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《猪源牛病毒性腹泻病毒rt-pcr检测方法的建立及表达bvdv保护性抗原重组猪痘病毒的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
ESTABLISHMENToFRT-PCRMETHoDSToDEFECTBOVINEⅥRALDIARRHEAVIR。US&CoNSTRUCTIoNoFRECoMBINANTSWINEPoXⅥR17SWSEXPRESSINGPROTECTIVEANTIGENOFBVDVByMengMingluDirectedbyProf．YaoHuochunADissertationSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentofTheRequirementforTheMasterDegreeofAgronomy(VeterinaryMedicine)CompletedinJune，2012CommencementinJune，2012 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名∥‘侈年乡月／髟日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在——年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密吼(请在以上方框内打“√”)⋯姗。毒㈣虢荡们阢导师(需亲笔)签名：夕f1／年参月f严日弦“乡日 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III符号及缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯V第一章BVDV研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11病毒概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12BVDV基因结构及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23蛋白结构与功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33．1p20(Npro)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43．2BVDV结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43．3p7⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53．4p125(NS2-3)、NS2和NS3⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．5p175⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．75急性感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．76垂直传播⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87持续感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98猪感染BVDV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。109诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1010防控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l110．1PI动物的鉴别与清除⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1llO．2人工免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12lO．3生物安全⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．211．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l1．2引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．3样品的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．4病毒的培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．5病毒核酸的提取和cDNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建1．6PCR体系退火温度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．7特异性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．8敏感性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．9重复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．241．10不同样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．241．1lPCR产物的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．1退火温度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2特异性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．3敏感性和重复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．4不同样品检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．5PCR产物的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31第三章表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组猪痘病的的研制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。33l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯341。1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯341．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。382．IE2基因的扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．392．2载体的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．3转化结果PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．4重组病毒的纯化与PCR鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l2．5E2表达的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．6重组病毒的遗传稳定性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯443讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一49至筻谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51 摘要猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的研制牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)-射#瘟病毒(HCV)和羊边界病病毒(BDV)同属于黄病毒科瘟病毒属的成员，BVDV除了能够引起牛的病毒毒性腹泻、粘膜病以及繁殖障碍等症状外，还可引起山羊、绵羊、猪、野牛、羊驼、白尾鹿等动物感染。猪主要通过与带毒动物接触或者使用被BVDV污染的疫苗感染BVDV，据报道猪感染BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。由于在规模化养殖中混合感染日益严重，而且牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒有着密切的联系，因此猪源牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的快速鉴别检测，对于猪群的混合感染、继发感染以及猪瘟疫苗生产中外源基因的检测和猪瘟免疫失败分析有着重要的意义。猪痘病毒(SPV)是痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，猪痘病毒属中的唯一成员，在自然情况下，SPV只感染猪，并且感染非常温和，能自行康复。由于SPV有生物安全性和临床安全性好、较大的插入外源基因的能力及能诱导宿主产生良好的保护性免疫反应等优点，故适合作为载体用于开发重组疫苗。1猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床运用根据牛病毒性腹泻病毒5t端非编码区基因序列，设计合成了一对特异性引物，经过PCR反应条件的优化，建立了BVDVRT．PCR的检测方法，其PCR产物大小分别为186bp，对于BVDV的检测灵敏度为10TCID50，对于CSFV、PRRSV、PEDV、SPV和PCV的PCR扩增结果均为阴性；用该方法对169份临床样品进行了检测，结果BVDV有20份阳性，阳性率为l1．8‰其中124份粪便样有11份阳性，22份组织样有4份阳性，23份猪瘟细胞苗样有5份阳性。成功测出两份阳性样PCR产物序列，并与代表毒株序列比对分析。本实验证明建立的RT．PCR检测方法具有快速、准确、低污染等优点，可用于临床样品中BvDv的检测。2表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的研制E2是BVDV囊膜糖蛋白含有病毒的主要抗原决定簇，能诱导机体产生保护性免疫反应，是BVDV的主要保护性抗原。本研究以BVDV标准毒株Oregonc24v基因 猪源牛病毒性腹泻病毒RT．PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建组为模板扩增出E2基因，将E2基因连接到通用克隆载体pVSCll／P28上，构建出转移载体pUSGll／P28E2，利用SPV020和SPV021两基因问的非编码区作为产生重组猪痘病毒外源基因的插入位点，GFP基因作为一个显性筛选标记，获得的重组病毒rSPV．E2。通过PCR、westembloaing和间接免疫荧光检测对rSPV．E2进行了鉴定，结果显示rSPV．E2能正确表达E2蛋白，重组猪痘病毒有望成为BVDV疫苗用于预防猪发生BVDV感染．关键词：牛病毒性腹泻病毒；RT．PCR；保护性抗原；重组猪痘病毒II ABSlRACTESTABLISHMENTOFRT-PCRMETHODSTODETECTBoVINEVIRALDIARRHEAVIRUSFRoMSWINE&CONSTRUCTIONOFRECOMBINANTSWINEPOXVIRUSESEXPRESSINGPROTECTIⅦANTIGENOFBⅦVABSTRACTBovineviraldiarrheavirus(BVDV)，aswellasclassicalswinefevervirus(hogcholeravirus)andborderdiseasevirus，isthememberofPestiviruswithinthefamilyFlayiviridae．BVDVcancausedigestivedisease，respiratorydiseaseandreproductivelosses．Infection，disease，orbothhavebeendescribedincattle，sheep，goats，pigs，bison,alpacas，llamas，andwhite—taileddeer，andamongotherspecies．AnimalswithvirusandvaccinescontaminatedwimBVDValeresponsiblefortheBVDVprevalenceinpigpopulations．ItisreportedthatBVDVissimilartotheCSFVintheclinicalsymptomandthepathologicalchangewhentheyinfectedthepigs．Co—infectionismorepopularandcomplicatedthanolddaysinintegratedpigindustry．TheidentificaldiagnosisbetweenBVDVandCSFVismoreandmoreimportantforthediagnosisofCO—infectionandsecondaryinfection，thedetectionofexogenousgeneinhogcholeravaccines，andtheanalysisofthefailureoftheimmunityofCSFV．Swinepoxvirus(SPV)isthesolememberofthegenusSuipoxvirus，belongingtothefamilyPoxviridae．SPVinfectsonlyswine．NaturalSPVinfectionsaretypicallymildandoccasionallyaccompaniedbylocalizedskinlesionsthathealnaturally．SPViswellsuitedforthedevelopmentofrecombinantvaccines，becauseofitsbiologicalandclinicalsafety,largepackagingcapacityforrecombinantDNA，anditsabilitytoinducesolidprotectiveimmunity．1EstablishmentandapplicationofRT-PCRmethodstodetectBVDVfromswineBasedonthesequenceof5'untranslatedregion(5’UTR)oftheBVDVgenome，面merWasdesignedandsynthesized．Byoptimizationofthereactioncondition,RT-PCRassayfordetectionofbovineviraldiarrheavirusfromswineWasestablished．ThespecificPCRproductsWas186bpinlength．ThedetectionlimitofcDNAtemplateintheRT-PCRWasIOTCID50；ThehishspecificityofthemethodWasdemonstratedbydetectingCSFV、PRRSV、PEDV、SPVandPCV．Among169clinicalsamples，therewere20samples丽tllBVDVpositive，谢tll1positiveof124fecessamples，4positiveoftissuessamples，and5III positiveofvaccinesamples．ItprovedthatRT-PCRassaycanbeappliedvalueinpractices．2ConstructionofrecombinantSwinepoxvirusesexpressingprotectiveantigenofBVDVGlycoproteinE2istheprotectiveantigenofBVDV，withthedominantantigendeterminants，inducesprotectiveinmmuologicaIreaction．Inthisstudy，weconstructedtransfervectorpUSGl1／P28E2basedonvectorpUSGl1／P28．Thenon-codingregionbetweentheSPV20geneandtheSPV21geneintheSPVgenomewasusedasanovelinsertionlocusforgeneratingrecombinantSPV，andadominantselectionprocedurebasedonGFPgeneexpressionwasdevelopedforrecombinantvirusisolation．Weused锄SsystemtoproducetherecombinantvirusesrSPV—E2．TherecombinantviruseswereidentifiedbyPCR,Westernblottingandimmunofluorescenceassays，andtheirreplicationwerecomparedwiththewild-typevirus．TheresultsdemonstratedthatE2geneexpressionfromtherecombinantvirusWasstableovertenpassages．ItsuggestedthatSPVrecombinantshavethepotentialasBVDVvaccinesfortheuseinpigs．KEYWORDS：Bovineviraldiarrheavirus；RT．PCR；Protectiveantigen；RecombinantswmepoxvirusIV 符号及缩略语V 第一章BVDV研究进展牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)可在世界范围内引起反刍动物发病，也出现过BVDV流行的报道，曾引起人们的广泛关注。牛病毒性腹泻病毒可引起多种动物发病并可寄生于多种器官而不仅仅是动物肠道。据报道牛病毒性腹泻病毒可引起牛、山羊、绵羊、猪、野牛、羊驼、白尾鹿等动物发病【l】。牛病毒性腹泻病于1946年由Olafson首次发现于美国纽约，1953年美国阿依华州描述了一种类似的临床及病理综合征，口腔出现溃疡，许多病牛死于出血性肠炎，当时叫做黏膜病，此后美国及世界各地都有类似的疾病发生并分离到许多分离株。随后大量的研究结果表明牛病毒性腹泻和黏膜病是由同一种病毒引起的。1971年美国兽医协会将其命名为牛病毒性腹泻／黏膜病，引起该病的病原为牛病毒性腹泻／黏膜病毒(BVDV)【2】。牛病毒性腹泻可引起动物消化道疾病，呼吸道疾病以及生产性能下降，因此可导致大量经济损失从。BVDV可通过多种途径在哺乳动物宿主体内存活并成功复制。BVDV可引起免疫抑制，可通过各种直接或间接途径传播，最重要的是，BVDV可通过持续感染动物进行更高效的传播。2007年，世界动物卫生组织把牛病毒性腹泻添加到须报告传染病名单中，但是仅仅只是牛的须报告传染病。1973年，Femelius等首次从自然感染发病猪体内分离到BVDV，从而首次在病原学上证实BVDV可自然感染猪【3】。1996年，王新平【4】等采用RT-PCR发法首次在国内证实BVDV可自然感染猪并出现类似猪瘟的症状与病变。一般情况下猪主要通过与带毒动物接触或者使用被BVDV污染的疫苗感染BVDV。据报道【5，6'71，澳大利亚、爱尔兰、德国等国家猪群中BVDV抗体阳性率达3-40％，荷兰达15-20％。BVDV与猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)核酸同源性约60％，氨基酸同源性约85％【8J，在血清学上存在交叉反应19】，因此用常规的血清学检测方法难以对BVDV和CSFV进行鉴别诊断。由于猪感染BVDV后会出现与猪瘟类似的症状且会干扰猪瘟的诊断及免疫效果，人们逐渐重视对猪感染BVDV的控制。l病毒概况牛病毒性腹泻病毒为单股正链RNA病毒，是黄病毒科瘟病毒属的原型成员，现在羊边界病毒及猪瘟病毒也都是瘟病毒属成员【101。成熟的BVDV病毒粒子有囊膜，直径约40-～60nm，内含直径约30nm的核衣壳。病毒对乙醚、氯仿及pH3．0敏感。病毒不耐热，56℃可使其灭活，病毒在低温下不稳定，在．60～．70。C真空冻干条件下可保存多年。大多数学者认为BVDV没有血凝性，但也有某些毒株能够凝集恒河猴、猪、 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建绵羊和雏鸡红细胞的报道。BVDV只有一个血清型。通过基因分析，BVDV可进一步分为两种基因型，即1型和2型【l¨。BVDV主要有两种生物型，即致细胞病变型(eytopathie，CP)和非致细胞病变型(non叫opathic，NCP)。目前已经发现有CP和NCP型BNDVI及CP和NCP型BVDV2存在，因此BVDV的生物型并不由其基因决定。只有NCP型BVDV可引起持续感染【12J。在诊断实验室分离到的BVDV毒株中NCP型分离株占90％左右【13】，CP型毒株非常少见。CP型BVDV由NCP型BVDV通过重组变异而来。目前发现一些NCP型BVDV在体外培养中可引起淋巴细胞病变，并可在临床上引发严重病情【141。作为RNA病毒，BVDV非常容易发生基因突变，由此导致病毒基因型、抗原性及致病性的改变。由于病毒在复制过程中频繁的基因突变，BVDV最终成为一群同源性较高的基因突变体。不同BVDV之间最可靠的鉴定标准是基因序列。不同BVDV之间的区别并不仅仅只由某段序列决定而是由整个基因组来决定【l51。尽管如此，由于BVDV基因组5’未翻译区(5’untranslatedregion，5'-UTR)高度保守并且有利于PCR扩增，5'-UTR常常被用来检测鉴定BVDV。而第一个非结构蛋白编码区是瘟病毒属所特有的基因序列，通常被用来鉴定疑似瘟病毒属病毒【161。BVDVl具有11个基因亚型(从BVDVla，BVDVlb到BVDVlj)【17】，BVDV2具有2个亚型(BVDV2a和BVDV2b)【18】。在美国牛群中主要存在3个亚型，即BVDVla、BVDVlb和BVDV2a，而北美牛群中78％持续感染牛是由BVDVlb所引起的，临床鉴定中BVDVlb也是最常见的亚型【19】。2BVDV基因结构及功能BVDV基因组为单股正链RNA，约为12～13kb[20]。整个基因组可分为5’未翻译区(5’untranslatedregion，5'-UTR)、开放阅读框架区(openreadingframe，ORF)和3’未翻译区(3’untranslatedregion，3'-UTR)---个部分。其中5'-UTR含有复制所需要的顺势作用元件和一个非帽依赖的翻译起始所需要的内部核糖体进入位点(internalribosomentrysite，IRES或ribosomollandingpads，RPL)；3'-UTR含有参与RNA复制的信号；ORF可编码近4000个氨基酸、分子量约500kDa的多聚蛋白[2H。多聚蛋白在病毒编码和宿主细胞内的蛋白水解酶的共同作用下，在翻译过程中或翻译后分别进行加工，产生出10～11个成熟的蛋白。编码蛋白质的基因在基因组对应的位置为5’-p20(Npro)-p14(C)-gp48(EO)一gp25(E1)-gp53(E2)-p7-p125(NS2-3)-p10(NS4A)-p30(NS4B)-p58(NS5A)-p75(NS5B)-3’[22J，其中p14、gp48、gp25、gp53是病毒的结构蛋白，其余为非结构蛋白，如图1．1所示。2 第一章BVDV研究进展西∥∥尹／∥5'UTR1毖：Q鐾端隐毒k眩溅骐岛—瀑羹囊曩如—囊§飘蝴3'UTR，图1．1BvDV的基因结构Fig．1-2OrganizationofthegenomeofBVDVBVDV的5'-UTR约由380"--385个核苷酸组成，5’末端无甲基化的“帽子”结构，5'-UTR序列在各BVDV毒株间有较高的保守性，因此常根据5'-UTR的序列合成引物来检测BVDV或用于对BVDV的分型23】。BVDV的5'-UTR中有6个AUG，但这些AUG均不能启动蛋白翻译，也没有相应的表达产物，BVDV的5'-UTR具有相当保守且稳定的二级结构。Deng建立了瘟病毒属5'-UTR的二级结构模型，以BVDVlNADL株较为典型，分为A、B、C、D4个功能区，其中C区是一个保守的不完全茎2环结构，D区占5'-UTR的2／3，其二级结构较为保守。5'-UTR内部有核糖体结合位点，核糖体中的18SrRNA3’保守序列GUCGAAACAAGG与瘟病毒5'-UTRIRES结合，在空间上有利于从OI江的AUG处启动翻译，这种结合不依赖于5’端的结构【24】，在BVDV2IRES决定病毒的毒力。瘟病毒属5'-UTR序列高度同源性和相似的二级结构说明，这一结构在病毒转录、翻译过程中起重要作用，瘟病毒属病毒可能以相似的机制进行转录和翻译【251。BVDV3'-UTR由223～230个核苷酸组成，始于ORF的终止密码子TGA，3’末端缺乏Poly(A)“尾”结构【26】，3'-UTR内有60bp富含AT的序列，有1个8核苷酸重复序列(TATATATA)，另外，3'-UTR中还存在两段50bp的向上序列。已证实5'-UTR及3'-UTR参与病毒的复制和调控，与病毒复制酶(p75)对RNA模板链的识别有关。3蛋白结构与功能BVDV的基因组中只有一个大的开放阅读框(RNA上第386～12349个核苷酸)，包含3988个密码子，可编码499kDa的蛋白。合成的聚蛋白经不同的前体蛋白分子，最终被加工成10～11个成熟的蛋白，如图1．2所示。 猪源牛病毒性腹泻病毒RT．PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建P20(prgPl40)P125(prpl75)囹匹jj凸a已叠峦—■■—■■●■■■—■●匕=============](pr2p116)@rpl65)墨墨§矗盎墨圆匕==========](Prgp78)P42匹aooo匕=](gp62)P10P30@133)岱＆跚●口匕========]gp48gp25gP53P54PS0P58P75墨翌圆墨圆—■■■●—■■●■●匕=了匕==]图1．2BVDV编码蛋白的加工与成熟过程Fig．1—2TheprocessingofproteinencodedbyBVDV多聚蛋白经加工后，最先形成的是p20蛋白和前体蛋白Prgpl40、p125和PrPl75。p20蛋白是BVDVN端的第1个产物，Prgpl40是病毒结构蛋白的前体分子，分子质量为140ku的糖蛋白，对Prgpl40的加工主要是在内质网上由宿主细胞的信号肽酶进行f27捌，Prgpl40首先裂解为Prgpll6，最后加工成gp53、gp48和gp25，无论是在感染的宿主细胞中还是病毒粒子上，这三种糖蛋白分子间均通过二硫键连接，形成二聚体。糖蛋白的这种二聚体对病毒粒子的装配十分重要，正是这些二聚体共同构成病毒的囊膜结构，这种结构在其他病毒中尚未发现。PrPl75是病毒非结构蛋白前体分子，首先裂解为PrPl65，再依次裂解为p10、p30、p58和p75。3．1p20(Npro)p20是ORF编码的第一个蛋白质，也称Npro，是黄病毒科中仅瘟病毒有的一种非结构蛋白，分子量为20．23kD。具有蛋白酶活性，在前体蛋白翻译的同时自身从前体上裂解下来【291。酶活性中心部位在40．160位氨基酸残基内，酶切位点在164位氨基酸残基附近。p20存在于宿主细胞的细胞质中，与病毒结构蛋白的成熟无关。3．2BVDV结构蛋白Prgpl40是病毒结构蛋白的前体分子，分子量为140kDa的糖蛋白。Prgpl40经蛋白水解酶的切割和糖基化酶的修饰，被加工成为成熟的病毒结构蛋白：p14(C)、gp48(E0)、gp25(E1)、gp53(E2)。p14是非糖基化的核衣壳蛋白，又称C，与病毒的基因组RNA构成病毒的核心。p14由85个(也有报道为102个【30】)氨基酸组成，N端切点可能在164-165位氨基酸残基之间，C末端切点可能在248。250位氨基酸之间。富含Lys，带有很高电荷。p14C端的54个氨基酸高度保守(91％)，它和第一个糖蛋白gP48之间(约250—267位氨基酸残基)存在一个18个氨基酸的疏水侧链，可能是负责糖蛋白转位的信号序列。Elahi4 第一章BVDV研究进展等【3l】构建了表达p14基因的重组腺病毒，将其免疫小鼠后，免疫小鼠脾细胞与基因I型和II型BVDV均能产生特异性免疫反应，表明p14蛋白具有免疫原性。对BVDV结构蛋白的研究多集中在其囊膜蛋白上。gp53(E2)是病毒囊膜糖蛋白，位于ORF的20077-3198位核苷酸，由374个氨基酸残基组成依其糖基化程度不同，分子量可为51～581(D．[321。未糖基化的蛋白部分含有19个Cys残基和5个可能的N-连接的糖基化位点，这些位点在BVDV不同毒株中非常保守【33】。gp53多以同源二聚体形式存在，或以异源二聚体gp53．p7形式存在，在细胞信号肽酶的作用下从多聚蛋白上裂解下来。gp53C端含有一个疏水的膜锚定区，通过这一疏水区锚定在囊膜上。gp53靠近N末端的一半含有多种依赖于构象的抗原结构域，其N端伸出BVDV囊膜表面，是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应与宿主细胞识别、吸附的主要部位瞰】。gp53具有中和活性，其N端有两个抗原决定区，一个是在种内保守的主要抗原区，另一个是决定不同毒株的抗原特异性区域。gp53是BVDV结构蛋白中变异率较高的一种蛋白【351，中和逃逸频率为10也·47。已证实，NADL株838位氨基酸残基D2N(Asp天冬氨酸．Asn天冬酰胺)突变可引起对抗体的中和逃逸【36】。gp53的变异使BVDV对环境有较好的适应性，是导致疫苗保护失效和牛持续感染的主要原因之一【37J。囊膜蛋白gp48，又称E0或Erns，位于ORF的81l～1491位核苷酸，由227个氨基酸残基组成，有8个可糖基化位点，去糖基化分子质量约为27ku。该蛋白缺乏膜锚定位点，而以一种至今未知的机制与细胞相连。在病毒粒子中，gp48以100ku大小的同聚体存在，在细胞信号肽酶的作用下，其N末端从多聚蛋白上裂解下来，可被分泌到宿主细胞外。gp48有其特有的RNase活性【381，但该活性在瘟病毒增殖及使机体致病过程中所起的作用尚不清楚，对gp48RNase活性的研究有可能为BVDV防治找到新的途径。gp48是BVDV编码蛋白中保守性很高的蛋白【391，其上有中和表位，产生的中和抗体具有中和BVDV和CSFV的能力。氨基酸序列分析结果表明，在这一蛋白内有一高度保守结构域，因此它可用于研究基因工程亚单位疫苗，也可作为基因工程诊断抗原。囊膜蛋白gp25又称E1，位于ORF的1492～2076位核苷酸，由195个氨基酸残基组成，非糖基化蛋白分子质量约为20ku，含有两个糖基化位点。gp25以C端的疏水区锚定在BVDV囊膜上，不能与BVDV抗体进行免疫反应。推测gp25埋在病毒囊膜内【40】。gp25可能在病毒包装、成熟过程中协助gp48(E0)的定位。3．3p7编码瘟病毒E2和NS2的基因被一个编码p7小肽的序列分开。p7的分子质量大 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建约为6ku,～7ku，主要由疏水氨基酸组成，E2和p7之间的裂解由宿主信号肽介导，在瘟病毒感染的细胞中，E2-p7的裂解效率不高，结果得到2种类型的E2，即E2和E2-p7。用双顺反子全长BVDVRNA转染试验和反式互补试验研究表明，在RNA复制和感染性病毒粒子形成时E2-p7均是非必须的，但还需确定它是否在自然宿主适应性方面有作用。将突变引入BVDV的感染cDNA，框内缺失全部的p7不影响RNA复制，但产生的病毒粒子无感染，用辅助病毒对p7进行反式互补后，又可获得感染性病毒【411，这一结果提示，瘟病毒p7对产生感染性子代病毒是必需的。3．4P125(NS2．31、NS2和NS3p125(NS2．3)是BVDV的非结构蛋白。在NCP型BVDV感染的细胞中，p125是一种成熟的蛋白形式142]；而在CP型BVDV感染的细胞中除了有稳定的p125外，还可在其内部的一个位点断裂，产生NS2和NS3。通常NS2．3裂解产生的NS3是CP型BVDV的一个标志【43】。但NCP型BVDV中，NS2．3位点的裂解未发生，所以只能观察到NS2．3。NS2蛋白的生物学功能尚未见报道。NS2．3和NS3为多功能蛋白，能与RNA结合，具有NTP酶、解旋酶和蛋白酶活性㈣。3．5p175p175蛋白大约占整个前体多聚蛋白的1／3，在感染细胞中可检测到。它从前体多聚蛋白上产生后，很快释放出成熟的p10和非成熟的p165，或p42和p133两种蛋白。p42不稳定，又加工成p10和p30，p133进一步加工成p58和p75。上述蛋白除p30尚未检测到外，其余均能从BVDV感染的细胞中检测到p10(NS4A)由64个氨基酸组成，在瘟病毒中高度保守，与CSFV54个残基的NS4A相似。瘟病毒的NS4A蛋白N末端是疏水的，其C末端带电荷的程度高。NS4A为NS3蛋自酶的辅助因子。NS3严格依赖于NS4A完成对NS4A和NS4B、NS5A和NS5B间位点的裂解。p30(NS4B)由347个氨基酸组成，分子质量为38ku---，39ku。瘟病毒的NS4B呈碱性，含几个疏水区，可能与膜相连。在病毒复制过程中，NS4B必需参与是顺式作用因子【451。有报道NS4B在病毒致细胞病变中有一定作用，突变可以减弱BVDV致细胞病变性。p58(NS5A)由496个~497个氨基酸组成，分子质量55ku--一56ku。NS5A为亲水性的，在细胞感染中相当稳定，其丝氨酸和苏氨酸残基有磷酸化现象。黄病毒科各成员中的NS5A均有磷酸化现象，它们在病毒生命周期中具有重要作用。NS5A与翻译延伸因子1的A亚基(eEflA)相互作用，在病毒复制过程中有一定作用[46J。BVDV编码p75(NS5B)的基因位于基因3’末端，与3'-UTR相邻。NS5B具有依赖RNA的6 第一章BVDV研究进展RNA聚合酶(RdRp)活性【47】和末端核苷酸转移酶(TNTase)活性【481。4流行病学BVDV的自然宿主为牛，通过血清学调查发现BVDV已遍布世界各地的牛群中。不同国家之间由于所用疫苗及饲养管理不尽相同，BVDV阳性率也有所不同，其中北美不同地区之间动物个体BVDV阳性率在40,--,90％149,50】。我国牛感染BVDV几乎达100％，很少检出阴性牛群。相对而言PI牛分布并不广泛，通常在牛群中不到1％【511。BVDV可在多种动物体内生存，因为最早是从牛体内分离得到故而被称为牛病毒性腹泻病毒。目前已经在偶蹄目7到10个哺乳动物科中50多种动物体内发现BVDV血清抗体[52,53,54】，对BVDV敏感的动物有牛、猪、绵羊、山羊、野牛、鹿及羊驼等动物。在北美有关鹿及羊驼感染BVDV的报道已经引起了人们的广泛关注。PI动物体内BVDV的鉴定对BVDV流行病学研究具有重要意义，因为PI动物是BVDV最重要的传染源。一般情况下猪主要通过与带毒动物接触或者使用被BVDV污染的疫苗感染BVDV。据报道，澳大利亚、爱尔兰、德国等国家猪群中BVDV抗体阳性率达3~40％，荷兰达15～20％。2008年宋永峰等【55】应用RT．PCR及套式PCR方法对我国浙江、湖南、辽宁、安徽、江西、广西六省(区)采集的病料中随机抽取43份样品进行检测，结果7份病料为BVDV阳性，阳性率为16．3％。目前国内猪群中BVDV的感染情况及感染率有待今后的进一步研究。目前人们普遍认为BVDV并不能够感染人类。但是BVDV变异性强，并且能够在体外用人类细胞系培养增殖【561，与人肝炎C病毒相似【571。1989年Wilks等【58】报道用ELISA从家畜管理人员、兽医及极少接触易感动物人的血清中检测到BVDV抗体，此外已经分别从两位健康人员、一位克罗恩病患者及一位患肠胃炎的两岁儿童身上分离到BVDV分离株【59,60,61,62】，因此BVDV是否能感染人尚无定论。5急性感染BVDV急性感染主要是感染刚出生的具有免疫能力的动物。PI动物是最重要的传染源，也可以通过接触带毒动物感染【631。最有效的传播途径是鼻子对鼻子传播。大多数情况下健康动物感染BVDV临床症状并不明显，此时可称为隐性感染，然而通过密切地观察我们可以发现，隐性感染动物会表现出发热、白细胞减少、食欲减退、产奶量下降等症状。怀孕母畜感染BVDV也会影响胎儿。急性感染动物的临床症状主要有腹泻、精神沉郁、眼鼻有分泌物、厌食、产奶量下降、咽疮风以及发热，通过实验室检验可发现以中性粒细胞减少为特征的白细胞减少症。美国和加拿大都出现过BVDV 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建最急性感染的报道，病畜通常表现严重的临床症状并有较高的死亡率f641。从最急性感染动物身上分离到的BVDV通过基因分析最终确定为BVDV2。急性感染BVDV还会导致以血小板减少为特征的出血综合征，牛犊和成年牛在自然感染BVDV后都可能导致血小板严重减少并发出血综合征【65娜】。该出血综合征的主要临床症状有腹泻带血、鼻出血、有淤血点或斑、伤口流血不止等。血小板减少性BVDV感染仅仅可通过动物感染NCP型BVDV2人工复制【67】。血小板机能障碍也可以再BVDV实验室感染动物身上发现【68】。因此，血小板数量下降以及机能障碍都可以引发出血素质。而BVDV感染骨髓巨核细胞的研究在BVDV介导的血小板减少症病因学上具有重要意义【691。BVDV急性感染对动物具有免疫抑制作用，主要表现为循环中免疫细胞数量减少及机能下降，并会增加动物对其他病原的敏感性。在由多重感染引起的牛呼吸系统综合征中，BVDV是～个重要病原。BVDV对天然免疫细胞及获得性免疫细胞都有影响。通常牛在急性感染BVDV后都会出现白细胞减少症，其严重程度因BVDV毒株不同而异，感染BVDV2白细胞减少症要比感染BVDVl严重，感染强毒株要比感染弱毒株严重【701。减少的自细胞主要以淋巴细胞和中性粒细胞为主【711。白细胞在被BVDV感染后会被机体免疫系统清除，BVDV也可以破坏免疫细胞，加上越来越多的免疫细胞向组织转移，这些因素都会导致白细胞减少。在BVDV急性感染期间，胸腺、脾、淋巴结及肠相关淋巴组织(Peyer氏小体)都会有淋巴消耗，其剧烈程度因毒株不同而异。急性感染也会造成淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞的机能下降【72,73,74】。6垂直传播停留在公牛生殖系统的BVDV并没有像停留在母牛生殖系统的BVDV一样得到人们足够的关注，BVDV能够在公牛的精液里存活f75,76,77J，并能在低温保存或加工处理过的人工受精时使用的精液里存活【78】。PI公牛精液里的BVDV滴度要比普通带毒公牛高。使用带毒公牛的精液进行人工受精会使母牛感染BVDV。急性感染BVDV时，病毒会在血液里出现，但随后就会被机体免疫系统清除，然而在睾丸组织里的BVDV却能存活很长时间。这最初是在一个人工受精中心得到证实，尽管血液里已经没有病毒，循环里血清特异性抗体浓度也很高，该公牛的精液里仍终生能检测出BVDV。在实验室里人工感染青年公牛是也会出现这种情况，在公牛感染BVDV2．75年后仍然可以从其精液里检测到病毒RNA，感染BVDVl2．5个月后其睾丸组织中仍然能检测到传染性病毒。血睾屏障的存在让睾丸组织了的BVDV能够长期存活而不被免疫系统清除。只是目前还不能确定睾丸组织里的BVDV对其他动物是否具有传染 第一章BVDV研究进展性，是否还能够导致病毒血症。BVDV可以通过胎盘传播，由此会导致经济损失。胎儿感染BVDV的后果主要与3个因素有关：感染病毒时胎儿的胎龄；病毒感染的组织器官；病毒的生物型、毒力及其靶细胞范围。除持续感染以外，怀孕母牛感染BVDV可能会导致流产、胎儿被吸收及由此引起的重复发情、产畸形胎儿、木乃伊胎以及产带毒胎儿或者弱胎。在怀孕的前三个月感染BVDV通常会引起胎儿死亡，怀孕中后期感染BVDV会引起流产及死产【791。在怀孕100到150天期间感染BVDV则会引起母牛产畸形胎儿，畸形胎儿的症状主要有小脑发育不全、髓鞘形成障碍、积水性无脑畸形、脱毛症、白内障、视神经炎、短颌症、脑积水、脑过小、胸腺发育不全、稀毛症、肺发育不全及生长缓慢。BVDV能否引起怀孕早期胚胎死亡尚有争议。母牛在受精前感染BVDV会降低受孕率【801。在急性感染BVDV后，病毒经血液循环进入卵巢并能引发卵巢炎导致卵巢机能障碍，这是母牛受孕率降低的原因之一[81,82】。在病毒血症期间进行人工受精母牛怀孕率会降低。人工受精是感染NCP型BVDV并出现病毒血症的母牛受孕率为44％，而对照组母牛受孕率为79％州。7持续感染持续感染(Persistentinfection，PI)是BVDV感染动物最重要的一个类型，是BVDV在动物群体中长期存在的重要模式，通过PI动物可在群内或者群间传播病毒。因此人们非常重视对PI动物的鉴定检测，并且在BVDV防控计划中清除PI动物是最关键的部分。牛的持续感染是母牛怀孕45到125天期间在子宫内BVDV感染胎JL苫JI起的，在此期间胚胎期将结束胎儿开始成形，胎儿的免疫系统正处于发育阶段，并且到125天胎儿的免疫系统也还没有完全发育成熟【831。此时病毒生物型的转变很重要，两个生物型的BVDV都可以引起胎儿死亡，但只有NCP型BVDV可以引起持续感染。在持续感染动物体内BVDV对淋巴细胞免疫耐受，但这免疫耐受是高度特异的，当动物感染不同BVDV毒株时可产生免疫应答【841。因此PI动物还是会出现血清抗体阳性，不能以血清抗体阳性排除动物持续感染的可能。在持续感染动物体内很多组织中都可发现病毒，并可从眼鼻分泌物、尿液、精液、乳液、粪便排毒，因此PI动物可高效地传播BVDV。PI动物可以经垂直传播途径传播BVDV。大部分PI动物出生后生命力很弱，发育迟缓，发育成熟后明显要比同群其他动物弱小，或者出生后不久死亡。而有的PI动物动物出生后可正常成长，仅从外观无法与其他动物区分。PI动物的免疫系统存在缺陷，这使得它更容易感染那些条件致病病原，这也可能是PI动物过早死亡的原因。黏膜病是BVDV引起的对动物损伤最大最剧烈的临床疾病，当PI动物感染CP9 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建型BVDV时就会引发黏膜病【85J。动物可以从体外感染CP型BVDV，其体内的NCP型BVDV也可以转变成CP型BVDV并可传播给群内其他的PI动物【86】。由于PI动物并不多，因此黏膜病发生率并不高，但致死率很高。BVDV引起的黏膜病可以分为急性致死性黏膜病、慢性黏膜病、可康复性黏膜病及迟发性黏膜病，发生哪种类型的黏膜病是由PI动物体内的NCP型BVDV与再感染的CP型BVDV之间抗原性关系(相近程度)决定的哺¨。8猪感染BVDV猪可通过与BVDV牛、羊接触或通过污染BVDV的疫苗而感染BVDV。一般情况下猪感染BVDV不表现明显的临床症状而呈现亚临床感染或隐性感染。自然条件下，猪先天感染BVDV的症状与病变类似于猪瘟【88】。据Terps仃a等【89】报道，感染猪发病通常于生后2"--4周龄，多数于生后4个月内死亡，有些于生后几天死亡，临床表现为贫血、被毛粗乱、生长迟缓及消瘦，有些还见有结膜炎、多发性关节炎和腹泻。病理变化以慢性胃肠炎及败血症变化为特征。心外膜、肾脏及淋巴结有多量出血点，消化道卡他性炎，胃、结肠、肓肠粘膜溃疡，可见有多量的扣状肿，类似慢性猪瘟的病变。Carbrey等190]观察到母猪自然感BVDV的症状为屡配不孕、产仔数下降和流产，先天性感染的仔猪可在生后产生BVDV抗体，也有形成持续性感染，持续感染猪可长期存在，并且可将BVDV传播给易感的母猪。目前我国的养猪业规模化养殖占10％左右，仍主要呈现散养模式，猪舍条件有限，生物安全性低，从业人员预防理念较落后，猪瘟疫苗污染BVDV现象依然存在，因此我国猪群BVDV的感染程度让人担忧，我国兽医工作人员及养猪从业人员应当给予重视。9诊断方法现在已经有多种检测BVDV的方法，临床上可根据实际需要选择。目前鉴别诊断PI动物的方法也有很多并在不断完善发展。确切的诊断要依靠实验室检测方法的结果。在得到确切阳性检测结果后要通过科学的管理与防控措施将感染BVDV带来的损失降到最低。最可靠的确诊方法是利用相应的细胞分离BVDVl911，然而这种方法要花费大量的时间和金钱，相对而言针对BVDV核酸及特异性抗体的检测方法更实用。我们可以从血清、全血、精液、鼻拭子及多种组织中分离到病毒。可从濒死动物血液中的棕色细胞中分离病毒，从死亡动物的淋巴组织中分离病毒进行诊断[921。免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidasemonolayeraSsay)可以在动物群体水平筛选分离病毒【93】，lO 第一章BVDV研究进展这个方法最初是用来检测PI动物的。通过这个方法可以做出确切的诊断，但是由于母源抗体的干扰不能用于3月龄以下小牛检测确诊。免疫组织化学方法(IHC)和抗原捕获酶联免疫吸附试验(ACE)可用来检测BVDV。这两种检测方法相比分离病毒而言可快速得到检测结果而且花费较小，已经被广泛使用。通过IHC和ACE检测表皮样品，这是目前广泛使用的确诊PI动物快速的方法【941。经病毒分离试验检测呈阴性的PI动物及因母源抗体干扰ACE试验检测呈阴性的血清样品也可以通过检测皮肤样品确诊【951。因此IHC和ACE非常适合用来检测PI动物。然而应当引起注意的是，在美国已经出现一株BVDV，用常规的IHC及ACE都不能被检测出来196]。分子生物学检测方法的已经成为了一种广泛使用的成熟的BVDV常规诊断技术。由于病毒RNA提取简单快捷，加上商业检测试剂盒的迅速发展，分子生物学检测技术已经成为检测病毒核酸理想的检测方法。RT-PCR具有高度敏感性，比病毒分离检测方法要敏感10到10000倍拶71。RT-PCR具有高度特异性，且是一种比较经济的检测方法，可用于检测各种组织及血清、全血、乳液样品。但是必须注意的是检测到病毒RNA并不等同于检测到传染性病毒【98】。血清学检测方法也可用于检测BVDV，但是却不能区分检测出来的血清抗体是由自然感染产生的，还是由接种疫苗产生的，还是由母源抗体转移而来的。血清学检测方法可用于疫苗免疫效果的评估以及判断畜群是否暴发BVDV感染[991。病毒中和试验是最常使用的血清学检测方法，根据所使用对照毒株的不同还可判断抗体是BVDVl特异性抗体还是BVDV2特异性抗体。但是并不能仅仅把血清中和抗体的检测作为鉴别诊断的依据。10防控清除传染源和切断传播途径是传染病防控最重要的两个方面。PI动物是BVDV最重要的传染源，清除PI动物是BVDV防控最重要的环节。要制定和执行良好的畜群卫生计划，避免怀孕母畜与BVDV的接触。在制定BVDV防控计划时要注意3个方面：(1)PI动物的鉴别与清除，(2)人工免疫(使用疫苗)，(3)加强生物安全防止敏感动物与BVDV接触【100A01]。有些欧洲国家实施了很好的BVDV防控措施，并取得良好效果。lO．1PI动物的鉴别与清除PI动物是BVDV最重要的传染源，必须防止PI动物繁殖后代，因为PI动物的后代肯定也是PI动物【l021。大部分的PI动物都是由上一代传染的，当然也应该防止仔畜 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建传染父母本。可用PCR、ACE或者IHC检测皮肤样品来确定幼龄动物是否属于PI动物。带有母源抗体的幼龄动物如果用PCR、ACE或IHC检测皮肤样品呈阳性，则该幼龄动物是PI动物。为排除急性感染的可能，青年及成年动物还应该在皮肤样品检测30天后再用RT-PCR检测全血或者从全血中分离病毒来确诊【103】。10．2人工免疫疫苗的使用在人类和动物抵抗传染病的过程中具有重要作用。由于BVDV会引起宿主的免疫抑制，使用活疫苗就存在这种危险。因此对BVDV疫苗的研究主要集中在病毒载体疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗等领域。猪痘病毒(Swinepoxvirus，SPV)是临床上引起猪痘的病原，该病毒在自然条件下仅感染猪，且通常为良性经过[i04]，故作为病原并不受重视。但是由于SPV作为载体具有很多优点，从而被认为是非常有应用潜力的猪源疫苗载体。目前，最常用的产生重组病毒的策略是通过在病毒感染细胞内的DNA同源重组来完成。在痘病毒复制期间，这种重组事件发生的概率大约是O．1％。重组是由转移载体介导的。充当转移载体的质粒必需具有下列三种元件：一个用于表达外源基因的表达盒子；一种筛选标记；一对和SPV基因组序列同源的重组臂。并且，重组猪痘病毒不会通过接触传染给未接种重组病毒的对照组的猪【1051。迄今为止人们已研制出多个能成功表达外源基因的重组猪痘病毒的载体系统，SPV作为猪源疫苗的活病毒载体也必将有广阔的应用前景。103生物安全严格的生物安全措施在现代养殖业的生产管理中非常重要。在BVDV的防控过程中，清除PI动物后应当实施严格的生物安全措施。引进新动物先要进行BVDV检测，特别是种畜，避免带入PI动物。新引进的动物要进行3周的隔离饲养。如果引进的是母畜，有条件的话可对其后代进行BVDV检测，以确保其不带有BVDV。种公畜在人工采精前必须进行BVDV检测，以确保人工受精使用的是安全的精液。还应当严格监控养殖场工作人员、设备及材料的进出入流动，实施良好的消毒措施。预防猪感染BVDV是还应当特别注意避免猪与牛、羊之间的互相接触，在使用疫苗之前应做好BVDV检查，防止在疫苗使用过程中感染BVDV。 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猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建encounteredwhendetectingbovineviraldiarrheavirusinIVFembryoproduction．Theriogenology2002；58：1399·1407．【99】SalikiJr,DuboviEJ．Laboratorydiagnosisofbovineviraldiarrheavirusinfections．VeterinaryClinicsofNorthAmerica-FoodAnimalPractice2004；20：69·75．【100】BrockKV．Thepersistenceofbovineviraldiarrheavirus．Biologicals2003；31：133一135．【101】LindbergALE．Bovineviraldiarrhoeavirusinfectionsanditscontrol—Areview．VeterinaryQuarterly2003；25：1-16．【102】SmithD凡GrotelueschenDM．Biosecurityandbiocontainmentofbovineviraldiarrheavirus．VeterinaryClinicsofNorthAmerica-FoodAnimalPractice2004；20：131-+．【103】WalzPH，GroomsDL，PasslerT’Ridpath正TremblayR，eta1．Controlofbovineviraldiarrheavirusinruminants．JVetInternMed2010；24：476-486．【104】ChevilleNF．Immunofluorescentandmorphologicstudiesonswinepox．PatholVetl966；3：556．564．【105】vanderLeekMLFJ，SorensenGeta1．EvaluationofswinepoxvirusasavaccinevectorinpigsusinganAujeszky'sdisease(pseudorabies)virusgeneinsertcodingforglycoproteinsgp50andgp63．TheVeterinaryrecordl994；l：13—18．20 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用摘要：根据牛病毒性腹泻病毒5’端非编码区基因序列，设计合成了一对特异性检测引物，经过PCR反应条件的优化，建立了BVDVRT．PCR的检测方法，其PCR产物大小分别为186bp，对于BVDV的检测灵敏度为IOTCID50，对于CSFV、PRRSV、PEDV、SPV和PCV的PCR扩增结果均为阴性；用该方法对169份临床样品进行了检测，结果有20份BVDV阳性，阳性率为11．8％，证明建立的RT．PCR检测方法具有快速、准确、特异性强等优点，可用于临床样品中BVDV的检测。关键词：猪源牛病毒性腹泻病毒；ImPcR；临床样品牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)和羊边界病病毒(BDV)同属于黄病毒科瘟病毒属的成员【l】，BVDV除了能够引起牛的病毒毒性腹泻、粘膜病以及繁殖障碍等症状外，还可引起山羊、绵羊、猪、野牛、羊驼、白尾鹿等动物感染【2，3】；据报道猪感染BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化【4】。Femelius等【51(1973)首次从自然感染发病的猪体内分离到BVDV从而在病原学上证明BVDV可以自然感染猪。王新平等【6】应用RT-PCR方法从内蒙古哲盟地区疑似猪瘟病料中检出BVDV(ZM．95)，从而在国内首次证实BVDV可自然感染猪。BVDV和CSFV一样可以通过自然宿主的胎盘屏障传给后代，怀孕母猪感染BVDV可导致流产、死胎、木乃伊及产下先天性异常的后代。近几年，猪感染牛病毒性腹泻病毒渐渐引起人们的关注。由于在规模化养殖中混合感染日益严重，而且牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒有着密切的联系，因此猪源牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的快速鉴别检测，对于猪群的混合感染、继发感染以及猪瘟疫苗生产中外源基因的检测和猪瘟免疫失败分析有着重要的意义。RT-PCR具有高度敏感性，高度特异性，且是一种比较经济的检测方法，可用于检测各种组织及血清、全血、乳液、粪便样品，在临床实践中已广泛应用。1材料与方法1．1材料牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Oregonc24v株及T-CP株源自江苏省出入境检验检疫局；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪痘病毒(SPV)和DH5ct由本实验室保存；PCR试剂、pMDl9．TVector试剂盒由TaKaRa公司生产；核酸胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒及病毒核酸提取试剂盒均购自GeneAid；M．MLV由北京百泰克生物技术有限公司生产；引物由Invitrogen上海公司合成；低温离心机、C02培养箱及超微量核酸蛋白测定仪为ThermoScientific公司产品；全自动凝胶成像系统来自Bio．Rad公司；PCR仪为Biometer产品；临床样品来自于江苏省、江西省、浙江省等同地区猪场各年龄段猪粪便样及疑似病猪的脾脏、小肠、淋巴结和不同厂家猪瘟细胞疫苗。1．2引物设计与合成根据已公布的牛病毒性腹泻病毒的基因序列，对比分析，选择保守性强的5’端非编码区基因序列，应用计算机软件Primer5设计合成了一对特异性引物(表2．1)。表2-1BVDV特异性检测引物．．．—．．．—．．．．．．．．．．．．．．．．．．Tab．2-1．specialprimerofBVDVPrimernameSequenceProductlength1．3样品的处理1．3．1组织样品的处理取病猪的小肠、脾脏和淋巴结等组织1．0～2．09，剪碎，匀浆再用PBS按1：5的体积比稀释，一20℃反复冻融3次，1200094。C离心5分钟，取上清，．20"C保存备用。1．3．2猪瘟冻干细胞苗的处理在疫苗中加入2mlPBS，吹打溶解后，取lml1200094"C离心10分钟，取上清-20℃保存备用。1．3．3粪样的处理取猪粪样1．0"-2．09，用PBS按1：5的体积比稀释，在震荡器上震荡15分钟，一20℃反复冻融3次，静置30分钟取上清，1200094"C离心5分钟，取上清，．20*C保存备用。 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用1．4病毒的培养本实验通过MDBK细胞增殖病毒。MDBK细胞在37。C-氧化碳培养箱培养，培养基为含10％胎牛血清的MEM培养基。取100pL病毒液接种于MDBK单层细胞，加入细胞培养维持液；或于细胞传代时加入100pL病毒液，40小时后收毒。(A)(B)图2-1MDBK细胞培养BVDV(A)NCP型BVDV(B)CP型BVDVFig．2—1BVDVculturedbyMDBK(A)NCPBVDV(B)CPBVDV1．5病毒核酸的提取和cDNA的合成按ⅥralNucleicAcidExtrantionKitII试剂盒说明书提取病毒核酸，取病毒细胞培养物或处理好的样品200pL至1．5mLEP管中，加入VBLysisBuffer400pL，剧烈振荡，室温静置10min，加入ADBuffer450pL，剧烈振荡，把VBColum放到2mLCollectionTube中，往VBColum中加混合液600pL，4"C12000rpm离心lmin，弃滤液，把剩下的混合液加入VBColum中，40C12000rpm离心lmin，把VBColum放到新的2mLCollectionTube中，往VBColum中加入400¨LWlBuffer，4"C12000rpm离心30s，弃滤液，往VBColum中加入600肛LWashBuffer，4"C12000rpm离心30s，弃滤液，4℃12000rpm离心3min，加入DEPC水201．,tL溶解沉淀，室温静置3min，4"C12000rpm离心lmin，．20℃保存备用。cDNA的合成：取高压灭菌的酶切管依次加入模板RNAlOpL、下游引物(50pm01)1uL，轻轻混匀后，在70℃水浴5min，再病浴5min，往酶切管中依次加入5ReactionBuffer4pL、RNaseInhibitor(40U／pL)lpL、dNTPMix(10mmol／L)2pL、M-MLV(200U／pL)lpL、加DEPC水至20“L。25℃作用10min，然后50℃反应60min， 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建然后在70℃加热10min结束反应，．20℃保存备用。1．6PCR体系退火温度的优化进行退火温度梯度PCR试验，以确定最佳退火温度。退火温度梯度设置为45。C、47℃、49℃、51℃、54℃、57℃、60℃、62℃、65℃。1．7特异性将CSFV、PRRSV、PEDV和BVDV分别提取RNA，反转录后的eDNA以及提取的PCV和SPV的DNA为模板进行PCR，判定该方法的特异性。1．8敏感性首先滴定CP型BVDVT-CP株病毒TCID50：将MDBK细胞在细胞瓶上传代培养，细胞长成单层后，胰酶消化3次，用营养液制成细胞悬液，转至96孔板，细胞培养箱中培养备用；稀释BVDV病毒，取24孔板，于一排6孔内加Hank’s液900ul，在第一孔内加入100ul病毒，依次倍比稀释；然后接种细胞，用24孔板稀释后的病毒对应接种96孔板内的细胞，做8个重复；于37。C吸附l小时，倒出孔内液体，加入2滴维持液培养；观察CPE产生情况，统计，计算TCID50。将原病毒cDNA做102"----10之TCID505个稀释度跑PCR检测引物对BVDV-F／BVDV-R敏感性。1．9重复性应用优化后的RT-PCR方法对3份BVDV阳性样品进行扩增，三次重复，确定其重复性。1．10不同样品的检测将来自不同地区的169份样品应用RT-PCR的方法进行BVDV抗原检测；样品包括猪的小肠、淋巴结等病料组织、粪便样品以及猪瘟细胞冻干疫苗。1．1lPCR产物的序列分析将部分临床病料中阳性PCR产物PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按微量胶回收试剂盒的使用说明回收目的DNA片段，与pMDl9．T载体连接后转化DH5ct，送Invitrogen生物技术有限公司测序，并在NCBI网站上下载部分BVDV代表毒株序列与测序结果比对分析。24 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RToPCR检测方法的建立与临床应用2结果2．1退火温度的优化经PCR退火温度梯度试验，从图2．2可知引物对BVDV．F／BVDV．R对退火温度的适应范围较广，可使用软件Primer5推荐的最佳退火温度54。C。bp1000750500250100^I1234S6了8910图2．2最佳退火温度的测试结果M：DL5000DNAmarker：1-9：退火温度分别为45℃、47℃、49℃、51℃、54℃、57℃、60℃、62℃、65℃Fig．2-2ThedeterminationofoptimalannealingtemperatureM：DL5000DNAmarker；Lane1·9：annealingtemperaturewas45。C、47。C、49。C、51℃、54"C、57℃、60℃、62℃、65℃经过优化PCR的最佳PCR的反应条件为：95"C预变性5min，95℃45S、54。C45s、72℃45s，35个循环，最后72℃延伸10min，16℃终止反应。2．2特异性以CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV的基因组RNA反转录的eDNA为模板以及PCV2、SPV的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，以H20作为阴性对照，试验结果(图2．3)显示，BVDV(Lanel)扩增出与之相符的186bp的条带，阴性对照(L觚e7)和其它病毒的核酸没有扩增条带(Lane2--一6)。 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建b10075502510图2．3特异性检测结果M：DL5000DNAmarker：1．BVDV；2．CSFV；3．PEDV；4。PRRSV；5．PCV2；6．SPV；7．阴性对照Fig．2-3SpecificresultofPCRfordetectingdifferentvirusesM：DL5000DNAmarker：Lane1．BVDV；Lane2．CSFV；Lane3．PEDV；Lane4．PRRSV；Lane5．PCV2：Lane6．SPV；Lane7．negativecontrol2．3敏感性和重复性根据96孔板内细胞CPE产生情况的统计结果(表2．2)可计算出T-CP株BVDV的lgTCID50为一5．5，即其TCID50为10‘5一／0．1mL。按102～10。2TCIDs05个稀释度稀释病毒原液cDNA跑PCR，根据PCR结果(图2．4)可知引物对BVDV-ⅣBVDv-R的灵敏度为10TCID50。2．4不同样品检测结果从江苏省、浙江省、江西省等地区收集的169份样品进行检测，其中124份粪便样有11份阳性，22份组织样有4份阳性，23份猪瘟细胞苗样品有5份阳性，如表2-3所示。部分电泳结果如图2．5。26 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用表2-2CPE统计结果Tab2．2SatatisticalresultsofCPE细胞病变孔数累加CPE数稀释度—i两F—■西手二_——弋丽再——面比率百分比10-18040040／40100％10—28032032／32100％10一·8024024|24100％10-47116116／1794％10．553949／1369％10—635494／1331％10—7l71161／176％10—8080240／240bp600500400300200100卜I123456图2-4灵敏性试验M：100bpladdermarker；1-5：102～10—TCID50cDNA；6：阴性对照Fig．2-4SensitivitytestofPCRM：100bpladdermarker；Lane1．5：102"-10-2TCID50cDNA；Lane6：negativecontrol27 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建表2-3样品中BVDVRT．PCR检测结果!些兰：!堡曼堡!坠壁垒￡皇堕皇鲤旦旦塑呈塑y垫!垒里望!曼兰塑堑垒!堕：旦曼垦样品类型检测份数阳性份数阳性率1234567891011121314151617bp500250100图2．5临床样品的检测结果1：：100bpladdermarker；10-DL5000DNAmarker；11：阳性对照；3、5、13、16：阳性样品：2、4、6-8、12、14、15．阴性样品；9、17：阴性对照Fig．2—5TheresultofdetectionforBVDVinclinicalsampleswithRT-PCRLane1：100bpladdermarker；Lanel0：DL5000DNAmarker；Lanell：Positivecontrol；Lane3，5、13、16：Positiveclinicalsamples；Lane2，4，6-8，12，14，15：Negativeclinicalsamples；Lane9、17：Negativecontrol2．5PCR产物的序列分析将部分临床病料中阳性PCR产物克隆至pMD一19-T载体，进行序列测定，成功测出两株序列F07与F10；从NCBI数据库中下载目标基因进行对比，同源性比较分析(图2-6)得出，F07与中国BVDVII型代表毒株SH-28的同源性最高，为95．6％，与BVDV标准毒株NY93同源性高达94．1％；F10与SH．28的同源性最高，为96．3％，与NY93同源性高达94．8％。从进化树分析来看，F07和F10也与SH-28及NY93处在同一迸28 化分支(图2．7)。8暑P皇oPercenlIdentity123●5B7B9t0"t213t■■-97日95．694．167．771．267．972．291．g69969．772．51F07seq22．3-|96．396．394．869．272．769．573．792．671．471．274．02F10．seq34．63．8—_97．095．669．274．269．573．793．372．272．O75．63SH·28．seq●4．63．83．1■■■95．668．474．271．073．794．870．772．074．0‘Isolate58．seq56．25．44．74。7■■■．72．273．570．274．493．374．472，776．35NY93．seq644．64'．7‘1．743．335．g■_77．477．377．666．990477．475．86ZM-95．seq737．735132．832启34．229．O■■■{97．282．173．578．290．287．97NADt-seqB44．641．742．439．240．728．114．6—■■79．767．981．185．081．88CV24．seq935．533．'33．432．127．620．523．9■■■69．977．680．88'．29TR．seq108．6787．05．47．046．233．644．640．2■_69．269．773．310HLJl0．seq''40．537．B36．439．332．310．527．222．527．642．0_79．777．311JN-1．seq1240．137．536．535．127．810817．622．640．124．6—_■睡87，2t2Deer．seq1335．733．230933．629．630．413．622．221．934．328．314．3■■■13O$10ss．sea123●5678910'11Z13图2-6F07，F10与参考毒株的核苷酸同源性比较Fig．2．6Comparisonnucleoticsequencehomologywithtypicalstrains37．6———1———————T———————广——————-T———————1_——————]———————T—————-135302520151050NucleoUdeSubsl枷ens(x100)3讨论图2．75'UTR建立的进化树Fig．2-7Phylogenetictreebasedon5’UTRN／OLseq0／24．seqDeer．seqOsloss．seqTR．S鲫刁*％，Se口JN-I．seqF07．Seq●一F10．se口●一iSO№58．seqHUl0．seaSH-28．seqNY93．seq近年来，我国规模化猪场养殖发展迅速，然而由于猪舍条件有限，生物安全性低，从业人员预防理念较落后，病原的混合感染非常严重，给疾病的诊断带来了很大的困难。关于猪感染BVDV的报告引起了人们的关注，据报道猪感染了BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化，并且可以通过自然宿主的胎盘屏障传给后代，怀孕母猪感染BVDV可导致流产、死胎、木乃伊及产下先天性异常的后代。BVDV只有一个血清型，根据其在细胞培养物中是否产生病变，可将BVDV分为致细胞病变(CP)型和非致细胞病变(NCP)型。根据病毒基因组5’UTR的序列将BVDV分成两种 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建基因型，即基因I和基因II型r7’8】。目前认为牛是猪感染BVDV的主要传播来源，如在某些疫苗的生产过程中使用了感染BVDV的牛血清以及牛睾丸细胞等都可造成疫苗的污染，从而感染给猪【9,10】。Wensvoort等(1988)报道，荷兰使用有BVDV污染的疫苗而引起仔猪BVDV的先天性感染并出现与猪瘟类似的症状与病变。此外还有牛奶做为猪饲料的添加剂也可造成猪感染BVDV，因此应该避免猪与感染BVDV的牛直接或者间接接触。BVDV都可导致流产、死胎、木乃伊及产下先天性异常的后代。虽然为牛是猪感染BVDV的主要传播来源，但是也有学者认为猪源BVDV除来源于牛的传播外，还具有独立的遗传衍化来源的可甜11】。本文设计了一对BVDV特异性检测引物，临床样品的检测结果显示猪瘟疫苗中BVDV污染率为21．7％，BVDV与CSFV有着密切的联系，但并不能确定注射污染了BVDV的猪瘟疫苗能否感染猪群，并引起猪群的发病。临床病料及粪便样的检测结果显示猪群中BVDV的感染率达10．3％，显示猪群的中仍有一定比例BVDV带毒者。将部分临床病料中阳性PCR产物克隆至pMD．19．T载体，进行序列测定，成功测出两株序列F07与F10；从NCBI数据库中下载目标基因进行对比，同源性比较分析可知F07与F10与BVDV代表毒株SH．28及NY93同源性达90％以上，从进化树分析来看F07和F10也与SH．28及NY93处在同一进化分支。由于BVDV、猪瘟、绵羊边界病病毒存在广泛的交叉感染，且感染BVDV会出现与猪瘟类似的症状与病变，因而会互相干扰各自的临床诊断。BVDV与猪瘟病毒氨基酸同源性约85％，在血清学上存在交叉反应，因此用常规的血清学检测方法难以对BVDV和CSFV进行鉴别诊断。随着分子生物学的发展，RT-PCR在疾病诊断以及抗原研究等方面得到了广泛应用，RT-PCR检测方法具有快速、准确、低污染、特异性高等优点，已成为临床与基础研究领域中一种简便快捷的筛选检测方法。本文建立的BVDVRT-PCR特异性检测方法，对于猪群的混合感染、继发感染以及猪瘟疫苗生产中外源基因的检测和猪瘟免疫失败分析有着重要的意义。30 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用参考文献【l】FranckiRIB，FauquetCM·KundsonKL．ela1．Classiifeationandnomenclatureofviruses：fifthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses．ArchViroll991：223·233．[2】EH．WalzDLG,rPassler,J．F．Ridpath，R．Tremblay,D．L．Step，R．J．Callan，andM．D．Givens．ControlofBovineViralDiarrheaVirusinRuminantS．VetInternMed201024：47每_486．[3】王新平，任文陡，朱维正，等．双抗体夹心ELISA检测牛病毒性腹泻病毒抗原的研究。中国兽医学报1995：246．249．【4】4PatonDJ，DoneSH．Congenitalinfectionofpigswithruminant-typepestiviruses．JCompPathol1994111：151．163．【5】FemeliusAL，AmtowerWC，MalmquistWA，LambertqMatthewsPJ．Bovineviraldiarrheavirusinswine：neutralizingantibodyinnaturallyandexperimentallyinfectedswine．CanJCompMed197337：96．102．【6】6王新平，涂长春，李红卫，等．从猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒．中国兽医学报19964：341-345．[7】杨永钦．牛病毒性腹泻病毒的基因分型．国外兽医学一畜禽传染病19963：56-58．【8】JonesDE．GenetictypingofbovinevirHaldiarrheavirusisolatesfromArgentina．VetMicrobiol20014：367-375．【9】9TerpstraC，WensvoortG．BovineViraldiarrheavirusinfectionsinswine．Tijdschr-Dier-geneeskd1991：943-948．[10】O’ConnorM，Lenihan只DillonP．PestivirusantibodiesinpigsinImland．VetRec199129：269．[Il】TerpstraC，WensvoortG．Congenitalpersistentinfectionofbovineviraldiarrheavirusinpigs：clinical，virologicalandimmunologicalobservations．VetQ1997：97—101．31 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建EstablishmentofRT．PCRmethodstodefectBovineviraldiarrheavirusfromswineAbstract：Basedonthesequenceof5'untranslatedregion(5’UTR)oftheBVDVgenome，primerWasdesignedandsynthesized．Byoptimizationofthereactioncondition,RT-PCRassayfordetectionofbovineviraldiarrheavirusfromswineWaSestablished．ThespecificPCRproductsWas186bpinlength．ThedetectionlimitofeDNAtemplateintheRT-PCRWas101TCID50：ThehighspecificityofthemethodWasdemonstratedbydetectingCSFV、PRRSV、PEDV、SPVandPCV．Among169clinicalsamples，therewere20sampleswithBVDVpositive．ItprovedthatRT-PCRassaycallbeappliedvalueinpractices．Keywords：Bovineviraldiarrheavirus；RT-PCR；clinicalsamples32 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用第三章表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组猪痘病的的研制摘要：E2是BVDV囊膜糖蛋白含有病毒的主要抗原决定簇，能诱导机体产生保护性免疫反应，是BVDV的主要保护性抗原。猪痘病毒(spy)是痘病毒科猪痘病毒属中的唯一成员，在自然情况下sPV只感染猪，并且感染非常温和，能自行康复。本研究利用通用克隆载体pusGl1／P28构建出转移载体pUSGl1／P28E2，利用SPV020和SPV021两基因间的非编码区作为产生重组猪痘病毒外源基因的插入位点，GFP基因作为一个显性筛选标记，获得的重组病-毒rSPV．E2。通过PCR、westemblotting和间接免疫荧光检测对rSPV．E2进行了鉴定，结果显示rSPV．E2能正确表达E2蛋白，重组猪痘病毒有望成为BVDV疫苗用于预防猪发生BVDV感染。关键词：BVDV；E2蛋白；重组猪痘病毒牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄病毒科瘟病毒属成员，可引起牛腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制，母畜流产、早产、死胎等等，此PFBVDV还可感染山羊、绵羊、猪、野牛、羊驼、白尾鹿等动物U,21。猪可通过与BVDV牛、羊接触或通过污染BVDV的疫苗而感染BVDV。一般情况下猪感染BVDV不表现明显的临床症状而呈现亚临床感染或隐性感染。自然条件下，猪先天感染BVDV的症状与病变类似于猪瘟【31。由BVDV引起的传染病已经给养牛业、养猪业和养羊业造成巨大经济损失。gp53(E2)是病毒囊膜糖蛋白，位于ORF的20077,-3198位核苷酸，由374个氨基酸残基组成依其糖基化程度不同，分子量可为51～58kDa[4]。E2含有病毒的主要抗原决定簇，能诱导机体产生保护性免疫反应，是BVDV的主要保护性抗原。用E2基因构建基因工程活载体疫苗可使动物体内产生抗该病毒的中和抗体，且不导致动物发生疾病，用于该病的预防和控制具有广阔的应用前景。猪痘病毒(SPV)是痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，猪痘病毒属中的唯一成员【5，6，17，8'9】。象其他的痘病毒一样，SPV在宿主细胞的胞浆内复制，基因组是大小约为146kb的双链分子【10】。在自然情况下，SPV只感染猪，并且感染非常温和，能自行康复【111。在所有被试验的哺乳动物和禽类中，只有兔子在皮内接种后能产生非复制性感染。由于SPV有生物安全性和临床安全性好、较大的插入外源基因的能力及能诱导宿主产生良好的保护性免疫反应等优点，故适合作为载体用于开发重组疫苗。我们利用SPV020和SPV021两基因间的非编码区作为外源基因的插入位点。在SPV基因组的SPV020和SPV021两基因间有一个366bp的非编码区。利用此非编码区的部分删除 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建而产生的重组猪痘病毒和亲本病毒相比仅有很轻微的致弱。说明该位点也是SPV的复制非必需区，适合用于构建疫苗用的重组猪痘病毒。本研究利用SPV作为载体构建了表达BVDV保护性抗原的重组猪痘病毒rSPV．E2，为BVDV及其他疫病在猪群中的预防提供新思路。1材料与方法1．1材料PK-15细胞和猪痘病毒Kasza株来自ATCC；通用克隆载体pUSGl1／P28由本实验室保存；胎牛血清、MEM和Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品；Ex．TaqDNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶等均购自宝生物(大连)工程有限公司；核酸胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒及病毒核酸提取试剂盒均购自GeneAid；无内毒素质粒中提试剂盒为GIAGEN产品；Prestainedproteinladder为Ferrnentas产品；甲基纤维素、NaHC03、胰酶等购自Sigma公司。低温离心机、C02培养箱及超微量核酸蛋白测定仪为ThermoScientific公司产品；倒置显微镜为Olympus产品；全自动凝胶成像系统来自Bio．Rad公司；PCR仪为Biometer产品；荧光显微镜为ZEISS公司产品。1．2方法1．2．1E2基因的扩增根据已发表的Oregonc24v株E2基因序列，用PrimerPremier5．0软件设计引物对E2．U／E2．D(表3．1)，在引物中加入限制性酶切位点SalI和BamHI，引物由Invitrogen上海公司合成，PCR产物大小约为1130bp。表3．1引物对E2．U／E2．DRIb3．1PrimmerE2．U／E2．DPrimernameSequenceE2．UE2-DGCGTCGACAACGCTGCCACGACTACTGCATTCCCGGGATCCTTA工AAATGGTCAGTGACCTCCAGGTCAAACCA1．2．1猪痘病毒的培养SPV用PK-15细胞增殖，PK．15细胞用含10％胎牛血清的MEM于37"(2含5％C0234 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT．PCR检测方法的建立与临床应用的培养箱中培养。SPV接种PK．15细胞第5天即出现了典型的SPV所致的细胞病变斑，感染的细胞变亮，核空泡化，如图3．1B。图3．1SPV在PK-15细胞上引起的细胞病变(A)正常的PKl5；(B)显微镜下的细胞病变斑Fig．3-1CPEofPK-15cellscausedbySPV．(A)NormalPKl5．(B)Fociseenbylightmicroscopy1．2．1载体的构建用引物对E2．U／E2．D扩增E2基因，切胶回收PCR产物：用限制性内切酶SalI和BamHI双酶切通用克隆载体pUSGl1／P28，切胶回收酶切产物。用DNA连接酶连接E2基因与通用克隆载体pUSGl1／P28，构建出转移载体pUSGl1／P28E2(图3．2)。该转移载体利用SPV020和SPV021两基因间的非编码区作为E2基因的插入位点，引入绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)基因做为筛选标记基因，使得重组病毒的纯化能在荧光显微镜的引导下精确进行。 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建1．2．2转化蟹P(BLA)pUSG1I／P28E2"098bp俐＼√一产／t＼只uc’‘≮≥专=多LFP11RF图3-2pUSGl1／P28E2示意图Fig．3-2thetransfervectorpUSGl1／P28E2为了提高转染效率，必须提高转移载体浓度。将转移载体转化到感受态细胞中，从感受态中提取高浓度的转移载体。DH5a感受态的制备方法为：(1)前夜接种受体菌(DH5a)，挑取单菌落于LB培养基中37。C摇床培养过夜(约16h)；(2)取lml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37。C摇床上剧烈振荡培养约2．5．3h(250-300rpm)；(3)将0．1MCaCl2溶液置于冰上预冷：以下步骤需在超净工作台和冰上操作(4)吸取1．5ml培养好的菌液至1．5ml离心管中，在冰上冷却10min；(5)4。C下30009冷冻离心5mira(6)弃去上清，加入1009l预冷0．1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20mira(7)4℃下30009冷冻离心5mira36 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用(8)弃去上清，加入1009l预冷0．1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；(9)细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15％．20％甘油)后一70℃贮存备用。转化的步骤为：(1)从．70℃冰箱中取2009L感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；(2)加入转移载体(含量不超过50rig，体积不超过10I_t1)，轻轻摇匀，冰上放置30mira(3)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3mira(4)向管中加入lmlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37。C振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达转移载体编码的抗生素抗性基[园(Ampr)；(5)将上述菌液摇匀后取loorJ，l涂布于Amp平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37。C培养16．24h；(6)从Amp平板上挑取茵落于LB液体培养基(含Amp)37"C振荡培养10h，取菌液用引物对E2一U／E2．D跑PCR鉴定。往LB液体培养基(含Amp)力lLA．PCR阳性菌液37。C振荡培养16h，提取转移载体，检测浓度，--70℃贮存备用。1．2．3转染将PK．15细胞接种到6well细胞培养板中，待细胞长成单层后，以0．02MOI的SPV感染细胞。37。C作用2h后，用pUSGll／P28E2质粒进行转染，将41．tg的pUSGl1／P28E2质粒溶于50ul无血清的Opti--MEMIReducedSerumMedium中，混合均匀；将10ulLipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti--MEMIReducedSerumMedium中，混合均匀，在室温下孵育5rain；孵育5rain后，将上述两种混合物混合(总体积100u1)，轻轻混合均匀后在室温下孵育20min：在6孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基，十字法混合均匀；细胞在37℃C02培养箱中培养4—6h后可更换培养基，转染后的细胞继续培养4天后，将培养物在．70℃一37。C冻融两次用于重组病毒的纯化。1．2．3重组病毒的纯化将PKl5细胞接种至6孔板中，待长成单层后弃营养液。将上面的转染产物稀释50倍、500倍和5000倍后接种细胞。每个稀释度接种一个孔，每个孔接种600laL。 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建37℃作用2h后，去感染液，每孔加3mL含1．5％甲基纤维素和2％胎牛血清的MEM作为维持液，37℃继续培养5天。然后在荧光显微镜的协助下，挑取发荧光的单个蚀斑重悬于O．2mL维持液中，在．70℃～37"C冻融两次用于下一轮纯化。纯化一直进行到出现在孔内的所有蚀斑均为荧光斑，一般纯化4．5轮即可。得到的重组病毒称作rSPV．E2。1．2．4重组病毒的PCR鉴定以重组病毒的基因组作模板，用引物对E2-U／E2．D进行扩增。1．2．5重组病毒的Westernblotting分析将PK．15细胞接种到直径100mm的培养皿中，待细胞长成单层后，分别用5MOI的重组病毒rSPV．E2进行感染。37℃培养60h后，去维持液，用PBS洗两次。加入适量PBS，将细胞刮下，用水平离心机以1300rpm离心10min。完全弃上清，加入70gLPBS将细胞重悬，并加入130gL2×SDS上样缓冲液。混匀后，在沸水中煮10min，以13000rpm离心2min，取10¨L上清进行电泳。电泳结束后，采用半干法将分离后的蛋白转印至PVDF膜上。然后用5％的脱脂牛奶于室温封闭2h，再将膜放入1：1000倍稀释的BVDV标准血清中，37℃作用90min。用TBST洗涤3次，每次10min。洗涤后，将膜放至lJl：3000倍稀释的SPA．HRP中，37℃作用60min。TBST洗涤3次后，用DAB显色。1．2．6重组病毒的间接免疫荧光鉴定将PK．15细胞接种于24孔板内，长成单层后，按每孔15PFU感染重组病毒。继续培养72h后，将孔内的细胞用PBS洗两次。然后用预冷的甲醇在．20℃固定10min，PBST洗涤三次后，用10％BSA在370C封闭2h。弃封闭液，用PBST洗一次。感染rSPV-E2的板子加入1：3000倍稀释的BVDV标准血清，37℃作用1h。经过三次的PBST洗涤后，细胞用罗丹明标记羊抗兔IgG(1：1000倍稀释)在37"C作用30min。在经过最后的洗涤后，在荧光显微镜下观察结果。1．2．8重组病毒的遗传稳定性实验用5MOI的重组病毒rSPV．E2感染PK-15细胞，37"C培养60h后，将培养物冻融3次。裂解物再感染PK．15细胞进行重组病毒的传代。以这样的方式，重组病毒传10代后，再进行PCR鉴定和Westernblotting分析，方法同上。2结果 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用2．1E2基因的扩增结果用引物对E2．U／E2．D扩增出的产物大小与预期的一致，大小约为1130bp(图3—3)。测序结果显示，扩增出的基因片段与预期的也完全相符。M12图3-3PCR扩增结果M：DL2000DNAmarker：1：E2基因：2：阴性对照Fig．3·3．ThePCRamplifiedproductsM：DL2000DNAmarker；Lane1：E2gene．Lane2：negativecontral2．2载体的构建及鉴定构建的通用克隆载体pUSGl1／P28大小为6020bp，包括两个和SPV序列同源的重组臂、P11-GFP基因表达盒子、W强启动子P28及在其下游的9个限制性酶切位点，两个启动子P11和P28方向相反。在插入1130bp的E2基因后得到的转移载体pUSGll／P28E2大小为7098bp。用限制性内切酶SalI和gamHI聂J'pUSGl1／P28E2进行鉴定，可见两条带，大小与预期的一致(图3．4)。 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建bp7500500025001000图3-4转移载体的鉴定M：DLl5000DNAmarker；1：转移载体pUSGl1／P28E2；2：pUSGl1／P28E2用SaJI*OBamHI双酶切Fig．3-4．TheidentificationofthetransfervectorsM：DLl5000DNAmarker；LanelthetransfervectorspUSGl1／P28E2：Earle2：pUSGl1／P28E2digestedwithSalIandBamHI2．3转化结果PCR鉴定从Amp平板上挑取菌落于LB液体培养基(含Amp)37"C振荡培养10h，取茵液用引物对E2．U／E2．D跑PCR鉴定，鉴定结果如图3．5。 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用图3．5PCR鉴定结果M：DL5000DNAmarker：2，5，6：阳性样；1，3，4，7：阴性样：8：阴性对照Fig．3-5．theresultofPCRidentification．M：DL5000DNAmarker：Lane2，5，6：positivesamples：Lane1，3，4，7：negativesamples：Lane8：negativecontral2．4重组病毒的纯化与PCR鉴定结果转染后第2天，如果病毒发生了重组，则在荧光显微镜下能见到少量发绿色荧光的细胞，基本单个存在(图3-6A)。在第一轮筛选时，荧光斑非常少，且一般比较小(图3-6B)，但是经过5轮纯化后，可见形成的蚀斑均为荧光斑，大小和亲本毒株形成的蚀斑一致(图3-6C)。以rSPV．E2的基因组做模板，用引物对E2．U／E2．D从重组病毒中能扩出一条约1．1kb的片段，与预期的相符；而从亲本病毒中则没有扩出任何条带(图3．7)。4l 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建(A)(C)图3．6重组病毒在PK-15细胞中形成的荧光斑(A)转染后的细胞；(B)第一轮纯化：(c)第五轮纯化：(D)阴性对照Fig．3·6FluorescentfocicausedbyrecombinantvirusesinPK-15cells(A)PK-15aftertransfection(B)thefirstroundofpurification．(B)thefifthroundofpurification(D)negativecontral2．5E2表达的鉴定Westernblotting分析显示，重组病毒rSPV-E2在PK一15细胞中能正确表达E2，大小约41．7kDa，与预期的一致(图3．8)所表达的蛋白均能被康复血清所识别。通过间接免疫荧光实验，我们进一步证实了重组病毒rSPV-E2能在PK．15细胞中正确表达E2(图3-9)。42 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用bp25001000M12图3．7重组病毒的PCR鉴定M：DLl5000DNAmarker；l：rSPV．E2；2：亲本病毒Fig．5—5PCRanalysisoftherecombinantvirusM：DL15000DNAmarker．Lane1：rSPV—E2．Lane2：wild·typeviruskDaM95725543342617匠』2‘4佩Da’8f13．8Westernblotting分析结果M：Prestainedproteinladder；1：感染rsPV．E2的PK-15细胞；2：感染亲本病毒的PK．15细胞Fig．3-8WesternblottinganalysisofrSPV-E2．LaneM：Prestainedproteinladder．Lanel：PK-15cellsinfectedbyrSPV-E2．Lane2：PK-15cellsinfectedbywild—typeSPV．43 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RBPCR检测方法的建立与临床应用疫苗，新型标记疫苗和鉴别诊断方法还存在许多问题，因此，牛病毒性腹泻疫苗仍有广阔的研究空间。E2含有病毒的主要抗原决定簇，能诱导机体产生保护性免疫反应，是BVDV的主要保护性抗原。利用基因操作技术将BVDVE2基因插入到另一种病毒基因组中，使之高效表达重组蛋白的重组病毒已经构建成功，使用的载体包括禽痘病毒、牛Ⅲ型腺病毒、水疱性12炎病毒和牛I型疱疹病毒。Grigera等【14J将E2基因克隆到水疱性V1炎病毒中，重组病毒免疫小鼠后能显著减少病毒感染症状，所产生的中和抗体在体内能持续180d。Kweo等【l5】将BVDVE2基因克隆到TK基因上，重组病毒免疫牛后，产生的中和抗体能显著减弱临床症状的发生。Hahn等人开发了一个产生重组猪痘病毒的载体系统。在这个系统中，TK基因位点被用来作为外源基因的插入位点，lacZ基因为筛选标记基因。使用这个系统，他们构建了一个表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒。这个重组病毒在感染细胞中能够正确地表达E2蛋白【l6。。本研究构建了转移载体pUSGl1／P28E2，通过在病毒感染细胞内的DNA同源重组，以SPV020和SPV021两基因间的一个366bp的非编码区作为产生重组猪痘病毒的外源基因插入位点，将E2基因和GFP基因重组到SPV基因组上，构建出表达BVDV保护性抗原的重组猪痘病毒rSPV．E2。含有GFP基因表达盒的重组病毒在荧光显微镜下形成发荧光的蚀斑，通过Westernblotting及间接免疫荧光实验证明重组病毒rSPV-E2能在PK-15细胞中正确表达E2，且所表达的蛋白能被标准血清所识别。该重组病毒的成功构建为BVDV及其他疫病在猪群中的防控提供了新思路。45 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建参考文献【l】WalzPH，GroomsDL，PasslerT'RidpathJF,TremblayReta1．Controlofbovineviraldiarrheavirusinruminants．JVetIntemMed201024：476．486．[2】王新平，任文陡，朱维正，等．双抗体夹心ELISA检测牛病毒性腹泻病毒抗原的研究．中国兽医学报1995：246-249．[3】PatonDJ，DoneSH．Congenitalinfectionofpigswithruminant-typepestiviruses．JCompPatholl9941ll：151．163．【4】4DonisRO，CorapiWDuboviEJ．NeutralizingMonoclonal-AntibodiestoBovineVkalDiarrheaVirusBindtothe56kto58kGlycoprotein．JournalofGeneralVirologyl98869：77·86．[5】DeBoerGF．Swinepox．Virusisolation，experimentalinfectionsandthedifferentiationfromvacciniavirusinfections．ArchVir01197549：141-150．【6】MassungRF,MoyerRW．Themolecularbiologyofswinepoxvirus．I．AcharacterizationoftheviralDNA．Virology1991180：347-354．【7】DartNS．ComparativeStudiesofPigpoxandVacciniaViruses．Ii．SerologicalRelationship．JCompPatholl96474：70．80．【8】DattNS．ComparativeStudiesofPigpoxandVacciniaViruses．I．HostRangePathogenicity．JCompPatholl96474：62-69．[9】AitkenWA．Swinepox．NorthAmVetl94829：353．【10】AfonsoCL，TulmanER,LuZ，ZsakL，OsorioFA，eta1．Thegenomeofswinepoxvirus．JournalofVirology200276：783—790．[11】ChevilleNF．Immunofluorescentandmorphologicstudiesonswinepox．PatholVetl9663：556-564．[12】孔繁德，陆承平．牛病毒性腹泻2粘膜病的最新研究进展．福建畜牧兽医200527．[13】王丹娜，吴明福，王君伟．牛病毒性腹泻疫苗的研究进展．畜牧与兽医200638：51—53．【14】GrigeraPRM，CapozzoAV．．Presenceofbovineviraldiarrheavirus(BVDV)E2glycoproteininVSVrecombinantpaniclesandinductionofneutralizingBVDVantibodiesinmice．VirusResVetSci200069：3．15．[15】KweonCHKS，ChioFA，eta1．Bovinehexesvirusexpressingenvelopeprotein(E2)ofbovineviraldiarrheavirusaLsavaccinecandidate．J洲edScil99961：395-401．【16】HahnJ，ParkSH，SongJY,AnSH，AhnBY．ConstructionofrecombinantswinepoxvirusesandexpressionoftheclaSsicalswinefevervirusE2protein．JVirolMethods200193：49-56． 第二章猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用ConstructionofrecombinantswinepoxvirusesexpressingE2proteinofBovineviraldiarrheavirusAbstract：GlycoproteinE2istheprotectiveantigenofBVDV，withthedominantantigendeterminants，inducesprotectiveinmmuologicalreaction．Swinepoxvirus(SPY)isthesolememberofthegenusSuipoxvirus，belongingtothefamilyPoxviridae．SPVinfectsonlyswine．NaturalSPVinfectionsaretypicallymildandoccasionallyaccompaniedbylocalizedskinlesionsthathealnaturally．Inthisstudy，weconstructedtransfervectorpUSGl1／P28E2basedonvectorpUSGl1／P28．Thenon—codingregionbetweentheSPV20geneandtheSPV21geneintheSPVgenomeWasusedasanovelinsertionlocusforgeneratingrecombinantSPV，andadominantselectionprocedurebasedonGFPgeneexpressionWasdevelopedforrecombinantvirusisolation．WeusedthissystemtoproducetherecombinantvirusesrSPV-E2．TherecombinantviruseswereidentifiedbyPCR,westernblottingandimmunofluorescenceassays，andtheirreplicationwerecompared谢ththewild-typevirus．TheresultsdemonstratedthatE2geneexpressionfromtherecombinantvirusWasstableovertenpassages．ItsuggestedthatSPVrecombinantshavethepotentialasBVDVvaccinesfortheuseinpigs．Keywords：BVDV：Protectiveantigen；Recombinantswinepoxvirus47 全文总结1根据牛病毒性腹泻病毒5’端非编码区基因序列，设计合成了一对特异性检测引物，建立了BVDVRT．PCR的检测方法。2检测了169份临床样品，结果有20份BVDV阳性，阳性率为11．8％。3成功测出两份阳性样PCR?匕物序列，并与代表毒株序列比对分析。4利用通用克隆载体pusol1／P28构建出转移载倒kpUSGl1／P28E2。5获得的重组病毒rSPV．E2，通过PCR、Westernblotting和间接免疫荧光检测对rSPV．E2进行了鉴定，结果显示rSPV．E2能正确表达E2蛋白。 致谢致谢本论文是在导师姚火春教授的悉心指导下完成的，在此致以崇高的敬意和衷心的感谢。感谢陆承平、范红结、刘永杰、费荣梅、任建鸾、于勇、张炜、吴宗福、潘子豪等老师在论文完成过程中给予的无私帮助。感谢祝吴丹、马拮、张慧、荣杰、蔺辉星、侯昕、张暑俭、高地、宋文超、汪鸣、吴文浩、王晓辉等在实验过程中提供的大力帮助。感谢室友蔺辉星、侯昕、廖学文在实验和生活中提供的帮助。感谢我的家人在我求学过程中给予的理解和支持。最后，向所有在论文完成过程中给予我关心、帮助和支持的亲人及朋友致以最诚挚的谢意!
