重组人vegf165蛋白在毕赤酵母中高效表达和多克隆抗体

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1、重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备王晓1,2,黄晓平1,2,周宇1,2,刁勇收稿日期:通信作者:刁勇(1967年),男,教授,主要从事新药研发、基因药物研究.E-mail:diaoyong@hqu.edu.cn基金项目:国家自然基金(No.81271691),国际科技合作项目(No.2011DFG33320),福建省科技重大项目(No.2013N5007),华侨大学校级基金(No.11HZR19)资助。,2*(1:华侨大学分子药物研究院,福建泉州362021;2:华侨大学生物医学学院,福建泉州36202

2、1)摘要:VEGF在大多数肿瘤中表达上调,是肿瘤新生血管生成最重要的细胞因子,临床上VEGF的抗体可以抑制肿瘤的发展。为深入研究VEGF165的生物活性及VEGF165抗体在肿瘤治疗中的作用,本文构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115(his4)中,经MD平板筛选出阳性表达菌株并进行PCR验证。菌株发酵上清液经SephadexG-25,HeparinSepharoseFF和SephacrylS-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,分子量约为24KD。重组人VEGF165蛋白能够诱导HU

3、VEC细胞增殖、提高HUVEC细胞的活性。重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价达1:51200。重组人VEGF165蛋白的表达及多克隆抗体的成功制备为进一步探索VEGF165在肿瘤形成中的作用以及VEGF165抗体治疗肿瘤的作用奠定了基础。关键字:重组人VEGF165蛋白;多克隆抗体;毕赤酵母;中图分类号:文献标志码:AHighlevelexpressionofrecombinanthumanVascularEndothelialGrowthFactor165proteininPichia

4、pastorisandPreparationofVEGF165PolyclonalAntibodyWangXiao1,2,HuangXiao-ping1,2,ZhouYu1,2,DiaoYong1,2*(1:InstituteofMolecularMedicine,HuaqiaoUniversity,Quanzhou362021;2:SchoolofBiomedicalSciencesHuaqiaoUniversity,Quanzhou362021)Abstract:Asthesinglemostpotentangiogenesi

5、sfactor,VascularEndothelialGrowthFactor(VEGF)weredetectedup-regulatedexpressioninmosttumors,andantibodiesofwhichwereshowntosuppresstumordevelopmentclinically.InordertostudythebiologicalactivityofVEGF165andtheeffectofVEGF165antibodyinanti-tumortherapy,therecombinantsec

6、retoryvectorofpPIC9K-VEGF165wasconstructed,linearizedandthentransformedintoPichiapastorisstrainGS115(his4)byelectroporation.ThepositivetransformantswereseperatedbyMDplatescreeningandconfirmedbyPCRreaction.Subsequently,therhVEGF165proteinwasobtainedbypurificationfromth

7、esupernatantwithSephadexG-25、HeparinSepharoseFFandSephacrylS-100gelfiltrationchromatographwithmolecularweightof24kDandpurityof95%,showingbySDS-PAGE.Furthermore,therecombinantproteinwasfoundtohavehighpotencyofinducingHUVECcellproliferationandimprovingHUVECcellactivity.

8、ThepolyclonalantibodygeneratedfromrhVEGF165immunizedmouseexertsthetiterof1:51200byindirectELISAanalysis.Thesuccessfulexpress

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