蓝舌病病毒15型vp2、ns3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文蓝舌病病毒15型VP2、NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopes硕士研究生.•赂6指导教师：吴东来研宄员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研宄生院2015年S月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文蓝舌病病毒15型VP2、NS3蛋白单克隆抗体

2、的制备及其抗原表位的鉴定PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopes硕士研究生：张沁指导教师：吴东来研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationPreparationoftheMonoclon

3、alAntibodiesagainstVP2andNS3ProteinofBluetongueVirusSerotype15andIdentificationofB-cellEpitopesM.S.Candidate：ZhangQinSupervisor：Prof.WuDong-LaiDegree：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015摘要蓝舌病（Bluetonguedisease,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV）引起的，由传播媒介

4、库蠓在动物间广泛传播的急性、烈性动物传染病。该病主要感染反刍动物（山羊、绵羊、牛、鹿、骆驼等），其中以绵羊最易感，病畜被感染后主要表现出高热、口腔黏膜发绀充血、面部水肿等症状，部分血清型可引起较高的死亡率。目前，BTV已多达27个血清型，各血清型之间无交叉保护作用，所以制备出针对某一特定血清型的BTV相关的诊断试剂是防治该病的最有效措施。BTV属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员，其基因组由10个分节段的双股正链RNA组成，分别编码7种结构蛋白（VP1~VP7）和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a及NS4)。其中，VP2能刺激产生型特异性中和抗体，NS3/NS3a参与病毒的释放。根据

5、Genbank中登陆的BTV15L2基因序列（CAE51102.1）及S10基因序列（AGJ83560.1）分别设计一对特异性引物，以实验室构建的分别含有BTV15的VP2编码序列以及NS3编码序列的重组质粒pZERO-B15-VP2和PEASY-B15-NS3为模板扩增VP2与NS3蛋白的编码基因。并将两者酶切处理后克隆于原核表达载体pMAL-C4X，构建重组表达质粒pC4X-B15-VP2和pC4X-B15-NS3。另TM外，将L2基因克隆于真核表达载体pFastBacHTA用于真核表达VP2蛋白；将S10基因克隆于原核表达载体PET-30a，构建重组表达质粒PET-B15-NS3。四种蛋

6、白表达纯化完成后，将原核重组VP2蛋白MBP-VP2和原核重组NS3蛋白HIS-NS3分别免疫4-6周龄的BALB/c小鼠以制备单克隆抗体（Monoclonalantibody，MAb）。取抗体滴度较高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，并分别以真核重组VP2蛋白BAC-B15-VP2和原核重组NS3蛋白MBP-NS3为包被抗原，以间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，最后获得3株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白MAb的杂交瘤细胞，分别命名为2C6、2D6、3B11；获得4株稳定分泌抗BTV15NS3蛋白MAb的杂交瘤细胞。分别命名为1B5、2B12、2G9、3D8。利用western-blot

7、（WB）和IFA试验对上述MAbs进行特异性鉴定，WB结果表明7株MAbs都能识别BTV15感染的BHK-21细胞内的相应蛋白；IFA结果表明2C6、2D6、3B11只与BTV15反应，而不与其他血清型BTV反应，而1B5、2B12、2G9、3D8与BTV1~24均发生反应。利用肽扫描技术6266对该几株MAbs识别的B细胞表位进行鉴定，结果表明2C6识别的抗原表位为LKYRP，2D6识别1524