发色剂与发色助剂对肉类制品发色效果的.研究与应用

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上海海洋大学硕士学位论文IIlnleme锄wllile，Ⅱ1ecoloroflow．Ilitritecuredfoodisequalt0product、^rinloutuSiIlgpi掣nentontllemm【et．(2)Alli曲-pe疵nIlanceliquidchromat0鲫llic(唧LC)m砒od懈developedforⅡ坨simultaIleousdeteminationbiogeIlicaminesincuredmeatproducts．InthefieldofconcemrationleVelsf而m50t0500p∥g，绷IdtheaVeragerecoverieswere90．5％．96．7％，锄dtllerelatiVe删arddeviationswere4．5％．6．9％，respectively．Dallsylated锄inessho、Ⅳedgoodlinearresponsesinmeconcen仃ationmge50“g／mL一500¨g／mL．Thecorrelationcoe伍ciemsofIillearre铲essioncurvesforeachanalysisweremorethallO．998．Tllismemodisconvenient，r印id，sellsitive趾dreliable．Tlleconce曲眦ionofbiogemc锄inesi1110w-IlitritecuredmeatproduCtsislo、Ⅳermallmatisontllemarket．Futhemore，t11enationalstalldardwereappliedtodetectC肠鼬r砌“聊6D胁，砌堋2锄d＆印缈如卵Dc淞口z腭埘R哪P刀6口砌inthesamplesof10w．nitritecuredmeat．R．esultssho、ⅣedthattherewerenotwonosogeneticbacteriuIIlinⅡlesampleduring1．6montlls．(3)TlleSPME／GC—MSandsenso巧evaluationwere印pliedtos．叫ythenaVorofcuredmeatfood．Theoptimals锄pleprepara：tionconditionisthats锄pleswerea_bsorbedbySPMEwith75¨mCAR／PDMSfiberneedlein30minsat50℃，andth融SPMEwasthemlaldesorbedontheGC．MSinlOmins．ResultsofSPME／GC．MSshowtllat锄ongVolatilesofcurcdmeataremostalcohols，aldehydes，ketonesandcarbonyl，tllerelatiVeperce姆ofwhjchisover50％inalls锄ples．Moreover，aldehydesareefrectiveinfluencetothelevelofs锄plefksh，besidestonavorofs锄ples．HexanalisthemostrepresematiVe．Resultsofsenso巧evaluationshowtllatthereisnoobviouSflavordi能rencebetweensamplesoflow．nitritecuredmeatprodu默s锄dthatontl：伦market，wIlichissmiliartoresultsofSPME／GC．MS．甜linall，melow-11i仃itecuredmeatproductshaVebeendevelopedbyanalyzingmeinteracti伽0nc010re伍Ⅺtbe艄俄mcolorreagentandcolorauxilia巧reagent．ARerbeingtested，thisproductissimilar、析mproduCtsontllemarket．KIeyword：Ili仃ite；cⅥedmeatproducts；ma也ematicmodel；interaction；biog砸c锄ine；seIlso巧eValuation 上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。言箬茹舞膊上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使甩学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于，不保密留言薹一2及弛日期：≯睡驹埔P一／指导教师签每!≥三l舀嘴日期：3I，o睥r月×扫 上海海洋大学硕士学位论文引言发色剂，是指食品加工工艺中使肉及其制品呈现良好色泽的物质。从古代开始，我国就使用发色剂来腌制肉类，这一加工方法历史悠久，对肉制品的生产和发展起到了重要作用。硝酸盐和亚硝酸盐是鱼、肉制品加工业中常用的发色剂，硝酸盐可在亚硝酸菌的作用下还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下产生游离的亚硝酸，亚硝酸盐与肉中的肌红蛋白结合，生成稳定的红色化合物——亚硝基肌红蛋白，使肉品呈现鲜艳的红色，使肉品保持独特的色泽。除了发色作用外，还具有增强肉制品特殊风味的作用，尤其是对肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及绿色乳杆菌等有抑制其增殖和抑制其产毒作用[1】。同时，亚硝酸盐具有一定的毒性，其使用量因而受到了很大限制，国际上各方面都要求把亚硝酸盐添加量限制在保证护色的最低水平。国外曾发生过几起由于使用亚硝酸盐不当而发生肉类食品中毒的事故。Freund在1937年首次报道了两例在职业接触N一亚硝基二甲基胺(NDMA)中毒案例，病人表现为中毒性肝炎和腹水，给小鼠和狗喂以NDMA也出现了肝脏退化性坏死。由Barnes和Magee(1954和1956)所做的工作引起了人们对亚硝胺的注意，他们揭示了NDMA不仅是肝脏的剧毒物质，也是强致癌物质，可以引起肝脏肿瘤【2】。此外，由于亚硝酸盐特别是工业用亚硝酸盐价格便宜，易于获得，可以显著改善食品的感官性状。如肉质酥烂，亮红色泽颜色好看，增强风味和抑菌作用等，尤其是在肉类加工业、豆制品等产品中被大量滥用，直接危害了人民的身体健康。在我国重大亚硝酸盐食物中毒事件几乎每年都有发生，最近一段时间内全国各地又接连发生中毒事件，“亚硝酸盐中毒”一时成为媒体和消费者谈论的热门话题，而且还引起一些消费者的恐慌。因此对于食品中的亚硝酸盐，人们可以说是既爱又忧，现在用于减少和消除发色猪肉制品中亚硝酸盐的方法主要有以下两种：(1)使用发色助剂减少亚硝酸盐的用量；(2)使用其它发色剂完全替代亚硝酸盐。一、低亚硝酸盐发色猪肉制品的研究现状所谓低亚硝酸盐发色猪肉制品即是通过添加发色助剂，从而达到减少亚硝酸盐用量的目的，提高发色肉的食用安全，常使用以下几大类添加剂13J：(1)护色剂(乙基麦芽酚和柠檬酸铁)选用乙基麦芽酚或柠檬酸铁作为呈色剂，可达到长期护色的目的。乙基麦芽酚是采用淀粉发酵而制成的一种增香剂，柠檬酸铁是一种营养强化剂，对人体均 上海海洋大学硕士学位论文无害，两者混合后能起到良好的呈色效果，使产品呈现美丽的红色。(2)抗氧化剂(抗坏血酸，乙基麦芽酚等)抗坏血酸可以促进亚硝酸盐还原成NO，并与肌红蛋白反应产生粉红色，缩短原料肉的腌制时间，使产品发色均匀。这种作用不仅发生在加工时，在贮藏中亦如此。未反应的肌红蛋白和被反应的肌红蛋白仍能借抗坏血酸的还原性，完成显色过程。用120mg一550mg／kg的抗坏血酸钠或异抗坏血酸钠可以降低亚硝酸盐水平。(3)抑菌剂(次磷酸钠，山梨酸钾)使用次磷酸钠或山梨酸钾可以有效抑制肉毒梭菌的生长，在适当pH值或有盐存在的条件下，次磷酸钠的抑菌效果更好。但是这两种抑菌类添加剂不具有发色的效果，过多的减少亚硝酸盐的用量会影响到发色肉制品的色泽。二、肉制品中无硝腌制剂的研究现状}4J通过对肉制品腌制机理的研究发现，要想得到亚硝酸钠的替代品，必须具备的条件为：含有足够的还原性物质，阻止亚铁氧化为高铁；提供稳定性高的配位体；应用安全无毒，符合有关标准的添加剂。(1)一氧化氮(N0)腌制剂在发色制品色泽形成的过程中，有一重要步骤，即一氧化氮与肌红蛋白结合一氧化氮高铁肌红蛋白，因此，将肉制品直接浸渍在一氧化氮溶液中，并在其中加入发色助剂如抗坏血酸等，可得到发色效果良好的腌肉制品。(2)蛋黄粉末腌制剂蛋黄粉末中的硫化氢(H。S)具有和亚硝酸盐相似的功能，容易和肉制品中的肌红蛋白结合，产生固定色素的效果。但使用的蛋黄粉末要求是蛋黄的冻结干燥品或喷雾干燥品，这样的瞬间干燥品中含有硫化氢。(3)耐盐性乳酸菌腌制剂众所周知，乳酸菌对腌渍类、肉类等食品的保藏是有效的。因此，在新鲜肉类或热处理过的肉类或含有这些肉类的食品中添加耐盐性乳酸菌后，发现不仅可大幅度地提高其保藏性，并且发色良好。同时使用pH调节剂，既能使乳酸菌维持一定的活性，又可防止食品腐败引起pH下降。三、存在的问题与展望从以上的介绍可知，采用低亚硝酸盐或无硝腌制剂对肉制品进行腌制，腌制品的发色效果较好，具有一定的防腐作用，同时亚硝基化合物的残留量较低，所以可以避免亚硝胺化合物对人体的危害，但由于低亚硝酸盐或无硝腌制剂目前正处于研究状态，还没有大规模地运用于工业生产中，作为新的腌制方法，两种方法存在的主要问题为：一是低亚硝酸盐腌制剂需要进一步挑选搭配发色剂和发色2 上海海洋大学硕士学位论文助剂的种类，确定各个添加剂合适的添加量，要在保持较好色泽的条件下，有效地降低使发色猪肉制品中亚硝酸盐的残留量，传统的方法往往通过各人的经验不断调配发色剂与发色助剂的比例，本文旨在通过数理统计的方法科学客观地确定各个发色助剂在腌制过程中的作用，以及它们所需的添加量。二是无硝腌制剂研究往往侧重于选用一些有发色效果的试剂替代亚硝酸盐进行发色，从而彻底消除亚硝酸盐对发色制品的影响，忽视了亚硝酸盐还具有使发色制品产生特殊风味和抑菌的作用，尤其是和肉制品作用后能产生的独特风味，至今无法用任何香精所取代，无论耐盐乳酸菌，还是蛋黄粉末都无法使腌制肉产生出其原有的传统的风味，这就意味着这类无硝发色猪肉制品很难被消费者所接受，因此无硝腌制剂的研究可谓举步维艰。然而在不久的将来，经过研究者的努力，新型的低亚硝酸盐或无硝腌制剂定能以崭新的面貌出现，大大提高发色制品的安全性。四、本研究的目的和意义随着经济全球化进程日益加速，食品安全不仅事关消费者健康，而且影响国际食品和农产品贸易，成为国际社会关注的焦点问题之一。发色猪肉制品(红肠、香肠、盐水方腿等等)在我国具有悠久的历史，在传统加工方法中，长期以来一直采用硝酸盐类作为发色剂，使发色猪肉制品呈现出良好的色香味及防腐抑菌效果，而过量摄入亚硝酸盐，会在人体或动物体内形成肛亚硝基化合物如胪亚硝基二甲基胺(NDMA，又称二甲基亚硝胺)等致癌性很强的物质，其安全性问题令人担忧【5。J。由于无硝腌制剂不能保持发色制品原有的风味，所以本课题从研究低亚硝酸盐腌制剂的角度出发，旨在通过正交、交互实验等实验方法，运用数学模型研究发色助剂(如维生素C、维生素E、烟酰胺、葡萄糖、柠檬酸、茶多酚和乙基麦芽酚等)与发色剂的协同作用，选择出最佳发色剂与发色助剂配比，有效降低亚硝酸盐的用量和残留量的同时保证很好的发色效果，并建立多种生物胺的检测方法，检测低亚硝酸盐腌制剂对发色制品货架期的影响；此外还运用GC／MS方法分析研究发色制品主要挥发性风味成份，评价低亚硝酸盐发色肉制品的风味。希望能从这些方面来改善发色制品目前所存在的问题，对于大大提高其食用的安全性具有重大的现实意义。 上海海洋大学硕士学位论文第一章低亚硝酸盐发色肉制品复合发色配方的研究本节从研究低亚硝酸盐发色配方的角度出发，根据各种发色助剂种类的特性选择最佳的配比。在本实验中将采用正交、交互试验，并运用色差计(CIEL水a水b：l：表色系统)及紫外光栅分光光度计，对试样的色泽及亚硝酸盐残留量分别进行了测定分析。根据获得的试验数据建立数学模型，解析发色助剂之间的协同作用，优选出最佳的发色配方。此配方不仅能使发色制品的感观色泽良好，还要能有效降低了亚硝酸盐的使用量和残留量，提高了发色制品的安全性【8驯。1．1发色剂及发色助剂的筛选与协同效应的研究1．1．1材料与方法1．1．1．1原料爱森新鲜猪后腿瘦肉(购于易初莲花超市)1．1．1．2仪器双航牌SJ210A手持式家用食品搅碎器；ZE2000测色色差计(NIPPoNPENSHOKU公司)；UV一2000(unico公司)；电子分析天平(MettlerAE160)d=0．o0019；电子天平(Sartorius)d=0．019；不锈钢高压杀菌锅(上海申安医疗器械厂)；YB35／YB46真空包装机(SHINDAIGO公司)1．1．1．3试剂分析纯：乙酸，对氨基苯磺酸，浓盐酸，盐酸萘乙二胺，乙酸锌，亚铁氰化钾，四硼酸钠；食品添加剂级：亚硝酸钠，葡萄糖，乙基麦芽酚，抗坏血酸，柠檬酸，茶多酚，烟酰胺，维生素E；适量白胡椒粉，食用精制盐，淀粉，玉果粉1．1．1．4溶液饱和硼砂溶液：精确称取50．009四硼酸钠溶于1000mL热水中，冷却后备用；1．0m01／L乙酸锌溶液：精确称取220．009乙酸锌，加30mL乙酸后定容至1000mL；2096盐酸溶液：量取浓盐酸540．5m1用水定容至1000IllL；0．4m01／L亚铁氰化钾溶液：精确称取106．009的亚铁氰化钾定容至1000mL；4 上海海洋大学硕士学位论文0．2％盐酸萘乙二胺：精确称取2．oog的盐酸萘乙二胺定容至1000lllL；O．4％对氨基苯磺酸：精确称取4．oog的对氨基苯磺酸，用20％的盐酸溶液定容至1000mL：亚硝酸钠标准储备溶液：精确称取5．009亚硝酸钠(分析纯)，溶液于looOlIlL水中，备用：亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1．0mL，加水稀释定容至1000IIlL，其浓度为5ug／IIlL。1．1．1．5制作工艺肉糜(2009为一组)_放入不锈钢容器中_将4．009盐溶液和一定比例的发色剂、发色助剂与肉混匀(发色剂、发色助剂)_4℃腌制72h_调味斩(调味量如下：淀粉9．379、玉果粉0．08昏白胡椒粉0．249)_÷斩拌混匀好的肉高压杀菌(12l℃下杀菌1h)一迅速冷却一真空包装-÷待用。1．1．1．6色泽的测定使用ZE2000测色色差计测定制品颜色，每组测定3个平行样。使用CIEL枣a％幸表色系统进行分析，其中L幸称为明度指数，L幸=O表示黑色，L木=100表示白色，中间有100个等级；a毒、b木决定色调，也称为色度指标，a奎值越大，颜色就越接近红色(a宰=60)，a宰值越小就越接近绿色(a枣=．60)；b+值越大，颜色就越接近黄色(b幸=60)，b宰值越小，颜色就越接近蓝色(b宰=．60)【lo】。本试验主要观察成品的红色，因此主要的色泽指标是a木。1．1．1．7亚硝酸盐残留量的测定根据国标法使用盐酸萘乙二胺法【¨】定性、定量测定实验样品中的亚硝酸盐的含量。取亚硝酸钠标准使用液0．O、0．5、1．O、1．5、2．0、2．5、3．0mL，置于25mL比色管，分别加入2IIlL的0．4％对氨基苯磺酸，0．2％的盐酸萘乙二胺lmL后加水定容至25mL，混匀静置25min，于分光光度计546nm波长处测定。由表5得出线性回归方程为：y=0．6782x+0．0044(相关系数r2=0．9962，说明所确立的回归方程是有意义的)表卜1亚硝酸钠浓度与吸光度的关系Tab．1．1T．herelationbetweenthesOdiumnitriteconcentra“onandtheabsorbance实验样品取2．09于100mL的容量瓶中，加入饱和硼砂溶液5mL和50mL的热5 上海海洋大学硕士学位论文水，沸水浴加热15分钟；冷却后加入2mL0．4m01·L’1的亚铁氰化钾溶液，2mLl．0mol·L。1的乙酸锌溶液，加水定容至100mL，静置30分钟：过滤，取滤液20lIlL于比色管中。以下步骤同亚硝酸钠标准液测定，亚硝酸盐的残留量根据线性方程计算。1．1．1．8正交试验方案选用L49(78)正交表【12-131，亚硝酸盐残留量和色泽a幸值测定3次取平均值，因素和水平数如下表1．2所示：表卜2正交试验因素与水平T'ab．1—2FactorsandleVelsofonhogonaleXperiments注：上表中各因素的量都是以试验用2009原料计。1．1．1．9交互试验方案【14．15】表卜3试验因素与水平’I、ab．1—3FactorsandleVeloftheexperiment表卜4L16(215)正交表的交互作用表T．ab．1．4TheL16(215)onhogonal&interactionaltable表头设计ABA蟠CA屹B宰cDEA祀胁EC吨FGHl232l456767452389lOll1213141598lllO131215141101l891415121323为了进一步确认各发色助剂对发色效果影响的协同作用，安排16组追加试验。6bHB挖¨m98765432●H"屹Bmn89674523B他"M98nm5476，挖nH：289mn4567¨m98”MB屹32●●23456789mU屹BH：。 上海海洋大学硕士学位论文在追加试验中，其试验步骤同正交试验，亚硝酸盐残留量和色泽a宰值测定3次取平均值。(试验方案如表1-3、表1—4所示)1．1．2结果与讨论1．1．2．1正交试验因素的确定一般常用的食品发色剂有亚硝酸钠、硝酸钠和硝酸钾。本试验考虑到发色效果及购买方便等选用亚硝酸钠。在加工发色制品过程中添加亚硝酸盐，能在肉中乳酸的作用下生成亚硝酸。亚硝酸很不稳定，在室温下可分解为硝酸和亚硝基。亚硝基与肌红蛋白结合生成鲜红色的亚硝基肌红蛋白，使肉制品呈现良好的色泽。为了加强亚硝酸盐的护色效果，减少亚硝酸盐的添加量，防止生成强致癌物亚硝胺，要加入一些发色助剂，其中维生素C和维生素E可作为抗氧化剂可防止肌红蛋白的氧化，促进亚硝基肌红蛋白的生成，并对亚硝胺的生成有阻碍作用；烟酰胺易与肌红蛋白结合成稳定的烟酰胺肌红蛋白，难于被氧化，此外它还存在于能还原高铁肌红蛋白的酶中，防止肌红蛋白的氧化变色；柠檬酸作为金属离子螯合剂，也可防止肌红蛋白的氧化变色；而茶多酚、乙基麦芽酚作为酚类物质具有较强的抗氧化性；葡萄糖能对发色效果可能有一定的增效作用【16J引。所以本研究确定的发色助剂为：维生素C、烟酰胺、柠檬酸、茶多酚、维生素E、葡萄糖、乙基麦芽酚(其水平量根据GB276卜1996的规定添加)。其他的因素如温度(包括腌制温度和杀菌温度)、压力、盐分等都控制在同一水平上，保证试验的可比性和准确性。1．1．2．2发色助剂对发色肉制品色泽和亚硝酸盐残留量的影响(A)发色助剂对色泽的影响根据J下交试验的结果知(见表1．5)，在正交试验的49组结果中，其色泽指标a木大于基准试验(指在发色制品中亚硝酸钠最大添加量，即0．329／kg【2】，在2009肉中添加0．06409，试验结果：a水=12．03)有41组，占正交试验总数83．67％。在这4l组试验中，亚硝酸钠的添加量都比基准试验的添加量小的多，但是制品的色泽却比基准试验好。可见亚硝酸钠单独作为发色剂对发色效果的影响和作用不是很大，而在发色助剂的协同作用下不但可以大大减少亚硝酸钠的用量，还可以增加制品的色泽。分析极差R值(见图1．1)，在发色助剂中，维生素C和乙基麦芽酚的助色作用最为显著，是影响色泽的主要因素，相对地柠檬酸、茶多酚、维生素E和葡萄7 上海海洋大学硕士学位论文糖的显著性次之，为次要因素，而单独来看烟酰胺的显著性最低。图卜1发色助剂对发色效果的影响显著性比较Fig．1-1Comp撕ngofe毹ctedsignificancetothecolorresultofonhogonaleXpemlentsbydi毹rentf弛rs(B)发色助剂对亚硝酸盐残留量的影响对正交试验结果R值分析(见表1．5和图1．2)，得：各发色助剂对亚硝酸钠残留量的影响，维生素C、柠檬酸、茶多酚和维生素E的作用是最为显著的，是控制亚硝酸钠残留量的主要因素，而烟酰胺、葡萄糖和乙基麦芽酚的作用效果次之，为次要因素。50005000500050005000≯爹拶≯妒≯≯矿图卜2发色助剂对亚硝酸钠残留量的影响显著性比较F培1—2Comp撕ngofe虢cteds咖ificancetothenitritesresiduesresultofonh090naleXpe咖lentsbydif-ferentf．actors由于上述结果分析只是对各个发色助剂单独的作用进行分析，并没有对各个因素之间的协同作用进行考虑，其实在发色制品常存在发色助剂之间以及发色剂和发色助剂之间的协同作用因此，在后面章节将运用交互试验进一步对各因素之间的协同效应进行分析研究，从而筛选出最佳低亚硝酸盐发色配方。8 上海海洋大学硕士学位论文表卜5正交试验方案和结果1’ab．1-5TheprogramandresultsoftheonhogonaleXp嘶mentS注：z：代表亚硝酸盐残差量9 上海海洋大学硕士学位论文1．1．2．3数学模型的建立设：Iz=60+6l夏+岛恐+63而+毛_+熟鼍+％k+岛而+氏黾+乞酸，x。一亚硝酸钠，x，一茶多酚，‰一维生素E，x，一葡萄糖，x。一乙基麦牙酚，￡I，￡2一测量误差，‰，口l，口2，口3，吼，吩，‰，口7，魄，60，6l，b2，b3，b4，b5，b6，b7，％待j‘2口o+口l矗+口2勃+d尚+口4k+吩堍+‰‰+口7％+口暑％+气i_l～鹌贝ux=[·：·三。；!；：。]，Y=[耋三，]，p=[二了之。]，￡=[￡：：三三，：]：1f，11．252．44O．028O．3539．02—2．22．370．3397．45＼f彳’1’I6．36—15．15—0．77—2．3945．412．0225．58O．07121．43JIB7J10 上海海洋大学硕士学位论文指标(即z值)的平均偏差率为0．125，拟合性较好，因此认为此二元线性回归方程是有效的，可以用来评价发色剂及发色助剂对于发色制品红度和亚硝酸盐残留量的影响。从拟合性的角度来看，影响其因素主要有：a实验操作同步性精确性；b实验条件一致性；c是否发生附加的反应。z值的拟合性比r值稍差，这是因为选用发色剂和发色助剂的种类和量各不相同，在腌制和贮藏的过程中会发生一系列化学反应，产生一系列不同的胺类物质，直接导致亚硝酸盐的残留量也不胫相同。因此，该数学模型的建立不仅为我们预测和评价发色剂和发色助剂的效果提供了精确的理论依据，也为下阶段检测发色制品中的有害胺类物质提供了事实依据。表卜6理论值与实际值的比较T￡Lb．1-6ComparisonoftheoreticalandsubstantialValues平均偏差率：r、F均偏差率=O．030z、F均偏差率=0．119注：#一实验号；A—r实验值；B—r理论值；X—z实验值；Y—z理论值1．1．2．5交互试验各因素水平的确定根据先前正交试验的结果，在每个因素中，选取两个对试验结果影响最为显著的水平作为交互试验的水平数，以进一步分析各个发色助剂之间的协同作用， 上海海洋大学硕士学位论文最终选出最佳添加方案。亚硝酸盐(E)为食品发色剂，维生素C(A)、烟酰胺(B)、柠檬酸(C)、茶多酚(D)、维生素E(F)、葡萄糖(G)、乙基麦芽酚(H)为食品发色助剂。正交交互作用表的因素为A、B、C、D、E、E、F、G、H(8个)，现每个因数分别取2个水平。由先前试验分析知因素A与B之间可能存在交互作用A木B；因素A与C之间可能存在交互作用A幸C；因素A与E之间可能存在交互作用A宰E；因素B与C之间可能存在交互作用B幸C；因素B与E之间可能存在交互作用B宰E；因素C与E之间可能存在交互作用C·E。因此初步选择厶。(215)正交交互表，表头设计与厶。(215)正交交互表如上所示【12-151。1．1．2．6交互试验结果分析表卜7试验结果表1’ab．1-7Resultsoftheexperiment注：表中1、2对应各因素的水平值；z：代表亚硝酸盐残差量；极差A：色泽指标的极差值；极差B：亚硝酸盐残留量指标的极差值A发色剂与发色助剂协同作用对色泽的影响由表卜7知，第2号实验中，色泽值口枣(红度)=14．08，其中因素C(柠檬酸)的极差R。=0．9为最大，表明因素C对色泽的影响最大；其中因素E(亚硝酸盐)的极差R。=0．05为最小，但并不表明因素E对色泽没影响；原因是第10、11列交互作用B吨、C牦，的极差分别为0．57、O．542并不小，因素B(烟酰胺)、因素C分别与因素E存在交互作用。第6列交互作用B木C的极差为0．12很小，表明12 上海海洋大学硕士学位论文因素B与因素C的交互作用小。因素A(维生素C)的极差R。=0．11小，但第3、5、9列交互作用A裆、A，lcC、A木E的极差分别为0．18、O．19、0．16比A因素的极差大，表明因素A与B、C、E存在交互作用。第12列因素F的极差为0．08很小，表明因素F(维生素E)对色泽的影响很小。从方差分析表中看到，因素E(亚硝酸盐)的p值=0．1198最大，其次因素F(维生素E)的p值=0．0745，因素A(维生素C)的p值=O．059也大于0．05。说明因素E对色泽的影响不显著，但因A宰B，A宰C，A·E，B木E，C木E对色泽的影响显著，故不可忽略因素A、E，因素F对色泽的影响不显著。各因素的交互作用(见图卜3)按显著性，由高到底(即p值由小到大)排序为：烟酰胺枣亚硝酸钠>柠檬酸，．c亚硝酸钠>维生素C木柠檬酸>维生素C木烟酰胺>维生素C木亚硝酸钠>烟酰胺木柠檬酸由表1．7算出每个因素的不同水平对应的平均发色效果，可以看出B，C，D，G，H，F的好水平分别为Bl，C2，Dl，Gl，H2，F2。A因素本身不显著，不能由A因素本身确定它的好水平，需要根据A幸B、A母C确定A因素的最佳水平，据此推断，A1具有较好的发色效果。表1—8口木方差分析表1'ab．1—8V撕aIlceaIlalysisof口宰平爹臀翟F值SSDFMS‘一0．046O．714O．1373．2220．152O．053O．469O．0ll0．102O．1301．177O．0291．525O．748O．004O．046O．714O．1373．2220．1520．05301469O．011O．102O．1301．1770．0291．5250．7480．004根据正交交互试验结果知：(a)根据单因素效应分析知，柠檬酸、葡萄糖和乙基麦芽酚对于色泽的影响较大，具有很强的发色、护色的作用。(b)根据各因素的协同效应分析知，烟酰胺、柠檬酸、维生素C与亚硝酸钠的协同效应最强，同时烟酰胺、柠檬酸、维生素C三者之间又有较强协同效应。可见烟酰胺、柠檬酸、维生素C在发色过程是必不可少的，发色效果非常显著，能使亚硝酸钠充分地发挥出发色的作用，对于整个发色制品的色泽影响较大。13渤ⅢⅢ帆渤观m嘲狮兰!m{呈叭m』00OI●OOL』(OO0O(OO(Ⅲ一～|耋|薹一㈣一l§珈一嬲娜舰昧TB鹕c小眦DEm||：{|：FGH鹾一脚 上海海洋大学硕士学位论文目维生素CjIc烟酰胺日维生素c缔f檬酸日烟酰胺木柠檬酸■维生素c木亚硝酸钠口烟酰胺木亚硝酸钠口柠檬酸木亚硝酸钠图卜3发色剂与发色助剂协同作用对色泽的影响Fig．1-3neinteractionofcoloragemsa11dcolorau)【iliaryagentsfore髓ctofc010rB发色剂与发色助剂协同作用对亚硝酸盐残留量的影晌由表卜7知，第5，13号实验残差分别为4．32、4．23，其中因素E的极差R=O．86为最大，表明因素E对残差量的影响最大；其次是A、B、H极差分别为0．6l、0．54、0．63。G因素的极差R=0．02，B，lcE因素的极差R=0．03都小，表明因素G、B牦对残差量多少影响；但因素B、E对残差量的影响较大，故不忽略B术E。表卜9亚硝酸盐残留量方差分析表撑11’ab．1—9V酊ianceanalysisofresiduaofnitrite(No．1)从方差分析表卜9中看到的所有因数的p值都大于0．05，此时因素G的p值分别为0．94最大，其次因素B牦的p值为0．926远远大于0．05。可以断定因素G、B术E对残差量的影响不显著，剔出因素G、B木E后重新做方差分析，得到新的方差分析表卜10：140T6543210磐荆嚣 上海海洋大学硕士学位论文表1—10亚硝酸盐残留量方差分析表带2T'ab．1—1Ovalrianceanalysisofresiduaofnitrite(No．2)各因素的交互作用(见图卜4)按显著性由高到底(即p值由小到大)排序为：柠檬酸木亚硝酸钠>维生素C·烟酰胺>烟酰胺木柠檬酸、维生素C木亚硝酸钠>烟酰胺母亚硝酸钠>维生素C幸柠檬酸日维生素C碘g酰胺口维生素C椭酸■烟酰胺舛宁檬酸目维生素c木亚硝酸钠田烟醐安垭硝酸钠囝柠檬酸垭硝酸钠图卜4发色剂与发色助剂协同作用对亚硝酸盐残留量的影响Fig1_4rnleinteractionofcolorage鹏觚dcolorauXiliaD，agentsforResiduaofN确te从上图卜4中不难发现，柠檬酸、烟酰胺或维生素C与亚硝酸钠协同作用时能有效地降低发色制品中亚硝酸盐的残留量，此外维生素C还能与烟酰胺发生协同效应进一步降低亚硝酸盐的残留量。1．1．3发色剂及发色助剂筛选的结果综合正交和交互试验的结果，以及试剂成本，筛选的结果为：对于残留量影响，茶多酚、乙鬟勰维生素C、烟酰胺、亚硝酸钠比较大，其中A水B(维生素C，lc烟酰胺)的协同作用最大。∞骺∞巧∞衢扣圬加嘶∞mm吼吼吼n吼吼仉仉仉智枷辚 上海海洋大学硕士学位论文对于色泽影响，柠檬酸、葡萄糖、乙戋彰捂批较大，其中B牦(烟酰胺水茶多酚)、C杷(柠檬酸木茶多酚)的协同作用比较大。由于所选因素较多，根据影响大小适当删减后为：乙基麦芽酚、维生素C、烟酰胺、亚硝酸钠、柠檬酸其中茶多酚与乙基麦芽酚同为酚类物质，抗氧化性相当，能有效保色。从成本角度看，茶多酚比较昂贵，所以决定用乙基麦芽酚替代茶多酚，与烟酰胺、柠檬酸发挥协同效应。此外，乙基麦芽酚也能有效降低亚硝酸盐的残留量。1．2发色剂和发色助剂配比量的研究通过正交和交互试验筛选出发色助剂后，就需要再利用正交试验确定发色剂与发色助剂量的配比。1．2．1材料与方法同1．1．1～1．1．1．7所述1．2．2正交试验方案拟通过5因素4水平正交试验来确定各试剂的添加水平：各水平值由先前的正交和交互试验值来确定，亚硝酸盐残留量和色泽a宰值(红度)测定3次取平均值。表卜11正交试验因素与水平Tab．1-11Facl【0rSandleVelsofonhogonaleXperiments1．2．3结果与讨论1．2．3．1最佳配比量根据试验结果，选择各因素的水平为：维生素C：第3水平(O．149／2009，0．7009瓜g)；乙基麦芽酚：第2水平16 上海海洋大学硕士学位论文(O．00249／2009，O．0129／l【g)；柠檬酸：第4水平(0．129／2009，0．6009／kg)；亚硝酸钠：第2水平(0．0099／2009，O．0459／l【g)；烟酰胺：第3水平(0．149／2009，0．7009／l【g)。按此配方制作的发色制品，其色泽和亚硝酸盐残留量分别为(又±s表示)：a木=13．12±0．18；亚硝酸盐残留量=5．74±0．19mg／kg。表卜12正交试验方案和结果Tab．1-12Prog瑚1andresultSoftheonhogonaleXperimentsR(A)0．400．29O．42O．340．54R(B)0．920．200．460．390．51注：极差A：色泽指标的极差值；极差B：亚硝酸盐残留量指标的极差值；z：代表亚硝酸盐残差量1．2．3．2数学模型的验证运用1．2．3的数学模型估测低亚硝酸盐发色配方，亚硝酸盐残留量和色泽值，为r(色泽值一红度)=12．22；z(亚硝酸盐残留量)=4．54mg／kg。与2．4．1所示试验值比较，偏差率分别为0．068和0．209，就拟合度而言，z值的拟合性比r值稍差，这是因为选用发色剂和发色助剂的种类和量各不相同，在腌制和贮藏的过程中会发生一系列化学反应，产生一系列不同的胺类物质，直接导致亚硝酸盐的残留量也不胫相同。综上所述，数学模型是有效的，能客观地评测发色助剂种类和添加量对于发色制品的影响，尤其是对色泽的影响。1．2．3．3最佳添加方案与其它添加方案的比较根据最佳配方依次添加各种发色剂和发色助剂，测得结果为，a水(红度)=13．14士0．11，亚硝酸钠残留量=5．65士0．11mg／kg。根据表卜13显示，空白肉(没17 上海海洋大学硕士学位论文有添加任何试剂)，其红度a木值为6．39士0．08，只有最优发色配方的一半；2号试验中按亚硝酸盐最大使用量O．159／kg㈣进行添加，其a水=13．28士O．12，亚硝酸钠残留量=31．55±O．2l，即在产品色泽变化不大的情况下，其亚硝酸盐残留量(9．9l士0．13mg／kg)却是最优配方的2倍左右。由此可见，一味的增加亚硝酸钠的用量不一定能大幅度改善发色制品的色泽。表卜13不同发色配方制品的色泽和亚硝酸盐残留量的比较Tab．1·13Comp撕sonofe仃ectofcolOrandresiduaofnitriteforVariouscuredproducts注：“一”代表空白；Z：代表亚硝酸盐残差量3、4号试验结果显示在没有添加亚硝酸钠或不添加发色助剂的条件下，发色效果较差(a，Ic=11．16士0．09)，缺乏发色制品特有的风味；同时亚硝酸盐残留量(18．34士O．17mg／kg)较高，可见，发色剂和发色助剂的作用是相辅相成的，缺任何一方都会影响到发色制品的品质。此外，1、2号试验结果还显示发色助剂能有效降低发色猪肉制品亚硝酸盐残留量，在添加的亚硝酸钠量同样的条件下，添加了发色助剂的1号试验其亚硝酸盐残留量(9．9l士0．13mg／kg)只有2号试验一未添加发色助剂(31．55士0．2lmg／kg)的三分之一。因此，发色助剂不仅具有较好协同发色作用，还能有效地降低发色制品的亚硝酸盐残留量。空白样品l号配方2号配方3号配方4号配方最优配方图卜5不同发色配方制品的色泽比较Fig．1-5Comparisonofe仟ectofcolorforV撕ouscuredproducts18∞叩∞∞∞∞∞叩∞一趑H啦‰ 上海海洋大学硕士学位论文鬻【日．34r壬一g．91：．图．5．65．网．空白样品l号配方2号配方3号配方4号配方最优配方图1-6不同发色配方制品的亚硝酸盐残留量的比较Fig．1-6Comparisonofresiduaofni仃iteforVariouScuredproducts总之，与对照试验相比，最优配方的低亚硝酸盐发色制品的发色效果最好，同时亚硝酸盐的残留量也最低(亚硝酸钠在肉制品中的残留量不得超过30．00m眺g—GB2760．96)。1．2．3．4自制低亚硝酸盐发色肉产品与市售产品的比较由于亚硝酸盐价廉，且有较好的发色效果，有一些厂家便在发色制品中大量添加亚硝酸盐，以增加产品的色泽和独特风味。本文选取了一些市售的发色制品与本文试验所制的低亚硝酸盐发色制品的比较结果如图卜7，卜8所示．前5个产品(不同品牌的盐水方腿和火腿肠)在发色过程都添加红色素(诱惑红一08．012；红曲红一08．120；胭脂虫红一08．145)，有些色素属于人工色素，过多摄入会危害人体的健康，所以前5个产品的a术(红度)大大高于最优配方的产品，在产品研发后期可通过选用一些天然的色素进一步调整发色制品的色泽。而第6个产品是传统的午餐肉，它没有添加色素，可作为本实验低亚硝酸盐发色配方的对照产品，由图卜9可见，两者在色泽上差别不大。而从图卜8中却不难发现低亚硝酸盐配方产品的亚硝酸盐残留量远远低于午餐肉(6号产品)的水平，只有它的三分之一，而其它发色制品质量参差不齐，经检验大多数产品(83％)其亚硝酸盐残留量是最优配方的2倍以上。19孤加巧∞圬加50舅，IE喇跚镁韧麓普倒 上海海洋人学硕l：学何论文0样品1样品2徉晶3样晶4样品5祥晶6量优配方样晶图1—7市售样品的a(红度)值与低亚硝酸盐发色配方之间的比较omparis()noraValucbetwecnsampleson【hemarke【andsampleusinglow—nitri(ef'0rmula00：惑．惑．1图．1国．1图．惑’网．闷样品l样品2样品3样品4样品5样晶6量优配方样品图卜8市售样品中亚硝酸盐残留量与低亚硝酸盐发色配方之间的比较Fig．1—8Comparisono九hcsodiumni【ritebeLweensamples()nChemarke【andsampleusinglow—n．LrjtcIhrmula图1—9低亚硝酸盐发色肉制品(左)与市售午餐肉(右)色泽比较卜ig．1—9Comparis()n()fthel()w—nitritemeats(1eft)andcurcdmcatsonthcmarkc【(rig虮)20∞∞∞∞∞∞∞∞；；弱加”如0oCn孓良孓n曩n孓0孓075432l1一蝼辽*幅F，奄』v茸蚧朝畿引謦翟爿 上海海洋大学硕士学位论文1．3小结本研究对一系列实验的结果分析评价得出低亚硝酸盐发色配方为：维生素C—0．7009／l【g；乙基麦芽酚—0．0129／埏；柠檬酸—0．6009／l(g；亚硝酸钠珈．0459瓜g；烟酰胺珈．7009／l(g。使用最佳添加方案，其a木(红度)=13．12±0．18，亚硝酸钠的残留量只有5．74±O．19mg／kg，为最高允许添加标准(GB2760．96)的19．1％。根据正交与交互试验建立的数学模型：Jr=l1．25+2．44鼍+o．028而+o．35岛+39．02确一2．2％+237k+o．33晦+97．45鼍12=6．36一15．15鼍一o．7乃吃一2．3铂+45．4■+l2．02％+25．58蚝+o．07而+王21．43蚝其中，．一色泽(红度)，z一亚硝酸钠残留量，五一维生素C，z：一烟酰胺，黾一柠檬酸，x。一亚硝酸钠，黾一茶多酚，％一维生素E，x，一葡萄糖，x。一乙基麦牙酚该模型解析了发色剂与发色助剂协同效应。其中对于发色效果而言：烟酰胺、柠檬酸、维生素C在发色过程是必不可少的，能使亚硝酸钠充分发挥出发色作用，其中尤以烟酰胺和亚硝酸钠应协同最明显，发色效果显著；对于亚硝酸盐残留量而言：柠檬酸、烟酰胺、维生素C与亚硝酸钠一起作用时能有效降低发色制品中亚硝酸盐的残留量，其中柠檬酸与亚硝酸钠协同效应最明显。因此发色剂与发色助剂混合使用能发挥其最大作用。在使用最佳添加量的条件下，与市售发色产品相比，其亚硝酸盐残留量仅为它们的二分之一；与不添加色素的产品相比，两者色泽相当。21 上海海洋大学硕士学位论文第二章生物胺检测方法的建立及其在发色肉制品中的应用生物胺是一类含氮的脂肪族或杂环类低分子量有机化合物，对动植物和微生物活性细胞有重要的生理作用。适量的生物胺有助于人体正常的生理功能，过量则会引起不良的生理反应。生物胺往往是在食品腐烂或发酵过程中产生。根据结构可以把生物胺分成3类：脂肪族：腐胺(Putrescine)、尸胺(Cadaverine)、精胺(Spermine)、亚精胺(Spermidine)等；芳香族：酪胺(Tyramine)、苯乙胺(Phenethylamine)等；杂环族：组胺(Histamine)、色胺(Trypt锄ine)等【19埘J。几种常见的生物胺的结构见图2—1NH2CH托H：NH3H。下№萨小mHI。l骧精艘＼—一H掰，一、．—^咿“、一，一＼，N＼／＼一～H12一苯羲乙虢图2—1几种常见生物胺的结构Fig．2·1S仃uctureOfblogenlcamlnes各种动植物的组织中都含有少量的生物胺，它是生物有机体内的正常活性成分，在机体内起着重要的生理作用。普遍存在于多种食品和含酒精的发酵饮料中，如：干酪、肉制品、水产品、啤酒、葡萄酒等。研究表明，生物胺在生物体内最主要的生物合成途径是氨基酸的脱羧反应，即通过食品中的微生物所产生的氨基酸脱羧酶的作用下，脱去氨基酸的羧基而生成的，也有部分生物胺是通过醛的胺化作用形成的。水产品、肉类制品等蛋白含量丰富的食品中生物胺含量与其质量密切相关，有望成为评价此类食品鲜度的一个重要指标。如某一食品中含有大量的生物胺，就表明该食品中的蛋白质发生了腐败变性，产生了游离氨基酸并转化为生物胺。人体摄入含有大量生物胺食品是会引起许多不良的生理反应。因此通过检测发色制品中生物胺的含量，就不难判断发色制品的新鲜程度【2M引。m^i黻c』、酶 上海海洋大学硕士学位论文表2—1．生物胺及其前体Tab．2一lPrecursorofbiogenic锄inesandbiogenicamines由于生物胺种类较多，各种胺存在的食物载体各不相同，如组胺、酪胺主要存在于一些变质动物类的肉食品中。除了组胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在会增强组胺和酪胺的不良作用。因此开发一种能同时检测多种生物胺含量的方法是十分必要的。2．1材料2．1．1仪器与试剂高效液相色谱仪配紫外一可见光检测器(waters510系列)，均质机，离心机，涡旋混合器。盐酸苯乙胺、盐酸腐胺、盐酸尸胺、盐酸组胺、盐酸章鱼胺、盐酸酪胺、盐酸亚精胺(均为色谱纯，购于Sig锄a公司)。甲醇(HPLC级)，乙腈(HPLC级)，丙酮(HPLC级)，丹酰氯(HPLC级)，其它试剂为分析纯。水由Milli—Q净化系统(Millipore公司)制得。苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，章鱼胺，酪胺和亚精胺标准溶液：分别称取盐酸苯乙胺、盐酸腐胺、盐酸尸胺、盐酸组胺、盐酸章鱼胺、盐酸酪胺和盐酸亚精胺标准品各13．01mg、18．29mg、17．15mg、16．57mg、12．38mg、12．66mg和17．55mg于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，得到1．0mg／mL标准储备液。根据需要可储备液稀释成适当浓度的标准使用液。O．4mol／L高氯酸溶液：量取24mL高氯酸(分析纯)，用水稀释到1L。2mol／L氢氧化钠溶液：称取4．09氢氧化钠，溶50mL水中。饱和碳酸氢钠溶液。10mg／IIlL丹酰氯溶液：称取0．29丹酰氯，溶20lnL丙酮。浓氨水，25％一28％(∥g)。2．1。2试样的制备与保存试样的制备：取样品约5009用组织粉碎机粉碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。试样的保存：将试样于一18℃冰箱中保存。 上海海洋大学硕士学位论文2．2测定方法2．2．1提取称取29(精确至0．019)样品于50IIlL离心管中，加入10mLO．4m01／L高氯酸溶液均质‘241，于3000r／min离心10min，上清液移入25IIlL棕色容量瓶中。沉淀物用10mL0．4mol／L高氯酸溶液重复提取一次，于3000r／min离心10min，上清液合并于容量瓶中，最后用O．4mol／L高氯酸溶液定容至刻度。2．2．2衍生从定容好的25mL溶液中取出1．0mL，移入5mL容量瓶中，依次加入100pL2mol／L氢氧化钠溶液、300肚饱和碳酸氢钠溶液和2mL10mg／mL丹酰氯溶液‘251，盖塞，于40℃避光反应45min。反应完毕后，加入100灿浓氨水，静置30min，用乙腈定容到5．0mL，振荡混匀，取适量的溶液过有机相针式滤膜(0．45岫)后，供液相色谱测定。混合工作标准液衍生：取适量混合工作标准液于5mL容量瓶中，加入300汕饱和碳酸氢钠溶液和2mLlomg／IIlL丹酰氯溶液，盖塞，于40℃避光反应45min。反应完毕后，加入100“L浓氨水，静置30min，用乙腈定容到5．00IIlL，振荡混匀，取适量的溶液过有机相滤膜。2．2．3色谱条件色谱柱：KromasilC18，5岬，150姗×4．6姗(内径)流动相：A：0．01m01／L乙酸铵；B：水+乙腈(10+90)含0．01mol／L乙酸铵。柱温：35℃；检测波长：254nm；进样量：10灿。梯度洗脱条件见表2．2。表2—2梯度洗脱条件1’ab．2·2Theconditionofgradiemelution2．2．4色谱测定平行试验：按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。24 上海海洋大学硕士学位论文回收率试验：阴性样品中添加标准溶液，测定后计算样品添加的回收率，并以(相对标准偏差)RSD表示方法的精密度。结果计算结果按式(1)计算矿1000尽C×——×——⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)所1000酬样中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg／l【g)；C_从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升(u咖L)；卜试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；肟一最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。2．3分析条件的选择和优化2．3．1色谱条件实验时选取了甲醇、乙腈、乙酸及乙酸胺犯6。271等溶液搭配使用来选择流动相。结果发现用0．1m01／L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相比较合适。但如果使用O．1mol／L乙酸铵溶液和乙腈以4：6的比例进行等梯度洗脱，整个洗脱过程将近75min，分析时间过长，还会导致最后几个峰峰形变宽。采用梯度淋洗可以缩短样品分析时间，改善了峰形，使定量分析更加准确。图2—27种生物胺标准品衍生物的色谱图(1O№／mL)卜苯乙胺，2一腐胺，3一尸胺，4一组胺，5一章鱼胺，6一酪胺，7一亚精胺Fig．2-2Chromatogramoftenbiogenic锄ines(10p咖L)1-phenylemyl锄ine，2-putrescine，3-cadav鲥ne，4-hi比阻ine，5一octop锄ine，6-tyr锄ine，7·sp锄idine此外，柱温的变化对各组分出峰顺序没有影响，但随着柱温的升高分析时间会缩短，在35℃时完成一次分析时间要比在20℃时快10min左右，明显缩短了分25 上海海洋大学硕士学位论文析时间。图2—2为7种生物胺标准品衍生物的色谱图。2．3．2提取方法本实验曾采用水、盐酸、甲醇、正丁醇、丙酮、三氯乙酸、高氯酸等溶剂口睨9】作为提取溶剂进行实验，实验发现O．4mol／L高氯酸溶液提取效果较好。为了进一步纯化样品，一般选取过固相萃取柱，有文献采用SAX柱和C。。固相萃取(SPE)柱。本文试用了SAX柱和C。。固相萃取柱分别进行纯化实验。小柱使用前经6mL甲醇和10mL水活化，然后移入1mL样品提取液，滤液全部收集至试管中。实验发现，用SAX柱后每种生物胺的回收率仅为40％左右；SAx柱经活化后抽干，然后倒入1mL样品提取液，再收集，这时组胺和酪胺的回收率都提高到80％以上，但其他生物胺回收率变化不大；将样液pH值调节至8．5再过柱，组胺和酪胺的回收率提高到80％以上，亚精胺的回收率提高到85％以上，但其他生物胺变化不大。改用C。。柱后2一苯乙胺、酪胺保留在柱中，章鱼胺回收率约15％，其他生物胺回收率约35％。虽然过固相萃取柱可以净化样品，但这会使某些生物胺回收率降低，不利于同时测定7种生物胺，因此本实验不采用固相萃取柱进行纯化。本检测的方法测定低限为50¨g／g，在此浓度下，样品提取液虽然未经固相萃取柱净化，但基体杂质对测定无干扰。2．3．3衍生化生物胺在紫外可见光范围内吸收很弱，紫外检测器不能直接检测，因此需衍生化以产生紫外吸收产物，适于HPLC法分离测定。本标准选用了邻苯二甲醛(OPA)、磺酰氯二甲胺偶氮苯(DabsylChlo订de)、丹酰氯(DallsylC11loride)、异硫氰酸苯酯(PITC)、荧光胺(Fluoresc锄ine)、氯甲酸(9．芴醇)甲酯(9．Fluorenylmemylclllorofomate)作为衍生试剂【28】，结果发现使用丹酰氯进行衍生效果很好，衍生方法也比较简单。由于生物胺在弱碱性条件下才能与丹酰氯发生反应，因此样品在衍生前需用氢氧化钠溶液调节pH至中性，再用碳酸氢钠溶液调节pH至8．5—9．0，否则无法分离样品；标准品直接用碳酸氢钠溶液调节pH至8．5—9．0。丹酰氯衍生需在40℃条件下反应45min。除了上述反应时间，分别衍生90min和150min实验，结果显示在不同衍生时间的条件下，峰面积没有明显差异。衍生反应完毕后需加入氨水，因其可与过量丹酰氯反应，其产物峰在生物胺峰之前，不会干扰组分的测定。 上海海洋大学硕士学位论文2．3．4衍生物的稳定性通过对2pg／mL的标准品衍生物做稳定性试验(表2—3)，发现放置在4℃、避光条件下，衍生物在2周内的峰面积变化不大，但第3周开始峰面积明显降低。因此，衍生物在4℃、避光条件下，可保存2周。表2—3丹酰氯衍生产物(2“g／mL)峰面积变化情况1’ab．2．3、／ade够ofpeakareaofderivatives(2¨g·mL。1)2．3．5线性范围7种生物胺浓度在50pg／IIlL一500“g／mL范围内，测得峰面积与浓度呈良好线性关系，其相关系数(r2)均大于O．998。2．3．6回收率、精密度和定量测定限本实验以虾、金枪鱼、鳗鱼作为样本。取适量标准品加入到2．0g样品中，使添加量相当于50pg／g，100弘g／g和500pg／g，每个添加水平各取36份试样(每种鱼各12份)。图2—3和图2—4分别为空白样品和添加样品(50¨g／g)的色谱图。外标法测得的回收率及精密度，当添加量在50烬／g一500弘g／g，7种生物胺的平均回收率在90．5％一96．7％间，相对标准偏差为4．5％一6．9％。(A)27 上海海洋大学硕士学位论文(B)o己oO(C)＼|LL．，、小～一一。介图2—3空白样品色谱图(A：虾；B：金枪鱼；C：鳗鱼)Fig．2-3Chromatogramofblanks锄ples(A—shrimp；B-tuIla；C—eel)(A)(B)八儿hL五虹止八＼』L√√L／ 上海海洋大学硕士学位论文图2—4样品添加50pg／g的色谱图(A：虾；B：金枪鱼；C：鳗鱼)Fig．2-4Chfomatogramofs锄plesadded50p眺stalld砌biogenic锄m(A-s“mp；B-nJna；C-ecl)根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定测定低限(LoQ)，LoQ为50pg／g。本方法中7种生物胺添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表2—4。表2—4外标法测得生物胺的回收率及精密度T曲．2-4Recove巧andprecisionofbiogenic锄inesusingeXtemalstalldardmethod化合物黼平≮赛产率高苯乙胺lOO90．55．250093．14．85096．95．9腐胺lOO93．O5。450094．55．55092．95．5尸胺10092．06．550093．46．35094．35．5组胺10092．6、5．750095．15．05094．75．O章鱼胺10093．74．550091．86．55092．65．2酪胺10093．85．750091．66．95092．56．7亚精胺loo92．46．050090．96．22．4低亚硝酸盐发色肉制品中生物胺含量测定前文已述，生物胺的前体物质是由食品中蛋白质腐败分解成游离氨基酸后形成的，因此可根据样品中生物胺的含量，断定发色肉制品中的蛋白质是否在细菌的作用下发生了腐败。由于市售午餐肉与本试验的低亚硝酸发色肉制品工艺条件类似，所以本节试验以此作为参照物。此外，以不加任何发色配方的新鲜猪腿肉(工艺流程及包装方法同低亚硝酸盐发色制品)作空白对照，样品都己在冰箱(4℃)中贮藏了一个月。29 上海海洋大学硕士学位论文每一种样品各做3个平行试验，每个试验取样29，前处理同2．2章节。色谱图如下图2—5、2—6、2—7所示，使用单点校正法，即直接比较法定量。前文已述(1．3．5)7种生物胺浓度在50pg／lllL一500pg／mL范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，且该方法测定低限为50pg／g，所以选择50岖／g的标准品作单点校正，样品中生物胺含量按式2进行计算。定量公式如下所示：Wi=}·加⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)Wi：待测组分的浓度；Ws：标准品的浓度；Ai：标准品峰面积；As：待测组分的峰面积图2—5低亚硝酸发色猪肉制品的生物胺检测图谱Fig．2-5Chromatogr锄ofbiogenicaminesoflow—nitritecuredmeat图2—6空白肉样品的生物胺检测图谱Fig．2-6Chromato野llTlofbiogenic锄inesofblankmeat图2—7市售午餐肉的生物胺检测图谱Fig．2-7Chromatogramofbiogenicaminesofcuredmeatonthemarkert经检测和定量分析后(见表2—5、2—6、2—7)，发现存在于发色肉制品中的生 上海海洋大学硕士学位论文物胺主要是苯乙胺，组胺，酪胺和亚精胺。由于使用了发色剂、发色助剂和真空保鲜技术(市售午餐肉一硬罐头；低亚硝酸盐发色肉制品一软罐头)，本试验的低亚硝酸发色肉制品和市售午餐肉的生物胺含量更低。而与空白对照的猪肉(未添加任何发色剂和发色助剂)相比较发现，其生物胺含量较高，且种类也较多，含有腐胺和尸胺，其中苯乙胺的含量最高，呈现腐败的迹象。因此，低亚硝酸发色肉制品有较好保藏性和货架期。表2—5午餐肉样品(市售)生物胺雨r_i丽—矗竽≮百—丽而r黼表2—6低亚硝酸盐发色肉制品样品Tab．2．6ThesamDleOf10w—nitritecuredmeat生物胺峰面积生物胺含量样品l样品2样品3平均值RsD(％)(IL∥mL)表2—7空白肉样品蚴胺雨r1丽—雨笋≮丽—1面广嚣2．5小结本节对自制低亚硝酸盐发色制品的食品质量指标进行了研究，选用高效液相色谱法建立检测多种生物胺的方法，并应用在检测发色肉制品的生物胺含量，以判断这些样品中蛋白质的腐败变质情况，考察发色剂与发色助剂对发色制品的品质和保藏效果的影响。试验结果表明：添加量在50¨g／g一500“g／g，7种生物胺的平均回收率在90．5％一96．7％间，相对标准偏差为4．5％一6．9％；在50¨g／mL一500¨g／IIlL浓度范围内，测得峰面积与浓度呈良好线性关系，其相关系数(r2)均大于O．998，所以用高效液相色谱法检测多种生物胺快速、简便、准确。此外，对本实验制品检测发现，其生物胺含量小于等于市售午餐肉中的含量。 上海海洋大学硕士学位论文第三章低亚硝酸盐发色肉制品中致病微生物的检测我国使用发色剂来腌制肉类的方法历史悠久，对肉制品的生产和发展起到了重要作用。亚硝酸盐作为鱼、肉制品加工业中常用的发色剂，除了使肉品呈现鲜艳的色泽和特殊风味外，还能有效地抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌。而降低了亚硝酸盐的用量是否会影响发色制品的保质期，本节将对此问题进行研究，考察低亚硝酸盐发色制品的抑菌效果。3．1发色肉制品中最常见致病菌3．1．1肉毒梭菌肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽孢，芽孢比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。由于发色制品往往都采用罐头包装，属于厌氧环境，肉毒梭菌易于在这类食品中生长，并产生有剧烈毒性的细菌外毒素。该菌中能在疱内培养基上生长良好，使肉变黑，产生H2S。其芽孢能耐高热，100℃处理十数小时亦不死亡，毒素须在100℃处理十多分钟才能破坏，消化酶不能破坏它。3．1．2金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌就是球菌的一种，它是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。主要中毒食品种类有奶、肉、蛋、鱼及其制品。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。肠毒素形成条件：存放温度，在37℃内，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良、氧分压低，易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含淀粉的食物，肠毒素也易生成。32 上海海洋大学硕士学位论文3．2材料与方法3。2．1材料物料试剂疾控中心仪器自制低亚硝酸盐发色猪肉制品庖肉培养基，卵黄琼脂平板，血平板，Baird—Parker平板(购自上海；7．5％氯化钠肉汤；革兰氏染色液显微镜(B)(2一奥林巴斯)，恒温培养箱(SHP一070型一上海试验仪器有限公司)3．2．2肉毒梭状芽孢杆菌的检验方法【30】增菌培养：取19样品放入事先配制好的庖肉培养基中，在65．70℃水浴锅中放气10miIl，再置入37℃培养箱中厌氧培养5—7天，每天观察结果；如果出现混浊现象，再进行革兰氏染色，镜检，检查结果如疑似为革兰氏阴性茵；可进一步进行分离培养和毒素检测。分离培养：挑取菌接种于卵黄琼脂平板上，35℃厌氧培养48h，肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠层样)薄层，但G型菌无此现象。毒素检测：动物试验3．2．3金黄色葡萄球菌的检验方法【3l】增菌培养：取19样品放入事先配制好的7．5％氯化钠肉汤中，在65．70℃水浴锅中放气10miIl，再放入37℃培养箱中厌氧培养卜2天，每天观察结果；如果出现混浊现象，再进行革兰氏染色，镜检，检查结果如疑似为革兰氏阳性菌；可进一步进行分离培养和毒素检测。分离培养：挑取菌接种于血平板和Baird—Parker平板，37℃培养箱中厌氧培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落再进行革兰氏染色镜检及血浆凝圃酶试验。3．2．4罐头食品商业无菌的检验方洲32J称重：用电子秤或台天平称重，1kg及以下的罐头精确到19，1kg以上的罐头精确到29，各罐头的重量减去空罐的平均重量即为该罐头的净重。称重前对样品进行记录编号。(此方法同样适合于真空包装的软罐头)保温：按照国标规定肉罐头属于低酸性罐头食品，再37℃条件保温10d，保温过程中应每天检查，如有胖听或泄漏等现象，立即剔出作开罐检查。 上海海洋大学硕士学位论文开罐：取保温过的全部罐头，冷却到常温后，按无菌操作开罐检验。将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外光杀菌灯照射30min。将样罐移置于超净工作台上，用75％酒精棉球擦拭无代号端，并点燃灭菌(胖昕罐不能烧)。用灭菌的卫生开罐刀或罐头打孔器开启(带汤汁的罐头开罐前适当振摇)，开罐市不能伤及卷边结构。pH测定：取样测定pH值，与同批中正常罐相比，看是否有显著的差异。感官检查：在光线充足、空气清洁无异味的检验室中将罐头内容物倾入白色搪瓷盘内，由有经验的检验人员对产品的外观、色泽、状态和气味等进行观察和嗅闻，用餐具按压食品或戴指套以手指进行触感，鉴别食品有无腐败变质的迹象。对有疑似问题的罐头进行涂片、染色、镜检。(方法同上肉毒梭菌和金黄色葡萄球菌检验)3．3结果与讨论亚硝酸盐一直在发色制品中使用，是因为它不仅能使肉制品产生诱人的色泽，还能有效地抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的增殖和产毒。为了检验低亚硝酸盐的发色猪肉制品同样具有抗菌抑菌的作用，本节试验制作了10个软罐头包装的发色制品样品，分五次(每次两罐)在1．6个月检验其是否含有致病菌(检验肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌)。在采用与市售发色猪肉制品相同的包装条件下，试验后发现研制的低亚硝酸盐发色猪肉制品同样具有良好的抗茵抑菌的作用，无论在1个月贮藏条件下，还是贮藏了6个月后都没有检测出肉毒梭菌和金黄色葡萄球菌，且软罐头外观完整，没有出现胀罐现象。此外，经过增菌培养后的培养基溶液依然清澈澄清，没有出现浑浊，长菌现象。因此，使用本文研制的低亚硝酸盐腌制剂同样能够保证发色猪肉制品新鲜度，达到其应有货架期。3．4小结本节通过检测样品中的肉毒梭状杆菌和金黄色葡萄球菌，考察发色剂与发色助剂对发色肉制品的品质和保藏效果的影响。试验结果表明：低亚硝酸盐发色肉制品在1—6个月保藏试验周期里没有发现肉毒梭状杆菌和金黄色葡萄球菌这两种致病菌，说明低亚硝酸盐发色配方同样具有很好抑菌效果，能有效防止肉毒梭状杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。34 上海海洋大学硕士学位论文第四章低亚硝酸盐发色肉制品风味物质的分析发色肉制品是我国传统肉制品中的一种，具有历史悠久，风味独特，颜色红润等特点，因此广受人民的喜爱，但是在制作发色制品的过程中要添加一种对人体有害的食用发色剂一亚硝酸盐，被人体摄入后易形成亚硝胺类致癌化合物，所以，近年来人们一直致力于寻找一些亚硝酸盐的替代剂或减少其用量。研究却发现亚硝酸盐的替代剂无法形成发色制品独特的风味，因此本文应用发色助剂与亚硝酸盐相结合，在尽量降低亚硝酸盐用量的条件下，保留发色制品原有的风味。本节通过分析研究自制低亚硝酸盐发色制品的挥发性物质，并结合感官试验，与市售发色制品进行比较，从而考察在低亚硝酸盐用量的条件下，能否保持传统发色制品独有的风味。风味是肉品的重要食用品质之一，至今，对于肉品风味已进行了大量的研究，超过1000种挥发性化合物被鉴定出来。目前研究萃取风味成分的试验手段主要有：蒸馏萃取法，超临界流体萃取法(SPE)，固相微萃取法(SPME)等【3”引，蒸馏萃取是十分传统的风味分析方法，广泛应用于熟肉、动植物油脂、蜂蜜、茶、蛋品、乳品以及各种果蔬风味物质的生产和研究。固相微萃取(solidphaseIIlicroex—traction，sPME)与传统常用的风味抽提技术如同时蒸馏萃取法(SDE)、(氮气)吹扫捕集法(NPT)和超临界流体萃取法(SFE)等相比，具有简便、快速、经济安全、无溶剂、选择性好且灵敏度高的特点，该方法集采样、萃取、浓缩、进样于一体，大大加快了分析检测的速度。目前固相微萃取在畜产品风味研究中已广泛应用。因此，本节应用SPME．GS／MS法研究低亚硝酸盐发色猪肉制品的挥发性风味物质。4．1固相微萃取头和解析，吸附条件的选择4．1．1材料与方法4．1．1．1试验样品自制低亚硝酸盐发色猪肉制品(同一批次，配料一致)4．1．1．2仪器手动SPME进样器(美国Supelco公司)；萃取头：85岬PA，75岬C舢DMS，65pmPDMS／DVB(美国Supelco公司)；GS／lvIS系统：GC一6890；MS-5975；aglient35 上海海洋大学硕士学位论文色谱工作站；NIST谱图库(Aglient公司)；色谱柱：HP一5MS弹性毛细管柱30Ⅱl×0．25咖×0．25岬恒温加热器；磁力搅拌子；顶空萃取瓶4．1．1．3色谱条件柱温箱：初始温度：35℃；初始时问：3．00ll血l；程序升温：第一阶段lO℃／min，到120℃，保留3min；第二阶段5℃／mill，到230℃，保留4min；总共运行时间：37．5mill进样口：不分流；吹扫流量：10．OmL／min载气体类型：氦气初始流量：1．0mL／min质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃：扫描范围35—350m／z；电离电压70V【36．3戤。4．1．1．4筛选的方法采用正交分析法筛选萃取头的类型以及吸附解析的条件，试验是选用四因素三水平的正交表(见表4．1)。四个因素分别为萃取头(85岬PA，75岬CA脚DMS，65岬PDMS／DVB)；吸附时间(20，30，40min)；吸附温度(30，40，50℃)；解析时间(10，15，20min)，共9个试验。表4—1风味正交试验计划表Tab．4—1FactorsandleVelsofnaVoronhogonaleXperimentS先把发色猪肉制品切成肉末状，取若干(大约3—49)塞入棕色顶空萃取瓶，不要塞满，以便萃取头能在瓶中伸缩，富集挥发性的风味物质。再把萃取瓶放入恒温加热器中进行水浴加热，每次要根据正交表设计的方案调节加热温度。达到萃取温度后，再插入手动萃取器，按方案控制吸附时间，吸附完，再按要求在GC／MS中解析。36 上海海洋大学硕士学位论文4．1．2试验的结果与讨论从表4．2中不难看出，在选用75岬C刖加DMS萃取头，50℃条件下，吸附30min，并在GC上解析10min，所出的峰面积最大，即所吸附的挥发性风味物质最多。此外，从正交分析表的极差R数值来看，对于固相微萃取的效果而言，萃取头影响最大，其它依次为解析时间，吸附温度，吸附时间，因此，在进行SPME试验前一定要保证萃取头完好，充分老化，去除萃取头上的杂质。表4—2正交试验的结果Tab4-2ResultSofnaVofo代hogon曩exp硎mentS因素萃取头甾间吸篙度解怒间船蠢LmlnJLoJLmln，L天lUl实验lPDMS／DVB20301010。58实验2PDMS／DvB3040155．82实验3PDMS／DVB4050206．39实验4CAR／PDMS20402027．20实验5CAR／PDMS30501043．01实验6CAR／PDMS40301529．87实验7PA20501518．41实验8PA302015．49实验9PA401021．97均值1(×107)7．6018．7318．6525．18均值2(×107)33．3621．4418．3318．03均值3(×107)18．6219．4122．6016．36极差R(×107)25．762．7l4．278．82根据上述试验结果，在分析发色制品挥发性风味物质时，应选用75岬CAR／PDMS萃取头，在50℃条件下，吸附30min，并在GC／MS上解析10min，试验测得总峰面积为4．51×108，超过正交试验中任何一组试验的总峰面积，因此在该条件下能最大限度萃取挥发性风味物质。4．2低亚硝酸盐发色肉制品与市售发色制品风味物质的分析比较对于低亚硝酸盐发色制品而言，不仅要控制好亚硝酸盐的用量，而且还要使其风味与原有的传统发色制品相一致，本节试验所选取的市售发色制品是某品牌午餐肉(因为该午餐肉系传统方法制作，未添加食用香精)。4．2．1材料与方法4．2．1．1物料本论文的研制低亚硝酸盐发色猪肉制品，某品牌午餐肉37 上海海洋大学硕士学位论文4．2．1．2试验材料与仪器手动SPME进样器(美国supelco公司)；萃取头：75pmC刖抑DMS(美国supelco公司)；GS／MS系统：GC一6890；MS一5975；aglient色谱工作站；NIST谱图库(aglient公司)；色谱柱：HP一5MS弹性毛细管柱30m×0．25蚴×0．25凹1；恒温加热器；磁力搅拌子4．2．1．3色谱条件柱温箱：初始温度：35℃；初始时间：3．00min；程序升温：第一阶段10℃／miIl，到120℃，保留3mill；第二阶段5℃／埘血，到230℃，保留4min；总共运行时间：37．5mill进样口：不分流；吹扫流量：10．0mL／miIl载气体类型：氦气初始流量：1．OmL／min质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；扫描范围35—350m／z；电离电压70V4．2．1．4试验步骤先把发色猪肉制品切成肉末状，取若干(大约3—49)塞入棕色顶空萃取瓶，不要塞满，以便萃取头能在瓶中伸缩，富集挥发性的风味物质。再把萃取瓶放入恒温加热器中，在50℃条件下水浴加热。达到萃取温度后，再插入手动萃取器(使用75肛mC删PDMS萃取头)，吸附30min，完后插入GC／MS中，解析10min，质谱分析。4．2．2试验结果与讨论4．2。2．1色谱图的直观分析比较本节试验采取比较法，选择自制低亚硝酸盐发色制品与空白肉样品，市售午餐肉挥发性风味物质相比较，试验离子峰图谱见下图4．1、4．2、4．3，结果发现空白肉样品的峰最少，即挥发性的风味物质较少，而市售午餐肉和自制低亚硝酸盐发色制品的挥发性风味物质明显多于空白肉样，因此，发色剂和发色助剂对于肉的风味影响是比较大的。根据图谱4．1，4．2，4．3显示，在保留时间5．6min左右，三个样品都出现一个峰，经分析知【39‘4舶，这个物质是己醛。发色制品的脂质易被酯酶水解产生游离脂肪酸(FFA)，这些酯酶主要是内源性的，并且优先水解产生亚油酸和油酸。脂肪水解3R 上海海洋大学硕士学位论文产生游离脂肪酸只是脂肪降解的第一阶段，游离脂肪酸会进一步发生氧化反应生成一些小分子物质，如醛、酮类。而己醛是亚油酸氧化产生的主要醛类产物，可以作为肉类脂质氧化状态评价的一项指标【4¨引，并且用来做为某些食品。如土豆条和坚果货架期的指标。醛的阈值很低，并且被认为与食品哈喇味相关．会对食品的风味质量产生重要影响。因此，可以通过观察己醛的含量来断定发色制品的新鲜程度。图4—1空白肉样品挥发性风味物质的离子峰图Fig4-1Totalioncoum(TIC)chromatogramofVolatilecomponentsderiVed矗．0mtheblaIll(s锄pleOfmeat图4—2低亚硝酸盐发色猪肉制品挥发性风味物质的离子峰图Fig4-2T口talioncount(TIC)chromat《F砌ofVolatilecomponentSde—Vedf沁mthes锄pleoflow．ninitecuredmeat39 上海海洋大学硕士学位论文L』i|．‘JJL—l。图4—3市售午餐肉挥发性风味物质的离子峰图Fig4-3T捌ioncount(TIC)ckomat0謦狮ofvolatilec锄ponentSde—ved行锄tllecWedmeatonthemarket4。2．2．2挥发性风味物质数量和种类的分析比较三种样品经GC／MS检测分析的结果如下表4．3、4．4、4．5所示。在试验中，每个样品做三个平行试验，经观察，发现发色制品的主要挥发性风味物质是醇、酮、醛类和烯烃类化合物【4钳。71，这些化合物占总挥发性风味物质的50％以上，在自制的低亚硝酸盐发色制品中醇类占29．15％，醛类占7．15％，烯烃类占34．73％，其它类1．69％，在市售发色制品中这三者的含量分别为4．23％、9．67％、46．92％和11．83％，而空白肉样品中这些挥发性风味物质几乎没有，从数据上再次证明了发色剂和发色助剂对于肉类的风味有较大的影响。前两者相比较发现，低亚硝酸盐发色制品中的醇类物质较多，而市售发色制品中其它类物质较多，但是醛类物质含量基本相似，该类物质是影响发色制品风味的主要因素。醛类物质不仅影响着发色制品的风味，而且还反映了发色制品的新鲜程度，在4．2．2．1章节中已经作了阐述，其中的己醛因具有令人不愉快的气味而常被用作评价肉类脂质氧化状态的一项指标。从下表知，添加了亚硝酸盐的发色制品的己醛含量分别为：2．35％，4．83％明显低于空白肉样品的14．13％，可见亚硝酸盐对于脂质的氧化具有一定的抑制作用，因为在发色制品中存有铁离子、结合铁、血红素铁，这三者对于脂质的氧化的效果是不同的，自由铁离子是肉制品中主要的脂肪氧化催化剂脚】，所有无机形式的铁对清洗过的肌肉纤维只有很弱的过氧化活性14列，故推测血红素铁比无机铁对脂肪氧化的催化作用要大。而亚硝酸盐能减少发色肉中铁离子的含量，促进铁的络合，进而降低了脂质氧化的程度，减少了己醛生成量。综上所述，本文研制的低亚硝酸盐发色猪肉制品和市售发色猪肉制品的主要 上海海洋大学硕士学位论文风味物质相同，基本上保持了传统发色制品的风味，能够满足消费者的口味要求。表4—3低亚硝酸盐发色猪肉制品主要挥发性风味成分疋lb。4-3、，olalilecomponentSoflow—curedmeatproduct序号保留时间(min)化合物名称峰面积平均值(×10’相对百分含量(％)表4—4市售午餐肉主要挥发性风味成分T，lb．4-4、，01atilecOmponentsofthecuredmeatonthemarket序号保留时间(min)化合物名称峰面积平均值(×106)相对百分含量(％)41 上海海洋大学硕士学位论文表4—5肉样品主要挥发性风味成分7I’ab．4·5、，oIatilecomponentsoftheblanks锄pleofmeat序号保留时间(min)化合物名称峰面积平均值(×106)相对百分含量(％)4．3低亚硝酸盐发色肉制品的感官评定为了更确切了解自制低亚硝酸盐发色猪肉制品与市售发色猪肉制品之间的风味是否有明显差别，就需要在对其挥发性风味物质分析的基础下，进行感官评定，分析两者之间的差别。4．3．1试验材料与方法4．3．1．1物料本论文研制的低亚硝酸盐发色猪肉制品，某品牌午餐肉(不含有色素)4。3．1．2样品的制备将熟制的低亚硝酸盐发色猪肉制品，某品牌的午餐肉切成1．5x1．5cm的小块，供感官试吃4．3．1．3感官评定员校感官评定员10名(5男5女)。4．3．1．4感官试验方法本节试验使用评分法来评估发色肉的感官属性，评分法是指按预先设定的评价基准，对试样的特性和嗜好程度以数字标度进行评定，然后换算成得分的一种评价方法。该方法不同于其他方法的是所谓的绝对性判断，即根据评价员各自的鉴评基准进行判断，它出现的粗糙评分现象也可由增加评价员人数的方法来克服。本试验使用．3~3(7级)等值尺度转换成相应的数值，感官评定表见附表，使用方差分析法分析结果，置信度Q=O．05。4．3．2结果与讨论4．3．2．1试验结果的方差分析通过对发色制品四个方面(色泽，风味，口感，质地)感官分析知，在色泽，42 上海海洋大学硕士学位论文风味上两者差异性比较小，两者的F。值分别为O．48，1．32远远小于口感(3．91)，质地(10．32)的F。值。在这四个感官特性中，色泽，风味，口感的F。值均小于F值，而质地的F。值远远大于F值，说明自制的低亚硝酸盐发色制品在三个感官特性上与市售产品的差别较小，但是两者在质地上却有一定的差别，这与发色配方无关，可能与辅料的添加量有关，经过调整可使低亚硝酸盐发色制品达到市售产品的品质。此外，四项指标的评审员F。值都小于F值，说明评价员之间没有显著性差异，试验结果可信度较高。表4—6感官试验的方差分析表Tab．4-6varianceanalysisofsenso叫eXperiment4．3．2．2感官评定结果与GC／Ms试验结果的比较经过对发色制品挥发性风味物质的分析检测发现，本试验研究的低亚硝酸盐发色制品的风味物质的成分、含量与市售发色制品基本一致；此外，还发现发色制品与空白样的风味物质组成差别较大，空白肉样中的风味物质品种少，同时量也较少，由此可知亚硝酸盐对与发色制品的风味形成具有重要的影响。但是GC／MS分析的结果往往与人们感官感受的结果又有一定的差距，所以经对产品进行感官分析后，发现本试验研究的低亚硝酸盐发色制品在色泽、风味、口感、质地上与市售发色制品没有显著性差异，同时也验证了GC／MS分析的结果。因此，在使用低亚硝酸盐配方的条件下依旧能够保持发色制品原有的风味。43 上海海洋大学硕士学位论文4．4小结本节在分析发色肉制品挥发性风味物质时，筛选出了合适的GC／MS试验的条件，即选用75岫C脚DMS，在50℃条件下，吸附30min，并在GC上解析10min。在此条件下，试验发现发色猪肉制品的主要挥发性风味物质是醇、酮、醛类和烯烃类化合物，这些化合物占总挥发性风味物质的50％以上，其中醛类物质不仅影响着发色猪肉制品的风味，而且还反映了发色肉制品的新鲜程度，在这些醛类物质中，己醛最具代表性。此外，根据对GC／MS试验结果比较还发现，本试验研究的低亚硝酸盐发色制品的风味物质的成分、含量与市售发色制品基本一致，感官评定的结果也验证GC／MS试验的结果。 上海海洋大学硕士学位论文结论本课题从研究低亚硝酸盐腌制剂的角度出发，通过正交、交互实验等一系列实验方法，得出了以下结果：(1)低亚硝酸盐发色配方为：维生素C—O．7009瓜g；乙基麦芽酚—O．0129／l(g；柠檬酸—O．6009／l【g；亚硝酸钠—O．0459／kg；烟酰胺—O．7009／l【g。使用最佳添加方案，其a木(红度)=13．12±0．18，亚硝酸盐残留量只有5．74士0．19mg依g，为最高允许添加标准GB2760．96的19．1％，与市售发色产品相比，其亚硝酸盐残留量仅为它们的二分之一；与不添加色素的产品相比，两者色泽相当，食用安全性大大提高。(2)根据正交与交互试验建立的数学模型能有效预测发色剂、发色助剂对于发色产品的影响。jr=l1．25+2．“五+o．∞8屯+o．3勤白+39．02h一2．2％+237％+o．3玺唧+97．45而p=6．36一15．15是一o．77屹一239而+45．4^+12．∞％+25．58≮+o．07吻+12l-43两其中，一色泽(红度)，z一亚硝酸钠残留量，五一维生素C，z：一烟酰胺，如一柠檬酸，x。一亚硝酸钠，x，一茶多酚，‰一维生素E，x，一葡萄糖，x。一乙基麦牙酚发色剂与发色助剂之间的协同作用明显，其中对于发色效果而言，烟酰胺、柠檬酸、维生素C在发色过程是必不可少的，能使亚硝酸钠充分发挥出发色的作用，其中尤以烟酰胺和亚硝酸钠协同效应最明显，发色效果显著；对于亚硝酸盐残留量而言，柠檬酸、烟酰胺、维生素C与亚硝酸钠一起作用时能有效降低发色制品中亚硝酸盐的残留量，其中柠檬酸与亚硝酸钠协同效应最明显。因此发色剂与发色助剂混合使用能发挥其最大作用。(3)选用高效液相色谱法建立了检测多种生物胺的方法，添加量在50pg／g一500¨g／g，7种生物胺的平均回收率在90．5％一96．7％间，相对标准偏差为4．5％一6．9％；在50邮／mL一500pg／mL浓度范围内，测得峰面积与浓度呈良好线性关系，其相关系数(r2)均大于0．998，该方法快速、简便、准确，能准确检测发色制品中的生物胺含量。对本试验制品检测发现，其生物胺含量小于等于市售午餐肉中的含量。(4)微生物检测结果表明研制的低亚硝酸盐发色肉制品在卜6个月试验周期里没有发现肉毒梭状杆菌和金黄色葡萄球菌这两种致病菌，品质良好，该制品有较好的货架期。45 上海海洋大学硕士学位论文(5)筛选出了合适的GC／MS试验前处理的条件，即选用75umCAR／PDMS，在50℃条件下，吸附30min，并在GC上解析10min。在此条件下，试验结果显示发色制品的主要挥发性风味物质是醇、酮、醛类和烯烃类化合物，这些化合物占总挥发性风味物质的50％以上，亚硝酸盐对于发色制品的风味有较大的影响，此外醛类物质不仅影响着发色猪肉制品的风味，而且还反映了发色猪肉制品的新鲜程度，在这些醛类物质中，己醛最具代表性。根据对试验结果比较还发现，本试验研究的低亚硝酸盐发色猪肉制品的风味物质的成分、含量与市售发色肉制品基本一致。此外，感官评定结果也验证了GC／MS试验的结果。 上海海洋大学硕士学位论文参考文献(1)赵建勇、李勇．食品中亚硝酸盐对人体的危害．新疆畜牧业，2004年第6期：37．39(2)刘家发、朱建如．食品中亚硝基化合物的污染及治理对策．公共卫生与预防医学，2005年第16卷第2期：32．34(3)唐爱明、夏延．肉制品中亚硝酸盐降解方法、机理及研究进展．FOOD&MACHINEY，2004年4月第20卷第2期：35—37(4)蔡健、王薇．肉类及肉制品中无硝腌制剂的研究．食品工业科技，2004年第8期：142．143(5)刘登勇、周光宏、徐幸莲．肉制品中亚硝酸盐替代物的讨论．肉类工业，2004年第12期：17．2l(6)钟耀广、南庆贤．发色剂在肉品加工中的应用．肉类加工，2001年第11期：17．18(7)胡滨、陈一资．硝酸盐对传统发酵肉制品质量的影响．肉品工业，2005年第6期；12一14‘(8)刘树兴、李宏梁、黄峻榕．食品添加剂．中国石化出版社，2001：110．130(9)吴永宁．现代食品安全科学．化学工业出版社，2003：215．267(10)李里特．食品物性学．北京：中国农业出版社，1998：139．209(11)GB／T5009．33．2003，食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法，中国卫生部和国家标准化管理委员会，2003年批准发布(12)任露全．实验优化设计与分析．北京教育出版社，2003：321．36l(13)方开泰、马长兴．正交与均匀实验设计．北京科学出版社，2001：152．187(14)刘文卿．实验设计．清华大学出版社，2005：89．178(15)HicksCR．FulldamentalConceptsinDesi印ofEXpe血nents．CBCCollegePublislling，1982：154—230(16)GB2760。96，食品添加剂使用卫生标准，国家质量技术监督局，1996年批准发布(17)胡国华．食品添加剂在禽畜及水产品中的应用．化学工业出版社，2005：89．310(18)凌关庭．食品添加剂手册．化学工业出版社，2002：456—78947 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上海海洋大学硕士学位论文(30)GB．4789．12．03，肉毒梭菌及肉毒毒素检验，中国卫生部和国家标准化管理委员会，2003年批准发布(31)GB．4789．10．03，金黄色葡萄球菌检验，中国卫生部和国家标准化管理委员会，2003年批准发布(32)GB．4789．26．03，罐头食品商业无菌的检验，中国卫生部和国家标准化管理委员会，2003年批准发布(33)Mottr锄DS．FlavorfomationinmeatandmeatproduCts：areView阴．FoodCh锄isny，1998，62(4)：415～424(34)LesimpleS，T0～esL，M巧avilaSeta1．、，olatilecompoundsinprocessedduckfillet[．玎．Jo啪alofFoodScience，1995，60(3)：615～618(35)江新业，宋焕禄，华永兵等．北京鸭／樱桃谷鸭肉汤中香味物质的比较．食品与发酵工业，2004，30(1)；21～24(36)刘源，徐幸莲，周光宏等．南京盐水鸭风味分析SPME方法研究．食品科学，2004，25(8)：142～145(37)EstebanmGM，AnsoreIlaD，AstiasardnIeta1．studyofthee仃宅ctofdifreremfibercoatingsandex拄actionconditionsondD，curedh锄VolatilecompoundseXn-actedbysoIid—phasemicroextrIaction(SPME)．T甜anta，2004，64：458—466(38)haustiK，Berl咖MJ，Gon面zCeta1．Volatilecom—呻oundsof觏Ⅳbeef舶m5localSpa王liShc甜lebreedsstoredundermodifiedatmosphere．Jo啪alofF00dScience，2002，67(4)：1580-1589(39)觚ndtB，S蜘stedLH，AndersenHJ．灿tioxidativeactivi够ofIli硫eillmetIIlyoglobininducedlipidperoxidation．ZLebensmUntersForsehA，1997，204：7．12(40)ShallidiF．FlaVorofmeat，meatproductsa11dseafoods．LondonBlacl【ieAcademic＆Professional：1998：57．332(41)JeonIJ，BasetteR．Analysisofn—hex孤烈aSi11dicesofpota_tocll主pshelfli岔．JFoodQu觚，1984，7：97-106(42)MatJI，SallveitME，KmchtaJM．PealllItaIld慨dnutrallcidi够：E恐ctsofoxygenconcentrationandrelatiVehunlidi够．JFoodSci，1996，61：465—468，472(43)加ltequeraT．LipidoxidativechaIlgesi11tlleprocessiIlgofIb甜aIlpigh啪s．FoodChemistry，1992，45：105—110(44)CmssCKZiegler．AcomparisonoftlleVolatile行actions蠡romcuredand49 上海海洋大学硕士学位论文1111cWedmeats．JFoodSci，1965，30：610．614(45)JolmsAM，BrikinsllawLH，LedwardDA．CatalyStsofliDidoxidationillmeatproduCts．MeatSCi，1989，25：209．220(46)MacDo删dB，(hayJI，GibbinsLN．Roleof11i仃iteincl】rrednleatnavor：锄tioxid锄troleofnitrite．JF00dSci，1980，45：893．896(47)ElmoreJS，MottI-觚DS，E】[1serMeta1．EneetoftllePolⅥmsa：tIlratedFattvAcidCompositionofBeefMuscleon吐leProfileofAroma、7blatiles．JAgricFoodChem，1999．47：1619．1625(48)AndrsAI，CaVaR，RuizJ．MoIlitomgvolatileeompoulldsd嘶ngdry一姗dl姗ripenillgbyS0lid—phasernjcroextractioncoupledt0anewdirectex锄ctiondeVice．Joun】面ofChromato伊apllyA，2002，963：83-88 上海海洋大学硕士学位论文附表低亚硝酸盐发色肉制品的感官评定表本次感官评定采用“7分制刀，评判标准详见下表：感官评定内容：1、请你依据上述标准就样品的气味进行打分：2、您觉得各样品之间是否有明显差别?() 上海海洋大学硕士学位论文致谢本文是在我尊敬的王锡昌教授、丁卓平教授的悉心指导下完成的。三年来，；两位老师不仅在学业上给我传道、授业、解惑，而且在生活中还给予我莫大的关心和帮助。两位老师渊博的知识、敏捷的思维、严谨的治学态度、兢兢业业的敬业精神，永远是我学习的榜样。谨此向两位老师表示我最诚挚的谢意。在这三年间，本实验室团结友爱、勤奋上进的氛围让我受益颇丰。在此我要特别感谢陶宁萍老师、刘源老师、包斌老师、刘振华老师和倪晔老师等人，他们在实验中给我提供了许多帮助，还有师弟师妹的大力协助，我的论文才得以顺利完成。在三年的研究生学习生涯里，我还得到我的辅导员吴文惠老师、华静老师的指导和帮助，在此一并表示感谢!我还要感谢我的父母，感谢他们二十余年的养育之恩，这篇学有所成的论文正是献给他们的最好礼物。衷心感谢所有关心我、支持我和帮助我的老师、同学和朋友们。再次感谢我们尊敬的王锡昌教授、丁卓平教授，祝他们身体健康、幸福快乐152 上海海洋大学硕士学位论文硕士期间取得的研究成果一、申请的专利《一种低亚硝酸盐发色肉食品》申请国家发明专利，专利申请号：2007l00474lO．1。二、发表的论文1)正交交互试验法讨论发色助剂对于降低亚硝酸盐残留量的效果川食品科学，2007，V01．28，No．7，215．218，ISSN：1002．6630(第一作者)2)水产品中生物胺的测定方法【J】上海水产大学学报，2007，v01．16，No．4，357．361，ISSN：1004．7271(第一作者)3)生物胺的检测方法评价【J】现在科学仪器，2006，第4期，89—9l，ISSN：1003．8892(第一作者)4)应用正交分析方法讨论发色助剂的优化叨上海师范大学学报．自然科学版，2006年12月增刊，25．29，ISSN：looO．5137(第二作者)三、参加的学术会议1)2007年8月1．2日于贵阳参加了食品科学杂志社主办的“食品与环境”学术会议，论文被收录并发表在食品科学杂志上