蓝舌病病毒12型ns1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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1、密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentiilcatioiiofB-cellEpitopes硕士研宄生：王海秀指导教师：吴东来研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研宄所研究生院2⑩15年5月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文蓝舌病病毒12型N

2、S1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentificationofB-cellEpitopes硕士研究生：王海秀指导教师：吴东来研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertati

3、onPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofBluetongueVirus12andIdentificationofB-cellEpitopesM.S.Candidate：WangHaixiuSupervisor：Prof.WuDonglaiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015摘要蓝舌病（Bluetong

4、uedisease,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV）引起的一种虫媒传染病，可以引起绵羊等反刍动物的出血性疾病，主要通过库蠓等昆虫叮咬传播，偶尔通过精液和胎盘传播。BTV基因组的多样性和节段性增加了病毒复制和组装过程中基因重组的可能性，目前已发现27个不同的血清型，并且同一血清型内含有大量的变异毒株。此外，全气候变暖引起库蠓等分布范围的变化，导致世界范围内爆发BT的可能性增加。与环状病毒属其他成员一致，疫苗免疫是预防BT和BTV传播最有效的途径，但是BTV血清型之间具有很

5、大的抗原差异性，彼此之间缺乏有效的免疫保护性。因此，制备具有型特异和群特异的单克隆抗体（monoclonalantibody，MAbs）为开发更好的诊断和研究试剂奠定基础，在BT防控方面具有重要意义。BTV基因组由10个分节段的双链RNA组成(Seg-1～Seg-10)，其中S5基因编码的NS1蛋白在BTV各血清型之间高度保守。本研究利用实验室保存的携带BTV12S5基因的重组质粒pEASY-NS1-BTV12为模板（GenBank登录号：KM485310）设计上下游引物，PCR扩增获得S5基因编码

6、区，获得的目的基因进行酶切后分别克隆转化至原核表达载体pET-30a和杆状病毒表达TM载体pFastBacHTA，构建重组质粒pET-NS1-BTV12和pFAST-NS1-BTV12。将重组质粒pET-NS1-BTV12转化至E.coliBL21（DE3）表达感受态细胞中，利用0.5mMIPTG成功诱导表达重组BTV12NS1蛋白。SDS-PAGE结果显示原核重组NS1蛋白（rP-NS1-BTV12）2+以包涵体形式表达。使用NiNTA树脂对其进行纯化，Westernblot（WB）验证重组NS1

7、蛋白能与本实验室保存的BT阳性羊血清发生反应。将重组质粒pFAST-NS1-BTV12转化至E.coliTMDH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒（rBacmidDNA）。将rBacmidDNA转染至sf21昆虫细胞，得到高效表达S5基因的重组杆状病毒BACV-NS1。SDS-PAGE结果显示sf21昆虫细胞成功表达重组NS1蛋白（rE-NS1-BTV12），同样以包涵体形式存在。电洗脱法洗脱纯化重组NS1蛋白，所获得蛋白同样可以与BT阳性羊血清发生反应。利用免疫BALB/c小鼠的脾细胞和SP2/0

8、骨髓瘤细胞融合技术获得杂交瘤细胞，并通过间接ELISA筛选出25株稳定分泌抗NS1蛋白的杂交瘤细胞株。WB结果显示，25株MAbs与rP-NS1-BTV12和rE-NS1-BTV12均呈阳性反应，而与只表达空载体pET-30a和野生型杆状病毒的蛋白呈阴性反应。IFA显示25株MAbs中22株杂交瘤细胞与BTV12呈阳性反应，而3株杂交瘤细胞（(2B7、3E9和4B9)）与BTV12呈阴性反应。22株阳性杂交瘤细胞中6株杂交瘤细胞(1F11、2F2、2C11、3C2、3