重组人vegf165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆

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1、重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备王晓1,2，黄晓平1,2，周宇1,2，刁勇收稿日期：通信作者：刁勇（1967年），男，教授，主要从事新药研发、基因药物研究.E-mail:diaoyong@hqu.edu.cn基金项目：国家自然基金(No.81271691)，国际科技合作项目(No.2011DFG33320)，福建省科技重大项目(No.2013N5007)，华侨大学校级基金(No.11HZR19)资助。,2*（1：华侨大学分子药物研究院，福建泉州362021；2：华侨大学生物医学学院，福建泉州362021）摘要：VEGF在大多数肿瘤中表达上调,是肿

2、瘤新生血管生成最重要的细胞因子，临床上VEGF的抗体可以抑制肿瘤的发展。为深入研究VEGF165的生物活性及VEGF165抗体在肿瘤治疗中的作用，本文构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体，线性化后电击转化至GS115(his4)中，经MD平板筛选出阳性表达菌株并进行PCR验证。菌株发酵上清液经SephadexG-25，HeparinSepharoseFF和SephacrylS-100层析介质分离纯化，目的蛋白纯度达到95%，分子量约为24KD。重组人VEGF165蛋白能够诱导HUVEC细胞增殖、提高HUVEC细胞的活性。重组人VEGF165蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，

3、间接ELISA法检测抗体效价达1：51200。重组人VEGF165蛋白的表达及多克隆抗体的成功制备为进一步探索VEGF165在肿瘤形成中的作用以及VEGF165抗体治疗肿瘤的作用奠定了基础。关键字：重组人VEGF165蛋白；多克隆抗体；毕赤酵母；中图分类号：文献标志码：AHighlevelexpressionofrecombinanthumanVascularEndothelialGrowthFactor165proteininPichiapastorisandPreparationofVEGF165PolyclonalAntibodyWangXiao1,2，HuangXia

4、o-ping1,2，ZhouYu1,2,DiaoYong1,2*（1:InstituteofMolecularMedicine，HuaqiaoUniversity，Quanzhou362021；2:SchoolofBiomedicalSciencesHuaqiaoUniversity，Quanzhou362021）Abstract:Asthesinglemostpotentangiogenesisfactor,VascularEndothelialGrowthFactor(VEGF)weredetectedup-regulatedexpressioninmosttumors,

5、andantibodiesofwhichwereshowntosuppresstumordevelopmentclinically.InordertostudythebiologicalactivityofVEGF165andtheeffectofVEGF165antibodyinanti-tumortherapy,therecombinantsecretoryvectorofpPIC9K-VEGF165wasconstructed,linearizedandthentransformedintoPichiapastorisstrainGS115(his4)byelectro

6、poration.ThepositivetransformantswereseperatedbyMDplatescreeningandconfirmedbyPCRreaction.Subsequently,therhVEGF165proteinwasobtainedbypurificationfromthesupernatantwithSephadexG-25、HeparinSepharoseFFandSephacrylS-100gelfiltrationchromatographwithmolecularweightof24kDandpurityof95%,showingb

7、ySDS-PAGE.Furthermore,therecombinantproteinwasfoundtohavehighpotencyofinducingHUVECcellproliferationandimprovingHUVECcellactivity.ThepolyclonalantibodygeneratedfromrhVEGF165immunizedmouseexertsthetiterof1:51200byindirectELISAanalysis.Thesuccessfulexpress