皱皮木瓜总黄酮分离纯化及镇痛作用机制研究

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三峡大学硕t学位论文皱皮木瓜总黄酮分离纯化及镇痛作用机制研究姓名：孔劲松申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：杨兴海20080401 内容摘要R的研宄大孔吸附树脂分离纯化皱皮木瓜总黄酮（FlavonoidfromLagenariaChaenomels，FLC）的工艺；探讨FLC的镇痛作用及其镇痛机制。方法1.称取一定量皱皮木瓜粉末，用70%乙醇于70°C水浴槽回流浸提3次，每次1小时，过滤，合并滤液减压浓缩至无醇味，加适量蒸馏水，分别用乙酸乙脂、水饱和正丁醇萃取，减压浓缩分别得乙酸乙脂部分与正丁醇部分；将正丁醇部分溶于蒸馏水中制成澄清的溶液即为FLC溶液（样品液）；采用DM-301、DA-201、DS-40KD-101-I、D-1015种型号大孔吸附树脂对FLC进行吸附纯化，以FLC收率、纯度为考察指标综合评价，优选出最佳树脂；并对优选出的树脂进行洗脱溶媒和洗脱用量的探讨。2.利用纯化的FLC进行动物镇痛实验药效学观察：（1）小鼠热板模型法调节热板仪温度至55°C,以雌性小鼠接触热板至开始舔后足的潸伏期为基础痛阈指标；取雌性小鼠60只，体重18-22g，选择其基础痛阈在10秒至25秒之间，随机分为6组，腹腔注射给药（给药剂量根据前期研究基础而定），分别测得小鼠给药后捕阈值，进行统计分析；（2）小鼠扭体模型法取小鼠50只，体重18-22g,随机分为5组，腹腔注射0.6%冰醋酸0.2ml/只，观察注射醋酸后30min闪扭体反应次数作为致痛的指标，进行统计分析；（3）兔耳皮下1C渗透外周模型法在耳根部中央动脉顺血流方向用'针尖刺入后，立即注入0.5ml肝素进行局部抗凝处理并固定；将耳背部内、外两侧耳缘静脉近心端分别用7#注射针头沿静脉血流方向逆向刺入并引流至体外，用蛙心夹夹住静脉以阻断其回流。在耳尖部固定一直径约0.8cm金属圈，充以饱和氯化钾溶液棉球，作为刺激电极正极，在耳根部固定一相同金属圈，充以生理盐水棉球，作为参考电极，两电极连上BL-420E生物机能实验系统，逐步加大刺激电流，以引起家兔挣扎吋的最小刺激电流为痛阈指标；取家兔36只，体重1.5-2.0Kg,随机分6组，制成兔耳皮下1C渗透外周镇痛模型，分别测定记录给药前后痛阈，进行统计分析。（4）FLC对坐骨神经组织钙含量影响按文献制备蟾蜍坐骨神经标本并称重，随即将标本浸4°C的任氏液中lh,分别加入50mmol/LKCL和10-5mol/LNA,刺激钙通道开放，以增加钙离子内流，继续在4°C任氏液中保存lh后取出标本，用无钙任氏液冲洗2次，以冲去标本表而的钙离子，滤纸吸干，放入去离子水清洗的坩锅内待消化，FLC组则在未使用激动剂前将标本浸在不同浓度的FLC屮30min,再分别放入上述相同的激动剂屮，后续处理相同。所有标本分别加入混合酸（硝酸0.9,高氯酸0.1）1.0ml在电热板上徐徐加热，消化至无色，待高氯酸冒烟吋取下，加入2%HCL溶解，再加入500ppm镧盐，定溶后待测。采用HITACHIZ-2000型原子吸收分光光度计测定（测定波长42207nm，灯电流10mA,狭缝0.7nm）。实验结果换算成每克样品含冇多 少微克（PPM）钙。结果：1.5种大孔吸附树脂静态饱和吸附量以干树脂计分别为：70.80,79.72,66.24，63.12，56.16mgg-i（干树脂）；静态洗脱率分别为:85.76%,79.24%,73.57%,81.45%,71.01%；DM-301型树脂综合性能最好，以50%乙醇为洗脱剂得到的目标产物纯度最高。2.FLC的镇痛实验结果表明：FLC明显延长电热板致痛小鼠舔足潜伏期，其延长效应能被EGTA增强，而被CaCl:所拮抗，维拉帕米可部分翻转CaCh对FLC延长小鼠舔足潜伏期的拮抗;FLC明显降低小鼠扭体反应次数，表明对化学致痛模型也具镇痛作用，且镇痛作用与FLC剂量存在依赖关系；FLC对兔耳皮下K+渗透致痛模型可显著提高痛阈，其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCL所拮抗，表明FLC也冇很强的外周镇痛作用，且镇痛作用与钙桔抗有关。坐.骨祌经组织钙含量测定结果表明，5%,10%和20%FLC呈浓度依赖性抑制50mmol丄4K+诱导Ca2+含量增加，10%FLC抑制lO-smmol.L-iNE诱导的Ca＞含量增加。结论1.DM-301型大孔吸附树脂表现出较好的综合性能，可以用于纯化FLC;用30%和50%的乙醇作为洗脱剂较好。2.本研究表明FLC的镇痛作用及其镇痛机理可能与其钙拮抗，抑制神经组织和非神经组织钙通道，减少痛介质释放有关。关键词：FLC大孔吸附树脂分离纯化镇痛作用坐骨神经钙拮抗 AbstractObjective:ToestablishatechnicalprocessforthepurificationofflavonoidsfromChaenomelesSpecTOsa(sweet)NakaiprovidingpharmacologicalexperimentswithrefinedflavonoidsandtoevaluatetheanalgesicactionanditsmechanismsoftotalflavonoidsfromChaenomelslagenaria(FLC).especiallyobserveanalgesicactionofFLCandassociationwithCa2+..Methods:1.DriedmaterialofChaenomelesSpeciosa(sweet)Nakaiisextractedwith95%EtOHat60°C.Afterremovingthesolvent,theEtOHestractissuspendedoverwaterandextractedwithethylacetateandn-butanol,respectively,toobtainethylacetateextractandn-butanolextract,n-butanolextractcontainsmuchflavonoids;DM-301、DA-201、DS-401、D-101-I、D-101typesofmacrorcticularadsorbentswereusedtoseparateandpurifyflavonoids.Theadsorptionratioandtheelutionratiowerecompared.2.UsingFLCinanimal’testtoobserveanalgesticeffect:(l)Inhot-platetest，themousebegintolibitslegsoonafterithasbeenputonhot-platewhichtemptureissetto55°Cbecauseofhotstimulation.Thetimefromtouchinghot-platetolibbinglegsisregardedasthestandardofpainthresh；optionsixtyfemalemousse,weight18-22g，10seconds<30cm）。1.3实验方法与结果1.3.1FLC的制备称取一定量皱皮木瓜粉末，用70%乙醇于70°C水浴槽回流浸提3次，每次1小时，过滤，合并滤液减压浓缩至无醇味，加适量蒸馏水，分别用乙酸乙脂、水饱和正丁醇萃取，减压浓缩分别得乙酸乙脂部分与正丁醇部分；将正丁醇部分溶于蒸馏水中制成澄清的溶液即为FLC溶液（样品液）。1.3.2芦丁标准曲线的制备精密称取芦丁对照品16mg于25ml容量瓶中，加蒸馏水溶解定溶到刻度。标准吸取此标淮液0.0，2.0,3.0,4.0,5.0，6.0ml置于25ml容量瓶中，分别加一定量40%乙醇，摇匀，力口5%NaNO:溶液0.5ml,摇匀，放罝6min,加10%Al（NO、A2=60%、A尸80%因素2:温度：B：=40°C、B:=60°C、B3=80°C因素3:时间：C：=lh、C、=2h、Cs=3h精密量取样品液1.0ml置10ml容量瓶中，加10%氯化铝溶液5.0ml,再加水定容至刻度，在390nm处测定吸光值A,计算结果，如下表编123456789号样品中黄4.76%5.26%3.52%2.59%3.28%4.39%3.48%2.99%4.41%酮的含呈1.4讨论应用大孔吸附树脂分离纯化有效成分在屮药产品研宂和产业化生产等领域具有十分广阔的前景，与其他纯化方法相比较，在富集有效成分、减少杂质方面显示出其优越性。树脂的吸附能力由树脂孔径、比表面积、表面电性或形成氢键等综合性能决定，一般情况下，非极性吸附树脂适合从极性溶液吸附非极性物质，反之亦然［4］，DM-301,DA-201型树脂在约4〜5h即可达到饱和吸附，速度较快，吸附量较大；木实验中为同时考察树脂性能，故吸附时间统一采用8h。DM-301为中性极性树脂，DA-201为极性树脂，两者吸附量均较大，由此可推知皱皮木瓜黄酮含较多极性较强的成分，如黄酮苷等；DM-301树脂洗脱率为85.76%，表现出最佳综合性能，产业化领域中可选用该型树脂来分离纯化FLC。在洗脱溶媒实验中，FLC主耍集中在30%和50%乙醇洗脱液，占全部洗脱液中FLC质量的90.37%,而在10%乙醇洗脱液中仅含有少量FLC,高浓度（70%和95%乙醇）洗脱液中黄酮类物质含量甚微；50%乙醇洗脱液得到的FLC纯度较高，达到96.63%,而30%乙醇洗脱液中FLC含量远远多于50%乙醇洗脱液中FLC含量（分别为232.50mg和133.35mg）。综合熔媒用量考察结果，在工业生产屮纯化富集FLC可用30%和50%乙醇洗脱，而无需采用高浓度乙醇，且这两种浓度的溶媒用量分别可选择4BV和2〜3BV即可达到节省溶剂、提高效率和纯度的目的。而低浓度乙醇（约10%）洗脱时可 除杂，但也能洗下少量FLC物质，为节省溶剂，减少黄酮损失，低浓度乙醇用量不能太大，实验数据参考为4BV即可。 2FLC镇痛作用及其机制分析2.1实验材料与仪器2.1.1动物小鼠，体重18-22g,家兔，2-2.5Kg,购于华中科技大学实验动物中心（SCXK（鄂）2004—0007）。2.1.2药品顾痛定（Rotundine，Rot）:山西云鹏制药有限公司出品，批号：20060402；CaCL:武汉化工试剂有限公司：维拉帕米（Verapamil，Ver）:江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：0603007；硝苯地平（Nifedipine，Nif）:湖北华中药业有限公司出品，批号：20070122;FLC：三峡大学天然产物研宄与利用实验室提供，临用时配成和应浓度备用。2.1.3仪器与设备YLS-6A智能热板仪：山东省医学科学院设备站产品HITACHIZ-2000型原子吸收分光光度计：日立公司产品2.2实验方法与内容2.2.1小鼠热板法取雌性小鼠60只，体重18-22g，选择其基础痛阈在10秒至25秒之间，随机分为6组。腹腔注射给药，分组及用药剂量见表1。调节热板仪温度至55°C,以小鼠接触热板至开始舔后足的潜伏期为基础痛阈指标。分别测得小鼠给药后痛阈值，进行统计分析。2.2.2小鼠扭体法取小鼠50只，体重18-22g，随机分为5组，每组10只。分组见表2,各组小鼠给药40min后，腹腔注射0.6%冰醋酸0.2ml/只，观察注射醋酸后30min内扭体反应（后肢伸直，背部抬高，腹部凹陷）次数作为致痛的指标，进行统计分析。2.2.3FLC对家兔耳皮下K渗透外周致痛截型的影响罝家兔于兔盒中，在耳根部中央动脉顺血流方向用7。针头刺入后，立即注入0.5ml肝素进行局部抗凝处理并固定；将耳背部内、外两侧耳缘静脉近心端分别用7#注射针头沿静脉血流方向逆向刺入并引流至体外，用蛙心夹夹住静脉以阻断其回流。在耳尖部固定一金属圈，直径约0.8cm,充以饱和氯化钾溶液棉球，作为刺激电极正极，在耳根部阀定一相同金属圈，充以生理盐水棉球，作为参考电极，两电极连上BL-420E.生物机能实骑系统，逐步加大刺激电流，以引起家兔挣扎时的最小刺激电流为捕阈指标。分别测定记录给药前后痛阈，按以下公式，求出镇痛效应。镇痛效应=（给药后痛阈一给药前痛阈）/给药前痛阈xlOO% 同法测得给药前后对侧兔耳痛阈值的变化，以排除药物从侧枝循环回流至全身产生的全身镇痛效应。取家兔36只，体重1.5-2.0Kg,随机分6组，制成兔耳皮下1C渗透外周镇痛模型，分别测定记录给药前后痛阈，进行统计分析。见表3。2.2.4FLC对坐骨神经钙含量影响2.2.4.1蟾蜍坐骨神经标本的制备取蟾蜍用探针破坏脑和脊髓，骶髂关节水平以上2cm处剪断脊柱，去皮肤及内脏组织（注意勿伤及来骨组织），只保留腰部以下的脊柱及后肢，放入盛有任氐液的培养皿中。对用过的器械先用蒸馏水冲洗，再用任氏液擦洗，以免污染神经。用粗剪刀从耻骨联合处剪开，沿脊柱正中线将两后肢及脊柱分为两半，放入盛有任氏液的培养皿中备用。取一侧后肢并扭转小腿使腓肠肌朝上，用蛙钉固定在蛙板上沿脊柱向大腿的半膜肌与股二头肌之间的裂缝分离坐骨神经至膝关节，过关节后，继续向下沿腓肠肌之间的裂缝分离两侧胫腓神经直至膝关节。最后将神经轻轻提起，剪断周围结缔组织及神经小分支，分离的坐骨神经标本全长应大于5cm。2.2.4.2坐骨神经钙含量测定按上述方法制备蟾蜍坐骨神经标本。标本称重，随即将神经标本浸在4°C的任氏液屮lh，分别加入50mmol/LKCL和lO-smol/LNA,刺激钙通道开放，以增加钙离子内流，继续在4°C任氏液中保存lh后取出标本，用无钙任氏液冲洗2次，以冲去标本表面上的钙离子，滤纸吸干，放入去离子水清洗的坩锅内待消化。FLC组则在未使用激动剂前将标本浸在不同浓度的FLC中30min,再分别放入上述相同的激动剂中，后续处理相同。所有标木分别加入混合酸（硝酸0.9,高氯酸0.1）1.0ml在电热板上徐徐加热，消化至无色，待高氯酸冒烟时取下，加入2%HCL溶解，再加入500ppm镧盐，定溶后待测。采用HITACHIZ-2000型原子吸收分光光度计测定（测定波长42207nm,灯电流10mA,狭缝0.7nm）。实验结果换算成每克样品含有多少微克（PPM）钙。结果分别见表4、5、6和图7、8。2.3.统计学处理本文中数据均以均数士标准差h士s）表示，经SPSS10.0软件单因素方差分析（one-wayANOVA）处理。 2.4结果FLC对小鼠热板法致痛实验的影响 表1FLC对小鼠热板法致痛实验的影响（x±s,n=10）组别剂量.kg.；痛阈/s306090NS■13.7±5.8512.6土2.4614.9土5.820%FLC2.0g32.4±17.75，29.0±13.2123.8±17.0520%FLC+EGTA2.0g+5umol48.3±8.7947.8土8.8428.0土16.3220%FLC+CaCh2.0g+50umol14.56土3氣18.3土6.1117.5土6.36颅痛定182mg39.4±19.6.30.5±21.2733.6±19.4820%FLC+CaCL+verapamil2.0g+50umol+0.25mg28.10土5.3227.36土5.4525.64土6.55与NS相比，*p<0.05,与20%FLC相比邱<0.05实验结果表明，2.0g.kg-,FLC明显延长小鼠舔足潜伏期，其延讼效应能被EGTA增强，被CaCL所桔抗。FLC对小鼠扭体法致痛实验的影响表2FLC对小鼠扭体法致痛实验的影响'Cx土s，n=10)组别剂量g.kg.扭体次数NS对照组—63.5土12.515%FLC组0.542.7±7.15,10%FLC组1.028.6土14.95"20%FLC组2.022.30X8.98-颅痫定组0.0152.50士3.54**与NS相t匕，*<0.05，**<0.01结果表明，FLC明显降低小鼠扭体反应次数，表明对化学致痛模型也具镇痛作用，且镇痛作用与FLC剂量存在依赖关系。FLC对家兔耳皮下K滲透外周致痛模型的影响表3FLC对家兔耳皮下K+渗透外周致痛模型的影响_（x±s,n=6）组别剂量/kg镇痛效应（％）NS8%FLC8%FLC+CaCh8%FLC+EGTA顾痛定8%FLC+CaCLlverapamil0.008g0.008g+0.2mmol0.008g+40umol4.0mg0.008g+0.2minol+0.03mg3.43土1.8665.37±5.07*22.08土1.25**138.44士17.69***30.9617.08*40.01土5.15与NS相比，*p<0.（）5,与8%FLC相比**p<0.05,***<0.05FLC对兔耳皮下K+渗透致镇痛模型可显著提高痛阈，其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCh所拮抗。表明FLC也有很强的外周镇痛作用，且镇痛作用与钙离子有关。 FLC对坐骨神经钙含量的影响表4NA和高钾对蟾蜍坐骨神经钙含量的影响（x±s,n=8）组别弼含量（ppm）任氏液组112士8 461土32881150NA组高钾组与任氏液相比，*p<0.05,**p<0.01表5FLC和硝苯地平对高钾诱发蟾蜍坐骨神经钙含景的影响（'x±s,n=8）钙含iIfI省•118loooooSA42组别朽含暈（ppm）5%698士4010%460±35*20%180±26*硝苯地T(10mol.L)490土35*与高钾组比较，*p〈0.05表6FLC和硝苯地平对去甲肾上腺素诱发蟾蜍坐骨神经钙含量的影响（"x±s;组别钙含量NA461±32NA+10%FLC154±30*NA+Nif(1()mol.L)387土25与NA比较，*p<0.05OCOFig7.FLC和硝苯地平对去甲肾上腺素诱发蟾蜍坐骨神经钙含量的影响（x±s9n=8） •coc•2004SCO,6CO<20%FL10%FL50/OFL503301lohszifFig8.FLC和硝苯地平对尚钾诱发蟾蜍坐骨祌经钙含量的影响（x±s,n=8）2.5讨论2.5.1痛觉的形成一般认为，感受伤害性刺激的皮肤感受器在形态学上是“游离”或未分化的神经末梢，但在这些神经末梢屮有不同的功能分化，其屮有些是痛感受器（nociceptor）。痛感受器与真皮中的小血管和巨细胞毗邻，形成一个功能性的痛反应单位，对组织损伤敏感。痛反应单位往往通过启动炎症反应（如巨细胞脱颗粒）对伤害性刺激作出反座。炎症引起组织胺等化学介质进入局部组织，继而刺激神经纤维。虽然大部分痛觉由感觉性C纤维传导，但对温度和压力敏感的高阈值感受器常将冲动传A纤维。组织中含有大量的这样的小祌经纤维，小祌经纤维直到痛反应单位被炎症介质激活后才真正地发挥传导痛觉冲动的作用。冲动到达位于背根祌经节的细胞体并传给脊髓背角的二级传入神经，继而通过脊髓丘脑束到达对侧下丘脑。外周伤害性刺激冲动传入后，经过中枢各级水平的调整作用，痛觉被感知［6］。对局部组织的物理、化学及免疫刺激常常导致局部化学介质的积聚。细胞膜受伤害性因子的影响致使膜结合酶（尤其是磷脂酶A2）被激活，从而使膜磷脂释放花生四稀酸。花生四烯酸是酶级联反应的起源，产生了前列腺素、血栓素和白细胞三烯;组织损伤还可使激肽原产生缓激肽，它也是一种强有力的疼痛和炎症介质;巨细胞脱颗粒释放组胺等化学介质促使损伤组织的中性粒细胞和嗜酸粒细胞浸润。上述化学介质可引起组织毛细血管扩张和通透性増加以及组织肿胀。同时，肿胀液体的聚集又会产生机械压力刺激非特异性感觉神经元|61。 •4—ThakimusSpinotlialunicTr:ut/-•«««^iSpinalCj)rdToparietalconexSynapsewithseccnclaryneuronin(lunulhornJellhpilvindorsalrootganglion；Noci:撼kCapil?Mr>I«♦I參•-celkOorsalHontPrimuryartercniliberFromMuHugh,JeannetteHR.Pain:neuroanatoiriy,chemicalmediatorsandclinic;implications.AACNClinicalIssues:AdvancodPracticeinAcuteandCritical6dre,2000;11(2):168-178Fig9Organizationofpainsensation.图9痛觉的形成2.5.2疼痛动物模型的特点及FLC对疼痛动物模型的影响以动物为研宂对象可以进行疼痛学的前瞻性和棊础性研宂，为镇痛药的筛选和药理作用研究奠定了基础。通过正常动物疼痛模型诸如热板法、扭体法和甩尾法己开发出人批经典的镇痛药，近年来使用炎症性疼痛模型及神经性疼痛模型对药物镇痛作用的评价也己从大量临床资料中得到证实。镇痛药效实验筛选方法原理是对实验动物施加疼痛的刺激（亦称伤害性刺激）引起痛反应，观察药物对痛反应的影响，较客观地评价药效。由于各种模型施加的刺激不同，致痛的机制各异，因此每种模型都有其各自的特点。本课题采用了多种疼痛模型以研宄FLC的镇痛作用，并试图阐明其镇痛作用的特点。热板法早在50年前就用于疼痛和镇痛的研宄。多年的研宄表明，凡在临床上对急性疼痛显示良好效果的镇痛剂，在热板法实验中都可明显延长动物的反应时间。热板法对镇痛药有很强的特异性，镇定剂或肌松剂等其他影响运动功能的药物对动物痛反应潜伏时间并无作用。因此，热板法是一个较理想的筛选镇捕药的疼捕模型。由于小鼠的反应比大鼠典型，热板法所用的实验动物以小鼠居多。热板法对小鼠几乎不引起组织损伤，可以多次测量，因此可用于研宂镇痛药物的起效时间和时效关系。多项研宂表明，反复多次使用热板刺激，易使小鼠产生学习和记忆现象，即若小 鼠一旦不再舔足，面出现了跳跃反应，再次实验在很短时间内就会出现跳跃反应，从而使热板法失效。Hunskaar等发现，每天一次或每周一次会导致反应时间逐渐缩短，甚至在后来的几次屮将小鼠放在没有加热的热板仪上，小鼠也会很快出现舔足或跳跃［7］。在木实验过程中，也观察到个别小鼠因反复刺激在短时间内产生跳跃反应的现象，在结果分析吋对这些个体予以剔除。木研究用热板法分别测量了给药后30分钟、60分钟、90分钟小鼠痛反应潜伏时间的变化。实验结果表明，20%FLC组同NS对照组相比，明显延长小鼠舔足潜伏期，其延长效应能被EGTA增强，被CaCl2所桔抗，维拉帕米可部分翻转CaCh对FLC延长小鼠舔足潜伏期的拮抗。EGTA是Ca2十络合剂，能以配位键结合Cam使组织中Ca2-卜含量降低。EGTA与FLC合用产生协同效应可能与组织中Ca2l•含量降低有关；CaCb能提高组织中Can含量，CaCh与FLC合用时FLC的镇痛效座明显减弱。维拉帕米是经典的钙通道阻滞剂，与CaCk、FLC一起合用能部分抵消CaCh的致痛作用，此拮抗可能与维拉帕米阻滞钙通道，减少致痛介质释放有关。扭体法是将一定量的化学刺激物质注入小鼠腹腔内，刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积较长时间的炎性疼捕，致使小鼠出现扭体反应［8］。本实验使用小鼠扭体法，R在进一步证实FLC对化学刺激物质的镇痛作用。结果显示，5%FLC组同NS组相比，P〈0.01，有显著的差异性，说明5%FLC有较强的镇痛作用；10%FLC组同5%FLC组相比，P〈0.01，20%FLC组同10%FLC组相比，P〈0.01,有显著的差异性，提示三个剂量组均能较好的抑制小鼠扭体反应，剂量成倍增人，抑制小鼠扭体反应的效果增加显著，低、屮、高剂量组间呈现较好的量一效关系。扭体法实验说明FLC对化学致痛模型也有镇痛作用。兔耳皮下K渗透外周致痛模型是筛选镇痛药是否具有外周镇痛作用较好6勺云力物模型。小鼠热板模型、扭体法模型，FLC通过腹腔注射给药，FLC进入腹腔后吸收进入小鼠全身各组织，FLC镇痛作用部位不能具体确定为周围祌经系统或中枢祌经系统，只能说明FLC有全身镇痛作用。而兔耳皮下K+渗透外周致痛模型克服了这一缺陷，FLC通过耳动脉给药后只分布于耳局部组织，可排除中枢影响。在家兔实验中，同样能观察到FLC的镇痛作用，且镇痛作用能被EGTA增强，被CaCh所拮抗，维拉帕米可部分翻转CaCh对FLC提高家兔镇痛效应的拮抗，这些效应同小鼠热板法相同，也提示FLC的镇痛作用同Caw•有联系。Ca2+通道及其阻滞剂的研究近年来发展较快，其研究内容受到学者的广泛重视。在研究钙通道中，一般利用NA开启受体依赖性钙通道（ROC）和高匕幵启电压依赖性钙通道（PDC）。在FLC对坐骨神经钙含量影响实验中，FLC对NA和高K.诱发Ca:十含量增加均有显著的抑制作用。这提示FLC对神经细胞上的流阻滞作用与Nif 不完全相同，不仅对PDC有阻滞作用，对ROC也有阻滞作用，其钙内流阻滞较为完全。而Nif虽能阻滞Ca2十经PDC内流，但不影响Ca242ROC内流，胞内Ca2十水平仍然很高，这就可解释为什么FLC有镇痛作用而Nif单用几无镇痛作用。哺乳动物祌经系统存在多种电压依赖性鈣通道(voltage-dependentcalciumchannels，VDCCs)，根据不同的电生理性质与药理学特点，可分为T、L、N、P/Q、R型等。其中T型属于低电压激活的钙通道，L、N、P/Q、R型属于高电压激活的钙通道，目前均已克隆［9］。不同的VDCCs具有不同的生物学功能，近年来N型VDCCs因其在疼痛研究中的重要地位而备受关注。N型VDCCs在组织巾的分布不同于其他VDCCs亚型。N型VDCCs主耍分布于神经元，N型(neuronal)即因此命名。T、L、P/Q、R型VDCCs不仅分布于神经元，还分布于心肌、骨骼肌、血管平滑肌细胞，以及胰岛P细胞、肾上腺嗜铬细胞、腺垂体等内分泌细胞。N型VDCCs主要分布于神经元突触前末梢，也分布于树突及神经元胞体。神经元上VDCCs的主要作用是调控去极化诱导的Ca2.内流，是Ca2i|Aj流的主要途径之一。Ca，.内流可以触发细胞内Ca2J衣赖的一系列生理反应，包括神经元兴奋性的调节、神经递质释放、激活第二信使和基因转泶等⑽。N型VDCCs主要分布于突触末梢，其功能主要为触发神经递质释放。多种神经递质和神经调质参与疼痛的传递与调控，这些物质包括:谷氨酸(glutamate，Glu)、乙酰胆碱(ACh)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、丫-氨基丁酸(GABA)及P物质(substanceP，SP)、降钙素基因相关肽(cal-citoningene-relatedpeptide，CGRP)等，其中Glu和SP与疼痛关系最为密切|M|。Glu作用于突触后膜NMDA、AMPAs海人藻酸(kainicacid，KA)受体及代谢型谷氨酸受体(mGluR)，SP作用于突触后膜neuroki-nin-l(NKl)受体，通过开放偶联的阳离子通道，及G蛋白、蛋白激酶C(PKC)、一氧化ZM(NO)、Ct等参与的一系列胞内信号转导过程，介导痛觉通路的兴奋性突触传递，从而将外周伤害性信息传入高位中枢，产生痛觉。另外，在炎症性痛或神经病理性痛等慢性捕中，机体对伤害性刺激敏感性增强，表现为“痛觉过敏(hyperalgesia)”和“触诱发痛(allodynia)”，GluSP介导的上述生化过程也参与了慢性捕时中枢和外周敏化的形成位于疼痛传递及调控通路的N型VDCCs参与调控上述疼痛介质的释放，因而在疼痛的传递与调控屮具有重要作用。神经递质储藏于轴突末梢的囊泡屮，递质释放依赖于递质释放部位的胞内游离Ca＞水平。递质释放前，囊泡必须锚靠在Ca^+流入部位，即突触前N型VDCCs，以及少量的P/Q型VDCCs附近。位于突触前膜活动区的Syntax-in1A蛋白与SNAP-25蛋白能以一种Ca2-依赖的方式与N型VDCCs的alB亚基的II〜Ill区的连接肽链结合，并能与位于囊泡膜的synaptotagmin蛋白及synaptobrevin蛋白相互作用形成SNARE核心复合物，从而把囊泡选择性锚靠在N型VDCCs周围。接着，在N型VDCCs流入的Ca2+触发下，N- 乙藻马来酰亚胺敏感因子(N-ethyl-malcimidc-scnsitivcfactor，NSF)和可溶性NSF附着蛋白a-SNAP作用于synapto-brevin、Syntaxin1A和SNAP-25,使SNARE核心复合物解聚，同吋移走nSec-1等囊泡释放的负调控因子，导致囊泡与突触前膜融合，并通过胞吐作用释放递质。synaptotagmin相当于一个Ca2+传感器，能感受开放通道附近的微域内Ca＞浓度的变化，当Ca2+R流时加速融合和胞吐，在无Ca、4青况下阻碍融合。SP等祌经肽的释放过程不同于经典祌经递质的释放，但也必须在N型VDCCs等流入的Ca2-的触发下，激活•胞内弼释放弼通道(ryanodinereceptor)等一系列生化过程，最终以旁分泌方式介导SP等神经肽释放。N型VDCCs在疼痛的传递与调控中具有重要作用，背根节伤害感受性神经元上存在特异的N型DCCs亚型为疼痛治疗提供了一个非常有意义的新靶标。如果研制针对背根节伤害感受性神经元上特异的N型VDCCs亚型的特异性阻断剂，则可以避免现有的N型VDCCs阻断剂用于镇痛治疗时的各种副作用。目前己有一些研究单位和公司正在研制针对伤害感受性神经元上的特异性N型VDCCs亚型的阻断剂，甚至在努力寻找可以口服的小分子N型VDCCs调节剂，以克服现有N型VDCCs阻断剂用于疼痛治疗时的上述不足。近年来的研究资料表明Ca2+参与疼痛调控过程。钙离子是具冇多种生物学功能的离子，起着极为重要和广泛的生理作用。痛觉是一复杂的主、客观反应的综合感知活动，是由伤害性感受器兴奋并经A类及C类纤维将冲动传入中枢而产生的。伤害性感受器可为多种致痛物质所激活，如缓激肤、5—HT、H+、K+及组织胺等。在致痛物质诱发的痛祌经放电模型上，K+、组织胺及缓激肽可显著诱发传入动作电位，痛觉末梢伤害性感受器兴奋与否，与其细胞内Ca＞浓度有关，提高细胞内Ca2+浓度可降低伤害性感受器兴奋阈值，反之可提高其痛阈，钙载体A23U7注入大鼠后足可产生痛敏反应，而维拉帕米可对抗此痛敏作用，很难产生镇痛作用。电压门控Na+通道开放，大量Na+内流引起动作电位的去极化，并使膜内负电位减小，进而激活电压门控钙通道开放，Ca＞内流。当1C外流超过Ca2^流时细胞生复极化。疼痛信号通过AS-，C-纤维由外周传到中枢。钠离子、钾离子、钙离子通道在疼痛信号传递过程中起到重耍作用，因此是治疗疼痛的潜在药物靶标。钙离子是神经传异和神经递质释放中重耍的第二信使，是神经兴奋和突触传递的重耍连接。电压依从性餌通道(voltageoperatedchannels,VOCs)普遍存在丁•哺乳动物的许多细胞屮，是控制细胞外钙离子内流的主要途径，广泛参与细胞的生理过程，如递质和激素的释放、肌肉收缩、钙调蛋0依赖性蛋0激酶的调控等。根据VOCs电生理特性，神经系统VOCs可分为L、N、T、P型，新近又在神经组织内发现丫Q和R型钙通道。通过对小鼠急性炎症模型的研究揭示，N-型钙通道在继发性热痛觉过敏(secondarythermalhyperalgesia）的产生和维持中起重要作用，P-型纟丐通道只参与了热痛觉过 敏的产生机制，L-型钙通道则对其维持和产生均无作用。在外周，钙通道参与伤害性感受器的兴奋和神经冲动沿AS、C类纤维的传导，抑制钙内流可提高感受器兴奋阈值和降低祌经冲动的传导。小鼠甩尾实验中发现鞘内给L-型钙通道阻滞剂（地尔硫卓、维拉帕米）可产生脊髓水平对躯干和内脏伤害性刺激的抗伤害作用。虽然实验表明维拉帕米本身在热板模型上无明显镇痛作用，但可部分翻转CaCL对FLC镇痛的拮抗，提示钙离子对FLC的镇痛作用的拮抗可能与钙离子内流有关，钙通道有L、N、T三个亚型，维拉帕米虽可阻断经L型通道钙离子内流，但不能阻断N、T型通道的钙内流，结果神经细胞钙离子水平仍然较高，所以维拉帕米本身无明显的镇痛作用。文献报道神经组织中也存在钙通道，其调节着神经递质的释放、树突神经元的动作电位、行为及节律活动。神经末梢可能存在着多种捕介质的受体或作用位点，而这些受体或位点偶联着钙通道，当捕介质兴奋其相应受体或作用位点时，钙通道幵放，钙离子流入细胞内，当细胞内钙离子浓度增高时，兴奋了痛感受器，产生痛感受器电位，形成痛冲动传入中枢，而FLC可能与阻滞钙通道的多个亚型，影响钙离子内流，因而使痛感受器不能兴奋和通过阻滞钙离子内流，减少神经致痛介质的释放而产生镇痛作用有关。FLC镇痛作用确切机制有待于今后的进一步研宂证实。 3总结本课题在研究FLC镇痛作用时，采用了多个镇痛模型，证实了FLC确有镇痛作用。同时加用CaCL、EGTA和Ver，观察到其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCh所拮抗，维拉帕米可部分翻转CaCL对FLC镇痛作用的拮抗，提示FLC镇痛作用与Ca>有着联系。FLC能减少由于高钾或去甲肾上腺素诱发的钙含量增加，由此得出了FLC镇痛机理可能与其抑制祌经组织钙通道和非祌经组织钙通道，减少致痛介质释放有关。但由于这一结论建立在药物的协同和拮抗作用以及用原子吸收光谱测定组织钙含量的基础上，有很大臆测性。进一步研究证实这一结论还需要作深入的实验，从离子通道水平上揭示FLC镇痛作用机理。 4下一步的研宄计划及展望4.1研宄FLC对风湿性关节炎的治疗作用目前，在治疗类风湿关节炎的药物中，疾病调修药因调节免疫、改变病变进程而逐渐受到青睞，但其起效慢、镇痛作用弱的特点使其不易被患者接受;而起效快且作用较强的非逛体抗炎药长期使用易产生严重不良反应，且可加重病变。近年来，中药治疗类风湿关节炎并取得了积极的进展，开发标木兼治的治疗类风湿关节炎的中药有效部位己成为该领域的热点。虽然雷公藤多苷和青藤碱在临床上己显示了良好的镇痛效果，但这些药物的不良反应限制了其在临床上的使用，因而开发新的抗炎镇痛中药愈来愈显示出它的必要性。前期的研宄工作已经证实皱皮木瓜粗提物对实验性关节炎具有较好的治疗作用。4.2膜片钳实验，从离子通道水平上证实FLC镇痛作用机理4.3细胞信号转导水平的研宂 参考文献王洋，王跃生，闫寒.大孔吸附树脂对干草酸的吸附与解吸性能研宄.中W中药杂志.2006,31⑷:295-297向大雄，李焕德，朱叶超，等.大孔吸附树脂分离纯平葛根总黄酮的研宄.中W药学杂志.2003,38(1):35-38潘细贵，汪洋，雷湘，等.大孔吸附树脂纯化黄抵皂苷的提取工艺研宄.中W咲院药学杂志.2005,25(11):1029-1031刘健伟，陈勇，熊富良等.骨碎补总黄酮提取和大孔吸附树脂纯化的工艺研宄.中国药学杂志.2006,41(16):1222-1224陈志武等一种简便实用的外周镇痛模型[J].中国药理学通报.1990；6:394.MuHugh，JeannetteMR.Pain:neuroanatomy，chemicalmediatorsandClinicalimplications.AACNclinicalissues:advancedPracticeinacuteAndcriticalcare,2000:11(2):168—178.HunskaarHS,BergeOG，andHoleK.Amodifiedhot一PlatetestssensitiveTomildanalgesics.behaviorualBrainResearch,2001;21(2):101-108宋必卫，徐叔云，马传庚，耿皖平.镇痛药物实验法.见:徐叔云，卞如镰，陈修主编.药理实验方法学(第三版).北京:人民卫生出版社，2002:882-895.ErtelEA，CampbellKP，HarpoldMM，etal.Nomenclatureofvoltage-gatedcalciumchannels.Neuron,2000,25:533-535.MillerRJ.RockingandrollingwithCa2+channels.TrendsNeu-rosci，2001，24:445-449.JarvisES，ZamponiGW.InteractionsbetweenpresynapticCa2-channels，cytoplasmicmessengersandproteinsofthesynapticvesiclereleasecomplex.TrendsPharmacolSci，2001,22:519-525.AugustineG.Howdoescalciumtriggerneurotransmitterrelease?CurrOpinNeurobiol,2001,11:320-326.VanegasaH，SchaibleHG.Effectsofantagoniststohigh-thresholdcalciumchannelsuponspinalmechanismsofpain，hy-peralgesiaandallodynia.Pain,2000,85:9〜18.WoolfCJ，SalterMW.Neuronalplasticity:increasingthegaininpain.Science,2000， 288:1765-1768.JiRR，KohnoT，MooreKA，etal.CentralsensitizationandLTP:dopainandmemorysharesimilarmechanisms?TrendsNeurosci，2003,26:696-705.后记我衷心的感谢我的导师杨兴海教授，在论文即将完成之际，导师对我的悉心指导、关怀与信任。在启发我的科研思路、引导课题的设计、实验的指导以及最后论文的修改中都倾注了大量的心血，他渊博的知识、缜密的思维、开阔的心胸让我深深崇敬，并将使我受益终身。杨兴海教授在指导实际工作中体现出的严谨踏实的作风也让我体会到了很多的科学真谛和人生哲理。我十分感谢机能学部主任王志强教授、实验室主任李从德老师，为实验顺利完成、论文的撰写提供了一个良好的工作和学习环境；机能学部的实验室王尊琼老师、郑世玲老师、叶红老师也为我提供实验所需的药品、器材，化生学院的刘朝霞老师热情指导我分离纯化FLC,在这里，一并感谢！我也十分感谢那些为我的实验献言献策的同班同学们！ 附录:攻读硕士学位期间发表的主要学术论文《皱皮木瓜总黄酮对胃肠平滑肌的松弛作用及其机制分析》时珍国医国药’2007,18(9):2123《生物黄酮类化合物对心血管、消化系统及镇痛作用的研宄进展》时珍W医W药，2007，18(5):1242 文献综述：生物黄酮类化合物对心血管、消化系统及镇痛作用的研究进展近年来生物黄酮化合物的研究取得了很多可喜成果，尤其在心血管、消化系统以及镇痛作用方面。本文就近年来相关研宄及其临床应用进展综述如下。1心血管系统1.1沙苑子总黄酮沙苑子总黄酮是从豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子中分离而得，早在20世纪80年代尹钟洙等曾初步观察到静脉注射沙苑子水煎剂及其总黄酮可引起血压明显下降，李景新等m报道沙苑子总黄酮对肾血管性高血压大鼠（RHR）有明显降压作用，其机理可能与其降低血管紧张素（Ang）水平有关。吴捷等m认为沙苑子总黄酮能抑制心肌细胞钙离子内流。1.2沙棘总黄酮（TFH）沙棘在许多药理作用方面与银杏相近，而银杏（TFG）抗心脑缺血作用已在临床上广泛应用，王立群等⑷实验表明，TFH和TFG对离体大鼠工作心脏缺血后心功能及血流动力学各指标冇不同程度的改善作用，主要表现在能明显减轻缺血后LVPSP,+dp/dtmax下降，TFH作用明显优于TFG。黄酮具有抗氧化、消除自由基作用。吴英等m研允表明沙棘总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤时能明显减轻缺血再灌损伤区超微结构的病理改变，显著提高大鼠心肌组织SOD活性并减少MDA的生成。TFH对大鼠心肌缺血再灌损伤的保护作用可能与提高自由基清除酶活性及抑制脂质过氧化反应有关。1.3淫羊藿总黄酮许兰之等…研究了淫羊藿总黄酮（TFE）对肾上腺素能受体阻断作用，发现TFE选择性阻断离体及整体动物心肌pi受体，对气管P2受体和血管平滑肌a受体无阻断的作用，此研宂为临床应用淫羊藿治疗冠心病心绞痛提供了理论依据。1.4水杉总黄酮程虹等m报道用水杉总黄酮10mg/kgip可推迟乌头碱诱发的大鼠心律失常的出现时间，缩短持续时间;提高氯化钙诱发大鼠心律失常的阈剂量;增加哇巴因诱发豚鼠心律失常的用量;还能对抗心肌缺血复灌所致的人鼠心律失常，表明水杉总黄酮具有广泛的抗心律失常作用。水杉总黄酮能明显减少甲状腺素所致心脏肥厚大鼠心脏重量，缩短心肌纤维直径，减少心室蛋0质及RNA禽量，降低心室Na+-K+ATP酶及Na、-Ca2。ATP酶活性，表明水杉总黄酮对甲状腺素所致大鼠心脏肥厚具有抑制作用，提示水杉总黄酮逆转心衰致心肌肥厚有一定的意义［8］。2消化系统2.1黄芩茎叶总黄酮黄芩茎叶总黄酮可剂量依赖性地抑制肭盐的吸收（P<0.01），其与考来烯胺的抑制胆盐吸收的作用相比，没有显著性差异（P〉0.05）。提示抑制胆盐的吸收可能是黄芩茎叶总黄酮调血脂作用机理之一。黄芩茎叶总黄酮应用于降血脂和防治冠心病可能会优于考来烯胺。但黄芩茎叶总黄酮抑制胆盐吸收的同时，脂溶性维生素的吸收会不会受到抑制尚须进一步研宂m。我室近来研究表明皱皮木瓜提取物依剂量抑制冑肠运动;抑制回肠自发性收缩反应和非竞争性拮抗乙酰胆碱诱导胃底平滑肌收缩的量效曲线;同时能减弱Ca2+所致兔回肠收缩，木瓜提取物对胃肠平滑肌收缩的松弛与抗钙作用有关UCN。提示皱皮木瓜具冇解痉作用。3镇痛抗炎3.1银杏叶总黄酮在小鼠扭体模型上，皮下注射银杏叶总黄酮20〜80mg/kg，可显 著减少小鼠扭体数，并且呈剂量依赖关系;在小鼠热板模型上，皮K注射和侧脑室注射银杏叶总黄酮均可显著地延长小鼠舔足潜伏期，结果表明银杏叶总黄酮有明显镇痛作用，其镇痛作用可能有中枢机制的参与uu。1.1芦丁宋必卫等［12］对芦丁的镇痛作用研宂结果表明芦丁（6.25〜100mg/kg，ip）呈剂量依赖性的抑制小鼠扭体反应;芦丁（50〜100mg/kg,ip）明显提高小鼠嘶叫刺激阀值，显著延长小鼠热板舔足反应潜伏期，表明芦丁冇镇痛作用。其镇痛作用比阿斯匹林强，但比吗啡弱。1.2木瓜野木瓜系木通科野木瓜属植物，具有袪风止痛功能。野木瓜对髓鞘和轴突膜有亲和力，可引起髓鞘和轴突膜结构的变化，从而异致神经传异阻滞［13］。我室实验结果表明:资木瓜提取物对醋酸、温度所致小鼠疼痛有较好的镇痛作用，但对二中苯所致小鼠耳肿胀消肿作用很弱［14］。1.3荞麦叶总黄酮荞麦叶总黄酮（TFBL）能明显减轻肉芽肿的形成，降低毛细血管通透性和抑制耳肿，显示TFBL具有明显的镇痛抗炎作用叫。其机制可能与TFBL所含的主耍成分芦丁和槲皮素有关。据报道，槲皮素对12脂氧合酶的活性有很强的抑制作用，可影响花生四烯酸的代谢过程。芦丁、槲皮素镇痛机制还与钙离子桔抗有关。TFBL具有清除自由基，抗脂质过氧化作用，可能也参与抗炎作用，有待深入研究。荞麦叶资源丰富，其提取的TFBL几乎无毒，值得进一步开发利用。3.5黄蜀葵花总黄酮（TFA）黄蜀葵花总黄酮TFA（ig或ip）可不同程度地抑制小鼠扭体反应;TFA（140,280mg/kg,ig）可使福尔马林致小鼠疼痛的I、II相反应明显减轻,TFA（ip）对同侧ip福尔马林导致的疼痛可产生同样抑制作用，但对侧ip福尔马林致小鼠疼痛无明显影响;动脉注射TFA200mg/kg可明显减轻KC1诱发的家兔疼痛反应;连续用药可使TFA在小鼠跳跃实验中阳性率为0。以上研究结果表明TFA有一定的镇痛作用局部给药奋效，连续用药无成瘾性。TFA的镇痛机制可能既不同于阿片类药物，也不同于非留体抗炎药，是一个镇痛机制值得进一步探讨的新型镇痛药物。3.6蜂胶总黄酮（TFP）蜂胶总黄酮具有广泛的生物活性如镇痛作用等。注射TFP后能减少小鼠扭体次数。热板实验结果也表明TFP可延长小鼠舔足潸伏期，即延缓疼痛反应。甲醛致痛模型结果表明，注射TFP后在第一时相对小鼠疼痛反应无明显影响，但可显著降低第二时相的疼痛反应。说明TFP对炎症所致疼痛反应有明显镇痛作用。icvTFP低剂量（为ip给药剂量的1/20,即5mg/kg）时，即可延长温浴致小献缩尾反应潜伏期，提示TFP对小鼠具冇中枢性镇痛作用。已知NO在外周和中枢中以不同水平参与痛觉的调节。高剂量TFP在抑制小鼠热板反应时能降低小鼠脑组织NO的含量，提示TFP镇痛作用可能与抑制小鼠脑组织中NO的释放有关;男外，ipTFP在抑制小鼠热板反应同时，可降低脑组织、血清中MAD含量，捉示TFP的镇痛作用与抑制自由基及其过氧化物产生也有一定关系。PEGz是一种非常重要的疼痛介质之一，PEG的外周致痛作用早己明确。ipTFP可降低脑组织和血清中的PEGz含量，提示TFP的镇痛作用与抑制PEG合成也有一定关系。TFP在多种疼痛动物模型中均表现出明显的镇痛作用，并可能通过降低脑组织中NO，MAD，PEG含量和血中的MAD，PEG含量而发挥镇痛作用。至于其确切的镇痛机制还有待进一步的研宄1181。4其他金丝桃苷、芸香苷及槲皮素等有良好的镇痛作用［19］，其作用机制与Ca2+拮抗有关，尤其是Hyp不仅在多种全身镇痛模型上有作用，而且在兔隐神经放电，兔耳K+皮下渗透等局部致痛模型上更冇良好的局部镇痛作用m，其作用机制与吗啡和阿斯匹林 皆不同，系一新型的镇痛药。综上所述，生物总黄酮来源广泛，具有镇痛消炎等多种药理作用，有的甚至在临床上得到广泛应用,是一大类值得进一步研宄和幵发的药物。 参考文献：[1jYinZZ,ChenSH,MaBB.PharmacologicalstudiesoftotalFlavonoidfractionofAstragaluscomplanatus[J].R.Brown.PharmacolClinChinMaterMed,1988，4(4):26.[2]李景新，薛冰，陈连璧，等.沙苑子总黄酮对高血压大鼠的降压作用及血管紧张素含量的影响[J].中国药理学与毒理学杂志，2002,16(5):336.[3]吴捷，于晓江，马欣，等.沙苑子总黄酮对豚鼠心室乳头肌和培养大鼠心肌细胞电生理作用[门.中国药理学通报，1994,15(4):343.[4]王立群，郑金生.沙棘总黄酮(TFH)与银杏总黄酮(TFG)心血管药效学的对比研宂[J].中国煤炭工业医学杂志，2002,5(12):1205.[5]吴英，王秉文，王毅，等.沙棘总黄酮对大鼠心肌再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报，1997,13(1):53.[6]许兰之，陈维宁.淫羊蕾总黄酮对肾上腺素P1受体的特异性阻断作用U].中国药理学通报，1994,10(4):311.[7]程虹，刘惟莞，陈翔，等.水杉总黄酮抗实验性心律失常的作用[J].湖北医科大学学报，1999,20(1):28.[8]程虹，刘惟莞，屠治东，等.水杉总黄酮对甲状腺素所致大鼠心脏肥厚的抑制作用[J].中国药理学通报，2000,16(3):277.[9]周崇坦，冯军，刘朝晖，等.黄芩茎叶总黄酮对离体大鼠冋肠胆盐吸收的影响[J].陕西医学杂志，2003,32(12):1093.[10]杨兴海，柳蔚，钱京萍，等.资木瓜乙醇提取物对胃肠平滑肌的实验研究[J].四川中医,2004,22(3):116.[11]陈志武，方明，马传庚，等.银杏叶总黄酮的镇痛作用[J].安徽医科大学学报，1997,32(1):15.宋必卫，等.芦丁镇痛作用[J].安徽医科大学学报，1995;30(3):177.叶文博，张慧绮，金荣华，等.野木瓜皂甙对大鼠神经髓鞘和轴突膜的作用[J].神经解剖学杂志，2003,19(3):311.柳蔚，杨兴海，钱京萍，等.资木瓜乙醇提取物镇痛抗炎作用的实验研宄[J].四川中医，2004,22(8):6.王元福.甜荞麦叶总黄酮镇痛抗炎作用的实验研究[J].上海中医药杂志，2004,38(11):55.韩淑英，朱丽莎，刘淑梅，等.荞麦叶总黄酮调血脂及抗脂质过氧化作用[J].屮国煤炭工业医学杂志，2002,5(7):711.[n]范丽，董六一，陈志武，等.黄蜀葵花总黄酮镇痛作用研宄U].中药药理与临床，2003;19(1):12.张波，王东风，王爽，等.蜂胶总黄酮镇痛作用及其机制研宄U].中国药房，2005,16(19):1458.宋必卫，㈩薇，刘颖雪，等.槲皮素镇痛作用的研宄[J].安徽医科大学学报，1994,29:168.陈志武，王宏光，方明，等.一种简便实用的外周镇痛模型U].屮国药理学报，1990,6:394.