延边黄牛犬新孢子虫ncsag1基因的克隆与序列分析

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1、《黑龙江畜牧兽医》科技版2010年1月(上)115延边黄牛犬新抱乎童NcSAG1基因的克灌与序列分忻贾立军，张守发，宋建臣(延边大学农学院动物医学系，吉林龙井133400)中图分类号：$852．723文献标识码：B文章编号：1004—7034(2010)O1一O115—03关键词：犬新孢子虫；NcSAGI基因；克隆；序列分析摘要：为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性，试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA，应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因，并将此基因克隆到pMD18一TSimple载体上，筛选获得重组质粒，然后转化到大肠杆

2、菌感受态细胞中，对PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的菌株进行测序，用DNASIS序列分析软件将目的基因与已发表的核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明：克隆的基因片段长度为681bp，编码226个氨基酸，与GenBank中发表的NcSAG1基因(AYl13004)核苷酸序列同源性为99．7％。新孢子虫病(neosporiasis)是由犬新孢子虫6．0软件设计了1对引物，并在上游引物的5端加人(Neosporacaninum)寄生于犬、牛、羊等多种宿主动物EcoRI酶切位点，在下游引物的5端加入SalI酶切细胞内而引起的一种原虫病，主要引起孕畜流产、死位点，引物由上

3、海英俊生物技术有限公司合成。引物胎以及新生儿的运动神经系统疾病。该病已在多个序列：上游引物P15一ACGAATYCACTGGTGGCGT—国家和地区爆发、流行，报道最多的是牛新孢子虫病。TCrITITI’GACT一3，下游引物P25一ACGTCGAC—有研究表明，犬新孢子虫的NcSAG1蛋白具有较强的CCATCCTFAGTGTCGGGTY一3。抗原性，NcSAG1(Nc—P36)在速殖子阶段表达，在黏1．4延边黄牛犬新孢子虫DNA的提取附和入侵宿主细胞中起着较大的作用，是犬新孢子虫取2g新鲜胎牛脑组织研磨成匀浆，吸出100IxL有效的疫苗候选抗原和诊断抗原。试

4、验提取了延边放人1．5mL离心管中，加入450L细胞裂解液黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA，对犬新孢[0．1mol／LTris—C1(pH值为8．0)、10％十二烷基子虫NcSAG1基因片段进行了克隆与序列分析，以期硫酸钠(SDS)、0．1mol／LNaCt、10mmol／LEDTA]，为深入研究犬新孢子虫NcSAG1基因功能奠定基础。同时加入10mg／mL蛋白酶Kl0L，混匀后55℃水1材料与方法浴2h；取消化液用等体积的酚一氯仿一异戊醇(按1．1虫株和病料体积比25：24：1配制)混合液抽提2次；取上清液加入犬新孢子虫Nc一1标准株DNA、刚地弓形虫R

5、H1／10体积的3mol／LNaAc及2倍体积的预冷无水乙标准株DNA，延边大学农学院预防兽医学实验室保醇过夜，4℃、15000r／min离心10rain；弃去上清液，存；流产胎牛，吉林省延边地区某牛场提供，无菌采集加入1mL70％乙醇，4cc、15000r／min离心5min；流产胎儿新鲜的脑组织作为病料。弃去上清液，室温空气中干燥或者真空干燥；加入1．2主要试剂30L的TE缓冲液[10mmol／LTris—C1(pH值为限制性内切酶EcoRI和SalI、TaqDNA聚合8．0)、1mmol／LEDTAI溶解DNA。酶、dNTP、pMD18一TSimple载

6、体、AgaroseGelDNA1．5目的基因片段的PCR扩增、纯化ExtractionKit、DNAMarker，均购自宝生物工程(大以提取的延边黄牛犬新孢子虫基因组DNA为模连)有限公司；其他常规试剂为国产分析纯。板进行PCR扩增，反应体系为25L。反应条件：1．3引物的设计与合成94℃预变性5min；94℃变性30S，59℃退火2min，根据GenBank中登录的犬新孢子虫NcSRS1基72c(=延伸1min，共3O个循环；72℃延伸10min。PCR产物经l0g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。用DNA因序列(AY113004)应用PrimerPremier5．0

7、和Oligo胶回收试剂盒回收PCR产物，一20℃保存，备用。1．6目的基因与克隆载体的连接、转化及鉴定收稿日期：2008—10—27；修回日期：2009—10—27基金项目：延边朝鲜族自治州科技发展计划项目(2008YB501将纯化的PCR产物与pMD18一TSimple载体于A15)16℃连接2h，按常规方法转化至感受态大肠杆菌作者简介：贾立军(1978一)，男，博±研究生．DH5c~中；在含Amp的LB培养板上选择10个白色HeilongjiangAnimalScience1l6andVeterinaryMedicine№12010单菌落，将其接种于含氨苄

8、西林(100g／mL)的LB液体培养基