抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步研究

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PreparationandPrimaryApplicationsofanti．．rabiesvirusmonoclonal』●11●antl1)0diesThesissubmittedtolaeSlSSUl9daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWangWen-juan(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfiShanHuProfiTangQingQingdao，ChinaJune，2012 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：≯7工年6月以日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。I保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：；京蹭时间：如I工年g月土7日导师签名：时间：加f2，年6月三|7 青岛农业火：学：硕士生毕业论文摘要抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用摘要狂犬病是一种重要的世界性人兽共患传染病，据卫生组织报告，全球每年报告5．5万例人狂犬病，该病病程进展迅速，一旦发病，100％死亡，而且全世界该病治愈病例极少，因此对该病的准确快速、特异性的诊断方法和有效的疫苗的研究显得尤为重要。1978年Wiktor报道狂犬病病毒单克隆抗体的制备，此后，狂犬病病毒单克隆抗体在狂犬病的诊断和免疫学分析中得到了广泛的应用，并有望在狂犬病暴露后预防中替代免疫球蛋白发挥作用。WHO推荐的用于狂犬病病原学实验室诊断的金标准免疫荧光(DFA)vX59．'i5x价狂犬病病毒(RV)中和抗体的快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)已经广泛应用于国内外。这两种检测方法均需要抗RV核蛋白fNe)荧光标记抗体，而RV在细胞培养中的产量较低，不易从RV颗粒获得大量纯化的NP，目前这种检测试剂在国内尚没有获得批准文号和商业途径可以获得，而进口产品价格昂贵，因此限制了这两种检测方法在国内的普遍应用和标准化。鉴于这种情况，此类研究的开展，将非常有助于发展我国具有自主知识产权的狂犬病实验室检测和诊断用试剂，提高我国狂犬病监测能力。本实验分为三部分内容，包括狂犬病病毒单克隆抗体的制备鉴定，单克隆抗体的标记以及标记单抗的初步应用。本实验室采用人用狂犬病疫苗PV株、杆状病毒表达的RV核蛋白以及狂犬病病毒野毒株HNl0，作抗原免疫6．8周龄雌性BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞按常规方法进行融合；利用间接免疫荧光法筛选杂交瘤细胞后，经克隆后建株，获得特异稳定分泌抗狂犬病病毒单克隆抗体细胞株，并将此细胞株经小鼠腹腔注射制备单抗腹水；然后进行了抗体亚类、特异性和敏感性以及蛋白免疫印记等的系统鉴定，利用SPA亲和层析的方法进行腹水纯化，通过常规方法对所得单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记，确定FITC标记抗体的工作浓度后对实验室现存的部分标本进行了检测，设置Millipore公司的标记单抗为阳性对照，对两者的检测结果进行了分析比较。每次融合，融合率达到80％v1‘上，融合后，立即将融合细胞液稀释到15．20块融合板，经过陆续三批的检测，1-2次的亚克隆，最终获得3株(3812、4A12和588)特异稳定分泌抗狂犬病病毒单抗细胞株，前两者腹水效价分别为1：8000，1：10000。 青岛农业大学硕士生毕业论文摘要由于588获得比较晚，后续工作针对前两株单抗进行，经鉴定，单抗亚类型为抗狂犬病病毒IgG2a亚类；经Western．blot鉴定两株单抗细胞株能高效价稳定特异分泌抗狂犬病病毒核蛋白单抗，且具有良好的稳定性和特异性；所得的FITC标记单克隆抗体3812和HRP标记的4A12的工作浓度为1：80和1：800。用所得的荧光标记的单克隆抗体细胞3812株(FITC．3812)通过直接免疫荧光法，检测本实验室保存的标本34份，其中阳性标本24份，阴性10份，阳性率为100％。结果证明3812株标记单抗建立的直接免疫荧光法对广泛存在的狂犬病病毒街毒株的检出具有较好的特异性和准确性。关键词：狂犬病病毒；单克隆抗体；检测；标记 青岛农业大学硕士学位论文ABSTRACTmonoclonalcelllines，afterthecloningofthepositivehybridoma，thecellstrainswereestablished，specifichybridomacelllineswithhi曲stabilitytosecretmonoclonalantibodyagainstrabiesviruswasobtained，thenasciteWaspreparedbyintraperitonealinjectionofmousemonoclonalantibodygenerated；thesubclassesandthespecificityandsensitivityhadbeenidentified,afterpurificationbySPAaffinitymethodthetwokindsofascitewerelabeledwithHorseRadishPeroxidase(HRP)andFluoresceinIsothiocyanate(FITC)respectively,thentheworkingconcentrationofthetwolabeledantibodiesWCI'edeterminedandtheFITClabeledaitibodyWasusedtosimpletestbyDFA，theresultWasanalyzedcomparedwiththeresultofcommerciallabeledantibodybyMillipore．Thefusionrateofeverytimewereabove80％，Fusioncellswereimmediatelydilutedinto15-20of96wellsboards，Afterthreeconsecutivebatchtestsand1or2timessubcloning，threespecifichybridomacelllines(named3812、4A12and588)withhigllstabilitytosecretmonoclonalantibodyagainstrabiesviruswasobtained．AscitestiterofthefirsttwoweI"c1：8000and1：10000．Afterbeenidentified,thetwomonoclonalantibodieswercallIgG2asubclassandthewestern-blotresultshowedthatthe3B12and4A12cellstrainswereallanti-rabiesNproteinmonoclonalantibodies，andtheworkingconcentrationofFITClabeled3812cellstrain(FITC·3812)andHRPlabeled4A12cellstrain(HRP-4A12)were1：80and1：800．TheFITC一3B12Wasusedtodetect34simplescollectedfromdifferentareasinChinabyourlab，24ofwhichwerepositivesimplesand10negativesimples．Afterdetection，thepositiveandnegativecoincidentrateWas100％．TheresultsshowedthattheDFAofFITC一3B12havegoodspecificityandvalidityformajorityrabiesstreetstrainswhichWaswidespreadinallthecountry．Keywords：rabiesvirus；monoclonalantibody；detection；label4 青岛农业人学硕j卜：学位论文目录一目录前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11单克隆抗体技术在狂犬病诊断以及免疫学分析方面的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22单克隆抗体技术在狂犬病暴露后预防方面的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23狂犬病诊断方法的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯194讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯225小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24试验二狂犬病毒单克隆抗体的鉴定及标记⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251试剂材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯345d、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36试验三狂犬病毒单克隆抗体的初步应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371材料和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．⋯．．⋯⋯⋯．．405d、l{；⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯．．41参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42英文缩写词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46导师组意见⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50在研期间科研学术成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51 青岛农业大学硕士学位论文conte-ntscontentsForward．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．⋯．⋯⋯．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．⋯．．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．11Applicationofmonoclonalantibodyinrabiesdignosisandimmuneanalysis．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22Applicationofmonoclonalantibodyinrabiespost·exposureprophylaxis．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23Developmentofrabiesdignosis．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3Test1preparationofaiti-rabiesmonoclonalantibody．⋯⋯⋯⋯．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．⋯⋯．．．．．101Metarials．．⋯⋯⋯．⋯．⋯．⋯⋯．⋯．⋯．．⋯．．⋯⋯．．．⋯．．．⋯⋯．⋯．．⋯．⋯⋯．⋯．．．．．⋯．．⋯⋯．⋯．．⋯．102Methods．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．1qI：lResultS．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．194Discussion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：I：：!；Conclusion．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．．．24Test2identificationandlabelofmonoclonalantibodytorabies⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251Metarials．⋯．⋯．．．⋯．．⋯⋯．⋯⋯⋯．．．⋯．⋯．．．．．⋯．⋯．⋯⋯．⋯．⋯．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．⋯．．．⋯⋯⋯⋯．21；2Methods．．．．．．．⋯．．．．．⋯⋯．．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．：}7：IResults．．．⋯⋯．．．．⋯．．⋯．．．．．．⋯⋯⋯．⋯⋯．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．3l4Discussion．．．．．．．．．．．．⋯⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．⋯．⋯⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．345Conclusion．．．．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．⋯．．⋯．．．⋯．．．⋯．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．⋯⋯．．．．．36Test3primaryapplicationofanti-rabiesmonoclonalantibodies⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37lMetarials．⋯．．⋯．⋯⋯．．⋯．．．．⋯．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯⋯⋯．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．：；72MethodS．⋯．．⋯⋯．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．373Results．．．⋯⋯．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．⋯．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．384DiSCUSSion．．．．⋯⋯⋯．．．．．⋯．⋯．．．⋯．．．⋯⋯．．⋯．⋯⋯⋯．．⋯．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．401；Conclusion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．qllReferences．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4：IAbbreviationKeys⋯．．⋯．⋯．．⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯．．．⋯⋯⋯．⋯．．．．⋯．⋯⋯⋯．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．⋯．．．．4t；Ideasoftutorialgroup．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．47acknowledge⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48Briefintroductionofauthor．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．49ArticlepublishedduringMaster⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50 青岛农业大学硕士学位论文日U晶目lj吾狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种恶性人畜共患传染病，人和所有温血动物对狂犬病病毒都易感染。由于该病一旦发病发病迅速且治愈率极小，动物传染源广泛存在，控制难度很大，在我国及其他发展中国家，人和家畜仍受狂犬病的威胁和困扰【11。随着狂犬病在我国的流行呈上升趋势，全世界每年大约需要疫苗达5000万剂以上。人或动物接种狂犬病疫苗后，需测定其血清内的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus，姗中和抗体效价，不低于O．5IU／ml[21时，才可认为达到有效保护能力，否则应予加强免疫，直至达到保护水平。综上所述，如何利用有效的诊断方法对攻击咬伤人的动物以及隐形带毒动物进行狂犬病病毒快速、准确的诊断，对进行狂犬病疫苗免疫后的动物进行抗体监测，以便尽快启动暴露后人员的治疗，防止不可治愈性和致死性狂犬病的发生，是保证人和动物安全的当务之急。狂犬病病毒单克隆抗体可应用于狂犬病的诊断和免疫学分析，并得到了广泛应用13训，人源性抗狂犬病病毒单克隆抗体有望在狂犬病暴露后预防中取代狂犬病病毒免疫球蛋白(RabiesimmuneglobulinRIG)发挥重要作用【5羽，并可以减少RIG引起的过敏反应以及传播性疾病的危害。目前WHO推荐的用于狂犬病病原学实验室诊断的金标准免疫荧光法(DFA)以及评价狂犬病病毒(RV)中和抗体的快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)已经广泛应用于国内外。这两种检测方法均需要抗RV核蛋fl(NP)荧光标记抗体，而RV通过细胞培养的方法产量较低，不可能从RV颗粒中大量获取大量纯化的NP，而目前这种荧光标记的抗体在国内尚没有获得批准文号而通过商业途径可以获得，加上进口产品的价格昂贵，因此限制了这两种检测方法在国内的普遍应用和标准化。鉴于这种情况，开展此类研究，将非常有助于发展我国具有自主知识产权的狂犬病实验室检测和诊断用试剂，提高我国狂犬病监测能力。1978年Wiktor报道狂犬病病毒单克隆抗体的制备，此后，狂犬病病毒McAb技术在狂犬病的基础研究、诊断检测都得到越来越广泛的应用。本实验室采用人用狂犬病疫苗株和杆状病毒表达的RV核蛋白以及野毒株HNl0分别作为抗原制备抗RV单克隆抗体，然后对其进行了异硫氰酸荧光素(FITC)和辣根过氧化物酶(HRP)的标记，通过前者的标记，建立了直接免疫荧光法用于狂犬病病毒标本的检测，后者可应用于竞争ELISA方法的建立，本研究的进行可为狂犬病病毒抗原检测及疫苗质量把关等工作奠定基础。 青岛农业人学硕士学位论文刖鬲目前除日本、英国、夏威夷等国家和地区没有狂犬病发生以外，本病呈世界性分布流行。亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区，占世界死亡总人数的99％。在正式报告的狂犬病的国家中，印度每年有3万人以上死于狂犬病，居首位，我国居第二位；狂犬病是我国发病报告传染病中报告死亡数最多的病种，我国近两年每年统计到的死亡人数超过3000例，不仅对个人而且对社会的危害极大【71。目前为止，狂犬病病毒分为5个血清型，7个基因型，其中致人狂犬病的主要是基因l型狂犬病病毒。导致狂犬病在我国持续流行的机理尚不清楚。1．单克隆抗体技术在狂犬病诊断以及免疫学分析方面的应用杂交瘤细胞是融合后的细胞，因此它结合了两种亲代细胞的特性，既有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，而且还有免疫淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。单克隆抗体的灵敏度高、特异性好的优点，应用在狂犬病方面，对狂犬病的检测、诊断能力以及对狂犬病病毒的抗原分布、变异情况和其他分子生物学方面的研究，起到了极大的作用。狂犬病病毒核蛋白0岬)单克隆抗体能够特异性的识别狂犬病病毒，从而区分狂犬病病毒与狂犬病相关病毒。早在1978年McAb技术建立之初，wiktor和Koprowski就利用杂交瘤技术制各抗RV的McAb，用于检测RV抗原变异株并首次用McAb通过病毒中和实验证实了不同狂犬病病毒之间存在着抗原结构上的差异，特别是不同地理位置以及不同宿主动物来源的狂犬病毒。此后又进行了一系列用单抗分析狂犬病病毒抗原结构的研究，同时狂犬病病毒单抗还可以在同一血清型内进～步分组，建立用于狂犬病分类和抗原变异性研究的单抗反应谱系来分析宿主动物在各个地理位置的分布，从而进行流行病学分析【8】。同时单克隆抗体技术可用于狂犬病病毒五种蛋白不同识别位点的鉴定和他们不同功能的分析。通过文献：G蛋白上至少有4个抗原位点【9】，用特异性抗N蛋白单抗证明核蛋白表面有三个不同的抗原位点椰、Nil、Nill)，其中M和Nill两个位点分别与313．337和374．383位氨基酸的伸展有关，P蛋白上存在两个抗原位点，Hiramatsu也证明M蛋白存在几个抗原位点【101。狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体在狂犬病的诊断和免疫学分析中得到了广泛的应用，WHO推荐的用于狂犬病病原学实验室诊断的金标准免疫荧光(DFA)以及评价狂犬病病毒(RV)中和抗体的快速免疫荧光灶抑制试验(RFFrr)，这两种检测方法均需要抗RV核蛋白0qP)荧光标记抗体，因此对于抗狂犬病病毒单克隆抗体的研究还是非常有必要的。2．单克隆抗体技术在狂犬病暴露后预防方面的应用 青岛农业大学硕士学位论文根据世界卫生组织(WHO)推荐的狂犬病暴露后预防措施可知，对狂犬病III级暴露后的预防措施为注射狂犬病疫苗的同时注射抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabiesimmune西obulin，RIG)。目前人抗狂犬病毒免疫球蛋白(humanrabiesimmuneglobulin，HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(equinerabiesimmuneglobulin，ERIG)为最常使用的免疫球蛋白。人抗狂犬病毒免疫球蛋白价格昂贵，马的免疫球蛋白又存在副反应以及抗体反应抑制现象等，这些缺点无疑影响了这两种免疫球蛋白的普及，但是抗狂犬病病毒单克隆抗体既能解决副反应、抗体反应抑制现象又具有成本低，可大量获取的优点，因此，不断有人[111尝试用抗狂犬病病毒单克隆抗体取代这种免疫球蛋白，以期其在暴露后预防中发挥作用。单克隆抗体鸡尾酒疗法是其中一个例子，这种方法始于1989年，Schumacher等【12】将多株鼠源的抗狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白的单克隆抗体混合使用，注射到感染狂犬病病毒的小鼠体内，进行动物保护实验。动物的保护性实验证明：致死量狂犬病病毒被动免疫后，这种单克隆抗体混合使用的方法能够完全抵御其攻击，对动物起暴露后预防保护作用。继而Fu、Montano、Muhamuda等人相继制备了针对不同蛋白的单克隆抗体，并进行了动物实验比较了RIG和单克隆抗体的保护性作用，并分析了糖蛋白单克隆抗体在暴露后预防的效剁”d51。3狂犬病诊断方法的研究进展：临床诊断根据卫生部2008年最新修订的狂犬病诊断标准，狂犬病的临床表现分为狂躁型和麻痹型。其中，狂躁型在我国最常见，主要表现为在愈合的伤口及其神经支配区有痒、痛、麻以及蚁走的感觉，之后出现高度兴奋、交感神经兴奋症状如心率加快、。多汗、流涎、吐沫、血压增高，怕风、阵发性咽肌痉挛，恐水等【161。逐渐发生全身迟缓性瘫痪，最终因呼吸、循环衰竭而死亡。麻痹始见于头部肌肉，该型在我国较为少见，病犬表现吞咽困难，恐水等，随后发生四肢麻痹，进而全身麻痹以致死亡。我国现在主要还是以临床表现诊断狂犬病为主，目前实验室诊断刚刚开始，对临床诊断病例尚不能达到100％实验室确诊。加上世界卫生组织提出只有实验室诊断才能确诊狂犬病【17】，因此还需要实验室诊断做出确诊，我国也提出了相应的实验室诊断要求并开发和建立了国际通用的狂犬病实验室诊断方法。实验室诊断方法组织学检测方法：内基氏小体的检测：内基氏小体为lqegri首次发现118】一种嗜酸性的包涵体，存在 青岛农业人学硕十!学位论文HU品于感染组织内，包括海马回、脑干、小脑等的细胞胞浆，此法能够在抗原量比较少的情况下，与其他方法相比得到更为准确的结果。但是其敏感性和可靠性不高，经大量调查发现，25％或以上的患病动物没有或检测不出内基氏小体，因此内基氏小体的示病作用作为公共卫生学检测目的时，价值有限【19】，究其原因可能与取样量有限有关，取样时可能取到了未经感染的组织导致假阴性，因此国际上已经不推荐使用此方法作为狂犬病诊断的实验室检测方法。免疫学检测方法：免疫学方法主要有以下几种。酶联免疫吸附试验(ELISA)：该方法用于大量样本的检测，不需要昂贵的仪器，而且在没有酶标仪的情况下也可以肉眼观察结果。该方法既可以用于检测抗原，也可用于检测抗体，目前世界上用于检测狂犬病病毒抗体的酶免疫法基本上是采用间接ELISA法。李金中等【20】建立的夹心Dot-ELISA在检测狂犬病病毒时使用较多，该法适用于狂犬病的诊断、流行病学调查和疫苗效价测定，该法灵敏度高，检出狂犬病病毒抗原的最低浓度为0．01IU／mL的标准抗原，重复性好。WHO推荐应用法国Pasteur研究所研制的快速狂犬病酶联免疫诊断方法用于检测脑样品中狂犬病核蛋白，现已市售，试剂盒名称为Platelia狂犬病诊断药盒，酶联免疫试剂诊断试剂为(RapidRabiesEnzymeImmuno．Diagnosis，RREID)，本方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、重复性好、不需要昂贵仪器等特点，最适合于做现场流行病学调查，也可作为狂犬病疫苗或狂犬病毒的鉴别诊断，检测结果可以很容易的用肉眼判别。所以一些不具备FAT条件的实验室完全可以使用检测抗原。美国Bio．Rad公司生产的狂犬病毒中和抗体检测试剂盒(PlateliaRabiesII)现已商业化并上市，是利用纯化灭活的病毒的糖蛋白为抗原，检测待测血清，然后加上连接有过氧化物酶的SPA蛋白，来检测待测血清中中和抗体的存在。有报道称此类ELISA方法可以检测免疫狂犬病疫苗后产生的中和抗体水平【211。据报道，ELISA方法检测免疫前和免疫后的狂犬病抗体敏感性和特异性与RFFIT一致【221。而检测N蛋白的双抗体夹心ELISA方法已于2004年11月份被中国药品生物制品检定所列为我国狂犬病疫苗鉴别诊断试剂。目前我国省市疾控中心多采用该方法，用于狂犬病毒抗体的检测。荧光抗体实验：直接荧光抗体检测为WHO专家委员会推荐的狂犬病诊断方法【231。国内于1998年首次使用该方法，该法是先利用球蛋白浓度确定的抗狂犬病高免血清以及荧光素异硫氰酸脂(FITC)$1J备好狂犬病高免荧光抗体，再取病料制备脑组织涂片，进行荧光染色。该方法可直接检测涂片的组织，也能用于检测细胞培养或被接种小鼠的脑组织中狂犬病病毒的存在情况。检测过程耗时短，若与单克隆抗体技术相结合能在一定程度上提高其特异性。当检测组织腐烂情况比较严重或者样本损坏严重无法对脑干、小4 青岛农业人：学硕士：学位论文前言脑或者海马角组织进行检查出现的阴性结果仍需要反复验证。乳胶凝集实验(1atexagglutinationtest，LAT)：本方法是用乳胶包被纯化的马抗狂犬病病毒的IgG抗体血清，乳胶能够使抗原抗体的反应放大，使结果更明显【241。KasempimolpomS等【25】报道，乳胶凝集试验能够检测在患病犬的脑和唾液标本中的狂犬病病毒，同时，乳胶凝集试验和FAT相比较得出，乳胶凝集试验敏感性达到95．2％，特异性达98．7％，阳性符合率97．6％，阴性检出率达97．4％。胶体金免疫层析法(GICA)：将羊抗鼠IgG(对照线)和抗狂犬病病毒单克隆IgG(检测线)VA条带状固定在膜上，胶体金标记抗体吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成抗狂犬病病毒抗体．狂犬病病毒．金标抗体的抗原抗体复合物而出现红色线。范晓娟，李刚等【26】应用基因工程的方法制备抗原蛋白，通过优化实验条件，成功地建立了胶体金免疫层析方法，对临床样品进行检测，其结果和ELISA相比具有较高的符合率。2004年，徐葛林【27】等人研制的GICA测试条特异性良好，检测可疑狂犬病犬唾液样品GICA与酶免疫检测(EIh)符合率达88．2％。该方法不需要额外的仪器设备、试剂以及专业技术人员，灵敏度高，特特异性好，速度快，可广泛应用于基层【281。．．病毒中和试验：1996年smith等建立的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和1998年Cliquet等建立的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)已经分别被WHO和OIE采纳，作为狂犬病中和抗体检测的处方方法，两种方法均采用单层细胞上接种一定量的狂犬病病毒和不同稀释倍数的血清混合液，24h37℃5％C02孵箱培养后，用80％丙酮4"C固定30rain，以FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体染色，最后判定待检血清的效价。前者用于检测动物血清样品抗体水平时，结果的一致性稍差，结果判定时主观性较强(需要人工准确对病毒增殖形成的荧光灶数量进行计数)。后者结果判定可靠，受主观因素影响小，操作简单，检测结果一致性好，适合大规模样本检测等。另外，梁红茹等人【29】建立了一种狂犬病毒新型快速荧光斑点抑制实验方法，该方法是用带绿色荧光蛋白基因的嵌合狂犬病毒HEP．GFP株为基础毒株建立的。结果显示，该方法与RFFIT方法的结果符合率较高，但还需要进一步的优化。上述几种方法都是用活的细胞和病毒进行测定，对仪器设备、操作水平和生物安全的要求较高，仅适合在实验室对少量血清样品检测使用。小鼠中和试验(MNT)是1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐使用的检测狂犬病毒中和抗体标准检测方法。该方法是将待测血清与一定浓度的病毒进行孵育之后进行 青岛农业．大学硕：卜!孚：何论文刖再成年小鼠脑内接种，根据小鼠的发病情况判断血清中中和抗体的滴度。该方法可定量检测狂犬病病毒中和抗体效价，但该方法存在的问题是动物间的个体差异会影响试验结果另外操作较繁琐，耗时长，不利于快速诊断，成本高。核酸检测：该方法可能会由于采样的不全面导致假阴性，但是由于核酸诊断可适用于多种样本且敏感性较高，因此可将其与常规诊断技术结合，当DFA检测结果不正常或者与预期结果不一致时，可用该种方法予以确诊性检测。反转录．聚聚合酶链反应(RT-PCR)：N基因是RV核蛋白的编码序列，它是毒株间保守性最好的基因，同时病毒增殖过程中拷贝数高f301，这些特性使其成为PCR检测的靶基因，可用于RV的诊断和病毒分型。该方法利用保守的N基因作为特异性引物设计靶基因，对病毒全基因组进行克隆和测序，几个小时内建立诊断。2006年，Vazquez．Morohs掣31】建立了用于检测所有7个基因型的RT-PCR方法。BiswalM等【32】应用套式RToPCR方法对保存5-6年的6份阳性和8份阴性非固定的脑组织样本进行了回顾性检测，结果特异性为100％，并且与对照样品无交叉反应。张建明等【33】建立的应用RT-ncsted-PCR检测犬唾液中狂犬病毒该方法为狂犬病的快速诊断提供了一种新思路。下表为我国及世界上常用核酸检测的引物和探针序列： 青岛农业人学硕士学位论文前言7 青岛农业大!学硕十!学位论文f1U鬲荧光定量PCR：近年来荧光定量PCR技术的不断发展已成为RNA病毒研究的重要手段。该方法是针对狂犬病毒N基因组保守区设计并合成了一对引物和一条TaqMan探针，对实验过程，包括临床样品操作荧光定量PCR和实验整体过程的各个步骤进行优化研究，建立了一套特异的检测方法。张强等【删通过检测狂犬病病毒N基因片段的TaqManPCR，与传统反转录PCR检测方法相比，其敏感性提高了10倍。WakeleyPR等【45】建立了用于RV基因1、5、6型鉴别的实时定量RT-PCR(real．timeRT-PCR)。目前国内的数个实验室已经建立了荧光定量PCR检测方法，国外个别实验室也建立了相应的检测技术。原位杂交法(ISH)：该方法的原理是利用其靶基因即编码一个或五个全部的病毒结构蛋白的基因组单链RNA或mRNA做为探针，检测标本中病毒的存在情况。NadinSA等【蛔研制了基因型特异性探针Q∞otype-speci矗cprobes)，可用于福尔马林固定的狂犬病标本RV的基因分型。CamieliJpt47"J等用RT-PCR方法扩增的PV株N基因cDNA为探针来检测病毒核蛋白基因，结果与RT-PCR方法相比，符合度为100％。FirmeganCJ等【48】研制了用于RV和欧洲蝙蝠1、2型病毒检测的RNA探针(riboprobes)。这种方法不仅可以检测病毒基因组RNA，还可以检测mRNA已确定病毒是否复制。另外还可应用递减PCR法、嵌套PCR方法及Y-FullRACE等多种方法对病毒基因进行测序检测【491。生物学检测方法：狂犬病毒的体外培养法通过接种动物或者细胞分离培养病毒，为最常用的病毒确诊方法。病毒分离后才能对病毒做出进一步的传代，并通过抗原或者遗传学分析进行特性鉴定。目前狂犬病病毒分离的两种方法是乳鼠接种试验Mrr和细胞分离试验。狂犬病组织培养接种试验(ⅪCIT)敏感性高、诊断简便快速。可从死后的脑组织、唾液腺以及皮肤、脑脊液的细胞分离培养病毒，从而作出诊断。但是从活体动物分离获得的样品，结果呈阴性时也不能轻易下结论。脑组织检查呈阳性的动物中，仅有少数在皮肤活组织，唾液和CSF检测中亦呈阳性。乳鼠接种试验Mrr：小鼠病毒中和实验广泛应用于人和动物疫苗接种后抗体水平检测。此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年WHO狂犬委员会建议人暴露后【50】，当所有脑组织样品采用FAT检测阴性时，必须采用MIT进行进一步的确定。但小鼠中和试验时间长，操作复杂，不适合门诊狂犬病暴露者抗体测定，而且仅凭动物发病症状不足以确诊，常常配合免疫荧光法做特异性鉴定。细胞培养分离狂犬病毒：有些实验室因为细胞培养分离狂犬病病毒操作简便以及费用较低而逐渐代替MIT，MNA细胞是一种小鼠成神经瘤细胞，因为狂犬病病毒是嗜神 青岛农业大学硕：仁学位论文HU舌经性病毒，神经细胞对狂犬病毒最敏感，该方法是将待测组织悬液离心后接种细胞，培养一定时间后，冷丙酮固定，然后用荧光标记的抗狂犬病毒核蛋白单抗染色，发现黄绿色特异性荧光者表明检测样品中含有狂犬病病毒。MNA细胞培养法对样品中狂犬病街毒的检测具有高的灵敏度和特异性，研究证明MNA细胞培养分离狂犬病毒街毒的敏感性与MIT方法相掣51。52】。汪霞，徐葛林等【53】证明MNA细胞培养分离方法可用于狂犬病街毒的检测和分离。该方法存在的弊端是如果接种样品有细菌等的污染，会导致接种失败。下表为常用于狂犬病病毒分离培养的细胞系：细胞系出处BHK-21细胞系MNA细胞系BSR细胞系VERO细胞系[54】[55][56】[57]现在我国狂犬病状况：目前我国狂犬病病例监测主要还是临床诊断为主，实验室诊断率很低，造成这种现象的原因主要是狂犬病多为散发，加之早期症状繁多，尤其是当未出现恐水、怕风等症状时，诊断较为困难，易误诊为其他疾病。另外在我国真正能检测狂犬病的实验室较少，而且技术人员的整体技术水平有待提高。目前狂犬病实验室诊断主要应用世界卫生组织(wiqo)推荐的DFA法和RT-PCR。而DFA方法在省市CDC由于荧光显微镜和技术人员缺乏的原因不能普及。伴随着科学技术的快速发展及科研工作者的努力，很多新型的狂犬病病毒检测及狂犬病诊断方法开发出来并在继续开发，对于实验室检测，原则上应采用两种以上的方法同时检测，以达到相互印证的目的。快速、敏感并能适合于野外和实验室操作为今后狂犬病毒抗原检测、血清抗体监测及病毒核酸检测方法开发研究的方向。 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备狂犬病病毒单克隆抗体在狂犬病的诊断和免疫学分析中得到了广泛的应用，并有望在狂犬病暴露后预防治疗中发挥作用。WHO推荐的用于狂犬病病原学实验室诊断的金标准免疫荧光(DFA)以及评价狂犬病病毒(RV)中和抗体的快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)已经广泛应用于国内外。这两种检测方法均需要抗RV核蛋白(NP)荧光标记抗体，而RV在细胞培养中的产量较低，不易从RV颗粒获得大量纯化的NP，目前这种检测试剂在国内尚没有获得批准文号和商业途径可以获得，而进口产品价格昂贵，因此也限制了这两种检测方法在国内的普遍应用和标准化。鉴于这种情况，开展了此类研究，以期获得具有自主知识产权的狂犬病实验室检测和诊断用试剂，提高我国狂犬病监测能力。1978年Wiktor报道狂犬病病毒单克隆抗体的制备，此后，狂犬病病毒McAb技术在狂犬病的基础研究、检测和诊断、治疗中都得到越来越广泛的应用。本实验室采用人用狂犬病疫苗株和杆状病毒表达的RV核蛋白以及野毒株HNl0株作抗原制备抗RV单克隆抗体，详细内容见下文。1材料1．1细胞株BHK-21细胞为乳仓鼠肾细胞，为狂犬病病病毒敏感的细胞株之一。BSR细胞为BHK．21细胞的一个克隆，引进自法国巴斯德研究所狂犬病室，由本实验室保存。SP2／0骨髓瘤细胞为新疆维吾尔族自治区疾病预防控制中心馈赠，由本实验室保存。1．2病毒株CVS．11病毒是狂犬病病毒国际标准攻击毒株，购自中国药品生物制品检定所，由本实验室保存。经测定，病毒滴度为2×106，该病毒最佳病毒攻击量即80％细胞感染量为15倍稀释。1．3实验动物BAka／C小鼠：免疫用BALB／C小鼠为6．8周龄，雌性小鼠。制备饲养细胞用BALB／C小鼠为8．10周龄雌性小鼠。制备腹水用BALB／C小鼠为10．12周龄，雌性小鼠。 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病痛毒单克隆抗体的制备免疫用抗原：真核表达的狂犬病病毒N蛋白【58】，为本科室通过RT-PCR技术扩增获得CVS．11N基因片段，克隆进杆状病毒供体质粒pFastBac中，构建克隆有CVS．11N基因杆状病毒重组表达质粒，然后转染Sf9昆虫细胞获得。狂犬病人用疫苗PV株浓缩液，辽宁成大生物股份有限公司馈赠，为狂犬病毒PV株，于1882年分离自法国巴黎一疯牛，经过兔脑传代致弱，细胞培养制成疫苗。HNl0株狂犬病病毒灭活液：HNl0株病毒为本科室2006年于湖南永州市男性15岁病人脑组织标本中提取，并经接种乳鼠脑内培养扩增。1．4主要试剂检测用试剂：伊文思蓝荧光素标记的抗狂犬病病毒核衣壳蛋白单克隆抗体Anti··MouseIgG(Fabspecific)··FITCantibodyproducedingoatPBS磷酸盐缓冲液粉剂(259PH7．4)细胞培养用试剂：DMEM培养液胰酶、EDTA双抗(青霉素／硫酸链霉素)胎牛血清苯扎溴铵溶液1640培养液I-IT培养基HAT培养基二甲基亚砜(DMSO)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂牛血清白蛋白(BSA)主要耗材、仪器Solarbio公司Millipore公司SigmaSolarbio公司GmCO公司由本所配液室提供GIBCO公司杭州四季青生物工程材料有限公司北京德润制药有限公司GmCO公司GIBCO公司GmCO公司美国Axygen公司Sigma公司 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备C02孵箱．20℃冰箱．80℃超低温冰箱普通离心机超速离心机6孔、24孔和48孔细胞培养板96孔可拆卸酶联反应板96孔微孔细胞培养板10ml、5ml、2ml吸管15ml、50ml离心管25cm2、75cm2细胞瓶2ml冻存管lml、2009l吸头酶标仪制冰机倒置荧光显微镜恒温水浴锅倒置光学显微镜微量可调移液器细胞计数板超纯水仪1．5试剂配制日本SANYO公司伊莱克斯(中国)电器有限公司日本SANYO公司美国Costar公司美国Coming公司美国Axygen公司Bio．rad公司日本SANYO公司奥林巴斯IX51德国优莱博(JULABO)公司奥林巴斯CXX41德国Eppendorf公司上海求精生化试剂仪器有限公司Millipore公司荧光素标记的抗狂犬病病毒核衣壳蛋白单克隆抗体染色液的配制：先用10ml蒸馏水溶解O．19伊文思蓝粉剂，制备1％的伊文思蓝溶液。然后1％伊文思蓝染色储存液按照1：300的比例，荧光标记的抗狂犬病病毒核衣壳蛋白按照1：50的比例，加入到PBS中，制备狂犬病毒荧光抗体染液。PBS缓冲液20mlFITC··N--Ag4009l1％的伊文思蓝溶液679l 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体i,Ol；i备荧光素标记的羊抗鼠IgG溶液的配制：先用10ml蒸馏水溶解O．19伊文思蓝粉剂，制备1％的伊文思蓝溶液。然后Anti·MouseggG(Fabspecific)-FITCantibodyproducedingoat按照1：60的比例，1％伊文思蓝染色储存液按照1：300的比例加入到PBS中，制各荧光素标记的羊抗鼠IgG溶液。胰酶消化液的配制：胰酶50mlEDTA150ML将从配液室领来的胰酶液与EDTA液按照l：3的比例配制。DMEM培养液的配制：DMEM培养液90ml双抗lmlFBS10mlDMEM培养液中加入10％的FBS和1％的双抗，配制成BSR细胞生长液。20％FBS的1640培养液的配制：1640培养液79mlFBS20ml双抗lml1640培养液中添加20％的FBS和1％的双抗，配制成SP2／0骨髓瘤细胞生长液。HT、HAT培养液的配制：HT培养液的配制：1640培养液74mlFBS20ml50xHT浓缩液5ml青霉素／硫酸链霉素(12抗)lmlHAT培养液的配制：1640培养液78mlFBS20ml100xHAT浓缩液lml双抗lml细胞冻存液的配制：FBS9ml 青岛农业火学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备DMSOlml将FBS与DMSO按照9：1的比例配制后用于细胞株的冻存。PBS磷酸盐缓冲液的配制(O．01M、PH7．2．7．4)按照说明书将整包的PBS粉剂(259)溶解于2000ml的蒸馏水中。2方法2．1检测用细胞抗原板的制备2．1．1BSR细胞的复苏和培养将一冻存管的BSR细胞从液氮罐中取出迅速放入37"C的水浴锅中，2min融化后，吸进1．5ml的离心管内1000r／min低速离心，然后将细胞吸进25cm2培养瓶内，置37"C、5％C02孵箱中培养。等细胞铺满瓶底用2ml的胰酶温和洗涤2次再加入2ml的胰酶于37"C孵箱孵育5min左右，显微镜下细胞开始圆缩，细胞瓶瓶面出现边缘粗糙时，弃掉胰酶，用6ml含10％FBS的DMEM培养液将细胞重悬，按照1：3的比例进行分瓶传代，每2ml细胞悬液／25cm2小瓶，补加10％FBS的DMEM培养液至5ml后继续37"C、5％C02孵箱中培养。2．1．2细胞接种病毒细胞再次铺满瓶底后同样方法用胰酶消化，用培养液重悬后计数，准备细胞计数器，依次使用水和酒精清洁计数器和盖玻片的表面，用不含棉绒的纸巾擦拭；将盖玻片缓慢平放在细胞计数器的中间突出面；用枪头吸取稀释后的细胞悬液刚好注满一侧的细胞池，在显微镜下用10x物镜进行细胞计数。并按照公式：稀释倍数x(Al电墟+A3_锚)／4×104计算细胞数目，A1、A2、A3、A4分别代表四角四个大方格。计数后将细胞稀释成lxl06，然后按照该病毒已知80％病毒感染量对病毒液进行15倍稀释，加入到细胞悬液中，37"C、5％C02孵箱中孵育lh，然后按照100ul／孔加到96孔板中，37℃、5％C02孵箱中培养24h。同时用未经病毒感染的空白BSR细胞以同样的细胞密度加在细胞对照孔内。2．1．3感染病毒后细胞的固定将培养24h后的细胞从孵箱中取出，弃掉细胞培养液，PBS洗两遍，然后按照50彬孔加入．20℃预冷的丙酮，4。C温度下固定30分钟。弃掉丙酮，PBS洗板3遍，室温自然干燥后即为抗体检测用细胞抗原板。将所得的细胞抗原板置于．70℃冰箱保存备用。2．2BALB／C小鼠的免疫2．2．1抗原处理 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备本实验总共采用三种不同的抗原免疫小鼠，分别是：真核细胞表达的狂犬病病毒N蛋白【58】、狂犬病人用疫苗PV株浓缩液、狂犬病病毒HNl0街毒株，两种病毒液均经过灭活后作为免疫用抗原。病毒的灭活将病毒感染的脑组织无菌研磨，按照1：10的比例加入O．5％乳蛋白Hanks液制成病毒悬液，3000r／min离心30min，取上清。将病毒悬液和B．丙内酯以1：8000．1：4000的比例混合，4"C放置24h灭活，次日37℃水浴2h除去B．丙内酯。抗原的乳化处理分别将等量的完全弗氏佐剂和免疫用的三种抗原进行混合和乳化。具体操作步骤如下：将其中一种抗原吸到三个无菌注射器内，另一个注射器吸进相同体积的完全弗氏佐剂，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。鉴定，将一滴乳化剂滴入水中，完整不分散且成滴状浮于水面的为合格的油包水剂。剩下两种抗原做相同处理。2．2．2小鼠免疫免疫用抗原为真核表达系统表达的抗狂犬病病毒CVS．11株核蛋白和人用狂犬病病毒PV株疫苗的浓缩液。两种免疫用抗原悬液，用紫外分光光度仪粗测其蛋白含量为1．1．5mg／ml，然后按照文献【59】中免疫程序中建议量进行不同浓度的稀释达到15099／0．5ml。然后用PBS溶液稀释到免疫用浓度(见表1．1)。表1．1狂犬病病毒cvs-11株核蛋白和Pv株抗原小鼠免疫程序Table1．1Immunizationprocessofrabiesvirus(CVS-11swain)nueleoproteinandPVstrainantigeninmice2．2．3小鼠免疫效果测定：小鼠于第2次免疫后及最后一次免疫后分别通过眼球采血，采集的血液3000rpm离心15分钟，分离的上清即为待测血清；从冰箱中取出制备好的细胞抗原板，用PBS振洗2遍，蒸馏水振洗1遍，晾干；待测血清1：10开始10倍系列稀释(用0．01mol／L，pH7．4的PBS稀释)，最终稀释浓度为1：1010，50urge垂直滴加在细胞抗原板孔内。将检测板置于有盖湿盒内，37"C保温30min；取出检测板，用加0．5％Tween．20的0．01mol／L、pH7．4的PBS洗2遍，蒸馏水洗1遍，晾干。孔内滴加一滴1：50稀释的荧光素标记的羊】5 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备抗鼠IgG，37。C保温30rain；洗板后晾干，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片；荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定：(．)无荧光；(士)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(卅一+卅)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(士)或(．)，即可判定为阳性结果。2．2．4加强免疫在融合前3天对免疫应答检测效果好的小鼠再通过腹腔注射无佐剂抗原进行加强免疫。免疫剂量和方法同第四次免疫(见表1．1)。2．3SP2／0骨髓瘤细胞的培养对SP2／0细胞经行复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管放到37℃水浴锅中5rain，然后1000r／min离心5min，弃去上层液，每个冻存管中加入lml1640，悬起细胞，在饲养细胞的孔中加入0．5ml的1640后，将这2ml细胞液平均加到24孔板的盛有饲养细胞的孔中，37"C，湿度为96％，5％C02孵箱中培养。将24孔板中六孔SP2／0骨髓瘤细胞，每三孔用弯头吸管吹打后全部吸到一个25cm2的细胞瓶中，5％C05孵箱中培养。其中48孔板中六孔再加入2mlRMPI．1640继续培养。2．4饲养细胞的制备饲养细胞取自8,--,10周龄雌性BABL／C小鼠腹腔巨噬细胞。8．10周龄雌性BABL／C小鼠眼球取血分离其血清．20℃保存用于阴性对照。然后将小鼠处死并浸泡于来苏儿中消毒5min。固定小鼠后，在超净台内按无菌操作剥离小鼠腹部皮肤，暴露腹壁，用一次性注射器吸取5ml10％胎牛血清的DMEM注入小鼠腹腔内，注意不可弄破肠壁和腹膜。用镊子或手轻轻挤压小鼠腹部20次左右，吸出腹腔内的液体，可重复2．3次。将吸出的腹腔巨噬细胞移入1块48孔板中的六个孔中，大约每孔有lml的细胞液，37℃、5％C02孵箱培养备用。2．5细胞融合SP2／0细胞的准备融合前两天，将SP2／0细胞扩大至1个75crn2细胞培养瓶中培养。融合时将细胞从培养瓶中轻轻的悬起，吸至50ml离心管中，37"C静置5rain，1000rpm离心5min，吸弃上清，用10ml不含FBS的RPMI．1640培养基洗一次。注意洗之前先用手指轻轻弹离心管使沉淀的细胞散开。细胞计数调整瘤细胞浓度。免疫脾细胞的制备待融合当天眼眶取血法处死免疫效果最好的小鼠，制备并保存其血清做阳性对照，加入0．01％叠氮钠(W／V)少量分装．20℃备用。将处死小鼠在来苏尔消毒液中浸泡数16 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备分钟后移入超净台，无菌取出小鼠脾脏于无菌培养皿中100目不锈钢铜网上，加10mlHT培养液，用注射器针芯轻柔研磨脾脏使淋巴细胞充分游离出来，缓慢吸至50mL离心管中。2000rpm离心5min，吸弃上清，再用HT培养基洗一次。重悬，细胞计数。免疫小鼠脾细胞与SP2／0细胞的融合按照文献【60,61】的方法，将培养好的加有饲养细胞的SP2／0细胞与脾细胞按照1：5的比例加入已准备好的免疫脾细胞，2000rpm离心5min，然后轻轻扣松沉淀，60秒内逐滴加完50％的PEG40000．8．0．9ml，静止反应lmin30s，分三次加完30ml1640培养基，以终止反应。然后500rpm离心5min。弃去上层液体，用200ml含20％血清(FBS)、I％HAT的RMPI．1640选择培养基重悬融合细胞，100111／孔的量加到20块96孔板中。置37℃，5％C02孵箱中培养观察。2．6融合杂交瘤细胞的筛选与克隆化培养2．6．1检测方法融合后每天观察融合细胞，待细胞板孔内细胞堆面积占到板底帕时，大约第10天开始用间接免疫荧光法对融合细胞上清进行检测，用已制备好的细胞抗原板检测，设置未经免疫小鼠血清为阴性对照，免疫小鼠血清为阳性对照。阳性杂交瘤细胞数传代过程中由于不稳定和受到损伤的原因可能会失去分泌抗体的能力，所以检测分三批进行，第一批检测阳性后要进行复核检测，传代后继续进行检测阳性的为阳性杂交瘤细胞株。2．6．2杂交瘤细胞的克隆培养筛选出阳性杂交瘤细胞孔内若是单个细胞则直接进行倍比稀释法克隆，若是多个细胞，则结合显微克隆技术则要结合显微克隆技术，分成多个单细胞克隆然后进行连续倍比稀释法分成为单一细胞，进行克隆培养。再次克隆后挑选出的阳性克隆孔用于建立细胞株。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交细胞尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，导致抗体分泌细胞丢失。克隆后挑选出阳性克隆孔，进行建株。克隆的前一天制备饲养细胞，方法如前所述。然后取一个96孔板，100J．tl／孔放置细胞生长液，制成稀释板。将检测为强阳性的细胞孔用吸管轻轻吹吸使细胞分散均匀，取lOOva置于稀释板的第一孔，连续倍比稀释11个孔。静置30min后，显微镜下观察，数出50个细胞的孔，将孔内的细胞收集，用20％胎牛血清的1640培养液稀释成5ml，100叫孔加到克隆板的50孔内。置37℃，5％C02孵箱中培养，第8．10天采集上清检测，选择仅有一个克隆生长的阳性孔传到48孔板建株。每次克隆化的同时将剩余细胞进行扩大培养冻存。经过1．2次克隆化，直至所有克】7 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制各隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2．7阳性杂交瘤细胞的扩大培养建株后每隔～代要检测一次细胞抗体分泌情况，再挑选出连续四次检NgEt性的细胞株，继续扩大培养，采取从48孔板，到24孔再到6孔板和细胞瓶的程序依次扩大培养。阳性细胞株要及时冻存以免丢失。冻存一个月后复苏检测细胞上清抗体滴度。2．8抗狂犬病病毒单克隆抗体腹水制取和效价测定挑选10周龄雌性Balb／c小鼠15只，腹腔注射灭菌石蜡油0．5ml／只。7天后，将杂交瘤细胞3812和4A12(由于588获取较晚，因此后续工作只针对这两株细胞进行)从培养板上吹打下来，1000r／rain离心10min，弃上清，用少量无血清的1640培养液重新悬浮，细胞计数，调整细胞数量为2x106个／ml。每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞0．5ml。7．10天后，当小鼠腹部极度膨胀，被毛竖起，行动受限时抽取腹水，抽取腹水采用无菌18号针头。将所得腹水3000r／min离心10min，收集上清，上清56℃灭活30min，．20℃保存备用。腹水效价测定：采用上述间接免疫荧光法，将所得腹水做为一抗从1：1000开始分别进行倍比稀释和lO倍系列稀释，最终稀释浓度为10000和1010，倒置荧光显微镜下观察结果并进行分析。2．9阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏2．9．1阳性杂交瘤细胞的冻存每次克隆均要冻存10．20个阳性杂交瘤细胞株。具体步骤为：1)选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下；2)1000rpm离心10min，弃上清，收集细胞沉淀：3)用冻存液(10％DMSO，90％FBS)将细胞沉淀悬浮，lml／管分装于冻存管中，加盖封严，并注明细胞批次、冻存日期；4)将冻存管先放置4"C，放置30mira5)然后转至．20℃冰箱放置2h；6)再移至．70"C低温冰箱中过夜，最后放入液氮罐中，并作好记录，长期保存。2．9。2阳性杂交瘤细胞的复苏从液氮罐取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴，轻轻摇动使其尽快在2min内融化。1000rpm离心10rain，弃上清。用20％血清1640培养液将沉淀悬浮，加入24孔板的3个孔内，置37℃5％C02孵箱内培养。为了提高细胞成活率，可以在24孔板内提前一天1只 青岛农业人学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备加入100“1的饲养细胞，饲养细胞制备方法如前所述。2．9．3阳性杂交瘤细胞的传代培养用含10％新生牛血清的RPMI．1640培养基，传代时，因杂交瘤细胞为半悬浮生长细胞，可根据需要弃去培养瓶内的部分培养液，轻轻摇晃数次或者用吸管稍微吹打几次即可悬浮，将悬浮的细胞重悬于适当体积的培养液中，摇晃数次使细胞分散均匀后分瓶，置37℃，5％C02温箱内培养。3实验结果3．1免疫用抗原的制备和病毒灭活：真核表达核蛋白经粗测后的含量为1．Smg／ml，经PBS稀释后进行免疫。HNIO株病毒经灭活后的含量接近于1．5mg／ml，经电泳验证灭活彻底后将灭活后的病毒常规接种BSR细胞，过夜孵育后丙酮固定，间接免疫荧光法检测并无荧光点的出现，进一步说明病毒灭活彻底。3．2抗原免疫小鼠效果检测将第二次免疫后以及全程免疫结束后的小鼠取尾血，室温静置1h后3000rpm离心，取上层血清用间接免疫荧光法检测抗体水平。用上述方法制备的抗原检测板，将所得的血清做一抗，从1：1000开始分别进行倍比稀释和10倍系列稀释，每个稀释度做3个平行对照，滴加在细胞抗原孔中，用FITC标记的羊抗鼠IgG做二抗，通过间接免疫荧光方法检测，测得小鼠免疫血清抗体滴度均达到1：1000以上。3．3间接免疫荧光检测结果融合后细胞开始分裂生长，大约第十天，单个的细胞长成圆丘状的一堆细胞，大小能成占孔底1／3。此时开始进行筛选检测，同时获得三株所获取单抗细胞培养上清效价均在1：800．900左右。由于细胞生长分裂参差不齐，本实验采用分三批进行检测，同时，筛选出细胞传代的过程都要进行检测。每一次检测细胞会因为传代受仪器冲击损伤或者本身稳定性差的原因而失去分泌抗体的能力。表2融合结果：表1．2狂犬病病毒核蛋白及人用浓缩疫苗、HNIO病毒免疫小鼠的融合及筛选结果Table1．2FusionandscreeningresultsofmiceimmunizedwithrabiesYk-U$nueleoprotein，19 concentratedvaccineforhumanuseandⅡN10vrius表达核蛋白免人苗PV株I-INlO病毒疫融合比例92．6％83．9％81％第一次筛选阳性克隆孔数423921第二次筛选阳性克隆孔数673第三次筛选阳性克隆孔数l21克隆阳性比例40．6％43．8％80％最终亚克隆阳性比例100％命名38124A12588图1．1间接免疫荧光检测阳性细胞图(400X) 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备图1．1所得单抗细胞上清原液间接免疫荧光法检测400x倒置荧光晁微镜下镜检结果A为3812株单抗；B为3812空白细胞对照；C为4A12株单抗；D为4A12空白细胞对照；E为588株单抗；F为588空白细胞对照；G为Miflipore公司抗RV核蛋白单克隆抗体；H为其空白阴性对照。Fig．1．1Examinationresultsofthemon岫clonalantibodycellsupernatantobtainedusingindirectimmunofluorescenceunder200×invertedfluorescencemicroscope‘Ais3812strainmonoelonalantibody；Bis3812blankcellcontrol；Cis4A12strainmonoclonalantibody；Dis4A12blankcellcontrol；21 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备Eis588strainmonoclonalantibody；Fis588blankcellcontrol；GlSanti-RVnucleoproteinmonoclonalantibodyfromtheMilliporeCorporation；HISitsblanknegatavecontr01．3．4腹水制备结果小鼠接种杂交瘤细胞后，第7天可见腹部略微胀大，第9．10天腹部明显胀大。小鼠行动缓慢，如不及时收集腹水小鼠会死亡。用一次性注射器抽吸腹水时，每只小鼠一次可收集3-7ml腹水，离心后上清呈淡黄色。腹水用间接免疫荧光方法测定腹水效价分别为1：10000和1：8000。4。讨论：4．1关于免疫用的抗原的处理。本次免疫采用狂犬病毒人用灭活疫苗，经浓缩后1：10稀释免疫。而病毒免疫用的的病毒HNl0则需要经过B．丙内酯1：4000．8000的比例4"C灭活24h，37℃水浴2h的处理。B．丙内酯是一种在狂犬病毒疫苗应用比较广泛和成熟的灭活剂，它主要靠破坏病毒的核酸结构达到灭活的目的，灭活后，通过间接免疫荧光检测结果呈阴性，表明灭活成功。因此本实验选用了该灭活方法【62石31。病毒的灭活方法有很多：甲醛灭活，甲醛为致癌物，残留的游离的甲醛对人体致害；紫外线灭活，有可能会灭活不彻底，不易操作；BPL(B．丙内酯)灭活，BPL是一种国内外广泛应用于各种疫苗灭活的灭活剂，它是一种杂环类化合物(C3H402)，沸点155"C，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用，其机理是改变病毒RNA结构达到灭活的目的。在国内，我们首次应用BPL对人用的地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行灭活，疫苗通过了卫生部新药审评委员会的评审。大剂量的BPL虽然是一种致癌物质，但是极易水解，水解后形成人体脂肪代谢产物B．羟基丙酸【641，对人体无害，因此本实验采用BPLl：4000．8000的比例，灭活。4．2细胞融合细胞融合是获得杂交瘤的最关键步骤，选择PEG4000融合前需提前37℃预热，充分准备好所需物品及试剂，严格注意无菌操作，此外还要熟练融合过程的各个操作步骤。加入PEG4000时一定要控制好加入的速度和作用时间，动作要缓慢，一般控制在60s内滴加完0．8．0．9mlPEG4000，作用时间过长对细胞毒性太大，易造成细胞损伤影响融合 青岛农业人：学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备后细胞的生长状态，时间若太短，造成细胞不能充分的融合的后果。4．3细胞污染及其处理这是单克隆抗体制备工作中最常见又不好处理的问题。一旦发现有霉菌或支原体的污染就应及早弃之，以免污染其他正常细胞。为防止污染，在培养骨髓瘤细胞、饲养细胞及杂交瘤细胞的过程要注意无菌操作，所用细胞培养器材、培养液及试剂尽量用一次性的，或者严格灭菌后使用，另外在细胞培养液中一定要加入双抗。初筛得到的杂交瘤细胞以及每次克隆后得到的亚克隆细胞的及时冻存是一个非常重要的步骤。在细胞稳定性检测尚没有得到最后确定时，筛选出的杂交瘤细胞随时可能因为细胞污染或者细胞传代过程中损伤等原因而失去分泌抗体的能力。如果没有原始初筛细胞的冻存株，将会导致实验功亏一篑。所以要尽早对生长对数期的状态形态良好的细胞进行冻存。冻存时要定期复苏，对细胞的稳定性进行检测。本次实验免疫原为PV株狂犬病毒人用灭活苗和表达的核蛋白，经浓缩后1：10倍稀释免疫，其中细胞的成分比较多，难免会有抗细胞成分的单克隆抗体产生，为避免结果出现假阳性，检测过程中设置了细胞阴性对照，只有病毒板反应阳性，细胞对照反应阴性的结果才最终判为真正阳性。在进行动物免疫前，抗原要和佐剂充分乳化，从而提高机体对抗原刺激的应答能力，使刺激机体分泌某些细胞因子的免疫原的降解速率减慢。免疫时采用皮下多点注射，提高抗原递呈细胞向免疫系统提供抗原的能力。实验结果表明，全程免疫后的小鼠脾脏为正常小鼠的2倍，脾细胞数量达到2．0x108。本试验融合后采用20块96孔板提前稀释，原则上达到每个孔里只有1．2个细胞。实验结果表明，单个细胞的比例分别占到21．4％和19％，这样既节省了大量的时间，直接将融合的单个细胞进行扩大培养，又省去了大量细胞克隆的麻烦，实际实验过程中克隆的次数能减少到1．2次。而且由于细胞已被稀释，克隆的方法也由原来复杂的有限稀释法改为连续倍比稀释法。其他多堆细胞的阳性孔结合显微注射的方法将多堆细胞分成单个细胞再进行克隆。在体外细胞培养中，由于杂交瘤细胞的密度依赖性，细胞数量较少时，细胞生长速度较慢或者成活率不高，饲养细胞的加入可能会使其更好的生长繁殖。饲养细胞选择与骨髓瘤细胞同鼠系的腹腔细胞。本试验在融合前1．2d制备饲养细胞，由于腹腔内巨噬细胞具有能分泌一些细胞生长所需的细胞因子，并能吞噬清除死亡细胞及碎片的作用，因此可提高杂交瘤细胞活性。但在实际操作过程中应控制饲养细胞的数量，过少或过多都不利于杂交瘤细胞生长，影响融合的效率或克隆化的成功，本试验融合前几次，因为取腹腔细胞时取的老鼠较多，饲养细胞过多，后来融合细胞生长缓慢而且最后腹腔内细胞覆盖了融合细胞，分析原因是饲养细胞取过多导致的。一般一只体重189左右Balb／c小23 青岛农业大学硕士学位论文试验一抗狂犬病病毒单克隆抗体的制各鼠制备的饲养细胞能铺3-4块96孔细胞培养板。而且要提前一天制取，第2天观察细胞的活性并观察是否污染，细胞活性不好、无贴壁生长或者污染的不能使用。经融合的细胞往往因为某些染色体的丢失导致不稳定f651，因此阳性细胞数量随着筛选进行会减少；及时的克隆也是得到单抗比较重要的步骤，因为在同一细胞孔中不分泌抗体的细胞生长能力会超过不分泌抗体的细胞，导致一段时间后会抑制分泌抗体的细胞的生长【661。目前，狂犬病已经成为严重危害我国公共卫生的重要人畜共患传染病。快速有效的诊断方法和得当的预防措施显得尤为重要。本实验所制备的单抗经鉴定为抗狂犬病病毒单抗并具有应用价值，将其异硫氰酸荧光素(FITC)和辣根过氧化物酶(HRP)标记制备荧光标记单抗和HRP标记单抗，并建立相应的检测方法为本实验下一步研究方向，以便为狂犬病病毒抗原检测及疫苗质量把关等工作奠定基础。4．4筛选方法的建立单克隆抗体筛选成功关键在于筛选方法的建立。本实验采用间接免疫荧光法，相比于ELISA具有精确，简便的优点。ELISA检测时由于病毒纯化过程中难免会有细胞成分的原因导致结果出现假阳性，灵敏性不高。但是本实验为节省后面克隆步骤，采用融合20．30块96孔板的方法将融合细胞进行了稀释，无疑加大了筛选的劳动量。因此本实验室决定在以后的筛选程序采用先用ELISA方法进行初筛，然后对ELISA阳性细胞株用间接免疫荧光方法进行验证。间接免疫荧光的检测板的制备过程中，．细胞铺板的密度不能太大，导致最后在荧光镜下因为细胞的重叠找不到特异性荧光点。同样密度也不能太小，易导致假阴性。5小结1)本研究成功完成了免疫小鼠脾细胞和SP2／0细胞的融合；2)本研究制备并保存了用于单克隆抗体筛选用的病毒检测板；3)制备出了3株抗狂犬病病毒的单克隆抗体细胞株，为单克隆抗体的标记奠定基础； 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记试验二狂犬病毒单克隆抗体的鉴定及标记狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的一种恶性人畜共患传染病，全世界治疗病例极少，因此其预防与诊断显得尤为重要。WHO建议的狂犬病诊断的金标准是免疫荧光检测，而国内目前尚没有获得批准文号的用于狂犬病实验室诊断的荧光素标记单克隆抗体；我国目前用于狂犬病特异性抗原检测的荧光素标记狂犬病单克隆抗体是进口试剂(RabiesDFAReagent，Millipore公司)，我国狂犬病病毒的地理和动物分布情况调查和狂犬病实验室诊断都需要大量荧光素或酶标记狂犬病单克隆抗体，因此研发具有自主知识产权的特异性检测狂犬病病毒抗原的荧光素或酶标记的狂犬病单克隆抗体，广泛应用于流行病学调查和实验室诊断，不仅解决了试剂的本土来源，也利于国家监测的标准化，为我国人畜共患狂犬病的防控提供技术支持，因此本试验在试验1的基础上对所得的单克隆抗体进行了FITC和HRP标记，具体内容如下：1试剂材料：Tris·base甘氨酸nProteinASepharose4FastFlow辣根过氧化物酶FITC粉末高碘酸钠硼氢化钠DMSO饱和硫酸铵溶液预染蛋白Marker考马斯亮蓝G．250鼠源单抗亚型鉴定试剂盒ISO．2NuPAGEMESSDSRunningBuffer(20x)NuPAGE4％．12％Bis．TrisGelCVS．11病毒包被ELISA板Sigma公司美国pharmaeia公司Sigma公司Invitrogen公司海泰公司馈赠 青岛农业火学硕士学僦论文试验二狂犬捐jj葛毒单兜隆抗体的鉴定及标记主要耗材、仪器(其他见试验1)超滤器透析袋蛋白电泳仪及iBlot转膜仪UVB凝胶成像仪所用溶液的配制：Millipore公司Seaskybio公司Bio．rad公司1．SDS．PAGE所用的溶液的配制：(1)考马斯亮兰染色液：0．25％(w／v)考马斯亮兰R-250，50％(v／v)甲醇，10％(v／v)&．g醋酸，40％蒸馏水。(2)脱色液的配制：在蒸馏水中加入50％甲醇、7％乙酸制成脱色液。2．Western．blot实验用到的试剂配制TBST缓冲液的配制：Tris·base12．19Nacl8．89将上述两种固体混合物加到1L的蒸馏水内，然后加入0．1％的tween．20制成TBST缓冲溶液。3．纯化洗液的配制：1M的Tris．Hcl的配制称取1219Tris碱，加800ml纯净水，溶解后再用约43ml浓盐酸调PH至8．0，最后定容到lL。最好过滤一下保存。经过稀释后配制0．1M和0．01M的Tris．Hcl。PH3．0的O．1M甘氨酸溶液的配制称取7．5079甘氨酸，加到lL的蒸馏水中，最后用大约2．3ml的浓盐酸，调PH至3。4．FITC标记所用溶液的配制：FITC—DMSO混合液：称取5mgFITC粉末，溶解于300ul的DMSO中。PH9．5的0．2M的Na2C03-NaHC03缓冲液的配制：称取lgNaHC03和0．89Na2C03溶于50ml的蒸馏水中，最后加1000ml蒸馏水。 青岛农业大!学硕十学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记5．过碘酸钠法制备HRP标记抗体所用试剂的配制(1)O．16mol／L乙醇溶液乙二醇0．1ml蒸馏水加至10ml(2)0．06ml／L过碘酸钠溶液(新鲜配制)Nal040．1289～蒸馏水加至10ml(3)O．1mol／LpH9．5碳酸盐缓冲液0．1mol／LNa2C0330ml0．1mol／LNaHC0375ml6．ELISA相关溶液的配制(1)洗涤液(PBST，pH7．4)：在PBS内加入O．05％的Tween-20。(2)封闭液(含5％脱脂奶的TBST)：5g脱脂奶，用PBST溶解后定容至100mL。2方法2．1腹水的纯化：采用SPA亲和纯化法，具体方法如下：1)lml100mMTris．C1(pH8．0)盐分三次平衡柱床，样品中混合1／10体积的Tris．C1(1M，pH8．O)后加样于柱床，摇匀，加盖，将柱床放4。C，30min。2)每5min摇匀一次，使抗体与葡萄菌球A蛋白充分吸附；打开底盖和顶盖，弃去柱床中液体，10倍体积分5次洗柱床(洗涤杂蛋白)，先100raM"Iris．C1(pH8．O)洗5次，再10mM"Iris．C1(pH8．O)洗5次；3)目的蛋白的回收：用100raM的甘AA(pH3．O)逐步洗脱，一共洗三次，每次lml，用100raM的甘AA(pH3．0)洗柱床，最后柱床用20％乙醇，lml保存于4。C。4)洗脱得抗体用紫外分光吸收法粗测，PBS溶液中4"C透析过夜。取少量用SDS．PAGE凝胶电泳经行分析和抗体效价ELISA法的检测。其余抗体在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到1-5mg／mL，分装后冻存。将纯化后的腹水进行SDS．PAGE电泳分析。SDS．PAGE电泳分析步骤： 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记将NuPAGEMESSDSRunningBuffer(20x)进行20倍稀释，混匀后加入到电泳槽内，然后取出NuPAGE4％．12％Bis．TrisGel胶，放到槽内，进行固定，移去梳子，用微量加样器冲洗加样孔。样品用样品稀释液稀释后，煮沸5min，用微量加样器上样159L，200V稳压电泳50rain。进行SDS．PAGE电泳。电泳完毕后倒掉电泳液，电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，放在干净吸水纸上，轻轻撬开两层塑料板，以免胶碎裂，用剥胶板小心剥下凝胶。取下凝胶置于考马斯亮蓝染色液中浸泡，以没过凝胶为最好，在平缓摇动的摇床上室温染色30min左右。回收考马斯亮蓝染色液，将凝胶置于脱色液中，在摇床上平缓摇动，其间注意观察脱色情况。脱色时间以凝胶背景干净、条带清晰为止，一般过夜脱色，脱净后将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。将脱色的胶在成像系统中成像并拍照。2．2单克隆抗体的鉴定2．2．1单克隆抗体类型的测定参照Sigma公司试剂盒(ISO．2)说明书。具体方法如下：捕获ELISA法检测单克隆抗体的类型，用PBS将抗体亚类1：10000倍稀释，100I_d／孔包被96孔ELISA板，37℃孵育1h；洗板3次，将待测单抗稀释至2-5pg／ml做一抗加入包被好的ELISA板中，1009l／孔，室温放置1h；洗板3次，1：50000稀释辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗，100肼L，室温孵育30min；洗板3次后加100pl／孔的TMB底物液，室温避光反应10．15min，终止显色。目测判定结果。2．2．2杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性测定将阳性杂交瘤细胞株体外连续培养3个月，每隔一周取细胞培养上清液检测抗体效价；将冻存六个月后的细胞株复苏，取培养上清液检测抗体效价。2．2．3特异性和敏感性鉴定采用间接免疫荧光法，CVS．11株狂犬病病毒感染BSR细胞经铺板后放置37℃，湿度为96％，5％C02的孵箱中继续培养24h。80％丙酮固定抗原板。制备具体方法如前所述。设置未经感染病毒的细胞铺板做阴性对照，利用固定病毒稀释抗体的方法将所得腹水做一抗从1：1000开始分别进行倍比稀释和10倍系列稀释，最终稀释浓度为10000和1010，每个稀释度设置三个平行对照。37"C避光保湿孵育30min，PBS洗板四次，加1：50倍稀释的FITC标记羊抗鼠IgG，37"C避光保湿孵育30min，PBS洗板4次，风干加60％PBS稀释的甘油封片；倒置荧光显微镜下观察结果并进行分析。2．3所得单抗Western．blot鉴定(Western．blot)：2．3．1上样与电泳： 青岛农业火学硕一卜学位论文试验二狂犬病痫毒单克隆抗体的鉴定及标记将灭活好的CVS．11病毒，经浓缩后，用样品稀释液稀释，煮沸5min，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS．PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。200V稳压进行SDS-PAGE电泳50rain。2．3．2Western．blot分析参照分子克隆试验指南进行电转印，进行Western-blot检测，试验操作步骤如下：(1)转印加样时，将样品与标准分子量Marker同一块凝胶上重复点样，一半用于转膜，另一半用来染色。戴手套，剪取大小与待转印凝胶相吻合的6张干净的Whatman3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品的顺序，在干净平皿里用电转移缓冲液浸泡5min。按3层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、3层滤纸的顺序叠放整齐，整个操作中应注意随时用玻璃棒清除硝酸纤维素膜或滤纸与凝胶之间的气泡，将上述叠放好的夹层物小心平放入半干式电转印槽内，硝酸纤维素膜靠近阳极端，胶靠近阴极端。连接电源，选择P3转印模式，转印时间选择8min。(2)封闭染色电泳完毕，取出硝酸纤维素膜，将一半硝酸纤维素膜用O．2％丽春红染色5min，用脱色液脱去背景颜色，以显示蛋白质区带。将另一半带样品的硝酸纤维素膜用PBS缓冲液洗10min，然后置5％脱脂奶封闭液中，室温缓慢摇动1．2h。(3)与抗体结合首先要进行单抗腹水稀释浓度的测定：封闭结束后，用洗涤液TBST洗硝酸纤维素膜3次，每次5min，用含5％脱脂奶TBST1：100倍开始稀释单抗腹水至l：1000，4℃过夜；然后用TBST洗3次，每次10min，加入1：2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(酶标二抗)，室温下轻摇孵育2h，取出用TBST冲洗4次，每次5min，最后用TBS缓冲液冲洗10min。(4)底物显色按照DAB试剂盒说明，加入稀释好的底物溶液，按膜面积加入3ml／crn2，室温轻摇2．10rain，细心观察显色情况，待出现明显褐色条带时，取出，用去离子水洗涤终止反应，将硝酸纤维素膜夹在滤纸中，干燥，置暗处保存。拍照留作试验记录，该显色膜可风干夹于两层滤纸中置暗处永久保存。2．4标记．2．4．1HRP标记 青岛农业人学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记方法：1)将5mgHRP溶于0．5ml蒸馏水中，加入新配制的O．06mol／LNal04水溶液0．5ml，混匀，置冰箱30min。2)取出后加入新配制的O．5mlO．16mol／L乙醇水溶液，进行30min室温放置。3)取出后加入含5mg的lml纯化抗体水溶液，混匀并装入透析袋中，以O．05mol／L、pH值9．5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析过夜使之结合，然后吸出加NaBH4溶液(5mg／m1)0．2ml，置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min。4)再次取出后离心，将所得沉淀物溶于少许0．02mol／L、pH值7．4PBS中，并对之透析过夜。5)次日再离心除去不溶物，即得酶～抗体结合物。6)酶标复合物的检测：用0．02mol／L、pH值7；4PBS将酶标复合物加至5ml，进行测定后加入牛血清白蛋白和防腐剂，．20℃保存。结合物中HRP与抗体量的测定，可用751型分光光度计，分别用280及403rim波长测定其光密度(OD)，并计算出OD403与OD280之比值以及HRP与抗体的mol／L比。结合物中HRP浓度(mg／m1)=OD403X0．4结合物中IgG浓度(mg／m1)=(OD280．OD403x0．3)xO．62酶／抗体m0眦=鬻×4结合物稀释度的测定：用酶结合物中抗体相应的抗原直接包被聚苯乙烯反应板，采用ELISA直接法测定酶结合物效价。通常本法制备的酶结合物作1：10000稀释时，其OD403仍在0．1以上。标记单抗工作浓度的测定：1)用海泰生物公司已包有狂犬病病毒的ELISA抗原板(CVS．11病毒，5ug包板)内加入3％牛血清PBST封闭液，200I．tL／孔，放入温箱内37"C封闭2h。2)封闭后取出抗原板，将板内液体倒掉，各孔加PBST洗液100pL，室温放置3min，倒掉，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次。晾干3)将瑚强标记的单抗用PBST进行1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400，六个稀释度稀释，每个稀释度1001．t【／孔，每个稀释度做4个重复，37"C孵育1h。4)按上述洗涤步骤洗涤。5)加入底物1001_lL／孔，显色15min，然后加入2mol／LH2S04100I_tL终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值。6)比较后取OD450值为1．0．1．5之间阳性值对应的抗体稀释度为最佳抗体工作浓度。 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记2．4．2FITC标记按照文献【67】将纯化的IgG抗体对PH9．9．5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入一个较小的容器内，称取5mgFITC，加入二甲亚砜(DMSO)5ml，使终浓度为lmgFITC／lmlDMSO，调整IgG浓度为lmg／ml，然后将FITC-DMSO溶液逐滴加到IgG溶液中，使IgG的比例接近50pgFITC／mgIgG；最后将标记物用PBS加至2．5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h，除去游离荧光素，至透析液清亮无颜色为止。直接免疫荧光法检测结合物稀释度：1．将铺满细胞瓶底的BSR细胞吹起，按照最佳病毒供给量即病毒15倍稀释，接种CVS．11毒，37"C继续培养24h。移去培养液，用90％冷丙酮固定30min，用PBS洗涤3次后晾干制成检测板。2．分别将所得的标记单抗用伊文思蓝液进行1：20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000倍的稀释。3．将各个稀释度的标记的单抗50ul，加入到检测板孔内。同时用小鼠阴性腹水做对照。4．将检测板放入湿盒内，37*(2，孵育30min后，取出板子，移去荧光抗体，用同样方法洗涤3遍。加入80％的甘油。在荧光显微镜下镜检。3．结果3．1纯化结果：图2．1纯化后所得腹水SDS．PAGE电泳分析图l为Marker条带；2、3为纯化的单抗3812和4A12电泳条带；314p皇■■■■■■■■■_Z3_l『一2-～。=i-毒．-硒mm巧如驺为" 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记4为未经纯化的腹水电泳条带。Fig．2．1AnalysisofpurifiedasciticfluidbySDS-PAGEElectrophoresis1isMarkerband；2and3areelectrophoreticbandsofthepurifiedmonoclonalantibodies3B12and4A12；4iselectrophoreticbandsofunpurifiedasciticfluid．3．2单克隆抗体的鉴定3．2．1抗体亚类鉴定结果所得单抗为IgG2a亚类单抗。3．2．2单抗稳定性检测结果表2．1建株后两株杂交瘤细胞株抗体分泌检测表Table2．1Detectionofantibody-secretionofhybridomacelllinesafterconstructionofcelllines：3．3标记结果：3．3．1HRP标记结果：，．t，，7嚏从结果中可见，ELISA直璋薅测定酶结合物工作浓度为1：800。表2．2脚F标记的4A12单抗株工作浓度测定结果：Table2．2Th杏detectionresultofworkingsolutionofHRP-4A1232 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记3．3．2FITC标记将所得FITC标记单抗用上述自制的抗原检测板进行检测。分别将所得的标记单抗进行1：20，40，60，80⋯⋯100倍的稀释，设置小鼠阴性腹水做阴性对照，Millipore公司标记单抗为阳性对照。结果如下：图2．2标记抗体的检测结果1待测标记单抗PBSA1：60倍稀释检测结果。2本实验所得标记单抗PBSAl：80倍稀释结果3Millipore公司标记单抗1：60倍稀释。Fig．2．2Detectionresultsoflabeledantibodiestestldetectionresultsoflabeledantibodieslabeled1：60timesdilutedwithPBSA2detectionresultsoflabeledantibodieslabeled1：80timesdilutedwithPBSA3detectionresultsoflabeledantibodiesofMillipore由图2．2可见，相比于阳性对照，本次试验单抗标记成功。但存在少许的背景颜色。3．4Western-blot鉴定结果经Western-blot鉴定，单抗的稀释最佳浓度为1：400，下图为1：400时两株单抗的Western．blot鉴定结果。结果显示两株单抗均在55KD的条带处显色，说明两株单抗均可特异性识别狂犬病毒N蛋白。 青岛农业大学硕士学位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记KDMarker王2图2．33812和4A12单抗腹水的Western．blot结果l为3812反应条带；2为4A12为4A12反应条带；+为阳性血清。Fig．2．3resultofwestern-blottestof3812and4A12Mabascites1for3B12reactionstrip，2isthe4A12reactionstrip，+isthepositiveserumreactionstrip4讨论所得腹水单抗含量为3．1mg／ml。但有少量的杂质存在，为防止后续工作受影响，对其进行了纯化。单克隆抗体纯化方法有很多种【68J：硫酸铵沉淀法和辛酸沉淀法、亲和层析法。其中硫酸铵沉淀法对腹水的纯化率较高但是回收率较低，同时对IgG的免疫活性有很大影响，而辛酸沉淀法则相反。因此，本实验使用亲和层析法，利用A．Sepharose介质加上不同PH洗脱分离鼠IgG。葡萄球菌A蛋I刍(SPA)可与IgG的Fc段特异性结合，对部分IgM也有吸附作用，通过不同PH调节来实现偶联于Sepharose凝胶表面的SPA对IgG的吸附。为目前少量IgG纯化的最好方法。经SDS．PAGE条带显示分别在50KD和25KD附近有较清晰的条带，这是因为在2．巯基乙醇存在的条件下，免疫球蛋白重链与轻链间的二硫键被还原，从而使二者分开。其中一条为IgG的重链，约50KD左右，另一条链为IgG的轻链，约为25KD，而未纯化的样品杂蛋白带较多，说明腹水经纯化后绝大部分杂蛋白被除去16引。单克隆抗体的标记：经鉴定合格的荧光抗体，加入0．01％的硫柳汞或0．1％的NaN3防腐，小量分装(O．5ml／安瓿)，若短期使用放于4。C冰箱，如长期不用放在．20℃冰箱。标记后的纯化首先除去游离的荧光素，采用透析法，具体方法为，配制PBS缓冲液，。瀵蘩囊餮纛憨隧霪燃燃㈣瓣。纛鬃鬣鬃然糕蒸8l7盖5l施站"n7543 青岛农业大：学硕十：字：位论文试验二狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定及标记将要纯化的标记抗体放进透析袋，透析过夜，不断更换洗脱液，直至透析液透亮。然后去少量进行染色实验进行鉴定。然后除去未标记及过度标记的蛋白，这个步骤是为了消除标记抗体蛋白的特异性抑制作用，以及过度标记蛋白所致的非特异性染色。有人采用过DEAE．SephadexA50离子交换层析柱，以梯度洗脱然后分部收集洗脱液，经过染色检查。但经过上述步骤处理的标记抗体，一般约损失50％。因此，本实验采用了稀释的方法达到目的。在碱性条件下FITC的碳酰胺键可特异性的结合抗体赖氨酸的e氨基结合，荧光素标记后抗体不影响正常该抗体识别抗原的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。试验过程中，FITC应该放在4"C暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解；FITC．DMSO液要现用现配；碳酸盐缓冲液要新鲜配制。据证实一个分子的IgG共有86个赖氨酸残基，然而却最多只有15．20个能被标记；FITC和IgG的比值过低容易减弱信号强度，难以用于检测。标记比值过高则可能导致抗原识别位点封闭或抗体分子表面吸附过多的没有标记的荧光素，出现非特异性结合而使检测背景过高；同时不同操作者对这个比例总结出了不同的最佳结合，比如2466】或3—10t701。在标记的过程中，发现以下因素均可对抗体标记效果产生明显影响：(1)荧光素的质量和IgG的比例，一般来说粉末状的荧光素以0．025．0．5mg／mL抗体这个比例较为合适，而结晶型的荧光素则可能0．006．0．008mg／mL才能达到最佳比例。(2)标记溶液酸碱度。标记过程中溶液的酸碱度应保持碱性约为pH9．0．9．5，过碱易导致抗体变性、效价降低；而溶液过酸则会导致标记效率降低、标记速度减慢等现象。(3)温度和时间。温度保持在4_25。C左右最为合适，温度较低，反应速度会减慢；温度偏高则反应过快。一般4"C需要6．12h以上，7-9℃需要3-4h，20．25℃只需要1．2h。(4)FITC的溶解液。各种所用的液体最好现用现配。(5)DMSO的体积及滴加速度。经查阅文献及多次试验，认为DMSO的体积应为抗体溶液的1／20为佳；FITC溶解于DMSO后，最好缓慢加入到抗体溶液中；滴加的过程应在磁力搅拌下进行，且缓慢搅拌，速度不宜过快。碘酸钠法是先用Nal04将HRP表面的糖分子氧化成醛基，再与免疫球蛋白上的氨基相结合，然后再用NaBH4将没有标记的醛基还原，获得稳定的酶标复合物。该方法获得的酶标抗体的产率高，酶与免疫球蛋白的活性无重大损失，是目前最常用的方法【71】。进行Western-blot时，将CVS．11感染细胞收获的病毒悬液，灭活离心除沉淀后用30000MWCO超滤膜离心管，以5000g定转角离心25rain，然后用PEG8000进行包埋 青岛农业人学硕士学位论文试验二狂犬炳病毒单克隆抗体的鉴定及标记浓缩，约30min左右，可以将其浓缩5倍，然后将所得的病毒液上样进行SDS．PAGE试验。加单抗腹水时，要提前摸索单抗的浓度，以便能清晰的观测到病毒与单抗腹水的反应。HRP标记的单抗可用于竞争法测定所得单抗的抗原位点。同时竞争ELISA方法的建立是本试验的下一步研究方向。5小结1)本研究成功对所制备的单抗进行了系统鉴定。2)本研究对单克隆抗体细胞株3812进行了F1TC标记，并进行了工作浓度的测定，为直接免疫荧光法的建立奠定了基础。3)成功对4A12进行了HRP标记，为狂犬病毒抗体的实验室检测奠定了基础。 青岛农业大学硕士学位论文试验三狂犬病病毒单克隆抗体的初步应用干；6)用90％甘油(PBS)封片，加盖盖玻片，荧光显微镜观察。结果判断：仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：一：无荧光；+／一：极弱的可疑荧光；+：荧光较弱，但清晰可见；++：荧光明亮，且多个视野均有分布；+++～++++：荧光闪亮，尼基氏小体清晰可见，且范围广泛。3结果： 青岛农业大学硕士学位论文试验三狂犬病病毒单克隆抗体的初步应用图3．1标记单抗3812株部分阳性标本直接荧光检测结果A1·Dl：分别为标本D21、HN38、JS21、JS36用市售Millipore公司FITC标记抗核蛋白单克隆抗体DFA检测结果A2．D2：分别为标本D21、HN38、JS21、JS36FITC标记3812株单克隆抗体第一次DFA检测结果D21．JS36：为标本D21、HN38、JS21、JS36FITC标记3812株单克隆抗体第二次DFA检测结果El·F1：为阴性标本SD36-SD38用市售Millipore公司FITC标记抗核蛋白单克隆抗体DFA检测结果E2-F2：为阴性标本SD36．SD38用FITC标记3812株单克隆抗体DFA检测结果Fig．3．Isomeofpositivesamples’DFAresultofFITClabeled3812monoclonalantibodyA1-D1：DFAresultofsimpleD21、HN38、JS21、JS36byFITClabeledMabofMilliporeA2-D2：DFAresultofsimpleD21、HN38、JS21、JS36byFITClabeledMab3812(FITC一3812)D21·JS36：DFAresultofsimpleD21，HN38，JS21，JS36byFITClabeledMab3812(FrrC-3812)ofthesecondtime．El·F1：DFAresultofnegativesimpleSD36-SD38byFITClabeledMabofMilliporeE2-F2：DFAresultofnegafivesimpleSD36·SD38byFITClabeledMab3812(FITC-3812)由图3．1可见，阳性标本无论是阳性对照还是所标记的单抗检测结果在标本的病灶部位发现很明显特异性的黄绿色荧光点。39强翁鬻。。■臻灞■ 青岛农业大学硕士学位论文试验三狂犬病病毒单克隆抗体的初步应用与阳性对照相比，薪得的标记单抗特异性较好，。敏感性相对稍弱≯阴性标本检出率-毽、、鹊，。100％，说明所制备的荧光抗体对范围广泛的狂犬病毒街毒株都具有识别能力，阳性符合率达到100％。但本实验的敏感性有待改善提高。表3．2标本DFA检测结果Table3,2DFAdetectionresultofsimple黧喜兰．竺竺兰竺鳖翌二缫夔塑兰．!：!二二．：阳性对照一，一一-一一-之聋。‘一一”j一、i‘堡垒垫堡二二：一一二．一二．一．．_：三毒．：二二．二二一．二二。：一，。：4讨论：本次实验，所选择的标本来源于全国9个不同省市。基因序列比对发现这34份标本序列不完全相同，即不是重复序列。因此本实验说明，所标记的单抗能够识别不同毒株的病毒。但由于在实验二部分所标记的单抗对细胞水平的检测灵敏性和特异性都较高，荧光强度并不低于阳性对照。但是在标本检测时荧光强度稍弱，原因可能是1．本实验制备的标记单抗为粗品，并没有像阳性对照那样对其进行了一系列的处理，而且经过紫外分光光度计粗测，本实验制备的荧光单抗的浓度与阳性对照所用的荧光单抗的浓度比值为1：5，所以认为这是导致同样标本两者荧光亮度差别的主要原因。2．荧光单抗放置的时间过长，导致荧光萃灭。由于细胞水平的检测和标本水平的检测并不是同时进行的，期间本实验标记的荧光单抗在冰箱中反复冻融数次，导致荧光后来敏感性稍弱的可能性不是没有。3．在标本检测过程中经过了无数次的洗涤可能导致部分与病毒反应的标记单抗脱落，而阳性对照的标记单抗是经过处理的证明比较稳定的。鉴于上述原因，将标记单抗重新进行了12倍稀释，即与Millipore公司所用的标记单抗中蛋白含量相同的情况下进行了第二次DFA实验检测，如图3．1，虽然荧光亮度达到了阳性对照，但是存在较深的背景。这与标记后单抗的纯化力度不够有关。因此，本实验将来的目标是进一步对标记后的单抗腹水进行纯化，减少背景非特异性染色的干扰，说明本实验所得的标记单抗应用潜力较大。 青岛农业大学硕士学位论文试验三狂犬病病毒单克隆抗体的初步应测5小结对建立的直接免疫荧光法进行了初步应用，检测了来自不同省市的狂犬病脑组织标本34份，结果显示，由Frrc标记的3812株单抗建立的DFA方法对广泛存在的狂犬病病毒街毒株的检出具有较好的特异性和准确性。41 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青岛农业大学硕：{：学位论文致谢时光荏苒，这个短暂而又漫长的三年就这样画上了句号。回望过去这三年，我们经历了一段从期待，到迷茫及痛苦煎熬，再到收获、成熟的旅程。这三年，不仅仅是一个收获实验结果的过程，更是～个历练自己使自己成熟长大的熔炉。这三年承载了太多太多的经历，同时也酝酿了了太多太多的感激，正是因为有了那么多人的无私的帮助和支持才使我认真勇敢的走下来。首先，感谢我的导师单虎老师和唐青老师。三年来，我深深受益于两位恩师的关爱和教诲，他们对科学前沿敏锐的洞察力、博大精深的学识、活跃的科学思维，开拓创新的精神；严谨的科研态度，热情待人、严于律己的生活原则，无不深深感染着我，激励着我，这是我人生路上得到的宝贵财富，使我受益终生。能师从两位恩师，得到老师从生活到工作学习的悉心照顾，我为自己感到庆幸，在以后的工作学习中必将继续以两位老师为榜样，在此谨向两位恩师表示诚挚的敬意和感谢!衷心感谢感谢中国CDC病毒所脑炎室主任梁国栋研究员对我工作的支持和对我北京两年生活和工作上的照顾。感谢新疆维吾尔族自治区疾病预防控制中心的李雄老师，他算是我刚开始接触实验的启蒙老师，在新疆呆的这两个月，他不仅用他废寝忘食的工作状态告诉我他是多么热爱他的工作；他还用他对科研的严谨态度教会我如何认真的去对待我的实验，他10年以来想法的实现教会我要坚持自己的梦想不放弃，严于律己，宽以待人的精神教会我为人处事的道理，李老师是我这一生学习的榜样。衷心感谢脑炎室付士红、王焕琴、何英、吕志、曹玉玺、申辛欣、朱武阳、王环宇和吕新军老师对我工作的指导和帮助，感谢曹蕾、陶晓燕、黄莹、杜加亮等师姐师兄们对我工作的悉心指导，感谢你们在实验和生活方面的支持和无私帮助，在这个大家庭中，我学会了很多。能够结识你们是我人生的幸运，是我一生的财富，你们是我永远的老师和朋友。特别感谢师兄王力华对我工作悉心的指导，感谢师姐于鹏程及家人对我生活上的无私的帮助。48 青岛农业人：：I顷：l一：学位论文致附衷心感谢尹翠萍，张建，郎树林，郭振洋，感谢董丹、赫晓霞、鲁苏娜，付娟娟、李佳、尹景峰，感谢师姐郑雅匀，师弟何健、赵俊伟、焦文涛、师妹查冰，感谢他们对我生活上、学习上的无微不至的关心和无私的帮助，是你们的真诚营造了脑炎室良好的大家庭氛围，让我在北京的这段时间能够轻松快乐的学习的同时交到了一生的朋友，感谢你们!感谢青岛农业大学同实验室的孙海芳、范懿娜、杨培培、王颖、孟培培、张鹏、史红、张洪亮、胡继明，师兄师姐，以及众多师弟师妹们生活上的关心，感谢我的姐妹们王会风、姜萍、张鑫鑫平时困惑中给我的鼓励和慰藉。深深感谢我的家人对我无私的爱以及对我学业的默默支持!最后，向所有关心帮助过我的老师、同学和亲朋好友，衷心地说一声谢谢12012．3．1049 青岛农业火：学硕十学位论文作者简历姓名：王文娟出生年月：198604教育背景：作者简历性别：女民族：汉2005年9月．2009年7月青岛农业大学动物科学专业获得学士学位；2009年9月．2010年9月青岛农业大学预防兽医学硕士基础课程学习；2011年10月一今中国疾病预防控制中心病毒所脑炎室完成硕士课题研究。 青岛农业)＼-T-硕十学位论文攻凄硕十划间科研!学术成果攻读硕士期间发表的文章1、PreparationandIdentificationofAnti-rabiesVirusMonoclonalAntibodies《中国病毒学(英文版)》，第一作者，2012．6已收录。论文支撑项目：公益性行业(农业)科研专项基金(NO．200803014)51