蓝舌病病毒17型vp2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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1、中国农业科学院硕士学位论文摘要蓝舌病(bluetongue，BT)是一种由蓝舌病病毒(bluetonguevirus，BTV)引起的通过库蠓等昆虫传播的非接触性病毒性动物传染病。主要感染反刍动物，为畜牧业带来巨大的经济损失，是国内外动物疫病防疫监测的重点。全世界共分离到至少24个血清型BTV，且各型问无交叉反应，因此快速的血清型检测方法的建立是预防本病的关键，以便针对当地流行的血清型选择相应疫苗控制本病。根据GenBank中已发表BTVl7的L2基因序列(M17438．1)设计l对引物，从感染BTVl7的BHK-21细胞中提取病毒RN

2、A，RT-PCR扩增L2基因。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达VP2蛋白。将L2基因克隆至pFastBacHTA供体质粒，构建重组供体质粒pFast-VP2。重组供体质粒转化DHl0Bac感受态细胞，获得重组杆粒BAC．V】P2。将重组杆粒转染s侈昆虫细胞，得到携带L2基因的重组杆状病毒BACV-VP2。对转染细胞进行SDS-PAGE和WesternBlot分析，结果显示VP2蛋白在S侈昆虫细胞中得到成功表达，且重组蛋白主要以包涵体形式存在。重组VP2蛋白能够与抗BTVl7绵羊阳性血清发生反应，显示出良好的抗原性．根据

3、GenBank中已发表的BTvl7的L2基因序列0V117438．1)设计两对引物，利用原核表达系统对L2基因进行分段表达。利用两对引物以重组供体质粒pFast-VP2为模板扩增出两段目的基因A和B。将A和B基因分别克隆到原核表达载体pET-30a中，构建重组表达载体pET-A和pET-B。将pEBA和pET-B分别转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导大肠杆菌BL21表达重组蛋白VP2-A和VP2-B。SDS-PAGE结果显示重组蛋白VP2-A和VP2-B均能在大肠杆菌中得到大量表达，主要以包涵体形式存在。表达产物以8M尿素变性后利用

4、Ni2+NTA树脂对其进行变性纯化。Westernblot结果表明两段重组蛋白均能与抗BTVl7绵羊阳性血清发生特异性反应，具备良好的抗原性。以原核表达的重组蛋白VP2-A和VP2-B为免疫原共同免疫BALB／c小鼠，并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2／0细胞进行融合。以原核表达的两段重组蛋白为主要检测抗原，建立间接ELISA检测方法筛选分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞。将第一次筛选到的阳性克隆以真核表达的重组VP2蛋白为检测抗原，通过间接ELISA方法进一步筛选，最终获得2株能稳定分泌抗BTVl7VP2蛋

5、白MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为BTVl7VP2·3F4、BTVl7VP2-4H10(以下简称为3F4和4H10)。Westernblot结果表明2株MAbs均与重组蛋白VF2-A和VP2．B发生特异性反应，而与空载体表达产物对照不发生反应，具备良好的反应原性。间接免疫荧光结果表明，2株MAbs均与BTvl7呈阳性反应，其中MAb3F4与BTvl～9、BTVll～23、茨城病病毒、中山病病毒、赤羽病病毒、牛轮状病毒、牛呼肠孤病毒均呈阴性反应，与BTVl0和BTV24呈弱阳性反应。利用合成肽方法对2株MAbs所识别的BTVl7VP2蛋

6、白的抗原表位进行了鉴定，结果表明，MAb31：4识别的抗原表位为540DPWNNR545，MAb4H10识别的抗原表位为唧WN卜限A蛳。本研究制备的2株BTVl7VP2蛋白MAbs及所鉴定的抗原表位，为BTvl7型特异性检测方法的建立及BTVl7VP2蛋白功能研究提供了基础，对BT的防控具有重要意义。关键词：蓝舌病病毒血清17型，VP2蛋白，单克隆抗体，抗原表位中国农业科学院硕士学位论文摘要AbstractBluetonguevires①TnanorbivirusoftheReoviridaefamilyencompassing24k

7、nownseroDfpes，causesahacmorrhagicdiseasemainlyinsheepandoccasionallyincattle．BTvistransmittedbetweenitsmammalianhostsbycertainspeciesofbitingmidgesanditcaninfeetallruminantspecies．BTrepresentsamajorbarriertointernationaltradeinanimalsandsomeanimalpredum,causingworldwide

8、economiclosses．So，itisimportanttoestablishBTVserotype-specificdetectionmethodforusingvaccinesofthehomologousBT