不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的比较分析

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1、第三军医大学硕士学位论文不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的比较研究摘要皮肤是人体的第一道防御屏障，最易受到各种损伤和疾病的伤害而导致皮肤缺损，组织工程皮肤产品的研发为皮肤缺损的治疗提供了新的手段。角质形成细胞构建表皮结构为外层皮肤提供有利的物理屏障。但是体外角质形成细胞培养易出现分化、增殖能力有限、培养周期长等缺点，因此通过研究角质形成细胞及其传代后细胞在组织工程皮肤的增殖分化情况，可以为我们筛选更优代次的种子细胞提供依据。目的：1、比较三维培养条件下，不同代次角质形成细胞在真皮层上的分化增殖能力。2、初步观察外源性Ⅳ型胶原对基底膜及表皮形态的变化

2、情况影响。3、了解角蛋白、丝聚合蛋白在不同代次角质形成细胞构建人工皮肤中的变化情况。方法：1、酶消化分离青年男性包皮标本获得角质形成细胞，用Ⅳ型胶原粘附法进行分选，并用角质形成细胞培养基进行培养、传代，观察1～5代次角质形成细胞在二维条件下的生长状况；用1～5代次角质形成细胞构建复方壳多糖组织工程皮肤，分为在表真皮之间加入外源性Ⅳ型胶原组及不加Ⅳ型胶原组，通过HE、PAS染色及电镜，观察各组组织工程皮肤的结构形态及基底膜形成状况。2、取2代角质形成细胞构建组织工程皮肤，通过MTT法比较不同密度表皮内角质形成细胞的增殖情况;同时在密度一定条件下，构建1、

3、3、5代次角质形成细胞的组织工程皮肤，用MTT法检测各代次表皮细胞的生长情况；并利用CK1/CK10、CK5/CK14、Ki67免疫组化染色比较各组组织工程皮肤表皮的增殖分化能力。3、用Westernblot检测丝聚合蛋白在各代次表皮的表达情况。结果：1、1～5代次角质形成细胞构建的组织工程皮肤都有明显的表真皮结构。1代、2代较其他代次的分层情况好，且含有黑色素细胞；2代表皮层厚度明显高于其他代次（P<0.05）。2、加Ⅳ型胶原组的表真皮间粘附的紧密程度高于未加Ⅳ型胶原组，Ⅳ型胶原对表5第三军医大学硕士学位论文皮层的厚度影响不大(P>0.05)。Ⅳ型胶

4、原组PAS染色阴性，说明单独加Ⅳ型胶原在培养时间非常有限的情况下难以形成基底膜结构。453、在5×10/ml～2×10/ml细胞范围内，组织工程皮肤的表皮中接种的角质形成细胞量越大，越有利于加快细胞增殖速度，并且前2代角质形成细胞增殖活力较好。4、2代角质形成细胞ki67增殖系数接近正常皮肤，其余各代次角质形成细胞的增殖系数逐渐减少（P<0.05）。5、CK1/CK10、CK5/CK14在1、2代皮肤中阳性表达明显，其余代次对于两种角蛋白的表达并不明显。5、丝聚合蛋白在各代次角质形成细胞构建的表皮中都能表达，以1、2代角质形成细胞中表达居多。结论：本研

5、究在三维培养条件下，对组织工程皮肤的种子细胞即角质形成细胞及传代细胞进行比较研究，合适用作种子细胞的代次是1、2代；Ⅳ型胶原是基底膜重要的组成成分，外源性Ⅳ型胶原能加强表真皮的粘附，但如要形成结构完整的基底膜，需要延长培养时间，增加外源性Ⅳ型胶原的接种量等；各代次角质形成细胞均有丝聚合蛋白，说明复方壳多糖组织工程皮肤具有较好保湿、抗菌作用。关键词：组织工程角质形成细胞增殖分化Ⅳ型胶原三维6第三军医大学硕士学位论文不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的比较研究第一章前言角质形成细胞（keratinocytes,KC）是表皮的主要组成部分，具有广泛的生物学

6、特征，对皮肤的结构功能有着重要的影响，是伤口愈合、再上皮化的重要细胞，也是组织工程[1]皮肤重要的种子细胞之一。1975年Rheinwald和Green首次在体外连续培养人角质形成细胞获得成功，标志着角质形成细胞体外培养技术的建立，但是由于角质形成细胞体外培养条件下的增生能力有限，传代困难，在实际应用中难以作为种子细胞用于构建组织工程皮肤。我科前期通过Ⅳ型胶原粘附法分选出表皮干细胞，使角质形成细胞的增殖[2]能力得到一定的改善，并且通过技术改良，采用冷消化法，建立了角质形成细胞稳定的传代和扩增方法。种子细胞是组织工程体外重建皮肤的物质基础之一。皮肤中表

7、皮的理想种子细胞应[3]该满足：1.来源方便；2.增殖能力强，生命周期长，便于建系；3.生物学功能与在体皮肤细胞一致；4纯度高，不含朗格汉斯细胞等其他杂细胞；5.无排斥反应。但在长期的实践中我们观察到表皮细胞体外培养易出现分化、增殖能力有限、培养周期较长等缺陷，这极大制约组织工程皮肤的发展。但是不同代次的角质形成细胞在真皮上的增殖分化能力如何，目前缺乏实验数据，值得深入研究。传统的二维培养方式被广泛用于细胞的增殖、迁移等特性的研究，然而越来越多实验发现二维环境培养出来的细胞与体内真实环境下的细胞在行为上存在较大的差异，而三维培养环境似乎更能反映体内活组

8、织真实的微环境。例如在成纤维细胞二维培养中，存在人为形成的背腹极化，粘连只在腹侧面形成；而在三