宁波地区汉族人群冠心病候选基因变异及其临床的关联性

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宁波地区汉族人群冠心病候选基因变异及其临床的关联性【摘要】目的:探讨CETPTaq1B，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ基因变异对宁波地区汉族人群血脂代谢及冠心病临床表型的影响.方法:入选宁波地区行冠状动脉造影（CAG）检查的汉族人群186例，男性75.1%,平均年龄(61±10)岁.其中冠心病组111例，对照组75例.采用苯酚氯仿异丙醇抽提外周血白细胞全基因组DNA，通过聚合酶链式反应（PCR）及限制性片段长度多态性（RFLP）结合测序方法确定候选基因ABCA1G596A单核苷酸多态性（SNPs）.结果:宁波地区汉族人群CETPTaq1B基因型B1B1，B1B2及B2B2分布频率依次为0.39，0.49及0.11；LPLHindⅢ基因型H+H+，H+H-及H-H-频率分别为0.58，0.39及0.03；LPLPvuⅡ基因型P+P+，P+P-及P-P-频率分别为0.38，0.55及0.07.宁波地区CETPTaq1B变异升高HDL水平（P=0.01），同时对TG亦有降低趋势（P=0.06）；LPLHindⅢ及PvuⅡ对HDLC均无显著影响，而LPLHindⅢ及PvuⅡ基因变异均显著降低血浆TG水平（P=0.001，P=0.04）；3种SNP对血浆总胆固醇及LDL均无显著影响.冠心病与对照组之间上述3种变异基因型频率分布均无显著性差异（P>0.05）.结论:冠心病候选基因CETPTaq1B，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ变异对血脂代谢产生一定的影响，但与冠心病临床表型之间缺乏显著性关联.【关键词】13 冠状动脉疾病；多态性，单核苷酸；脂类；胆固醇酯转运蛋白；脂蛋白脂酶【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofvarcationofCETPTaq1B,LPLHindⅢandLPLPvuⅡgenesonplasmalipidmetabolismandclinicalfeaturesofcoronaryarterydiseaseinNingboHanpopulation.METHODS:Totally186patientsundertakingcoronaryangiographywererecruitedfromNingbodistrict,including111patientswithcoronaryarterydisease(CAD)and75controls.Malesubjectsaccountedfor75.1%andaged（61±10）years.TheDNAwasextractedfromperipheralwhitebloodcellsbyproteinaseKdigestion,phenolandchloroformextractionaswellasisopropanolprecipitation.Thesinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)ofcholesterolestertransferprotein(CETP)Taq1B,LipoproteinLipase(LPL)HindⅢandLPLPvuⅡweregenotypedbyPCRRFLP,andverifiedbygenesequencing.RESULTS:GenotypefrequenciesofCETPTaq1B,LPLHindⅢandLPLPvuⅡvariantswere0.39，0.49and0.11forB1B1,B1B2andB2B2,0.58,0.39and0.03forH+H+,H+H-andH-H-,0.38,0.55and0.07forP+P+,P+P-andP-P-,respectively.HDLClevelwassiginificantlyhigherinCETPB1B1carriersthaninB2B2carriers(P=0.01),whileTGlevelhadatrendofdecrease(P=0.06).SNPsofLPLHindⅢandLPLPvuⅡpredictedplasma13 TGlevel(P=0.001andP=0.04).ThreeSNPswerenotsignificantlyassociatedwiththeplasmatotalcholesterolandLDLClevels.However,CETPTaq1B,LPLHindⅢandLPLPvuⅡvariantswerenotpredictiveofthepresenceofcoronaryangiographicdefinedcoronaryarterydiseaseinNingbodistrictHanpopulation(P>0.05).CONCLUSION:CETPTaq1B,LPLHindⅢandLPLPvuⅡvariantexerteffectsonplasmaHDLCandTGlevelsratherthanangiographiccoronaryarterydisease.　　【Keywords】coronarydisease；polymorphism,singlenucleotide;lipids;cholesterolestertransferprotein;lipoproteinlipase　　0引言　　动脉粥样硬化和冠心病的防治仍是一个世界性医学难题.“心血管病危险因素”的确立堪称为冠心病防治史上的一个里程碑，然而近半数的冠心病患者并不具备已知的这些危险因素［1］.高密度脂蛋白（HDL）异常降低被认为是冠心病发病的独立危险因素［2］.研究认为，胆固醇酯转运蛋白（cholesterylestertransferprotein，CETP）及脂蛋白脂酶（lipoprotein13 lipase，LPL）基因在HDL代谢及胆固醇逆向转运过程中发挥重要作用［3］，因此，本研究探讨单核苷酸多态性（SNPs）CETPTaq1B，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ等与宁波地区汉族人群冠心病中间表型（血脂代谢）及临床表型的关联性.　　1对象和方法　　1.1对象选择200301/2005/07在宁波市第一医院接受冠状动脉造影检查者186例，均为宁波市永久居住汉族人群.冠心病及对照病例分别定义为至少一支冠状动脉主支狭窄程度≥50％，或主支血管狭窄程度均<10％.入选者次日晨采取空腹静脉血作血脂测定.血脂测定包括总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（LDLC），高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）及甘油三酯（TG）均采用标化酶法.研究对象临床资料包括冠心病传统危险因素通过WindowsAccess软件录入.所有入选者均签写知情同意书.排除标准：有2wk内服用调脂药者，具有已知脑卒中及周围血管病但冠状动脉造影（CAG）正常者.　　1.2方法　　1.2.1DNA提取在接受CAG检查的同时采取外周静脉血20mL，置于酸性柠檬酸（ACD）抗凝试管，离心分离血浆与血细胞，于-80℃冰箱分装贮存.采用蛋白酶K消化、苯酚氯仿抽提以及异丙醇沉淀的方法提取外周血白细胞全基因组DNA［4］.13 紫外分光光度计定性及定量检测DNA.DNA标本分储存液（200mg/L）及工作液（15mg/L），分别保存在-80℃及4℃条件.　　1.2.2SNPs基因型检测CETPTaq1B,LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ基因型的检测分别采用聚合酶链式反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLPs）以及测序等方法［5］.　　统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计分析.计量资料（血脂水平）用x±s表示，计数资料（等位基因及基因型频率）用百分比表示.组间分析采用用χ2检验或单因素方差分析（onewayANOVA）.基线变量（包括传统危险因素及SNPs）对血脂的影响采用多因素回归分析。双侧P≤0.05为差异具有显著性.　　2结果　　2.1RFLPs电泳图及测序CETPTaq1B基因型有B1B1（669bp和744bp）,B1B2（669bp,744bp和1413bp）及B2B2（1413bp）；LPLHindⅢ基因型有H+/+（115bp和586bp），+/-（115bp，586bp和701bp）及-/-（701bp）；LPLPvuⅡ基因型有P+/+（110bp和321bp），+/-（110bp，321bp和431bp）及-/-（431bp）.RFLP产物经测序证实单核苷酸多态性（SNP），基因变异依次为CETPTaq1B（G→A），LPLHindⅢ（T→G）及LPLPvuⅡ（C→13 T）单核苷酸替换（图1）.　　2.2基线特征本研究入选宁波汉族人群186例，其中冠心病111例，对照组75例.心血管病传统危险因素包括年龄、性别、吸烟、高血压病、糖尿病及血脂异常等在病例与对照组之间分布存在显著性差异（表1）.　　2.3基因频率及HardyWeinberg平衡检验宁波地区汉族人群CETPTaq1B基因型B1B1,B1B2及B2B2频率分别为0.39,0.49及0.11；LPLHindⅢ基因型H+/+，H+/-及H-/-频率分别为0.58，0.39及0.03；LPLPvuⅡ基因型P+/+，P+/-及P-/-频率分别为0.38，0.55及0.07.根据HardyWeinberg平衡吻合度检验，提示本研究人群符合随机抽样，样本具有良好的代表性.　　2.4SNPs与血脂的关系CETPTaq1B等位基因B2携带者血浆HDLC水平显著高于B1携带者（P=0.01）；LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ基因变异与HDLC水平无显著相关性（P>0.05）.LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ不同基因型携带者之间血浆TG水平有显著性差异（P<0.05），CETP基因变异具有降低血浆TG趋势，但未达到统计学显著性（P=0.06，表2）.CETPTaqIB，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ等SNPs与TC及LDLC水平无显著相关性.13 HDL影响因素多元逻辑回归分析，自变量包括年龄、性别、吸烟、高血压病、糖尿病及SNPs等为血浆HDLC水平独立影响因素.　　2.5ABCA1G586A与冠心病发病的关系在冠心病及对照组人群中CETPTaqIB，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ基因型分布均无显著性差异（P>0.05，表3）.通过对性别因素进行分层分析，结果仍提示在冠心病及对照组之间上述SNPs基因型频率及等位基因频率均无显著性差异.　　A1,B1,C1:RFLPs琼脂糖电泳结果；A2，B2，C2：测序结果.　　图1各基因限制性片段长度多态性及测序分析结果（略）　　表1研究对象基线特征（略）　　bP<0.01vs对照；TC：总胆固醇；HDLC：高密度脂蛋白胆固醇；LDLC：低密度脂蛋白胆固醇；TG：三酰甘油.　　表2SNPs与血浆HDL及TG的影响（略）　　表3SNPs与冠心病发病的关系（略）13 　　3讨论　　HDL代谢异常作为冠心病发生和发展过程中重要的生物学环节（即中间表型），逐渐成为近年来冠心病防治的一个热点和靶点.研究认为，普通人群中血浆HDLC浓度变异的70%决定于遗传因素［3］,其中CETP及LPL基因在胆固醇逆向转运及HDL代谢过程中发挥关键作用.　　本研究显示，CETPTaq1B变异显著升高血浆HDLC水平，这与欧美［5］及国内人群［6］部分研究资料一致.Ordovas等［5］通过对美国FraminghamOffspringStudy的2916例个体研究发现，Taq1BRFLPB2等位基因携带者血浆CETP活性明显降低（P<0.05），而且B1B1,B1B2及B2B23种基因型携带者血浆HDLC水平依次升高（P<0.001）.关于CETPTaq1B基因变异与冠心病之间的相关性一直存在争论,在不同人群与不同研究中其结果不尽一致.研究发现,CETPTaq1B变异基因型频率存在明显的性别差异［14］,因此本研究通过对性别因素进行分层后仍然未发现CETPTaq1B变异与冠心病之间显著的相关性.　　CETPTaq1BRFLP发生在基因内含子区域,因而不会直接改变表达产物的结构与功能.Kuivenhoven等［8］认为Taq1B作为某一功能性变异位点或单倍体(如Taq1BMsp113 Rsal连锁)的标记物（marker），从而影响血浆HDL代谢.他们发现Msp1RFLP等位基因M1携带者HDLC亦显著降低，然而Taq1B与Msp1均不能引起CETP结构与功能的改变.但RsalRFLP却能引起CETP氨基酸序列发生改变（Lle405→Val）.因此CETPTaq1B基因多态性对血脂代谢以及冠心病易感性的影响可能是通过连锁不平衡及单倍体原理发挥作用，不同种族人群之间基因连锁方式、基因与环境之间的相互作用亦可能不尽相同，因而在不同种族或不同研究中结果存在一定差异.　　LPL在脂肪细胞、骨骼肌以及心肌细胞等部位合成以后，通过与硫酸乙酰肝素蛋白多糖分子结合而转位于血管内皮细胞表面.其主要生理功能是水解富含甘油三酯脂蛋白（乳糜微粒及VLDL）中的甘油三酯［9］，TG水解所产生的磷脂以及载脂蛋白则作为HDL合成的原料.关于LPL基因HindⅢ及PvuⅡ与动脉粥样硬化疾病及血脂代谢相系的研究结果差异很大，部分研究甚至得出相反的结论，如Ahn等［10］研究提示LPLHindⅢ（+）携带者冠心病病变程度较及HindⅢ（-）携带者严重，然而亦有研究认为［11］HindⅢ（+）可使CHD病变程度减轻，而且这两项研究均未发现PvuⅡ多态性与冠心病的关系.相反，Wang等［12］研究却提示PvuⅡ（+）显著增加冠心病及糖尿病的发病危险，而且这种相关性不受血脂水平的影响，但该研究尚未发现HindⅢ多态性与冠心病的联系.因此，LPL基因多态性对冠心病临床表型的影响目前尚无统一的认识，可能是不同人群中基因的连锁方式不同所致［13-14］.13 　　本研究提示CETPTaq1B，LPLHindⅢ及LPLPvuⅡ变异对血浆HDL及甘油三酯水平具有一定的相关性，而这种相关性并未能预测冠心病临床表型的显著改变，因此有必要进一步通过增加样本量以及通过冠心病亚组分析来探讨基因变异对血脂的影响以及由此而产生的临床效应.【参考文献】　　［1］BraunwaldE.Shattucklecturecardiovascularmedicineattheturnofthemillennium:triumphs,concerns,andopportunities［J］.NEnglJMed.1997,337(19):1360-1369.　　［2］GordonDJ,ProbstfieldJL,GarrisonRJ,etal.Highdensitylipoproteincholesterolandcardiovasculardisease.FourprospectiveAmericanstudies［J］.Circulation,1989,79(1):8-15.　　［3］RaderDJ，CyrilleM.GenesinfluencingHDLmetabolism:Newperspectivesandimplicationsforatherosclerosisprevention［J］.MolMedToday,2000,6:170-175.13 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