聚集成团。②细胞团形态比较：膜腺组织裂解液诱导形成有被膜包裹的细胞团，显微镜下观察可见细胞团内大量体积小的细胞组成，细胞团表面平整。尼克醜胺形成的细胞团由数个体积较大的细胞聚集组成，倒置显微镜下观察细胞团表。面凹凸不平整，细胞团周围无被膜包裹⑨ＤＴＺ染色结果不同：正常膜岛双硫踪染色为猩红色，尚未分化成熟的细胞团ＤＴＺ染色不着色或着色不明显，双硫踪染色可反应诱导后细胞胞浆分泌锋离子的结果，是膜岛细胞内分泌功能活动的表现。膜腺组织裂解液诱导２１ｄ形成的细胞团全部染色，－染色深、呈掠红色（Ｆｉ４）２３ｄｇｇ；尼克酷胺诱导形成的细胞团染色浅，细Ｆ－此ｉｇ３）胞团少部分染色呈栋黄色，染色浅（ｇ。因，在相同诱导时间，膜－ＭＳＣｓ后形成的细胞团胞浆内粹离子更丰富腺组织裂解液诱导ＢＭ、分泌功。Ｍａｌｌｏ能更活跃；可推测膜腺组织裂解液相比较尼克醜胺诱导效能高④ｒｙ染色结果不同：族腺组织裂解液诱导５０ｄ形成的细胞团Ｍａｌｌｏｒｙ可见细胞团３７ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文内周围嫩黄色及中必红色的两种细胞。尼克酷胺诱导５４ｄ形成的细胞团Ｍａｌｌｏｒｙ染色可见染成淡黄色，未见不同染色的细胞。５．构建膜岛样结构的意义总结膜腺组织裂解液与尼克醜胺两种诱导方法－，尼克醜胺诱导ＢＭＭＳＣｓ分化形成了膜岛素分泌细胞，诱导效能低。膜腺组织裂解液中存在的可溶性小分子或蛋白提供干细胞向膜岛方向分化的壁貪微环境，模拟了体内膜腺微环境；膜腺组织裂解液作为天然生物诱导剂成分更接近于机体微环境，裂解液中存在的细胞因子可能在间充质干细胞与膜腺细胞之间的ＢＭ－ＭＳＣ交换中起到重要作用；可体外诱导ｓ跨胚层分化为膜岛样结构。一膜岛样结构是体外诱导途径获得的，是类由多种膜岛细胞组成的具有膜岛素分泌功能细胞团。许世清等秀导化胎来源的ＰＳＣ形成的膜岛样结构，免疫英光细胞化学染色可见诱导形成的细胞团内存在分泌膜岛素和膜岛血糖素两种族岛细胞一。膜岛样结构的形成相比较单的膜岛素分泌细胞，对促进膜岛目细胞存活和调控族岛素的分泌都具有重耍的意义。膜岛目细胞成熟及膜岛素的释放与膜岛ａ细胞关系密切。膜岛结构中的ａ细胞化Ｐ－分泌膜高血糖素肤１，能够促进膜岛样细胞团的成熟，增强膜岛样细ｂｗ胞团对葡萄糖敏感性。Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ等和化ｋａｍｉ等正实ａ，膜岛细胞Ｇｃｇ基因编码化Ｐ，保护膜岛目细胞内分泌功能，促进膜岛素基因的转录及增加膜岛素的合成和分泌。体内移植实验也证实了膜岛样结构的重要性—［４。４＂ａ，缺乏细胞的膜岛移植不利于膜岛素释放，移植后比完整的膜岛移植的膜岛素释放水平低及生存时间也显著降低。构建的膜岛样细胞按照类似膜岛细胞的结构方式组成，各种分泌功能的膜岛样细胞相互调节，形成的膜岛样结构分泌膜岛素功能才能趋向完善，推测膜岛样结构是体外获得一功能膜岛、体内移植治疗突破的关键因素之。３８ 体外巧导冒髓源间充质干细胞分化为膜岛祥结构的初步探讨２０。届硕±学位洽文总之，膜腺组织裂解液诱导形成的膜岛样结构在膜岛细胞的构成比例及方式上与与正常膜岛还是存在较大的差距。正常膜岛０细胞位于膜岛结构中必、占膜岛细胞总数的７０％或［＾上；ａ细胞占少部分，位于膜岛结构－ＭＳＣｓ形成了两种类型的膜岛样细胞周边。虽然诱导ＢＭ，但膜岛样结构内ａ细胞占大部分比例，位于膜岛中必；目细胞位于周围，占小部分比。例考虑形成的膜岛样结构与正常膜岛成熟度存在差距，膜岛素释放水平有待进一步实验探讨。３９ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜巧样结构的初步探讨２０巧届硕±学位论文结论１．采用优化的自然沉降与差速贴壁培养相结合的实验方法，可建立稳定的ＢＭ－ＭＳＣｓ培养体系－，获得并建立ＢＭＭＳＣｓ系，为后续诱导实验提供可靠的种子细胞。２－．尼克酷胺定向诱导ＢＭＭＳＣｓ可形成膜岛素分泌细胞，但未能形成膜岛样的结构。一３．膜腺组织裂解液中存在的天然生物因子，可能在定程度上模拟了膜腺的微环境－ＭＳＣｓ形成了由类ａ，诱导ＢＭ细胞与类目细胞组成的，有完整被膜包裹的膜岛样结构。４０ 体外诱导骨髓源间觸干细胞分化为廣巧麟构的初步親寸２０巧届硕±学位论文存在问题与展望一实验通过自然沉降法与贴壁培养法相结合，获得了类高度可塑性的－ＭＳＣｓＢＭ，为后期的诱导分化提供了实验诱导的种子细胞。实验初步完成及比较了尼克醜胺与膜腺组织裂解液两种诱导方法。存在问题：１．尼克醜胺诱导形成了族岛素分泌细胞，形成的细胞团数量少，诱导效能低。’２－．仅仅初步探讨了中胚层来源的ＢＭＭＳＣｓ分化为膜岛样结构，后期需要开展功能及其体内的实验。展望；１－、本实验主要探究了ＢＭＭＳＣｓ向膜岛方向分化过程中的细胞形态变化特，点，后期实验可运用分子生物学技术和方法适时开展蛋白质及其基因组学方面的研究。一２Ｈ维支架环境下诱导ＢＭ－ｓ形成膜岛样结构、进步在ＭＳＣ，为体外构建人王族岛做初步探讨。４１ 体夕惯导昼髓脯司充质巧田胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文附图：ｍＦ－－ｉｇｌａ；原代培养４８ｈ可见折光透亮的细胞，Ｆｉｂ：原代培养４ｄ，，ｇｌ可见Ｈ角形细胞中间散在贴壁的单个大核球形细胞贴壁展开．散在折光亮的圆形细胞Ｆ－－ｉｌｃ＝篡二代培养４ｄ，细胞球形，单个大Ｆｉｄ；第二代培养４ｄｇｇｌ，折光透亮的球形，核、折光透亮集落分布细胞１１－１－－－－／Ｍ２０４００２２０４０９２８Ｐ／）Ｉ０１（１０）Ｍ２０１４１０１２２０４０９２８Ｐ０２（１０１１：弟二代培养４ｄ折光透見的细胞形，－ｆ：第；代培养７ｄ球形干细胞贴壁分化黑Ｊ跌，Ｍ２０－－Ｘ）１５０．１３２０１５０１２７Ｐ２０Ｋ２０－＾５０３ｌ８－０＾Ｘ）１５０３０３Ｐ０２（１０４２ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文Ｆ－－ｉｇ２ａ＝成骨诱导３ｄ，可见细胞拉丝样变化Ｆｉｇ２ｂ：成骨诱导２ｌｄ／分化的细胞交错分巧）－－—１１１１１：４加１＾化日〇１巧１１【／）１１１：］ｅｘａｍｅ１ａｓｏｎｅｌ１ｔ／Ｊ服０４日日２０４０叫北１２０４１）３４３［１日ＭＳ２０４＾４２０１４０２４ｄｈＣ０１４１０３ｄ２ｌＯ＊：：如；龜這議？－Ｆ－出成背巧导〇加ｉｇ２ｃ；成唱诱４＾２５ｄ分化的细胞刚裂，来尖成闽Ｆｉｇ２，分化形成的细胞団．－－胳Ｏ．￣ｒ〇：ＪｌＪＳ２０Ｕ（）２ｌｄｅｘａｊｉ！ｅＵｉａｓｏｎ（２０ｌ４）３ｄ：３５（ＸＯ）Ｍ沿（＞１１１２化：０１４１０。ｄ（ｘａｉ化ＴｉｉａｓｏｔｗＱＯＨＩｌ３（ｌ巧／ｌＯ）Ｈｌ１１！ｉ心議－ｅ－Ｆ：＝ｉｇ２成骨诱导后茜素红染色，呈红色的钓结节Ｆｉｇ２ｆ成骨诱导后ＡＫＰ染色可见胞浆内黑色钩盐沉权ＭＳ２０Ｈ－－－－－－Ｘ１２２９２０１４１０２４ｄｅｘａｉｎｅｔ＇ｈａｓｏｎｅ２０１４１１０３ｄ就（Ｘ１０ＪＭＳ２０１如３２７２０１５０３０３ｄｅｘａ！ｉｉｅｔｈａｓｏｎｅ２０１如３１２ｄｌ５（１０；国顔－６ｉ－Ｆ１ｉ（／：ｉｉｇ２ｇ；成脂诱导１ｃ，油红０染色脂滴染成红色ＭＳ２日加解］ｏ Ｍ２０Ｉ４１００１０３０（／１０ＭＰＪ０１１０１４０３０ｎｄｉｉ１２１／０）４２０４９）４００６２９ｉｃｉｍｍｄｅ２０４ｌ００４ｄ（１ｒ，——Ｋａｗ—ｌｉｉｒＰＷ占－Ｆｃ４ｄ－ｉｇ３：尼克離胺诱导Ｆｉｇ３ｄ；尼克醜胺诱导ｌＯｄ一细胞进步分化，出现成团趋势球形细胞分化形成小簇样聚集－－－２０１１０１ｎａｃｉｎａｍｅ１１０－－ＭＰ４００８２４０９３０Ｘ１）ＭＰ２０１１１０１ｉａｃｎａｍｅ１１０ｌ＞＜１ｉｉｄ２０４０４ｄ４（〇４０４２４０９３０ｎｉｉｄ２０４０４ｄ０（０）－Ｆ－ｉ３ｅ：尼克酷胺诱导９ｄＦｉ３ｆ：ｇ１形成的细胞团ｇ尼克離胺诱导２２ｄ细胞团增多ＭＰ２０－ｎａｃｎａｍｅ－（Ｘ）－－ｎａｃｎａｍｅＸ１４１０２３２０１４０９３０ｉｉｉｄ２０１４１００４ｄｌ９２０ＭＰ２Ｕ１４１犯６２日１４０９３０ｉｉｉｄ２０１４１０（Ｍ祀２（如）４４ 体外语导育髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文－０Ｆｉ；尼克說胺诱导２３ｄ巧硫腺染色可见细胞团染色浅，少部分染成掠黄色（Ｘ４）ｇ３ｇ，－－出Ｍ１２０１４９０ｉａｃｎａｍｄｅ；０４（／２０）Ｐ２０４１０了２０３ｉｉｉ２１１００４３Ｆ－４４０ｉｇ３ｈ；尼克說胺诱导别，项硫腺染色可见细胞团部分染成掠红色（Ｘ）１１－ｎａｃｎａｍｅ／ＭＰ２０４２ｎ２０）１４１０２７ｉｉｉｄ２０ＵＵ０５ｄ４５Ｐｌ（４０Ｆ－，４０ｉｇ３ｉ：尼克酌胺诱导５４ｄＭａｌｌｏ巧染色可见细胞团染成淡黄色（Ｘ）－－ａｃａｍ－－Ｍ〔）Ｐ２０１４１２巧２０１４１０２１ｎｉｉｎｉｄｅ２０１４Ｕ０５ｄ５４ＰＩＸ４０４５ 体外语导畳髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０。届硕±学位论文國－■Ｆｉａ－ｇ４：族腺组织裂解液１秀导８ｄＦ４ｂ：膀腺组织裂解液诱导２８ｄｉｇ一可见球形细胞扩增．部分拉丝样分化细胞分化形成类折光呈浅紫色、透亮的细胞，细－－ｌｓａｔｅＷＵ口ＳｄＳＰ（／日；ｙ１Ｉ胞球形，大小不等，密集分布服］日－１４１２２６２０１４１１１ＴＩｖｓａｔ记０Ｈ１１２８祀８ｍ〔／］０■）－－Ｆｉｇ４ｃ；膀腺组织裂辟液诱导３ｌｄ円ｇ４ｄ：膜腺組织裂解液诱导３７ｄ可见折化透亮的细胞扩增后聚集成团团内细胞出现向多个细胞团分化趋势麵龜Ｆ－７ｄｉ４ｅ：膜腺组勤裂解液诱导４ｇ＾＾Ｆ夷形成的细胞团有被膜包裹揣ａＪ點ＳＳＩＳＴ细胞体积－－－－，ＭＰ２０１５０１１４２０４７ｌｓａｔｅ２０Ｕ２Ｊ？ｄ４７ｐＣＸ４０），胞浆比例大１ｎｉｙｎｌ小单个核ＨＰ０－－２１加１１８２日１４１了Ｗｓａｔｅ１４ｎ２８ｄ５２ＰＣ／４０Ｊ１１２０ｌ４６ 体夕隙导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文Ｆ－ｉｇ４ｇ；膜腺组织裂解液诱导２１ｄ，双硫腺染色可化被膜包裹的膜岛样结构染稳红色２－－－－ＭＰ２０－－－－Ｘｌ４７〇４２〇ｌｓａｔｅ２０４２０３ｄ２Ｐ（Ｘ０４２２Ｔ２０１４１１２０ｌｓａｔｅ２０１４１２０３ｄ２１Ｐｌ２０）ＨＰ０１２２２］１Ｉｙ１１Ｉｌ１）１１ｙ（．議１－Ｆｉｈ：峽腺组织裂解浪诱导；５０ｄ，Ｍａｏｒｇ４ｌｌｙ染色Ｗ见细胞团周围染成淡黄色，中如染成红色ＭＰ２０１－－泌ｅ－－／如１２３２０１４１１２ｌｌｙｔ２０１４１２０３ｄ加Ｐｌ（４０）遂泌＾＾撼－５２ｄ－ＦＦｉ：５２ｄｉｇ４ｉ；膜腺组织裂解液诱导ｇ４膜腺组织裂解液诱导ｊｎｓｕｌｎ？可祀染色ｉｉ免疫组织化学染色见细胞团踪色阳性染色，可见多个细胞组成的细胞团－－－－ＣＭＰ；ｌ〇８２０４７ｌｓａｔｅ２〇４２８ｄｏ２ＰＸ４０＞＾Ｏ３１１１１１１ｙ］１１ｌ－－ｓａｅ－－Ｃ／）ＭＰ２０１５０１１８２０１４１１１７ｌｙｔ２０Ｈｉ１２８ｄ５２Ｐｌ４０４７ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２Ｑ。届硕±学位论文ＡＢＣＨ＾Ｂ２８Ｓ１８Ｓ■Ｆ－ｉｇ５ａ：ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果Ａ－：ＢＭ服Ｃｓ尼克醜胺诱导２３ｄ总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果Ｂ：ＢＭＭＳＣｓ膜腺组织裂解液诱导２３ｄ总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果Ｃ诱导前ＢＭＳＣｓ总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果麵Ｆ－－ｉ５ｂｉｎｓｕｉｎｇ：ｌ基因及Ｐ内参ＲＴＰＣＲ扩增产物电泳图Ａ：空白对照组Ｂ－：ＢＭＭＳＣｓ尼克醜胺诱导２３ｄＣ－ＭＳＣ：ＢＭｓ膜腺组织裂解液诱导２３ｄＤ：ＢＭＳＣｓ诱导前Ｅ：ｍａｒｋｅｒＦＧＨ—：目ｃｔｉｎ、、ａ内参４８ 体外诱导晉髓源间充２０。届硕±学位洽文］賢Ｆ细胞分化为演岛样雛的初步探讨参考文献山ｃｏ－山ｌａｎｕｓＡＨｏｌｚＧＧＴｈｅｉｓｅＮＤｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｍｅｔｅｎｔ，，，ｇｐｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｎｄｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗｉｔｈｏｕｔｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｃｅｌｌｆｌ－ｉｓｉｏｎＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００３，１１１（６）；８４３８５０．，［２］ＫｏｌｆＣＭ，ＣｈｏＥ，ＴｕａｎＲＳ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆａｄｕｌｔｍｅｓｅｎｃｈｅｍｃｅ－ｙｍａｌｓｔｌｌｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｈｅ，ｓｅｌｆｒｅｎｅｗａｌａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｅｓＴｈｅｒ２００７（１）。０４．，＾３ｔ－ＺｈａｎＹ，ＳｈｅｎＷＨｕａＪｅｔａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｉｃｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃ山ｓ１；ｅｒｓｆｒｏｍｂｏｎｅ［］ｇ，，ｅｍｃｅ－ｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｆｉｒｓｔｔｒｉｍｅｓｔｅｒａｂｏｒｔｕｓｃａｎｃｕｒｅｓｔｒｅｔｏｚｏｃ－－ｉｎｉｎｄｕｃｅｄｍｏｕｓｅｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｒｅｕｖｅｎａｔｉｏｎ民ｅｓ＾０１０１３（６）：６９５ｐｊ，７０６．４ＸｕＹＸＣｈｅｎＬＨｏｕＷＫｅｔａｌ．Ｍｅ化ｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉ化ｒａｔ［］，，，ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｓｅｃｒｅｔｅｃｔｏｋｉｎｅｓｔｈａｔｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｇｌｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｙｙ－ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ．ＴｒａｎｓｌａｎｔＰｒｏｃ２００９４１（５：１８７８１８８４．ｐ，，）ＪＡｕＭ－－ｉａｎＪＬｕＫｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｌｕｓｔｅｒｓ口］ｇ，，，ｐｇｆｒｏｍ－ｈｕｍａｎｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００７２５（８）：１９４０１９５３．ｙ，，６ＦａｎＣＧＺｈａｎＪＺｈｏｕＪＲ－Ｔｈｅｒａｅｕｔｉｃ饥ｅｎｔｉａｌｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍ［］，ｇＱ，ｐｐｙｃｅ－ｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌ巳ｏｒｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ民ｅｖ２０１１，７（１）；１９５；＞２０７．７ＣｉｃｅｒｉＦ，ＰｉｅｍｏｎｔｉＬ．Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓ：ａｎｏｌｄｓｔｏｒｗｉｔｈ［］ｐｙｎｅｗｅｒｓｅｃｔｉｖｅｓ．ＣｅｌｌＴｒａｎｓｌａｎｔ２０１０１９（１２）：１５１＾１５２２．ｐｐｐ，，－脚ＭｉｌａｎｅｓｉＡＬｅｅＪＷＸｕｅｔａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｎｅｓｔｉｎｏｓ出ｖｅｃｅｌｌｓ，，Ｑ，ｐｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｉｎｔｏａｎｃｒｅａｔｉｃｅｎｄｏｃｒｉｎｅａｎｄｄｕｃｔａｌｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＪｐＥｎｄｏｃｒ－ｉｎｏｌ２０１１２０９（２）：１％２０１．，，４９ 体外读导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步親■寸２０。届硕±学位论文ａｎａｎ－口Ｈ，Ｚ，ｉＡ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ］ＷｇＫｇＬｐｇ－－ｃｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＰＤＸ１ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｌｌｓ．ＭｏｌＭｅｄＲｅ２０１２，６ｐ，（６）－：１４２８１４３２．１０民ａｈｍａｔ－ｉＳＡｌｉａｎｉＮＫａｄｉｖａｒＭ．Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｕｃｏｓｅｒｅｓｏｎｓｉｖｅ［］，ｊ，ｇｇｐｉｎｓｕｌｉ－ｌｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｅｎｔｖｉｒａｌｂａｓｅｄｐｄｘ１ｇｅｎｅｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅＣ５７ＢＬ／６ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｈｓＲｅｓ（）ｙｐｙＣｏｍｍｕｎ＾０－１３４３７（３）：４１３４１９．，［１１］ＭｉｎｇｕｅｌｌＪＪ，ＥｒｉｃｅｓＡ，ＣｏｎｇｅｔＰ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ卫ｘｐＢｉｏｌＭｅｄＭａｗｏｏｄ２００１２２６６－（）：５０７５２０．（ｙ），，１２ＢｅｅｒＮａｒｄｉＮ，ｄａＳｉｌｖａＭｅｉｒｅｌｌｅｓＬ．Ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｎ［］ｙｙｖｉｔｒｏｅｘａｎｓｉｉ－ｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｚａｔｏｎ．ＨａｎｄｂＥｘＰｈａｒｍａｃｏｌ２００６１７４）：２４９ｐｐ，，２８２．［１３］李鲁生，张涵，王成俊，等．骨髓间充质干细胞的分离方法和生物学特性．－中国组织工程硏究与临床康复，２０１化１４（１０）：１８６９１８７３．１４ＷｕＪＹＬｉａｏＣＸｕＺＰｅｔａｌ．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｔｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｔｈｅ［］，，，［ｙａｄｕ＂ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ．ＺｈｏｎｕｏＳｈｉＹａｎｙ］ｇｇ２００６－ＸｕｅＹｅＸｕｅＺａＺｈｉ１４（３）：５５７５６０．，，［１５］ＧｏｔｔｉｐａｍｕｌａＳ，ＡｓｈｗｉｎＫＭ，ＭｕｔｔｉｇｉＭＳ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄ－ｍａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｉｎ－ｓｅｒｕｍｆｒｅｅｃｏｎｄ１－ｉｔｉｏｎｓ．ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ２０４３５６（１）：１２３１３５．，，［１巧ＴａｎｇＤＱ，ＣａｏＬＺ，ＢｕｒｋｈａｎｉｔＢＲ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｏｂｔａｉｎｅｄ任ｏｍｍｕｒｉｎｅｂｏｎｅｐｇｍａｒｒｏｗ－．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００４＾（７）：１７２１１７３２．，，１７Ｓｃｈｏ巧ｅｗｅｅｎｔｈｅｓ－ｌｄ民．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｂｅｔｌｅｅｎｃｏｌｏｎｆｏｒｍｉｎｃｅｌｌａｎｄ［］ｐｐｙｇｔｈｅｈａｅｍｏｏ－－ｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ．ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ１９７８４（１２）：７２５．ｐ，，５０ 体外诱导骨體源间充质干细胞分化为膜皂祥结构的初步探巧２Ｑ。届硕鮮位论文１Ｄｕ＼ｄｌｌｉｅＳＡｔａＵＭＳｏｕｎａｃｅｒＡｅｔａｌ．Ｔｈｅｍｅｓｅｎｃｈｍｅｃｏｎｔｒｏｌｓ化ｅｔｉｍｉｎ［，，，糾ｙｇ－ｏｆａｎｃｒｅａｔｉｃｌｆｆｅ－ｂｅｔａｃｅｌｄｉｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００６５５（３：５８２５８９．）ｐ，，ｌｉｒｔｉＹＳＬｅｅＪＪ，ＳｈｉｎＪＳ，ｅｔａｌ卫ｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｍｏｕｓｅａｎｃｒｅａｔｉｃ［＾Ｋ，ｐｒｅｅｎｅｒａ－ｇｔｉｏｎａｎｄＨＩＴＴ１５ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｒａｔａｎｃｒｅａｔｉｃｐ卫－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２００３，３０９（３）：５２８５３２．ｙ０ＬＬ－ＹａｎｉＳＨａｔｃｈＨｅｔａｌ．虹ｖｉｔｒｏｔｒａｎｓ出瓶ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｈｅａｔｉｃ口］ｇ，，，ｐｓｔｅｍｃｅ－ｌｌｓｉｎｔｏａｎｃｒｅａｔｉｃｅｎｄｏｃｒｉｎｅｈｏｒｍｏｎｅｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄｐｐｇ－ＳｃｉＵＳＡ２００２９９（１２：８０７８８０８３．，，）２Ｓｏ－－１ｒｉａＢ．Ｉｎｖｉｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａ［］ｃｅ－－ｌｌｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ２０〇６８（４５）：２０５２１９．，Ｌ２２ＺａｌｚｍａｎＭＧｕｔａＳＧｉｒｉＲＫｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｈｅｒｌｃｅｍｉｉｎｍｉｃｅｂ［］，ｐ，，ｙｐｇｙ黎ｙｕｓ－ｉｎｇｈｕｍａｎｅｘａｎｄａｂｌｅｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ姐筋ｒｅｎｔｉａｔｅｄ负ｏｍｆｅｔａｌｌｉｖｅｒｐｐｇｒｏｅｎｉｔｏｒｌｌｌ－ｃｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００３１００（１２）＾２５３７２５８．ｐｇ，，２３ＧａｏＲ，ｓｔｉｎｏｖＪ，ＰｕｌｋｋｉｎｅｎＭＡｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｃｒｉｎｅ［］Ｕ，ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｉｒｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ打ｉｎｕｍａｎａｄｕｌｔ兵ａｎｃｒｅａｔ－ｉｃｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００３５２（８）：２００７２０１５．ｐ，，－２４ＣｚｕｂａｋＰＢｏａｒｓｋａＪｕｎａｋＡＴａｂａｒｋｉｅｗｉｃｚＪｅｔａｌ．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆ［］，ｊ，，＇ｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｌｌ－ｉｎｃｅｓｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｐｇｇｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓ２０１４０１４（６２８５９１．，＾－ｍｏ－２５ＩｃｈｉｄａＪＫＢｌａｎｃｈａｒｄＪＬａｍＫｅｔａｌ．ＡｓｍａＵｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｆＢｅｔａ［］，，，ｇｓｉｎａｌｉｎｒｅｌａｃｅｓｓｏｘ２ｉｎｒｅｒｏｒａｍｍｉｎｂｉｎｄｕｃｉｎｎａｎｏ．ＣｅｌｌＳｔｅｍｇｇｐｐｇｇｙｇｇＣｅ－ｌｌ２００９５（５）：４９１５０３．，，［２６李艳华，白慈贤，谢超，等．成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为］－族岛样细胞团的研究．（６）．自然科学进展，２００３，１３：５％５９７２７寇亚丽．．［］，胡利霞，李琴，等膜腺干细胞体外培养扩増的方法中国组织工２０１１－程研究与临床康复１５（１０）：１８１９１８２２．，，５１ 体外深导膏髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０巧届硕±学位论文［２８］柳氣张雪衔李莉Ｍａｌｌｏｒｙ氏膜岛细胞染色法的改良现代生物医学进００７７（－８９展，２１２）：１８８８１８．，口９］ＣｈａｎｇＣ，ＮｉｕＤ，ＺｈｏｕＨ，ｅｔａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏ－ｉｎｓｕｌｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｓｕｐｏｎｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｉｎｖ－ｉｔｒｏ．ＴｒａｎｓｌａｎｔＰｒｏｃ２００７；３９（１０）：３３６３３％８．ｐ，，［３０］ＴｒｅｍａｉｎＮ，ＫｏｒｋｋｏＪ，ＩｂｂｅｒｓｏｎＤ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＳＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆ２，３５３ｅｘｓ－ｎｒｅ化ｅｄｇｅｎｅｉｎａｓｉｎｇｌｅｃｅＵｄｅｒｉｖｅｄｃｏｌｏｎｙｏｆｕｎ出ｆｆｅｒｅｔｉａｔｅｄｈｕｍａｎｐｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｒｅｖｅａｌｓｍＲＮＡｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅａｇｅｓ．ＳｔｅｍＣｅ－ｌｌｓ２００１１９（５）：４０８４１８．，，ｌＦｅｉＹＸｉｅ打ＷａｎＹｅｔａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ打ｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ口］，，ｇ，［ｙｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｒａｔｉｎｕｒｅｄａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｐｇｊｐ＂Ｗａ－ｅｘｔｒａｃｔ．ＺｈｏｎｕｏＸｉｕＦｕＣｈｏｎ打船ｉＫｅＺａＺｈｉ２０１４２８（５）：６２５６３２．］ｇｇｇ，，２、口李琴，赵文靖，寇亚丽，等．也肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心］６－０．肌样细胞的分化．中国组织工程研究与临床康复，２０１１，１５（１０）：１７２１７３－－３ＣｈｅｎＷ，ＢｅｕｍＳＯａｒｅＡｄｄｏＬｅｔａｌ．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｂｅｔａｃｅｌｌ口］ｇ，ｐ，出ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓｂｙａｄｕｌｔｉｓｌｅｔｃｅｌｌｓｄｏｃｉｎｏｌｏ－．Ｅｎｒｇｙ２００９１５０（２）：５７０５７９．，，〇ｈＢＪＯｈＳＨＣｈｏｉＪＭｅｔａｌＣｏ－ｌｔｕｒｅｗｉｈＭａｌＣｌｌｓＡｕｇｍｅｎｔｓＰＷ．ｃｕｔｔｕｒｅＩｓｅｔｅ，，，ｔｈ－ｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＩｎｓｕｌｉｎＰｒｏｄｕｃｉｎＣｅｌｌｓｆｒｏｍＰｌｕｒｉｏｔｅｎｔＳｔｅｍｇｐＣｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｖ，２０１４，［３＾ＫａｎｉｔｋａｒＭ，Ｂｈｏｎｄｅ民．Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆｉｓｋｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅａｎｃｒｅａｓ－．ＲｅｖＤｉａｂｅｔＳｔｕｄ２００４１（４）：８５１９２．ｐ，，１口６］ＸｉｅＨ，ＷａｎｇＹ，ＺｈａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｉｎｊｕｒｅｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｐｒｏｍｏｔｅｓｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｉｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏ－ｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１３８（９）：ｅ７６０５６．ｐｇ，，５２ 体外语导晉髓１间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文口７］许世清，口秀丽，张文健，等．诱导干细胞分化的膜岛细胞形成膜岛样结构－的实验研究．中国医药生物技术６）：４１７４２３．，２００９，４（＊－３８ＭａｒｃｈｅｔｉＦＬｕｉ民ＢｕｌｉａｎｉＭｅｔａｌ．ＡｌｏｃａｌｌｕｃａｏｎＨｋｅｅｔｉｄｅ１［］，ｐ，ｇ，ｇｇｐｐＧＬＰ－ｓｓｔｅｍ１ｉｎｈｕｍａｎａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２０１２５５（）ｙｐ，，（１２）－：３２６２３２７２．３９ＦｕｋａｍｉＡＳｅｉｎｏＹＯｚａｋｉＮｅｔａｌ．Ｅｃｔｏｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｏｆＧＩＦｉｎａｎｃｒｅａｔｉｃ［］，，，ｐｐｐｂｅｔａ－ｃｅｌｌｓｍａｉｎｔａｉｎｓｅｎｈａｎｃｅｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｗｉｔｈｃｏｍｐｌｅｔｅａｂｆ－－ｓｅｎｃｅｏｒｏｌｕｃａｏｎｄｅｒｉｖｅｄｅｔｉｄｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２０１３６２（２）；５１０５１８．ｐｇｇｐｐ，，［４０］ＬｉＧ，ＹｅＬ，ＬｉＪ，ｅｔａｌ．Ｉｍａｃｔｏｆｉｓｌｅｔａｌｈａｃｅｌｌｌｏｓｓｏ打ｉｎｓｕｌｉｎ［ｐｐ－ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｚｈｏｎｈｕａ巧ＸｕｅＺａＺｈｉ２００２８２（２０）：１４２７Ｉ４３１．］ｇ，，４ａｎＺｈａｎＷＣａ－ＨｉＨｅｔａｌ．ａｌｈａＣｅｌｌｌｏｓｓｆｒｏｍｉｓｌｅｔｉｍｓｉｔｓｉｎｓｕｌｉｎ［＂Ｗｇ，ｇｊ，ｐｐ破ｓｅｃｒｅｔ－ｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．Ｉｓｌｅｔｓ２０１１３（２）：５８６５．，，５３ 体外诱导骨髓源间雜干细胞分化为膜岛样瓣的初步探讨２０。届硕±学位论文？综述？体外诱导骨髓间充质干细胞向膜岛方向分化的研究进展随着间充质干细胞的深入研究一一，在代谢疾病领域的主要疾病之糖尿病在实验研究领域越来越受关注，糖尿病由于膜岛素分泌绝对缺乏或膜岛素抵抗，使人体内葡萄糖不能作为有效能源，葡萄糖沉积于血管、器官等引发的一系列的伴随症状。目前，治疗的有效途径是体内注射族岛素及口服降糖药，这两种方法只能是从症状上改变表观，并不能解决实质性－膜岛功能受损一根本的问题、膜岛器官的衰竭。骨髓间充质干细胞作为种可再生资源具有自我更新、分化潜能；由于其易获取、来源稳定、研究可靠等特性－，越来越多的基础及临床实验用于探索多能干细胞骨髓间充Ｗ－ＭＳＣ质干细胞（ＢＭｓ）在膜岛方向的治巧作用。１－ＭＳＣｓ？、什么是ＢＭ在骨髓内富含有多种类型的干细胞，包括间充质干细胞、造血干细ＢＭ－ＭＳＣｓ是来源于骨髓的成体干细胞胞和内皮祖细胞等。，存在于骨髓中的未分化细胞多能干细胞，起源于早期中胚层，具有干细胞的共性（即自我更新及多向分化能力、非终末分化细胞、缺乏分化标志、无限增殖分裂－ＭＳＣ、通过对称性和非对称性性两种方式生长等），ＢＭｓ可Ｗ分化出多种细胞、组织等，但分化潜能不及全能胚胎干细胞，组织干细胞失去了Ｗ发育成单个个体的能力。Ｃａｌａｎ于１９９１年把骨髓中这种具有粘附于培ｐ养皿表面－ＭＳＣ、在体外高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为ＢＭｓ。２、骨髓间充质干细胞有哪些特性？２．１生长特性５４ 体外诱导晉跑源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文体外培养时发现骨髓间充质干细胞具有一般细胞生长规律（滞留期、指数期、平台期），实验主要采用全骨髓贴壁培养法，原代培养４ｈ后细６ｈ胞开始贴壁，内贴壁完成，刚贴壁的细胞光镜观察类似成纤维的外观，呈圆形或者纺锥形，与成纤维细胞形态类似。随着培养时间的延长，可观察到有明显的胞饮和细胞分裂活动一；细胞体积进步増大、出现克隆样生长，可见兰角形、多角形；培养３ｄ左右细胞长满瓶底需及时传代。由于间充质干细胞贴壁生长的特性，通过控制消化酶与消化时间不断提高间充质干细胞的纯度一，般传至第３代纯度可达９５％。传代后球形细胞减少，梭行及多角形较多，有学者认为形态较小的为再循环干细胞，有较强的克－ＭＳＣ隆増殖能力；形态较大的细胞为成熟ＢＭｓ，其克隆形成率低。２．２标记特性及鉴定方法－ＭＳＣｓ具有多种标志物ＢＭ，兼具间充质、内皮细胞、肌肉细胞的特征；包括生长因子、细胞因子、粘附因子、受体及整合素。目前尚未刷选出其独有的标志分子一。般认为细胞粘附因子ＣＤ４４、ＣＤ５４是间充质干细胞的重要标志。巧４４是细胞表面糖蛋白，与细胞骨架相互作用，使间充质干细胞与细胞外基质蛋白结合，为其提供生长错定生长位点。ＣＤ５４为细胞间粘附因子，介导细胞与细胞及细胞外基质的粘附。由于间充质干细胞具有自我更新、髙度增殖的干细胞特性，ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９等表一－ＭＳＣ达也阳性。目前实验中般采用排除法和退逆法对ＢＭｓ鉴定。①排除法：不表达内皮细胞、成纤维细胞、造血干细胞及血细胞抗原ＣＤＵｂ，ＣＤ４５、ＣＤ３４等，表达干细胞抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４等排除造血干细胞。②推逆法：利用其多向分化潜能的特性，给予适当的诱导因子，细胞出现分化表型，如诱导成骨、软骨、脂肪方向分化Ｗ推逆其为ＢＭ－ＭＳＣｓ。５５ 体外诱导晉酷源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文２．３归巢特性ＢＭ－ＭＳＣｓ能自动归巢于损伤及炎症区域，炎症组织产生大量的细胞１２３１－ｓＳａ因子ＭＳＣｉｔｏ等，ＢＭ有向损伤组织趋化的能力。首次证明了送种特Ｍ－ＭＳＣｓ性，在该研究中将标记的Ｂ从静脉内注射到健康小鼠体内，发现在骨髓中存在外来的间充质干细胞，而当也脏存在梗死区域后，外源标记ａｎｇ的干细胞大量的集中在梗死区域。Ｗ等通过模拟也肌梗死病例，将标记的间充质干细胞注入大鼠巧主动脉内，观察到在形成的癒痕组织中出现有单个或成簇样的纤维原样细胞，；而癒痕的周边呈正常必肌细胞表型认为间充质干细胞通过冠状动脉可向也肌梗死局部趋化ＢＭ－；目前认为ＭＳＣｓ归巢由粧附因子和趋化因子等介导。么４可塑性ＢＭ－ＭＳＣｓ具有多向分化潜能的特性称为可塑性；间充质干细胞的分化条件包括体内分化和体外分化两种。体内分化表明成体干细胞的分化受细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用及各种体液因素的影响，指出壁－蠢（ｎｉｃｈｅ）是ＢＭＭＳＣｓ在持定兰维空间结构生长微环境。体外的诱导环境多数通过模拟这一微环境途径来实现的。目前证实间充质干细胞至少可向Ｗ下成熟细胞分化，肌细胞、骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞、神经ＢＭ－Ｍ细胞、肝细胞、抓腫细胞等；因此可见ＳＣｓ可塑性能力强大。２．５免疫调节性ＢＭ－ＭＳＣｓ可通过多种途径发挥对机体免疫细胞生物学的调节作用，体外研究表明，间充质干细胞可抑制混合淋己细胞（ＭＬＲ）或植物血凝素（ＰＨＡ）刺激引起的Ｔ淋巴细胞增殖，在ＭＬＲ初始阶段的第３ｄ加入间充质干细胞，能够显著抑制ＭＬＲ增殖，且抑制效应是剂量依赖性，即体内ｆｉ＂－ＭＳＣ注射的ＢＭｓ数量越多，产生的免疫抑制作用越强。Ｋｒａｍｐｅｒａ等５６ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０巧届硕±学位论文在实验中取ＢＭ－ＭＳＣｓ上清液与Ｔ细胞进行赔育抑制的Ｔ细跑增殖作用消ＢＭ－ＭＳＣ失，认为ｓ可产生可溶性的细胞因子，通过细胞间的直接接触作用而Ｗ阻碍Ｔ细胞与抗原递呈细胞的接触，从而实现抑制Ｔ细胞增殖的效果。３－、ＢＭＭＳＣｓ在膜岛方向研究成果一ＢＭ－ＭＳＣｓ的跨胚层分化作用。，使治巧糖尿病又多了条途径现阶ＢＭ－ＭＳＣ段人们已经成功的将ｓ移植到患者体内用于治疗骨组织缺损和也肌ＢＭ－ＭＳＣ梗死等疾病，这些临床实验结果使得诱导ｓ分化为膜岛细胞成为治疗搪尿病新的发展方向。３．１免疫调节治疗－ＭＳＣｓ免疫调节作用在糖尿病研究实验结果中表明－ＢＭ，ＢＭＭＳＣｓ可Ｗ达到减輕自体免疫反应对新生成目细胞损害作用。Ｋａｎｇ等证实，在自体免疫反应导致６细胞大量损害后－ＭＳＣｓ，ＢＭ移植可Ｗ逆转，：鼠的高血糖症。在其他的报道中，注射骨髓间充质干细胞可Ｗ抑制自体＾应中的Ｔ细胞功能＋，提高转录蛋白ＦＯＸＰ３监督Ｔ细胞、重建外周免疫耐受。１５１１Ｋｏｉｍａ等体外注射骨髓到正常模型鼠体内，在膜腺腺泡中观察到表达ｊ膜岛素原的骨髓获得细胞。３．２体内移植治疗在糖尿病早期阶段向大鼠体内注入ＢＭ－ＭＳＣｓ可Ｗ増加膜岛素受体（ＩＲＳ－１）Ｂ及蛋白激酶憐酸化，从而改善外周膜岛素抵抗，相反在糖尿病鼠晚期阶段膜岛素敏感性未见改善ＢＭ－ＭＳＣｓ，实验表明能够加强目细胞功１２７１ＢＭ－ＭＳＣｓ能Ｗ纠正高血糖症状。也有学者提出，或其释放的营养因子可Ｗ起到保护残存目细胞的作用，促进内源性干细胞向目细胞增殖、减少外周膜岛素抵抗，Ｗ改善糖尿病症状。Ｐｈａｄｎｉｓ等研究糖尿病患者微环５７ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文ｈＢＭ－ＭＳＣｓ）的影响境对非糖尿病来源的骨髓间充干细胞（，表明糖尿病微环境通过细胞外信号、微环境Ｗ及内在的遗传程序从干细胞的早期阶段就开始影响干细胞的分化；加入胎儿膜腺裂解液模拟高血糖糖尿病壁臺环－ＭＳＣｓ分化了形成膜岛样细胞团－境，犯Ｍ，而来源于犯ＭＭＳＣｓ可Ｗ通过体外编程形成了更为成熟的膜岛样细胞团，表明糖尿病高血糖微环境在体内外ＢＭ－ＭＳＣｓ的分化中起到重要的作用。３．３替代治疗目前０细胞治疗的主要方法是通过诱导ＢＭ－ＭＳＣｓ定向分，替代膜岛化而来。化等将由大鼠间充质干细胞诱导分化的膜岛样细胞团移植到？糖尿病鼠肾包膜下，结果发现移植后２３ｄ小鼠血糖水平开始恢复正常；移植到后１７ｄ后将６只模型鼠的移植物移去，导致糖尿病鼠重新出现高血糖并且陆续死亡，而其余３只接受移植的模型小鼠血糖水平维持相对正常达９０ｄ。相同的实验现象在Ｔａｎｇ实验中也有报道，将诱导分化的ＭＳＣｓ注射到模型大鼠体内，Ｉｗ后与注射前相比较血糖水平有下降，而注射未分化的ＭＳＣｓ及空白对照组与注射前血搪水平没有明显变化。４Ｍ－ＭＳＣｓ向族岛、Ｂ方向的诱导途径膀腺细胞的发育在胚胎时期按照先后顺序顺序完成，首先胚胎干细胞＋形成限定的内皮细胞，其次诱导内皮细胞形成ＰＤＸ１膜腺祖细胞，最后形成的内分泌祖源细胞再最终形成膜岛素分泌细胞。模拟这种阶段性分化方１１＂法，实验证实间充质干细胞诱导效率显著增加，且分泌产物接近人体正常０细胞所分泌及对多种分泌刺激产生应答反应。现阶段的实验诱导方法大都根据此阶段方法模拟诱导间充质干细胞向膜岛素分泌细胞分化。总结目前的诱导方案。，大致有Ｗ下几种４．１化学试剂诱导５８ 体外ｉ秀导晉範源间充质干细胞分化为膜巧的巧步探讨２０。届硕±学位论文是目前最常用的诱导干细胞分化方法－，常见的化学诱导剂有目细胞调节素、活化素、尼克酷胺、碱性成纤维生长因子、内皮细胞生长因子、Ｂ２－琉基立醇等干细胞生长因子、；７、。所用的方法按照不同阶段所用的试剂的不同一，大致分为步法、两步法、Ｈ步法。一（１）步诱导法也称定向诱导法，在诱导过程内使用成分相同的培养液。Ｃｈｅｎ等研究大鼠ＢＭ－ＭＳＣｓ在体外经数次传代后在含有血清的＾ＤＭＥＭ中加入６琉基乙醇和尼克醜胺预处理２４小时－－，然后在无血清的ＨＤＭＥＭ培养液加入６琉基置醇和尼克醜胺１０小时后，诱导后干细胞由纺煙状变为圆形或楠圆形的膜岛样细胞团ｔｉｎ蛋白表达及记录到诱导不同ｆ间段膜岛，检测到ｎｅｓ｜素量的变化情况；移植诱导后形成的细胞团于糖尿病模型鼠体内，免疫萊光实验证实了糖尿病鼠膜腺中存在形态类似族岛样细胞的细胞团，并检测ＫＢＭ－ＭＳＣ出微量膜岛素分泌；证实了ｓ在特定的诱导条件下能够分化为具有，膜岛素分泌功能的膜岛样样细胞；因此得出骨髓细胞存在膜体细胞能＾够分化为具有功能的内分泌细胞。（２）二步诱导法分两个阶段诱导，两个阶段的诱导液成分不同。张立明等通过两ＢＭ－ＭＳＣ０步法对第Ｈ代ｓ进行诱导，首先，将含１＾１３化碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦ畑）、表皮生长因子（ＥＧＦ）、肝细胞生长因子（ＨＧＦ０混合培养基诱导６ｄ０１１、ＨＧＦ、Ａ、；其次，换用含有１ｇ／Ｌ的目细胞素激活素膜－高血糖素样肤１（ＧＬＰＳ１）、全反式维甲酸和１０ｎｉＭ尼克醜胺及２９泌２７的－ＭＳＣｓ形胞体变大培养基诱导，观察到ＢＭ，形态不规则不规则，最后形成细胞团样结构。体内移植诱导组细胞团模型鼠血糖有下降但未完全降至正５９ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜巧样结构的初步探讨２０。届硕±学位洽文常水平；而３周后血糖未有明显下降，考虑可能是移植细胞在体内未有继续增殖或者诱导细胞还没有真正成熟。（３）Ｈ步诱导法分Ｈ个阶段进行诱导，每个阶段使用的诱导液成分各不同。如ＴａｎｇＢＭ－ＭＳＣｓ等通过诱导大鼠获得了具有膜岛素分泌功能的细胞，扭转了－，ＭＳＣｓ先用低糖（５．５ｉｍｎｏｌ／ｌ糖尿病鼠的高血糖症状，在实验中将ＢＭ）？或高糖（２３ｉｍｎｏｌ／Ｕ诱导２４个月后，再用含尼克酷胺的低糖培养基诱？－－７ｄ导７ｄ，最后在培养液中添加ｅｘｅｎｄｉｎ４诱导５。结果ＲＴＰＣＰ检测到－－ＢＭＭＳＣｓ分化过程中出现Ｇｌｕ２，葡萄糖激酶、族岛淀粉样蛋白多糖、－ｎｅｓｔｉｎ、ＰＤＸ１等多种基因表达及产物形成。从基因及蛋白的水平证实了分化的细胞为膜岛素分泌细胞，同时发现髙糖环境更有利于干细胞的分１４＂－ＭＳＣ？３ｄ化。刘雅娟等使用无血清低糖ＤＭＥＭ培养液诱导ＢＭｓ２，然后添加ｂＦＧＦ及ＥＧＦ等继续培养７ｄ；最后换为含有Ｂ２７、ａｃｔｉｖｉｎＡ、地塞米ＤＭＥＭ７ｄ－松，ＢＭ、族岛素及尼克醜胺的无血清高糖诱导结果同样使得ＭＳＣｓ为族岛样细胞团。４．２微环境诱导法由于间充质干细胞具有不定向的自发的分化潜能，通过生物模拟族腺生长分化环境，采用提取的族腺裂解液模拟膜腺生长所需微环境，从而达到定向诱导间充质干细胞向膜岛方向分化的潜能的目的，在此结论上提＂＂学说，由基出壁盡，即膜岛生长及分化在所处的特定的环境下发生因。、体外环境及外界刺激等共同作用的结果（１）膜腺组织裂解液诱导资料显示，大鼠膜腺是膜腺分化的强有力的诱导剂，受损的膜腺中包含了目细胞再生及干细胞分化所需的特殊因子，蛋白组分析膜腺组织提取朗 体外语导骨ＩＴ源间充质干细胞分化为膜岛的初步探讨２０。届硕推位论文液中存在族腺发育及分化中表达的蛋白，提出这些蛋白可能是提高干细胞Ｕ９１向膜岛素分泌样细胞分化效率转录因子。李宏丹等分别在膜腺裂解液－（Ｒ阳）不同溶度（１０、２０、３０、４０、５０、ｌＯＯｍｇ／１）诱导ＢＭＭＳＣｓ，只有当ＲＰＥ溶度达到５０ｍｇ／ｌ时才起到促分化作用，浓度增加促分化作用未见增强一，延长分化时间到个月，观察到细胞继续分裂未见分化成熟。指出５０ｍｇ／ｌＲＰＥ是诱导间充质干细胞的最佳分化溶度，推测Ｒ祀发挥促分化作用的可能是小分子化类。Ｘｉｅ等将传统的化学试剂诱导法与ＲＰＥ诱导法及两者混合方法结果进行了比较，混合组诱导法诱导产物分泌的ＰＤＸ１、－ＲＰＥ诱ｎ３膜岛素、Ｃ肤等水平与传统诱导组及导组均高，表达的Ｎｇ、ＳＳＴ基因水平在诱导的前７天内逐渐增强。通过数据结果比较，＾ＲＰＥ能够在传统诱导方法基础上提高间充质干细胞的转化效率及膜岛样分泌细胞的成熟度一。体外将诱导产物移植到糖尿病鼠肾被膜下，混合组的血糖个月肉维持在１５０ｇ／ｌ，相比于传统诱导组血糖更高（２００ｇ／ｌ）。（２）共培养法诱导骨髓来源的间充质干细胞与膜岛细胞共同培养的方法。许多研究证实－ＭＳＣｓ与族岛细胞共培养可Ｗ增强膜岛功能及促进膜岛恢复通过ＢＭ。Ｏｈ－ＭＳＣｓ等通过共同培养膜岛与ＢＭ，检测到膜岛目细胞特有的基因表达，－Ｓ＾Ｇ－如ＰＤＸ１、Ｉｌ、ｌｕｔ２等，在培养体系内增加葡萄糖浓度可Ｗ刺激膜岛素量增多，体内实验也证实了诱导产物能够降低糖尿病模型鼠的血搪。沈－ＭＳＣｓ及膜岛细胞浩亮等采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室共同培养ＢＭ，在下室中放入载有间充质干细胞的玻片，填充胎牛血清的ＩＭＤＭ培养液浸没到上室的聚碳酸醋膜，而在小室的上室中加入纯化的膜岛细胞，上室予含有胎牛血－清的ＲＰＭＩ１６４０填充７天。；细胞共培养后即出现了膜岛素分泌４．３体内诱导方法６１ 体外诱导骨體源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位洽文有学者提出体内的膀腺旁分泌因子能够促进间充质干细胞的分化与成Ｗ－熟。Ｂａｎｅｒｉｅｅ等体内注射未分化的ＢＭＭＳＣｓ于，间充质ｊ糖尿病患者体内干细胞能够在体内起到降低并稳定血糖的作用，而维持血糖正常可达Ｗ３０ｄＣｈｏ－。ｉ等体外模拟膜岛细胞所需环境，在兔的ＢＭＭＳＣｓ中加入膀腺提取液，诱导形成了具有分泌功能的膜岛样细胞色炎光蛋白标记；而将绿的间充质千细胞移植到糖尿病模型鼠体内，结果却未能缓解族腺损伤。Ｂｅ－ｌｌ等未能证实移植体外来源的ＢＭＭＳＣｓ能够直接降低血糖及增生目细胞，尽管人骨髓间充质干细胞显示多种提高膜岛功能、降低高血糖症及与ＢＭ－扩増目细胞等作用，结果显示ＭＳＣｓ未能促进膜岛内血管形成及膜腺发育早期阶段内＋Ｎｇｎ３基因的表达，缺乏直接分化为目细胞能力的有为证据，所Ｗ也有学者提出不能最终证实体内外源性的骨髓间充质干细胞转分化为膜岛素分泌功能的目样细胞。５、骨髓间充质干细胞分化为膜岛素分泌细胞的常用实验鉴定方法在膜腺发育过程某些转录因子在膜腺形成过程中持续表达，目前较为肯定的形成膜岛细胞的分子标志物包括膜岛发育过程中的转录因子及膜岛ｎｅｓｔ－－素基因，如ＰＤＸ１、ｉｎ、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ａｘ４、ａｘ６、Ｎｎ３、ｐｐｇＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ２．１、Ｎｋｘ２．２等基因的表达。与膜岛细胞内分泌功能有关的ＧＣＫＧＬＵ－２、，膜岛素、膜高血糖素、生长抑素及膀多肤等，都是干细胞向膜腺方向分化的有力证据。５．１膜腺细胞分子标记物（ＤＣＫ１９一是膜腺干细胞的分化标志之，在正常骨髓中无表达，是上皮细胞骨架的组成成分，表达于正常上皮及上皮源性肿瘤组织，沈１９是干细胞诱导后重要检测的基因之一。６２ 体外巧导营疆源间充质干细胞分化力廣巧的初步探讨２０。届硕±学位论文２ＰＤＸ－（）１（膜十二指肠同源异型盒基因）是干细胞发育过程中首先表达的转录因子，又名膜岛素促进因子，膜腺发育早期表达的转录因子，在原肠内胚层背侧及腹侧的膜腺胚芽的生长发育起着重要的作用。饼Ｎｅｓｔｉｎ（巢蛋白）巢蛋白是高分子中间丝蛋白，表达于分化中的纤维母细胞，未见表达于上皮细胞一些相同。在早期胚胎发育时期，膜岛细胞与神经细胞具有的表型一Ｗａｎ来源于骨髓细胞分离培养，化ｓｔｉｎ即是其中的种，ｇ等对ＰＤＸ－出的表达ｎｅｓｔｉｎ强阳性的神经干细胞进行１基因转录，结果检测到Ａ膜岛素ｍＲＮ及膀岛素蛋白的表达，指出了骨髓为膜岛移植来＾｜的重要途＋径。也有实验将ｎｅｓｔｉｎ标记的膀腺导管上皮细胞诱导得到膜岛样细胞团，推测ｎｅｓｔｉｎ分子标志是膜腺内分泌干细胞分化的过程中重要的标识因子。饼Ｎｇｎ３（神经元素３）－是内分泌部位发育的起始因子，属于膜腺发育过程中短暂表达ＢＨＬＨ家Ｗ一族蛋白的种，而在成熟膜岛中是不存在的。有报道神经元素３分布于膜腺内分泌细胞起始发育的背侧膜芽部分。５．２双硫腺染色一膜岛细胞因含有丰富的锋离子，而双硫膝是种锋离子藝合指示剂，双硫踪染，因此双硫腺染色作为初步鉴定膜岛细胞的特征性染色方法色后可见族岛细胞团染成猩红色。此种方法具有操作简便，阳性率高，特。性稳定的优点，已广泛用于膜岛及诱导产物的鉴定５３ＲＴ－．ＰＣＲ检测膜岛素基因表达６３ 体外语导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样绍勾的初步探巧２０１５届硕±学位论文从基因的出发点检测产物的特性，具体方法是提取诱导后细胞的－ＲＮＡ，ＲＴＰＣＲ鉴定膜岛素。通过、膜岛血籍素等基因的表达５．４ＥＬＬＩＳＡ法检测膜岛分泌的蛋白用于检测诱导产物的膜岛素分泌检测诱导产物功能，在不同浓度的葡萄糖作用于膜岛素分泌细胞，放射免疫法或电化学发光法检测细胞培养液中膜岛素含量，从而定量测定出族岛素的分泌量，可Ｗ追踪观察诱导的不同阶段膜岛素等蛋白的释放量。６ＢＭ－ＭＳＣｓ在、糖尿病方向亟待解决的问题首先，诱导产物的成熟度。内源性天然ｅ细胞有２０％ｍＲＮＡ转录分泌膜岛素－，膜岛素蛋白的含量为ｌＯｍｇ，人体空腹情况下释放Ｃ肤的量在？－１５．４ｇ／１之间。而文献报道体外诱导干细胞获得细胞团最大的ＣＪ！太释放３８１１水平少于１／１。体外产生的细胞是不成熟的ｇ，并且对葡糖糖刺激存在一定程度的缺陷的。诱导产物预评估是糖尿病治疗成功的先决条件，体外获得的膜岛样细胞移植首先应该满足对葡萄糖刺激敏感。其次，诱导产物自身免疫的破坏。移植体外来源的诱导产物对宿主免疫系统存在抑制作用。新出现的办法是用藻蛋白酸盐或者是生物适合的聚氨靡－聚乙稀化咯焼厕合成的微胶囊包裹细胞，从而产生免疫隔离或者是阻止移植物排斥反应，这种做法在长时间移植免疫的安全问题上辅助了同种异体移植或异种移植。最后，移植位点的选择。膜岛移植最先移植到腹膜腔，而移植到腹膜腔不容易嫁接，而且移植细胞在腔里面四处分散及失去功能的概率高；口静脉注射途径伴有口静脉高压症及血栓形成的风险。目前实验移植细胞位点大多在肾被膜下或者脂肪垫下，但在技术上这些移植位点并不理想。６４ 体外诱导骨髓源间充质干细胞分化为膜皂样结构的初步顆牙２０。届硕推位论文参考文献－４４［１］ＢａｎｅｒｅｅＭＫｕｍａｒＡＢｈｏｎｄｅＲＲ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｉａｂｅｔｅｓｂ［Ｕｊ，，ｐｙｍｕｌｔｉｐｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ卫ｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２００５３２８－（１）：３１８３２５．，，［２］ＢｅｌｌＧＩ，ＢｒｏｕｇｈｔｏｎＨＣ，ＬｅｖａｃＫＤ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｕｂｔｙｐｅｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｓｌｅｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄ－ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ２０１２２１（１）：９７１０乂，，ｍａＲｅｓ－３Ｃ巧ＩａｎＡＩ．ＭｅｓｅｎｃｈｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪＯｒｔｈｏ１９９１９（５）：６４１６５０．［］ｙｐ，，ＣｈａＬＧ－ｔ－－ｓｅＵｌｌｏａＭｏｎｏａＦ，ＫｉｄｄｅｒＢＩｖｅｔａｌ．Ｉｓｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ１化ｅ…，ｙ，－ｃｅｌｌｓａｒｅｎｏｔｄｅｒｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｔｉｉ－ｉｖｅｄｖｉａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｙｒａｎｓｔｏｎ鱗ｍＰｄｘ１ｏｒ－－ｉｎｓｕｌｉｎｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００７５６（１）：３７．ｐ，，５ＣｈｅｎＬＢ，化扣巧ＸＢ，ＹａｎＬ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ［］ｇｙ－ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌ约ｂｅｔａｃｅｌｌｓ．ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ２００４１０ｐ，，（２０）－：３０１６３０２０．ＣｈｏｉＪＢＵｃｈｉｎｏＨＡｚｕｍａＫｅｔａｌ．Ｌｉｔｌｅｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｔｍｎｓｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ［句，，，ｂｏｎｅｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｒｒｏｗｌｌｓｉｎｔｏａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｉａ２００３４６，ｐｇ，（１０）－：Ｄ６６１３７４．［７］ＤｉＧｉｏａｃｃｈｉｎｏＧ，ＤｉＣａｍｐｌｉＣ，ＺｏｃｃｏＭＡ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍ－ｃｅｌｌｓｉｎａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｓ：ｓｔａｔｅｏｆｔｈｅａｒｔ．ＴｒａｎｓｌａｎｔＰｒｏｃ，２００５３７（６）：２６６２，ｐｐ２６６３．阿ＧａｏＲ，ＵｓｔｉｎｏｖＪ，ＰｕｌｋｋｉｎｅｎＭＡ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｃｒｉｎｅｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎａｄｕｌｔｐａｎｃｒｅａｔ－ｉｃｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｉ化ｅｔｅｓ２００３５２（８：２００７２０１５．ｐ，，）［９］ＧｒａｄｗｏｈｌＧ，ＤｉｅｒｉｃｈＡ，ＬｅＭｅｕｒＭ，ｅｔａｌ．ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎＳｉｓｉｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒ化ｅｄｅｖｅ＇ｌｏｍｅｎｔｏｆｔｈｅｆｏｕｒｅｎｄｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｌｉｎｅａｅｓｏｆ化ｅｐａｎｃｉｅａｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌｐｇＡｃａｄＳｃ－ｉＵＳＡ２０００７（４）：１６０７１６１１．，＾６５ 体外诱导骨酷原间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探讨２０。届硕±学位论文１０ＩａｎｕｓＡＴｈｅｌ－ＨｏｌｚＧＧｉｓｅＮＤｅｔａｌ．Ｉ打ｖｉｖｏｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｕｃｏｓｅｃｏｍｅｔｅｎｔ［］，，，ｇｐｐａ打ｃｒｅａｔｉｃｅｎｄｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗｉｔｈｏｕｔｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｃｅＵｆｕｓ－ｉｏｎ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００３１１１（６）：８４３８５０．，，ｌｌａｆａｒ－ｉａｎＡＴａｈｉｋｈａｎｉＭＡｂｒｏｕｎ８约ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｉｈｉｅｌｄｉｎｓｕｌｉｎ［＂，ｇ，，ｇｙｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＢｉｏｌｐｇｙＲｅ２０－１４４１（７）：４７８３４７９４．ｐ，，１２ｈａ－ＫａｄａｍＳＭｕｔｌａＳＮａｉｒＰｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｌａｃｅｎｔａｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ［］，ｙ，，ｐｙｓｔｅｍｃｅ－ｔｌｌｓａｎｄｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｓａｎｏｖｅｌｇ－ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｉｎｄｉａｂｅｔｅｓ．ＲｅｖＤｉａｂｅｔＳｔｕｄ２０１０７（２）：１６８ｐｙ，，１８２．［１３］ＫａｎｇＥＭ，ＺｉｃｋｌｅｒＰＰ，ＢｕｍｓＳ，ｅｔａｌ．ＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｐｒｅｖｅｎｔｓｄｉａｂｅｔｅｓｉｎＮＯＤｍｉｃｅｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｓｌｅｔｃｅｌｌ－ｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｎｃｅｄｉｓｅａｓｅｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＨｅｍａｔｏｌ．．Ｅｘ２００５３３（６）乂９９７０５ｇｐ，，［１４］ＫａｙａｌｉＡＧ，ＦｌｏｒｅｓＬＥ，ＬｏｐｅｚＡＤ，ｅｔａｌ．Ｌｉｍｉｔ；ｅｄｃａｐａｃｉｔｙｏｆｈｕｍａｎａｄｕｌｔ－－ｉｓｌｅｔｓｅｘａｎｄｅｄｉｎｖｉｔｒｏｔｏｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｂｅｔａｐｐｇｃｅ－ｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００７５６（３）＾０３７０８．，，１５－ＫｏｉｍａＨＦｕｉｍｉａＭＭａｍｕｒａＫｌｒａａｎｃｒｅａｉｃｉｎｓｕｌｉｎｔｓｕｅｔａ．Ｅｘｔｔ［］ｊ，ｊｙ，，ｐｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｉｎｍｕｌｔｉｌｅｏｒａｎｓｉｎｄｉａｂｅｔｅｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳｐｇｐｇ２００４１０１（８）－Ａ：２４５８２４６３．，，６ｓ－＂ＫｒａｍｅｒａＭＣｏｍｉＬＡｎｅｌｉ民ｄ；ａｌ．Ｒｏｌｅｆｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｍｍａｉｎｔｈｅ］ｐ，，ｇ，ｇｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｏｆｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｙｙｙ－ｃｄｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００６２４（２）３％．，，：３Ｗ１７ＫｕｍｅＳ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓａｎｄｒｏｓｅｃｔｓｉｎａｎｃｒｅａｔｉｃｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ．Ｄｅｖ［］ｐｐｐｐＧｒｏｗｔｈ－Ｄｉｆｆｅｒ２００５４７（６）：３６７３７４．，，８ｓａｄ－ｈｏ１ＫｕｎｉａＹＴｓｕｂｏｏｋａＹａｍａｚｏｅＮ，ｉＭｅｔａｌ．Ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｄｕｃｅ［］，Ｓｊ，－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｇ－ｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓ２０１２８（２）：２７４２８４．ｐｐ，，６６ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结巧的巧步探讨２０１５届硕±学位论文ｔ－１９ＭｉｌａｎｅｓｉＡＬｅｅＪＷＸｕｅａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｎｅｓｔｉｎｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓ［］，，Ｑ，ｐｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｉＴｏｗｉｎｔｏａｎｃｒｅａｔｉｃｅｎｄｏｃｒｉｎｅａｎｄｄｕｃｔａｌｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ｐＪＥｎｄｏｃ－ｒｉｉｉｏｌ２０１１２０９（２）：１％２０１．，，ｔ－ｔｔ２０ＯｈＢＪＯｈＳＨＣｈｏｉＪＭｅａｌ．Ｃｏｃ山ｕｒｅｗｉ化］ＶｌａｕｒｅＩｓｌｅｔＣｅｌｌｓＡｕｍｅｎｔｓ［］，，，ｇ－ＰｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＩｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｇＣｅｌｌｓ任ｏｍＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ民ｅｖ２０１４，，２１ＰｈａｄｎｉｓＳＭＧｈａｓｋａｄｂｉＳＭＨａｒｄｉｋａｒＡＡｅｔａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［］，，，ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｏｆ出ａｂｅｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓｏｒｔｒａｉｔｕｎｉｕｅｍａｒｋｅｒｓｐｑｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｔｈｅｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．民ｅｖＤｉａｂｅｔＳｔｕｄ，２００９，６（４）－：２６０２７０．Ｂｍ－２２民ｅｚａｎｉａＡｉｎＪＥＡｒｏｒａＰｅｔａｌ．民ｅｖｅｒｓａｌｏｆｄｉａｂｅｋｓｉｔｈｉｎｓｕｌｉｎ［］，，，：ｗｉｌｄｒｉｖｅｄｉｎｖｉｔｒｏｆｍｈｕｍａｎＩｕｒｉｏｔ；ｅｎｔｓｌｒｏｄｕｃｃｅ；ｅｍｃｅｌｌｓ．ＮａｔｐｎｇｌｓｅｒｏｐｐＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１４，，ｔｔｆ－２３ＳａｉｔｏＨＴａｋｅｕｃｈｉＭＣｈｉｄａＫｅａｌ．Ｇｅｎｅｒａｉｏｉｉｏｌｕｃｏｓｅｒｅｓｏｎｓｉｖｅ［］，，，ｇｐ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｌｅｔｓｗｉｔｈａｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓ吐ｕｃｔｕｒｅｆｒｏｍｍｏｕｓｅｆｅｌ；ａｌｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｓａｉＫＵＰＳｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１１６（１２）：ｅ２８２０乂，，２４ＳｃｈｉｅｓｓｅｒＪＶＷｅｌｌｓＪＭ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｅｔａｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｌｕｒｉｏｔｅｎｔ［］，ｐｐｓ－１；ｅｍｃｅｌｌｓ：ａｒｅｗｅｔｈｅｒｅｅｔ？ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ２０１４１３１１（１２４１３７）．ｙ，，［２５］ＳｃｌｉｕｌｄｉｎｅｒＭ，ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙＮ．Ｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏ打ｉｃｓｌ；ｅｍｃｅｌｌｔｍｏ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｉａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｌ２００３３６５（４４６４６１．ｙ，，２６ＳｃｈｕｌｄｉｎｅｒＭＥｉｅｓ民ＥｄｅｎＡｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｒｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ［］，ｇ，，ｈｕｍａｎｅｍｂｒｏｎ－ｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｂｒａｉｎ民ｅｓ２００１１３（２）：２０１２０５．ｙ，声２７ＳｉＹＺｈａｏＹＨａｏＨｅｔａｌ．Ｉ打ｆｕｓｉｏ打ｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ［］，，，ｈｅｒｌｙｃｅｍｉａｉｎｔｙｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｒｏｌｅｉｎｙｐｇｐ１－ｉｍｒｏｖｉｎｉｎｓｕｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２０１２６（６）：１６１６１６２５．ｇｙ，，ｐ［２８］ＳｏｒｄｉＶ，ＭａｌｏｓｉｏＭＬ，ＭａｒｃｈｅｓｉＦ，ｅｔａｌ．ＢｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓａｒｅｓｔｒｉｃｋｄｓｅｔｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙａｃｔｉｖｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｘＤｒｓ６７ 体外诱导晉髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的初步探巧２０。届硕±学位论文ｃａｐａｂｌｅｏｆｐｒｏｍｏｔｉｎｇｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０６－－（２）．４１９４２７．２９ＳｏｒｄｉＶＭｅｌｚｉＲＭｅｒｃａｌｌｉＡｅｔａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｃｅｌｌｓａｅａｒｉｎｉｎ［］，，，ｙｐｐｇ－ａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅａｒｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｃａａｃｉｔｐｐｙ－化ｉｍｒｏｖｅｔｒａｎｓｌａｎｔｅｄｉｓｌｅｔｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｄｌｓ２０１０８（１）：１４０１５１．ｐｐ，之３０ＴａｎＤＱＣａｏＬＺＢｕｒｋｈａｒｄｔＢＲｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［］ｇ，，，ｏｆ－ｉｎｓ山ｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｍｕｒｉｎｅｂｏｎｅｍａｒ－ｒｏｗ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ２００４５３（７）：１７２１１７３２．，，［３１］ＴａｎｇＤＱ，ＷａｎｇＱ，ＢｕｒｋｈａｒｄｔＢＲ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－－ｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｕｔｐｇ，－ｔｎａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｔｌｏｎｇｅｒｍｃｕｌｔｕｒｅｒｕｎｎｉｎｇｒｉｓｋｏｆｍａｌｉｇｉｏｎ．ＡｍＪＳｅｍＣｅ－ｌｌｓ２０１２ｌ（２）：１１４口７．，，３２ＵｒｂａｎＶＳＫｉｓｓＪＫｏｖａｃｓＪｅｔａＬＭｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｏｅｒａｔｅｗｉｔｈ［］，，，ｙｐｂｏｎｅ％（１－ｍａｒｒｏｗｃｅｌｌｓｉｎ化ｅｒａｏｆｄｉａｂｅｔｅｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００８）：２４４２５３．ｐｙ，，－３３ＷａｎＨＪｉａｎｉＡ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ［］ｇ，ｇＺ，Ｌｐｇｄｅｒ－－ｆｅｃｌｉｖｅｄｆｒｏｍＰＤＸ１ｔｒａｎｓｔｅｄｎｅｕｒａｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＭｅｄＲｅ２０１２６ｐ，，６－（）；１４２８１４３２．３４ＷａｎＴＴａｎＷＳｕｎＳｅｔａｌ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｉｎｆｉｉｓｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ［］ｇ，ｇ，，ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｍｒｏｖｅｓｍｏｃａｒｄｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｙｐｙ－ｍｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅｍｉａ．ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ２００７，３５（１１）：２５８７２５９３．ｙ，ｏｏｄｂｕｒＤＲｅｎｏｌｄｓＫＢｌａｃｋＩＳ．ＡｄｕｌｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｐｙＷｙ，ｙ，ｅｘｒｅｓｓｅｎｎｌｉｎｅｅｃｔｏｄｅｒｍａｌｅｎｄｏｄｅｒｍａｌａｎｄｍｅｓｏｄｅｒｍａｌｅｎｅｓｒｉｏｒｔｏｐｇ，，，ｇｐｎｅｕｒｏｅｎｅｓ－ｉｓ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ２００２６９（６）：９０８９１７．ｇ，，［３６］ＸｉｅＨ，ＷａｎｇＹ，ＺｈａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｉｎｊｕｒｅｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｘｔｒａｃｔｐｒｏｍｏｔｅｓ－ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｙ－ｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｃｉｎｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ＾０１３８（９）：ｅ７６０５６．ｐｇ，说 体外语导骨淀＇源间充质干细胞公化为廣岛样结巧的初步探巧２０。届硕±学位论文３７ＺｈａｎＹ，ＤｏｕＺ．Ｕｎｄｅｒａｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔｓｔａｔｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ［］ｇ，ｙｎｄｕｃｅｄ－ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｂｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｉｎｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｌｅｔｌｉｋｅｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓ化ｎｏｒｍａｌｉｚｅｈｅｒｌｃｅｍｉａｉｎｍｉｃｅ：ａｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ２０１４５ｙｐｇｙｙ，，（３）乂６．口８］李富荣，龙爱梅，齐焊，等．族岛干细胞转分化族岛样细胞与天然膜岛功２００８－能的比紋中国组织工程研究与临床康复１２（２５）：４８３３４８３６．，，［３９］李宏丹，穆长征．体外应用大鼠膜腺提取物诱导小鼠间充质干细胞分化－．．为膜岛素产生细胞解剖学报，２００９，４０（５）：７８９７９３［４０］刘雅娟，李秀东，陈强，等．骨髓间充质干细胞体外诱导分化为膜岛样细胞及其对坏死膜腺组织的修复．吉林大学学报（医学版），２００５，３１－（６）１８３６８３８．菩［＂］沈浩亮，王志伟，朱铭岩，等．体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向族岛－样细胞分化．中华膜腺病杂志：３９７４００．，２００８，０８（６）［４２］王志伟，钱海蠢，王勇，等．成人骨髓间充质干细胞体外分化为膜岛Ｐ细胞－的初步研究．苏州大学学报医学晰２００６０３）：３７８３８１．（，，■［４３］张立明，王人颠，万美荣，等．骨髓间充质干细胞体外诱导分化为膜岛样＊－细胞的降血糖作用★．中国组织工程研究２０１３３１）：５６９９５７０４．，，４４张立秋，孙洁，怀乔，等．间充质干细胞向膜岛样细胞诱导分化的研究进［］－展．医学综述２０１３１６）：２８９２２８９４．，，的 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结构的巧步探讨２０。届硕±学位论文致谢时光菩巧，研究生求学生涯即将结束，四年前我怀着对研究生生活的美好憧憬来到了广西医科大学，在基础医学院开始了我的求学之路。四年的求学生涯是一段让人难忘的回忆。紧张的学习和督促是指导我前进的一一动力、书本、实验室和我，文献起度过了漫长求学生涯，是段令人难忘的经历－一。回首往昔，这座绿城南宁给了我很多的记忆。又是年毕业季，即将离开时才发现自己是非常依恋医科大学的这片热止，留恋这里的一个角落花草树木，留恋这里的每。此时此刻，写下致谢，百感交集。一－岁月如歌，光阴似箭，感谢我的导师陈维平教授直Ｗ来对我的宽容和培养，当问题不能解答的时候，当方向看不到光明的时候，他的鼓励和督促是我继续向前的动力。从论文定题到写作定稿，倾注了陈老师大量的也血。在我攻读硕壬研究生期间，深深受益于陈老师的关屯、爱护和淳淳教导。他作为老师，点拨迷津，让人如沐春风；作为长辈，关怀备至，让人感念至深。能师从陈老师，我为自己感到庆幸。在此谨向陈老师表示我最诚擎的敬意和感谢！感谢组庇教研室各位老师给了我亲切的关怀和无私的帮助，谢谢你们！感谢师姐师兄的关必和鼓励，感谢李琴师姐、亚丽师姐、文猜师姐、吴卓师姐对我实验的指导和纠错，感谢师弟师妹对我的关也和帮助。感谢研究生同学给我的鼓励与支持，感谢宿舍舍友的陪伴和引导，感谢我的家一人直陪伴左右，感谢研究生期间给我的成长！吴丽情２０－－１５０５２１７０ 体外语导骨髓源间充质干细胞分化为膜岛样结巧的巧步探讨２０。届硕±学位论文攻读学位期间发表的学术论文１．吴卓，赵文猜，李琴，吴丽情，陈维平．骨髓源性间充质干细胞Ｈ维－微环境复合培养体系的构建［Ｊ］．广西医科大学学报，２０１２１６（１０）：１７２９，１７３２２．吴丽情，寇亚丽，赵文猜，吴卓，徐亦辰，李琴，陈维平．体外定向诱导膜腺干细胞分化为膜岛样结构．待发表。攻读硕±学位期间参加的学术会议２０１４年８月参加第四届全国基础医学实验教学研讨会。７１
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