prrsv非结构蛋白nsp1α对细胞sumo化修饰的影响

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＾睾个１１义聲ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕ｉ学位论文ＩＭＡＳＴＥＲＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＩ＾ＰＲＲＳＶ非结构蛋白Ｎｓｌａ对细胞ｐＳＵＭＯ化修饰的影响ＩＮＦＬＵＥＮＣＥＯＦＳＵＭＯＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＮＣＥＬＬＳＯＦＰＲＲＳＶＮＯＮＳＴＲＵＣＴＵＲＡＬＰＲＯＴＥＩＮＮＳＰｌａ研究生：尚敏ＣＡＮＤＩＤＡＴＥ：ＳＨＡＮＧＭＩＮ导师：肖少波教授ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＰＲＯＦＥＳＳＯＲＸＩＡＯＳＨＡＯＢＯ专业：预防兽医学ＭＡＪＯＲ：ＰＲＥＶＥＮＴＩＶＥＶＥＴＥＲＩＮＡＲＹＭＥＤＩＣＩＮＥ研究方向：动物病毒学ＡＮＩＭＡＬＶＩＲＯＬＯＧＹＦＩＥＬＤ：中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二〇—五年六月ＪＵＮＥ２０１５， 分类号密级华中农业大学硕士学位论文PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响InfluenceofSUMOmodificationoncellsofPRRSVnonstructuralproteinNsp1α研究生:尚敏学号:2012302110181指导教师:肖少波教授指导小组:肖少波教授方六荣教授罗锐副教授王荡讲师专业：预防兽医学研究方向：动物病毒学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2015年6月华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院二○一五年六月 ｆ华中农业大学学位论文独创性声明及使活授权书ｉ如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈堯的论文是我个人在导师指导下进行的巧究工作及取得的巧究成＾乂标注和致谢的地方外果。展巧所知，论文中不包含其他人已经发，除了文中特別加表或撰写过的研究成果，化不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书一同工作的同志对本研究所做的任而彼用过的材料。与我，指导教师对此进行了审定。何贡献蝴已在论文中做了巧确的说巧，并表示了谢意；各月曰巧究生签名；时间种化年、句攸午学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使巧学位论文的规定＊即学生必须睹照学枚要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学梳有权保存提交论文的印刷版和电子版，、汇并提供目录检索和闽览服务，可臥采用影印、骗印或扫描等复制手段保存骗学化论丈。本人同意华中农业大学可Ｗ用不同方式在不同嫌体上发表、传播学位论文的全部或却分内蓉－同时，为存在馆际合作关系的兄弟高板用户提供文献传遥和吏撫服务本人保留在其他祕体发表论文的权为。（注：保密学位地文巧涉原蚊术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密巧论丈）在解密盾适用于本授权书。；学位论文作者签名；尚奴导邮签名签名日期：ｗ化年６月午日签名日期！年６月６日 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响目录摘要..................................................................................................................................iABSTRACT.......................................................................................................................iii缩略语表(Abbreviation)......................................................................................................v第1章文献综述...............................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展...................................................................11.1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒简介.................................................................11.1.2PRRSV基因组结构.....................................................................................11.1.3PRRSV逃避天然免疫研究进展.................................................................31.1.4Nsp1α研究进展...........................................................................................31.2SUMO化修饰研究进展........................................................................................41.2.1SUMO化修饰简介......................................................................................41.2.2PIAS蛋白家族简介.....................................................................................61.2.3病毒与SUMO化修饰................................................................................71.3酵母双杂交研究进展...........................................................................................8第2章研究目的与意义.................................................................................................10第3章材料与方法.........................................................................................................113.1实验材料.............................................................................................................113.1.1细胞、毒株与菌株...................................................................................113.1.2载体与质粒...............................................................................................113.1.3工具酶及主要试剂...................................................................................133.1.4WesternBlot以及CO-IP实验所需材料..................................................143.1.5主要缓冲液与相关试剂及其配制............................................................143.1.5.1质粒构建相关试剂..........................................................................143.1.5.2细胞培养相关试剂..........................................................................153.1.5.3WesternBlot缓冲液和试剂及蛋白提取试剂...............................153.1.5.4酵母双杂交相关试剂......................................................................163.1.6主要实验仪器及设备...............................................................................173.1.7分子生物学分析软件...............................................................................173.2实验方法.............................................................................................................173.2.1细胞样品总RNA的提取、RT-PCR.......................................................173.2.1.1总RNA的提取...............................................................................173.2.1.2cDNA的合成...................................................................................18I 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文3.2.2目的序列的PCR扩增..............................................................................183.2.3PCR产物或酶切产物的电泳检测............................................................193.2.4PCR产物或酶切产物的回收与纯化........................................................193.2.5外源DNA片段与质粒载体的连接反应.................................................193.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法).................................................203.2.7连接产物的转化.......................................................................................203.2.8重组质粒的制备与鉴定...........................................................................203.2.8.1质粒的小量制备.............................................................................203.2.8.2质粒的大量制备.............................................................................203.2.8.3质粒DNA的定量...........................................................................213.2.8.4重组质粒（阳性质粒）的鉴定.....................................................213.2.9酵母双杂交筛选互作蛋白.......................................................................213.2.9.1酵母感受态细胞的制备.................................................................213.2.9.2质粒转化酵母感受态细胞.............................................................223.2.9.3酵母融合质粒的自激活和毒性检测.............................................223.2.10质粒的转染（脂质体介导的瞬时转染法）..........................................223.2.11双荧光素酶报告基因检测.....................................................................233.2.12WesternBlot检测目的基因在真核细胞中的表达和互作....................233.2.12.1免疫共沉淀样品制备....................................................................233.2.12.2蛋白表达样品制备.......................................................................243.2.12.3SDS-PAGE电泳.............................................................................243.2.12.4WesternBlot检测分析..................................................................243.2.13荧光共聚焦检测蛋白质的亚细胞定位..................................................253.2.14统计学方法.............................................................................................26第4章结果与分析.........................................................................................................274.1.酵母双杂交系统分析Nsp1α与SUMO化修饰系统相关蛋白PIAS1、UBC9的相互作用................................................................................................................274.1.1相关酵母重组质粒的构建.......................................................................274.1.2酵母双杂交系统分析Nsp1α与PIAS1、UBC9的相互作用.................294.2免疫共沉淀验证细胞内PIAS1与Nsp1α的互作关系....................................294.3Nsp1α的SUMO化修饰的探索.........................................................................314.4Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰的探索.........................................................324.5Nsp1α通过阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进IRF3的降解.........................344.6Nsp1α及其突变体的分析...................................................................................36II PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响4.6.1Nsp1α及其突变体对细胞内SUMO化修饰的影响...............................364.6.2Nsp1α及其突变体对IFN-β启动子的影响.............................................36第5章讨论...................................................................................................................39第6章小结...................................................................................................................41参考文献...........................................................................................................................42致谢...............................................................................................................................50III PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响摘要SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier）化修饰是一种广泛存在于真核细胞的蛋白质翻译后修饰。有报道显示，一些病毒编码的蛋白能够利用SUMO化修饰系统对宿主蛋白的亚细胞定位、稳定性和信号转导等方面进行调节，抑制或逃逸宿主的免疫反应，从而调控病毒的增殖。猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的免疫抑制性疾病。PRRSV编码的Nsp1α是一种多功能的非结构蛋白。通过生物学软件预测发现PRRSVNsp1α具有被SUMO修饰的潜在位点，但Nsp1α是否真正被SUMO修饰尚需实验验证。本研究从SUMO化修饰这一新的角度探讨PRRSVNsp1α的生物学功能。主要研究内容如下：1．Nsp1α与SUMO化修饰系统相关蛋白PIAS1、UBC9的相互作用分析构建与SUMO化修饰相关的结合酶UBC9和连接酶PIAS1酵母重组质粒，经检测证实重组质粒pGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9无酵母毒性及自激活性。利用酵母双杂交技术分析Nsp1α是否与PIAS1、UBC9存在相互作用。结果显示，在酵母系统中，Nsp1α与PIAS1发生相互作用，但与UBC9不存在相互作用。为了进一步验证Nsp1α是否能与PIAS1在哺乳动物细胞中发生相互作用，在HEK-293T细胞中共转染Nsp1α和PIAS1的真核表达质粒，免疫共沉淀实验的结果表明，Nsp1α与PIAS1不存在直接的相互作用。2．Nsp1αSUMO化修饰的检测虽然免疫共沉淀实验证实Nsp1α与PIAS1不存在直接的相互作用，但考虑到生物信息学预测的结果，我们还是进一步分析了Nsp1α是否被SUMO化修饰。在HEK293T细胞中共转染pCAGGS-HA-Nsp1α、pCAGGS-Myc-SUMO1和pcDNA-His-UBC9三种真核表达质粒，通过免疫共沉淀检测Nsp1α是否存在SUMO化修饰。结果发现Nsp1α没有被SUMO化修饰。3．Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰水平既然Nsp1α不存在SUMO化修饰，那么Nsp1α是否调控宿主蛋白的SUMO化修饰水平呢？为了探讨这一问题，将不同剂量的Nsp1α真核表达质粒和SUMO1真核表达质粒共转染HEK293T细胞，通过WesternBlot分析细胞的SUMO修饰水平。结果显示：细胞内的SUMO化修饰水平受到显著的抑制，且与Nsp1α的表达呈剂量依赖性，表明Nsp1α具有去SUMO的特性。根据Nsp1α晶体结构和实验室已有的Nsp1α截短突变体，进一步探讨了Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰的功能结构域，i 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文结果表明，Nsp1α的锌指基序ZF1结构域在这一过程中起着关键作用。4．Nsp1α通过阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进IRF3的降解以前的研究证实PRRSVNsp1α能够拮抗RIG-I介导的β-干扰素（IFN-β）产生。为了探讨Nsp1α去SUMO修饰是否在其拮抗IFN中发挥作用，将Nsp1α真核表达质粒与编码RIG-I通路中关键信号分子（RIG-I、IPS-1、TBK1、IRF3）的表达质粒共转染HEK293T细胞，采用双荧光素酶报告系统进行检测，结果显示：Nsp1α抑制IFN-β的作用靶点为转录因子IRF3；超表达Nsp1α后，IRF3的SUMO化修饰水平显著降低，而且IRF3的稳定性减弱。这说明，Nsp1α能够通过阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进IRF3的降解，从而抑制IFN-β的产生。5．Nsp1α赖氨酸位点的分析赖氨酸（K）残基在许多蛋白的翻译后修饰中发挥重要作用。为了分析Nsp1α的赖氨酸残基对其去SUMO化修饰功能的影响，进一步构建了Nsp1α的突变体K117A、K150A、K169A，在HEK293T细胞中过表达这些突变体。WesternBlot结果表明，Nsp1α的三个赖氨酸位点均负调控其阻碍细胞SUMO化修饰。双荧光素酶报告系统结果也进一步表明，Nsp1α的赖氨酸位点对其抑制IFN-β启动子具有负调控的作用，且能抑制组成性激活体IRF3-5D诱导的IFN-β启动子的激活。综上所述，本研究证实Nsp1α不能被SUMO修饰，却意外发现Nsp1α能够阻碍细胞内蛋白的SUMO化修饰。更有意义的是，Nsp1α通过阻碍干扰素信号通路中的关键转录因子IRF3的SUMO化修饰并促进其降解，从而拮抗I型干扰素产生，揭示了PRRSVNsp1α调控干扰素的一种新的作用机制。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；Nsp1α；SUMO化修饰；PIAS1；IRF3.ii PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响ABSTRACTSmallubiquitin-relatedmodifier(SUMO)isapost-translationalmodificationofproteinsthatwidelyexistineukaryoticcells.IthasbeenreportedthatsomevirusesencodeproteinsusingtheSUMOmodificationsystemtoregulatehostproteinsubcellularlocalization,proteinstabilityandinhibiteorescapethehost'simmuneresponse,therebyregulatingtheproliferationofvirus.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeisanimmunosuppressivediseasecausedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).Nsp1αthatencodedbyPRRSVisamultifunctionalnon-structuralproteins.ThroμghthebiologysoftwarewepredictedNsp1αhasapotentialsitemodificationbySUMO,butthereisnoexperimentconfirmedtheexistenceofNsp1αSUMOmodification.Inthisstudy,weexplorethebiologicalfunctionofNsp1αfromtheSUMOmodificationofthisnewperspective.Themainresearchcontentsareasfollows:1.TheinteractionanalysisofNsp1αandSUMOrelatedprotein,PIAS1andUBC9WeconstructedtheYeastrecombinantplasmidofpGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9、pGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9.TherecombinantplasmidpGADT7-PIAS1,pGBKT7-UBC9hadnotoxicityandselfactivityinyeast.Theresultsshowedthatinyeastsystems,Nsp1αinteractwithPIAS1,butthereisnointeractionwiththeUBC9.InordertofurtherverifywhetherNsp1αcaninteractwithPIAS1inmammaliancells,theeukaryoticexpressionplasmidNsp1αandPIAS1weretransfectedintoHEK293Tcells,Co-immunoprecipitationexperimentsshowedthatthereisnodirectinteractionbetweenNsp1αandPIAS1.2.DetectiontheSUMOmodificationofNsp1α.Byconsideringthebioinformaticspredictionresults,wefurtheranalyzedtheSUMOmodificationofNsp1αalthoμghCo-immunoprecipitationexperimentsconfirmedNsp1αandPIAS1havenodirectinteraction.IntheHEK293TcellstransfectedwithpCAGGS-HA-Nsp1α,pCAGGS-Myc-SUMO1andpcDNA-His-UBC9threeeukaryoticexpressionplasmid,byCo-immunoprecipitationtodetectwhetherexisttheSUMOmodificationofNsp1α.TheresultsconfirmedthatNsp1αdoesnotexisttheSUMOmodification.3.Nsp1αblockintracellularSUMOmodificationlevelSinceNsp1αSUMOmodificationdoesnotexist,whetherNsp1αregulatethelevelofSUMOmodificationofhostproteins?Toexplorethisquestion,theHEK-293TcellsweretransfectedwithincreasingamountsofNsp1αexpressionplasmidandSUMO1iii 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文expressionplasmid,wefoundthatNsp1αhinderedtheintracellularSUMOmodificationlevelinadosedependentmanner,andthedomainofZF1playsakeyrole.4.Nsp1αremovaltheSUMOmodificationofIRF3,promotingthedegradationofIRF3PreviousstudieshavedemonstratedthatPRRSVNsp1αcanantagonizeRIG-Imediatedinterferon-beta(IFN-beta)generation.Nsp1αandRIG-ImediatedsignalingpathwayproteinsweretransfectionHEK293Tcells.DualluciferasereporterassayshowedthatNsp1αtargetedIRF3.AfteroverexpressionofNsp1α,SUMOmodificationlevelofIRF3weresignificantlyreduced,atthesametime,IRF3stabilitydecreased.ThisshowsthatNsp1αcanbedestroyedIRF3SUMOmodification,andacceleratethedegradationofIRF3,thusinhibitingthegenerationofIFN-β.5.AnalysisofNsp1αlysinesitesInordertoanalyzetheeffectoflysine(K)residuesofNsp1αtoSUMOmodificationfunction,weconstructNsp1αmutantsK117A,K150A,K169A,overexpressthesemutantsinHEK293Tcells.WesternBlotresultsshowedthattheremovalofintracellularSUMOmodificationwerenegativelyregulatedbythreelysinesofNsp1α.However,dualluciferasereportsystemtestresultsshowedthatthelysineresiduesK117,K150,K169ofNsp1αplaynegativeregulatoryroleintheinhibitionofIFN-βpromoter,andinhibitthestimulationwithIRF3-5D.Insummary,thisstudydemonstratedthatNsp1αcannotmodifiedbySUMO,butwefoundthatNsp1αcanblockSUMOmodificationincells.Moresignificantly,Nsp1αantagonizetypeIinterferonproductionbyhindertheSUMOmodificationofIRF3,whichisakeytranscriptionfactorintheinterferonsignalingpathway,andpromoteitsdegradation,revealanewmechanismofNsp1αinterferonregulationKeywords：PRRSV;Nsp1α;SUMOylation;PIAS1；IRF3.iv PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响缩略语表(Abbreviation)英文缩写英文全称中文全称aaAminoacid氨基酸AmpAmplicillin氨苄青霉素bp,kbBasepair,Kilobasepair碱基对,千碱基对cDNAComplementaryDNA(与RNA)互补的DNACO-IPCo-immunoprecipitation免疫共沉淀ddH2ODoubledistilledH2O双蒸水DMEMDulbecco’sModifiedEagleMedium一种细胞培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸dsRNADoublestrandsRNA双链RNADTTDithiothreitol二硫苏糖醇EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EAVEquinearteritisvirus马动脉炎病毒HEK293Humanembryonickidney293人胚胎肾细胞HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HCMVhumancytomegalovirus人巨细胞病毒HAdV5humanadenovirusserotype5人类腺病毒血清型5hepSheparansulfate硫酸乙酰肝素HSVherpessimplexvirus单纯疱疹病毒IFNinterferon干扰素ISREIFN-stimulatedresponseelement干扰素刺激应答元件IRF3Interferonregulatoryfactor3干扰素调节因子3KanKanamycin卡那霉素KDaKilodalton千道尔顿LBLuria-BertanimediumLB培养基LDVLactatedehydrogenase-elevatingvirus小鼠乳酸脱氢酶病毒McAbMonoclonalantibody单克隆抗体MCSMultiplecloningsite多克隆位点MEF2Amyocyte-specificenhancerfactor2A肌细胞特异性增强因子2AmRNAMessengerRNA信使RNAmol/LMolarperliter摩尔每升NF-κBNuclearfactor-kappaB核转录因子κBNspNon-structureprotein非结构蛋白NDSMsnegativelychargedamino带负电荷氨基酸依赖的acid-dependentSUMOmotifsSUMO基序ORFOpenreadingframe开放阅读框v 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文PAMPPathogenassociatedmolecularpattern病原体相关分子模式PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白PCPPapain-likeCysteineProtease酶PCRPolymrasechainreaction聚合酶链反应PorcinereproductiveandrespiratoryPRRS猪繁殖与呼吸综合征syndromePRRSVPRRSvirus猪繁殖与呼吸综合征病毒PIASproteininhibitorofactivatedSTAT激活的STAT蛋白抑制剂PDSMsphosphorylation-dependentSUMO磷酸化依赖的SUMO基序motifsPPARγperoxisomeproliferator-activated过氧化物酶体激活受γreceptorγr/mRotationperminute转每分RT-PCRReverasetranscriptpolymerasechain反转录聚合酶链反应reactionSUMOsmallubiquitin-relatedmodifier苏素SHFVSimianhemorrhagicfevervirus猴出血热病毒SENPssentrin-specificproteases丝氨酸特异性蛋白酶STUbLsSUMO-targetedubiquitinligasesSUMO靶向性泛素连接酶SAE1SUMO-activatingenzymesubunit1SUMO激活酶SCMSUMOconsensusmotifSUMO保守基序SIMSUMO-interactingMotifSUMO相互作用基序SARS-CoVSARSCoronavirusSARS冠状病毒PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGESDS-Polyacrylamidegel十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰electrophoresis胺凝胶电泳s,min,h,dSecond,minute,hour,day秒,分,小时,天SeVSendaivirus仙台病毒Phosphate-bufferedsalineinclude含0.05%Tween-20的磷酸盐TBST0.05%Tween-20缓冲液TEMEDTetramethylethylenedamine四甲基乙二胺TNFTumorNecrosisFactor肿瘤坏死因子UBC9ubiquitin-likeconjμgatingenzyme9泛素样结合酶9Ublsubiquitin-likeproteins类泛素蛋白UBA2ubiquitin-likeactivatingenzyme泛素样激活酶亚基2subunit2VSVVesicularstomatitisvirus疱疹性口腔炎病毒µg,mg,gMicrogram,milligram,gram微克,毫克,克µL,mL,LMicroliter,milliliter,liter微升,毫升,升µmol/LMicrmolarperliter,微摩尔每升vi PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响第1章文献综述1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展1.1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒简介猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV），是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arterivirus）(Meulenberg2000)。动脉炎病毒属的其他成员还包括：马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV）、猴出血热病毒（Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（Lactatedehydrogenase-elevatingvirus，LDV）。PRRSV是1987年首先在美国发现，1990在德国也发现了该病毒。该病毒造成了全球范围内养猪产业巨大的经济损失。它是以引起母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等严重繁殖障碍，和仔猪与生长猪的呼吸窘迫为显著特征的传染病(Rossow1998)。感染PRRSV还会诱发继发性细菌和病毒感染，这可能是该病毒诱导的免疫抑制引起的(Fengetal.2001;Mateuetal.2008)。目前根据血清学和病毒基因组的差异，PRRSV分为欧洲型和美洲型。R.Allende等研究人员对欧洲型（LV）和美洲型（16244B）进行了深入的探讨。该研究发现，两种毒株间核苷酸序列的同源性为63.4%，开放阅读框（openreadingframes，ORF）ORF1a所编码的非结构蛋白氨基酸的同源性仅为47%，ORF1b氨基酸的同源性为66~75%(R.Allendeetal.1999)。2006年PRRSV在中国首次被报道，该病的流行也使得我国的养猪产业蒙受了重大的经济损失(Sunetal.2009)。目前我国所分离到的毒株主要为美洲型。1.1.2PRRSV基因组结构PRRSV基因组大小约15.0Kb，含有九个开放阅读框（openreadingframes，ORFs),分别是ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7（如图1-1A）(Fangetal.2010)。其中ORF1a和ORF1b编码复制酶多聚蛋白，pp1a和pp1b。pp1a和pp1b在ORF1a编码的病毒蛋白酶的加工下产生多种非结构蛋白（non-structuralproteins，Nsps）。Nsp1α、Nsp1β、Nsp2通过自我剪切首先从pp1a多聚蛋白中释放出来，然后Nsp4（3C样蛋白酶）剪切其余的非结构蛋白，如Nsp9（RNA聚合酶）、Nsp10（解旋酶）、Nsp11（内切核糖核酸酶）（如图1-1B）(Kroeseetal.2008;Sunetal.2009)。ORF2a、ORF3、ORF4分别编码糖基化膜相关的单体结构蛋白GP2a、GP3和GP4。E蛋白是由ORF2b编码的一种非糖基化的膜相关蛋白。这四种单体结构蛋白以多聚复合体的形式嵌入病毒粒子中。病毒囊膜中含有两个重要的囊膜蛋白，GP5和M蛋白。其中，糖基化的囊膜蛋白GP5是由ORF5编码，非糖基化的膜蛋白M由ORF6编码。GP5和M蛋白形成异源二聚体分布于病毒粒子的表面。ORF7编码N蛋白，其为病1 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文毒唯一的核衣壳组分（如图1-2）(Musicetal.2010)。PPRSV感染巨噬细胞的初始阶段是通过GP5-M复合体与硫酸乙酰肝素（heparansulfate，hepS）结合，使得病毒在细胞表面附着(Delputteetal.2005)。接着在唾液酸（sialicacid）的介导下将唾液酸粘附素（sialoadhesin，Sn）递呈给GP5(Delputteetal.2004)（如图1-3）。有研究表明，表达清道夫受体CD163类型的细胞易受PRRSV的感染(Calvertetal.2007)。图1-1PRRSV基因组图示(Fangetal.2010;Sunetal.2009)Fig1-1PRRSVgenomeorganization图1-2PRRSV病毒颗粒示意图(Musicetal.2010)Fig1-2SchematicrepresentationofthePRRSVparticle.2 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响图1-3PRRSV囊膜蛋白与蛋白的互作示意图(Dokland2010)Fig1-3Mapofprotein–proteininteractionsinthePRRSVenvelope.1.1.3PRRSV逃避天然免疫研究进展干扰素(Interferon，IFN)是一种多功能细胞因子，在抗病毒免疫中起着重要的作用。干扰素通常分为三种类型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干扰素是主要的抗病毒天然免疫细胞因子，包含IFN-α和IFN-β。其中IFN-α含有多种亚型，而IFN-β仅有一个亚型。目前有很多的研究已经证实，PRRSV能够通过抑制Ⅰ型干扰素的产生来逃避宿主的天然免疫。2014年，杨汉春的研究小组发现，PRRSV编码的Nsp1α/β、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5和Nsp11都能抑制IFN-β启动子活性(Chenetal.2014)。其中，Nsp4主要是通过抑制NF-κB的活性从而抑制Ⅰ型干扰素的产生，但它不能阻碍NF-κB的磷酸化及其核转运(Chenetal.2014)。Nsp1β能显著性的抑制IRF3的磷酸化及其核转运，同时也能抑制由仙台病毒诱导的IFN-β启动子活性(Beuraetal.2010)。Nsp11能拮抗干扰素，但当Nsp11失去其内切核糖核酸酶活性时，其抑制由Poly(I:C)诱导的IFN-β启动子活性的功能就丧失(Shietal.2011a)。WangR等人的研究结果表明，在VR-2385毒株中，非结构蛋白（nsp1β、7、12）和结构蛋白（GP3和N）存在抑制干扰素刺激应答元件（IFN-stimulatedresponseelement，ISRE）的生物学活性(Wangetal.2013)。1.1.4Nsp1α研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）的非结构蛋白（nonstructuralprotein,Nsp）Nsp1α是一个多功能蛋白，它不仅在复制酶多聚蛋白水解加工中发挥重要的作用，也参与抑制宿主天然免疫反应。Nsp1α能阻碍I型干扰素（interferon,IFN）的产生和下游信号通路(Chenetal.2010)。它包含三个不同的功能基序：木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶（papain-likecysteineproteaseα,PCPα）基序，N-末端锌指基序（zincfinger,ZF1），和一个CTE基序3 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文（carboxyl-terminalextension）(Hanetal.2013)。Nsp1α的木瓜样半胱氨酸蛋白酶活性对其抑制IFN-β的产生是必需的(Shietal.2011b)。Nsp1α的CTE（carboxyl-terminalextension）结构域和氨基酸残基F176对Nsp1α抑制I型干扰素也起着至关重要的作用(Shietal.2012)。Nsp1α的ZF1结构域具有降解CBP（CREB-bindingprotein）的功能，这也可能是其抑制干扰素的关键性机制(Hanetal.2013;Shietal.2013)。马动脉炎病毒（EquineArteritisVirus,EAV）非结构蛋白Nsp1分布于细胞质与细胞核内，PRRSVNsp1α与其存在相似的分布，但缺失Nsp1αC端的14个氨基酸残基后，它在细胞核周富集且呈点状分布(Songetal.2010)。肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）是一种早期的应激因子，有两种生物学功能：诱导细胞凋亡和诱导产生前炎症因子。Nsp1α能特异性的抑制转录因子结合到CRE-κB元件上的TNF-α启动子上(Subramaniametal.2010)。1.2SUMO化修饰研究进展1.2.1SUMO化修饰简介蛋白质翻译后修饰种类繁多，主要包括磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化和泛素化等形式。其中泛素化（ubiquitylation）是介导蛋白质降解的重要方式之一。近些年来几种小的类泛素蛋白（ubiquitin-likeproteins，Ubls）陆续被发现，它们结构与泛素类似，在细胞内具有广泛功能，但并不介导蛋白酶体依赖的蛋白质降解过程，SUMO（smallubiquitin-relatedmodifier）就是其中的重要成员之一。SUMOs是一类高度保守的蛋白质家族，为大多数真核细胞生存所必需。SUMO蛋白分布广泛，存在于各种真核生物细胞中。哺乳动物编码四种不同的SUMO蛋白，分别为:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。其中SUMO1-3在各种组织中均有表达，而SUMO4则主要在肾脏、淋巴结和脾脏中表达。SUMO化修饰调节过程可分为以下四个主要步骤（如图1-4）(Gareauetal.2010)。(1)成熟阶段：SUMO首先会被泛素样蛋白特异性蛋白酶（ubiquitin-likeproteinsUlps）和丝氨酸特异性蛋白酶（sentrin-specificproteases，SENPs）剪切暴露出C端的两个甘氨酸，形成成熟的SUMO(Gongetal.2006;Shenetal.2006)。(2)激活阶段：成熟SUMO的C末端甘氨酸，在SUMO激活酶（SUMO-activatingenzymesubunit1，SAE1）和泛素样激活酶亚基2（ubiquitin-likeactivatingenzymesubunit2，UBA2）的作用下，与泛素样激活酶亚基2（UBA2）的半胱氨酸残基（Cys）连接，此激活过程需要ATP的参与。(3)结合阶段：激活后的SUMO，转移到E2结合酶(ubiquitin-likeconjμgatingenzyme9，UBC9)的半胱氨酸残基上(Kerscheretal.2006)。(4)连接阶段：该阶段可通过四条途经对底物蛋白进行SUMO化修饰（如图1-4）。①含有SCM（SUMOconsensusmotif）基序的底物蛋白可直接识别SUMO-UBC9复4 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响合物，UBC9将SUMO递呈给底物蛋白的赖氨酸残基(Rodriguezetal.2001)。②E3连接酶可通过SUMO相互作用模体（SUMO-interactingMotif，SIM），调整E2-SUMO的硫脂键使其以一个合适的空间位置对底物蛋白发生SUMO化修饰，如RanBP2（Ran-bindingprotein2）(AndreaPichleretal.2002)。③通过E3连接酶的SP-RING和SP-CTD结构域分别和E2、SUMO结合使其对底物发生SUMO化修饰(Rytinkietal.2009;Yunusetal.2009)。④E3连接酶还可同过PINIT结构和底物结合，促进底物的SUMO化修饰(Yunusetal.2009)。(5)去SUMO化阶段：SUMO化修饰是一个可逆的动态过程，在去SUMO化酶SENPs和Ulps的剪切作用下，SUMO分子从底物蛋白上解离下来，重新进入SUMO化循环(Hickeyetal.2012)。图1-4SUMO化修饰循环(Gareauetal.2010)Fig1-4TheSUMOconjμgationcycle许多底物蛋白都含有SUMO结合保守基序(SUMOconsensusmotif，SCM)ΨKXE(Ψ代表疏水性氨基酸；K为赖氨酸；X代表任意的氨基酸；E为谷氨酸)(Rodriguezetal.2001)。除了SUMO保守模体（SCM）以外，最近还发现了其它的一些SUMO化基序。这些基序包括，倒装保守基序（Invertedconsensusmotif）、疏水性保守基序、磷酸化依赖的SUMO基序（phosphorylation-dependentSUMOmotifs，PDSMs）和带负电荷氨基酸依赖的SUMO基序（negativelychargedaminoacid-dependentSUMOmotifs，NDSMs）。磷酸化依赖的SUMO基序（PDSM）为ψKX(D/E)XXSP，是在SUMO保守序列（SCM）后紧随着一个磷酸化位点(Yangetal.2006)。该磷酸化位点增强了蛋白的SUMO化修饰的水平。这种机制体现在很多的转录因子上，如过氧化物酶体激活受γ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ，PPARγ）(Yamashitaetal.2004)和肌细胞特异性增强因子2A（myocyte-specificenhancerfactor2A，MEF2A）(AryamanShalizietal.2006)。5 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文1.2.2PIAS蛋白家族简介哺乳动物PIAS（proteininhibitorofactivatedSTAT）蛋白家族包括：PIAS1、PIAS3、PIASx(PIAS2)和PIASy(PIAS4)(KShuai*2000;Shuai1999;Shuaietal.2003)。除了PIAS1以外，其他的PIAS蛋白都含有两个亚型。PIAS1是以STAT1（Signaltransducerandactivatoroftranscriptionproteins）为诱饵，利用酵母双杂交方法筛库发现的。PIAS1的C端能与激活的STAT1相互作用，作为构架蛋白，与STAT1二聚体特异性结合并形成复合物，遮蔽它们与DNA的结合功能域，从而抑制转录(BINLIUetal.1998;ChanD.Chungetal.1997)。在随后的研究中发现，PIAS蛋白可以作为SUMO连接酶E3促进底物的SUMO化修饰,从而调控转录因子转录活性(Doerksetal.2002;Schmidtetal.2003)。大部分的PIAS蛋白有五个保守的结构域（如图1-5）：SAP结构域、PINIT氨基酸基序、RLD(RING-finger-likezinc-bindingdomain)结构域、AD(highlyacidicdomain)结构域和S/T(serine-andthreonine-richregion)区域。目前的研究报道，PIAS蛋白可以通过四种主要的分子机制抑制基因的转录：1，阻碍转录因子DNA结合活性位点，如PIAS1能抑制STAT1和NF-κBp65的DNA结合活性(Liuetal.2004;Liuetal.2005)。2，募集转录相关的调节因子。PIASx是通过与STAT4相互作用而被发现的，但它们的作用并不影响STAT4与DNA的结合活性，而是以PIAS作为构架蛋白，招募HDAC等抑制因子，形成转录抑制复合物，抑制白细胞介素(interleukin-12,IL-l2)激活的STAT4的转录活性。因此，可推测，PIASx是STAT4的辅抑制物(Aroraetal.2003;Grossetal.2004;Longetal.2003;Tussie-Lunaetal.2002)。3，促进转录因子的SUMO化修饰，PIAS蛋白促进STAT1氨基酸残基K703位点的SUMO化修饰(DanielaUngureanu2005;Nishidaetal.2002;Rogersetal.2003)。4，在某个亚细胞核结构上富集辅阻碍物配合物使转录因子失活，如LEF1(lymphoid-enhancer-bindingfactor1)与PIASy在细胞内共表达时，LEF1的蛋白活性受到抑制(Doerksetal.2002)。物化学和遗传学的研究表明，PIAS蛋白参与调控JAK-STAT，NF-κB，MAPK和SMAD等信号通路。PIAS1,PIAS3和PIASx都能与STAT1,STAT3andSTAT4发生相互作用，从而负调控JAK-STAT信号通路(BINLIU*†etal.1998;ChanD.Chungetal.1997;Schmidtetal.2003)。PIAS家族成员中有两个蛋白参与NF-κB信号通路，PIAS1和PIAS3(Jangetal.2004;Liuetal.2005)。PIAS1和PIAS3都能与P65互作，但它们的作用机制不同。PIAS3结合p65的N端(Liuetal.2005)，PIAS1结合p65的C端(Jangetal.2004)。Long和他的同事发现，PIAS3募集p300和CBP增强SMAD3的转录活性(Longetal.2004)。6 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响图1-5PIAS蛋白结构域(Shuaietal.2005)Fig.1-5ThedomainstructureofPIASproteins.1.2.3病毒与SUMO化修饰目前的研究发现，病毒感染后，病毒蛋白以不同的策略参与宿主的SUMO化修饰系统（如图1-5）(Everettetal.2013)，从而调控机体的免疫系统促进自身的增殖。甲型流感病毒（InfluenzaAvirus）基质蛋白（MatrixProtein，M1）(Wuetal.2011)、轮状病毒（Rotavirus）的VP蛋白（ViroplasmProteins）(Campagnaetal.2013)、牛痘病毒（vacciniavirus，VACV）E3蛋白(Gonzalez-Santamariaetal.2011)、人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）IE2(immediate-early2)蛋白(Kimetal.2010)等，这些蛋白利用宿主的SUMO化修饰使自身发生SUMO化修饰(如图1-6a)，破坏宿主天然免疫，调节自身的复制和组装。有研究报道某些病毒蛋白能与SUMO化修饰相关的E1、E2、E3酶发生相互作用，参与调控SUMO化修饰信号通路。腺病毒蛋白Gam1的表达会导致SUMO化激活酶E1（SAE1/SAE2）的失活，从而抑制SUMO化信号通路（如图1-6b）(Boggioetal.2004;Boggioetal.2007)。人类腺病毒血清型5（humanadenovirusserotype5，HAdV5）(GuusHateboeretal.1996)、SARS-CoV的N蛋白(Fanetal.2006)、甲型流感病毒（InfluenzaAVirus）的NS1(Xuetal.2011)、人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）UL44(Sinigaliaetal.2012)等病毒蛋白能与E2结合酶UBC9发生特异性的结合（如图1-6c）。EBV（Epstein–Barrvirus）的早期蛋白Rta能激活病毒的裂解周期，酵母双杂交发现其能与PIAS1、PIASxα、PIASxβ互作(Li-KwanChang‡etal.2004;Liuetal.2006)。荧光共聚焦实验证实在真核细胞中，Rta与PIASxα、PIASxβ在细胞核内存在共定位(Liuetal.2006)。埃博拉病毒（EbolaZairevirus，EBOV）的VP35参与PIAS1介导的IRF7的SUMO化修饰过程(Changetal.2009)。含有SIM结构病毒蛋白还能与发生SUMO化修饰的蛋白发生相互作用，如人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）IE2与SUMO化修饰的TAF12（TBP-associatedfactor12）之间就是通过IE2的SIM结构域构成非共价的连接(Kimetal.2010)。有些病毒蛋白还可起到E3连接酶的功能，促进底物蛋白的SUMO修饰或者扮演去SUMO化酶的功能阻碍底物的SUMO化修饰。同时，含有SUMO靶向性泛素连接酶（SUMO-targetedubiquitinligases，STUbLs）的结构域的病毒蛋白，可介导SUMO化底物的降解（如图1.5h），如单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）的ICP0（infectedcellprotein0）含有泛素E3连接酶的RING结构，能诱导蛋白酶体对SUMO化的Sp100的降解(Boutelletal.2011;Everett2001)。7 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文病毒蛋白不但能参与SUMO化修饰系统的调节过程，还能利用SUMO化修饰系统对宿主细胞内的其他信号通路进行调节。KubotaT等证实疱疹性口腔炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV）感染条件下，IRF3和IRF7不仅仅会发生磷酸化修饰，还会被SUMO1、SUMO2、SUMO3修饰，其中SUMO化结合位点为IRF3的Lys152和IRF7的Lys406。SUMO化的IRF3和IRF7能显著增强VSV的感染。突变IRF3和IRF7的SUMO化位点阻碍其SUMO化修饰会导致IFNα4和IFN-β的mRNA的转录水平上调(Kubotaetal.2008)。NF-κB信号通路中，p100的磷酸化是通过p100的SUMO化修饰来完成的(Vatsyayanetal.2008)。IκB发生磷酸化后会被泛素蛋白酶体系降解，从而释放NF-κB，而当IκB被SUMO化修饰以后，将不会被蛋白酶体系所识别而降解，进而不能释放NF-κB，下游基因的表达受到阻碍(Miyamoto2011)。图1-6病毒与SUMO化修饰关系示意图(Everettetal.2013)Fig1-6Overviewofviralproteinengagementwithsumoylationevents1.3酵母双杂交研究进展酵母双杂交由Fields在1989年提出，主要用于在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用。它可以用来检测蛋白质之间的相互作用，还能发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。酵母双杂交的主体思想很简单，就是利用转录激活蛋白GAL4蛋白的两个特征性的结构域设计的。GAL4蛋白有DNA结合结构域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）和RNA聚合酶II募集转录激活结构域（RNAPolII-recruitingtranscriptionactivationdomain，AD）两个结构域，当GAL4结合到上游激活序列（(upstreamactivesequence,UAS）就会结合RNA聚合酶转录下游的基因。当BD和AD没有结合到一起时就无法启动下游基因的转录。我们将诱饵蛋白与BD结合，猎物蛋白与AD结合，如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生相互作用，那么就会促使BD和8 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响AD的结合，激活下游基因的转录。在Y2H菌株中，存在四种报告基因，分别是金担子素A抗性基因（ABA）、α-半乳糖苷酶基因、组氨酸和腺嘌呤合成基因。用于酵母双杂交的两个常用的载体，pGADT7和pGBKT7。pGADT7上含有猿猴病毒40（SV40）SNL、亮氨酸合成基因（LEU）、氨苄抗性（AMP）、HA标签。pGBKT7上含有色氨酸合成基因（TRP）、卡那抗性（Kana）、MYC标签。当着两种质粒转入酵母中，由于pGADT7能表达LEU（亮氨酸），pGBKT7能表达TRP（色氨酸），所以能在SD/-LEU/-TRP的固体培养基上生长。如果诱饵蛋白和猎物蛋白能发生相互作用，就会启动下游报告基因的表达，使得酵母菌能在SD/-LEU/-TRP/-HIS/-ADE/X-gal/ABA的固体培养基上生长，并且呈兰色菌落。酵母双杂技术的广泛应用，很大程度的提高了实验的进程。目前，很多实验是基于酵母双杂交的初步筛选结果而展开的。2006年，FanZ等人用SARS冠状病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARS-CoV）的N蛋白做诱饵筛选人类淋巴细胞的cDNA文库，结果发现其N蛋白能与SUMO化修饰的E2结合酶UBC9和SUMO1发生互作(Fanetal.2006)。2010年，GladueDP等人通过酵母双杂交系统证实，猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）的Core蛋白能与SUMO1和UBC9相互作用(Gladueetal.2010)。2012年，WangL等人以PRRSV的非结构蛋白Nsp1β作为诱饵，在酵母双杂交系统中筛选猪肺泡巨噬细胞（Primarypulmonaryalveolarmacrophages，PAM）cDNA文库，发现PCBP2（poly(C)-bindingprotein2）与其存在相互作用(Wangetal.2012)。9 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文第2章研究目的与意义本课题通过研究PRRSV编码蛋白Nsp1α与SUMO化修饰系统的关系，解析Nsp1α与SUMO化修饰与其抑制干扰素合成以及信号转导之间的关系，系统分析Nsp1α-SUMO化修饰在PRRSV感染中扮演的角色，深入探讨SUMO化修饰对Nsp1α抑制IFN-β的影响。同时，本研究从病毒编码蛋白翻译后修饰这一新的角度解析PRRSV诱导免疫抑制的策略，为阐明PRRSV的致病和免疫机理奠定基础，为研制更加安全有效的新型疫苗提供理论依据。10 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响第3章材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞、毒株与菌株人胚肾细胞（HEK293T）和子宫颈癌细胞（Hela细胞）为本实验室保存。仙台病毒（Sendaivirus,SeV）购自中国科学院武汉病毒所病毒资源与信息中心。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。酵母Y2H菌株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室曹罡教授馈赠。3.1.2载体与质粒真核表达载体pCAGGS-HA（图3.1）、pCMV-Tag2B-Flag（图3.2）、pCAGGS-Myc、pcDNA-His（图3.3）萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-Luc、海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK均购自Promega公司。酵母表达载体pGADT7（如图3.4）和pGBKT7（如图3.5）由华中农业大学农业微生物国家重点实验室A318室友情提供；阳性对照酵母表达质粒pGBKT7-p53和pGADT7-T均由华中农业大学农业微生物国家重点实验室B206室友情提供。PRRSV各编码蛋白Nsp1α酵母重组表达质粒pGADT7/pGBKT7-Nsp1α由本实验室构建并保存。图3.1真核表达载体pCAGGS-HA图谱Fig.3.1StructuralmapoftheeukaryoticexpressionvectorpCAGGS-HA11 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文图3.2真核表达载体pCMV-Tag2B图谱Fig.3.2StructuralmapoftheeukaryoticexpressionvectorpCMV-Tag2B图3.3真核表达载体pcDNA-His图谱Fig.3.3StructuralmapoftheeukaryoticexpressionvectorpcDNA-His12 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响图3.4pGADT7限制性图谱图3.5pGBKT7限制性图谱Fig.3.2RestrictionmapofpGADT7Fig.3.3RestrictionmapofpGABK73.1.3工具酶及主要试剂各种限制性内切酶（Restrictionendonuclease,RE）、T4DNA连接酶、DNAMarker等工具酶和TaqDNApolymerase（PCR聚合酶）、dNTPs等PCR试剂均为大连宝生物公司（TaKaRa）产品。T4DNA连接酶、蛋白质Marker为Fermentas公司产品。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。EasyPurePlasmidMiniPrepKit购自北京全式金生物科技有限公司。质粒大量制备试剂盒（目录号：D6915-04）、Trizol总RNA提取试剂盒均购自Omega公司。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母浸出物为OXOID产品。反转录试剂盒（TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit）购自Roche公司。Real-timeRT-PCR试剂（SYBRqPCRMix）购自ABI公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Luciferase®ReporterAssaySystem）、低熔点琼脂糖（LMP）均购自Promega公司。胎牛血清（FBS）均购自GibcoBRL公司。抗生素、DMEM培养基、脂质体转染试剂盒Lipofectin2000（LipofectamineTM2000TransfectionReagent）、无血清培养基OPTI-MEM为Invitrogen公司产品。RPMI-1640液体培养基、无酚红DMEM粉末购自Hyclone公司。DAPI（4’,6’-diamidino-2-Phenylindole）（标记细胞核的荧光染料）、FITC标记山羊抗兔荧光二抗、cy3标记山羊抗鼠荧光二抗均为碧云天生物技术研究所产品。13 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文葡萄糖（Glucose）、PEG3350、醋酸锂（LiAc）、鲑鱼精DNA（SalmonspermtestscarrierDNA）、腺嘌呤（Adeninehemisulfatesalt）均购自Sigma公司。酵母YPDA培养基（YPDAMedium）、酵母基础培养基（MinimalSDAgarBase）、酵母营养缺陷型培养基DOSupplement（SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu-Trp及SD/-Leu-Trp-His-Ade）、酵母转化试剂盒（YeastmakerTMYeastTransformationSystem2UserManual）等为Clontech公司产品。卡那霉素（Kana）和氨苄青霉素（Amp）购自Invitrogen公司。其他各类试剂均为进口或国产分析纯试剂。3.1.4WesternBlot以及CO-IP实验所需材料Western及CO-IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂（Cocktail）、NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺）均为Sigma公司产品。PVDF膜（0.2μm以及0.45μm规格）为Millipore产品。AgaroseA+G、5×SDS-PAGE上样缓冲液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠/兔IgG均为碧云天生物技术研究所产品。HA鼠源单克隆抗体、Myc鼠源单克隆抗体和Flag鼠源单克隆抗体购自MBL公司；β-actin鼠源单克隆抗体购自Abclone公司；化学发光底物（ClarityTMWesternECLSubstrate）为BIO-RAD公司产品。3.1.5主要缓冲液与相关试剂及其配制3.1.5.1质粒构建相关试剂LB液体培养基（高盐）：取酵母浸出液物（YeastExtract）5g，胰蛋白胨（Tryptone）10g，NaCl10g溶于900mLddH2O中，搅拌至完全溶解，定容至1000mL，121°C高压灭菌20min，室温保存备用。LB固体培养基（高盐）：在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，121°C高压灭菌20min，室温保存，使用前将其完全溶解，待温度降至50°C左右，按照比例加入相应的抗生素，铺制平皿，待冷却凝固后，4°C倒置保存备用。氨苄青霉素（Ampicillin）：100mg/mL，取5gAmpicillin于50mL离心管中，加入40mLddH2O，充分溶解后定容至50mL，0.22μm滤器过滤后，分装1mL/管，-20°C保存备用。卡那霉素（Kanamycin）：50mg/mL。取2.5gKanamycin于50mL离心管中，加入40mLddH2O，充分溶解后定容至50mL，0.22μm滤器过滤后，分装1mL/管，-20°C保存备用。电泳缓冲液（50×TAE）：将242.0g的Trisbase，57.1mL的冰乙酸，100.0mLEDTA（0.5mol/L）加入到ddH2O中，然后定容至1L。0.8%琼脂糖凝胶：将琼脂糖0.8g加入到2mL50×TAE的缓冲液和98mL14 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响ddH2O的液体中，加热溶解。2%琼脂糖凝胶：将琼脂糖2g加入到2mL50×TAE的缓冲液和98mLddH2O的液体中，加热溶解。0.1mol/LCaCl2溶液：取27gCaCl2·6H2O溶于ddH2O中并定容至1000mL，过滤除菌，分装后置-20℃保存，用于大肠杆菌感受态细胞的制备。DEPC处理水：0.1%DEPC。按DEPC粉剂和ddH2O比例为1:1000配制成溶液，于121℃蒸汽灭菌20min后，保存于室温。PBS缓冲液：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4，溶于800mLddH2O中，调pH至7.2，定容至1000mL，高压蒸气灭菌，室温保存备用。3.1.5.2细胞培养相关试剂DMEM细胞基础培养基：称取13.37gDMEM粉末溶于900mLddH2O中，轻轻搅拌至完全溶解，加入NaHCO33.7g和HEPES5.985g，溶解后，用HCl调pH至6.8，定容至1000mL，0.22μm滤器过滤除菌，4°C保存备用。细胞生长液：每100mL完全培养基中含DMEM基本培养基90mL，FBS10mL，4°C保存备用。细胞维持液：每100mL完全培养基中含DMEM基本培养基98mL，FBS2mL。细胞消化液（0.06%胰蛋白酶液）：取葡萄糖1g，NaHCO30.35g，NaCl7.94g，KCl0.4g，EDTANa20.6g溶于900mLddH2O中，完全溶解后，调pH至7.2，定容至1000mL，然后加入2.5g胰蛋白酶，0.22μm滤器过滤除菌，4°C保存备用。3.1.5.3WesternBlot缓冲液和试剂及蛋白提取试剂5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris-Base15.1g、甘氨酸94g、SDS5g溶于800mLddH2O中，搅拌至完全溶解后，定容至1000mL。用之前将其稀释成1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：将3.09gDTT溶解于20mL0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）中，过滤除菌后分装，-20℃保存备用。10%（W/V）过硫酸铵：称取1g过硫酸铵于8mLddH2O中，搅拌至完全溶解后，定容至10mL。1MTris-HCl（pH6.8）：称取121.1gTris-Base于800mLddH2O中，完全溶解后用浓HCl调pH值至6.8，定容至1000mL，室温保存备用。1.5MTris-HCl（pH8.8）：称取181.7gTris-Base于800mLddH2O中，完全溶解15 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文后用浓HCl调pH值至8.8，定容至1000mL，室温保存备用。30%（W/V）聚丙烯酰胺：购自BIO-RAD公司，4°C保存备用。10%（W/V）过硫酸铵：将lg过硫酸铵粉末溶于l0mLddH2O中，4°C保存备用，两周内用完。5×SDS上样缓冲液：1mol/LTris-HCl（pH6.8）12.5mL，称取SDS10g（10%），甘油50mL（50%），β-巯基乙醇5mL，0.2%溴酚蓝0.2g，补水到100mL，分装成1mL/管，于-20°C保存备用。12%SDS-PAGE（分离胶10mL）：ddH2O3.3mL、30%丙烯酰胺溶液4mL、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL。5%SDS-PAGE（浓缩胶3mL）：ddH2O2.1mL、30%丙烯酰胺溶液0.5mL、1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.38mL、10%SDS0.03mL、10%过硫酸铵0.03mL、TEMED0.003mL。膜转移缓冲液：称取甘氨酸14.43g，Tris-Base3.03g于600mLddH2O中，搅拌至溶解后加入200mL甲醇，搅拌均匀，定容至1000mL。膜清洗液（TBST）：称取NaCl8.8g，1mol/LTris-HCl（pH8.0）20mL于800mLddH2O中，搅拌至溶解后，加入0.5mLTween20，混匀后，定容至1000mL。裂解液（2×LBA）：4%SDS4g；3%DTT3g；30%甘油30mL；0.065Mtri-HclPH（6.8）6.5mL；加去离子水至100mL，混匀与-20℃保存。RIPA裂解液：150mMNaCl0.89g；10%甘油10mL；1%NP401mL；0.1%SDS0.1g；50mMTris-HCl（PH7.4）5mL；2mMEDTA.2Na0.074g；加去离子水至100mL，混匀与-4℃保存。封闭液：含5%（W/V）脱脂奶粉的TBST。显色液：ClarityTMWesternECLSubstrate化学发光底物（BIO-RAD）。3.1.5.4酵母双杂交相关试剂YPDA液体培养基：称取50gYPDA粉末溶解到900mLddH2O，轻轻搅拌至完全溶解，定容至1000mL，115°C高压灭菌15min，4°C保存备用。YPDA固体培养基：按液体培养基方法配制成液体培养基后，每1000mL液体培养基中加入20g琼脂粉，待完全溶解后，分装，115°C高压灭菌15min，待温度降至50°C左右，铺制平皿，4°C倒置保存备用。酵母营养缺陷型培养基：称取26.7gSD粉末和1.3g相应的Dropout粉末溶解到950mLddH2O中，定容至1000mL，115°C高压灭菌15min。相应的固体培养基，则再此基础上加入20g琼脂粉，待完全溶解后，分装，115°C高压灭菌15min，待16 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响温度降至50°C左右，铺制成平皿，4°C倒置保存备用。SD/-His/-Leu/-Trp/-Ade：四缺培养基，Dropout为缺失His、Leu、Trp和Ade。SD/-His/-Leu/-Trp：三缺培养基，Dropout为缺失His、Leu和Trp。SD/-Leu/-Trp：二缺培养基，Dropout为缺失Leu和Trp。SD/-Leu：一缺培养基，Dropout为缺失Leu。SD/-Trp：一缺培养基，Dropout为缺失Trp。3.1.6主要实验仪器及设备凝胶成像系统（US，NucleoTech）；暗箱式紫外透射仪（ZF-90，上海顾村电光仪器厂）；超速冷冻离心机（Germeny，Beckman）；台式高速冷冻离心机（Eppendorfcentrifμge5415R）；电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；PCR仪（USAMJ&ABI）；倒置显微镜（Olympus）；倒置荧光显微镜（OlympusIX70）；超低温冰箱（LegaciTMRefregerationSystem）；制冰机（SANYO）；电子天平秤（Sartorius）；PH计（METTLERTOLEDO320PHMeter）；温控摇床（LAB-LINE公司）；恒温培养箱（上海），恒温CO2培养箱（US，SheldonNanataeturingLuc）；真空干燥器（D-6072Dreieich，WGermeny）；微波炉（格兰仕）；可调式多温水浴锅（PharmaciaLKBMultiTempⅡ）；超净工作台（哈东联）；分光光度计ND-1000spectrophotometer(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)；荧光素酶报告检测系统（Promega）；荧光定量PCR仪（ABI）；激光共聚焦扫描显微镜（Zeiss）等。3.1.7分子生物学分析软件分子生物学分析软件包括：DNAman、DNAuser、DNAstar、Primer5.0、GraphPad.Prism.v5.0、SUMOplot™AnalysisProgram等。3.2实验方法3.2.1细胞样品总RNA的提取、RT-PCR3.2.1.1总RNA的提取按照实验室常用RNA的提取方法进行提取。操作过程如下：1)将收集的细胞离心加入1mLTrizolReagent，充分涡旋混匀，室温静置5min。2)加入200μL三氯甲烷，充分涡旋混匀后，冰浴静置10min，4°C12000r/m离心5min。3)取80%的上清（一般约为400μL），加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4°C12000r/m离心10min。17 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文4)吸弃上清，加入1mL预冷的75%乙醇，颠倒混匀，洗涤。5)500r/m室温离心5min，吸弃上清，尽量吸干，放在超净台上风干15min-20min（不宜过于干燥，否则RNA不宜溶解）。6)加入20μLDEPC水溶解RNA。7)紫外分光光度计测定A260及A280值，确定样品RNA含量及纯度，于-80°C保存备用。3.2.1.2cDNA的合成以提取的RNA为模板反转录（两步法）。反转（ReverseTranscription，RT）的体系（20μL）为：第一步：组分体系体积RNA1μgOligo(dT)1μLH2O适量至终体积13μL反应条件为：65°C10min，之后迅速置冰上静置。第二步：组分体系体积5×RTBuffer(2)4μLRnaseInhibitor(3)0.5μLdNTPMixture(4)2μLTranscriptorReverseTranscriptase(1)0.5μL第一步产物终体积20μL反应条件为：55°C30min，85°C5min，4°C保存。合成好的cDNA置于-80°C保存备用。3.2.2目的序列的PCR扩增根据NCBI上公布目的基因组序列信息，运用DNAClubPrimerPermier5.0和DNAMAN设计目的基因的扩增引物（见附表1）。扩增条件为94℃预变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃1min/kbp（根据片段大小确定时间）；30个循环后72℃延伸10min。PCR反应体系（如表3.1）。18 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响表3-1.PCR反应体系（50ul）Table3-1.Polymerasechainreaction(PCR)system（50ul）PCR体系组分体积5×PrimeSTARbuffer(Mg2+plus)10uldNTPMixture4ul上游引物1ul下游引物1ul模板DNA1ulPrimeSTARHSDNAPolymerse0.5ulddH2O32.5ul3.2.3PCR产物或酶切产物的电泳检测PCR或酶切结束后，称取0.2g琼脂糖于100mL烧杯中加入24.5mL蒸馏水，0.5mL50×TAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却到60℃，加入一滴EB，摇匀，倒入预先架好梳子的胶膜中，凝固15min以上。待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子备用，将1/10体积10×上样缓冲液加入到待电泳的PCR产物或酶切产物样品并混匀，用微量加样器将适量样品加到梳孔中，同时加入DNAMarker作对照。恒压120V，电泳30min左右。电泳结束后关闭电源，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察和照相。3.2.4PCR产物或酶切产物的回收与纯化用琼脂糖胶DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）纯化PCR或酶切产物DNA。具体步骤参照试剂盒说明书。3.2.5外源DNA片段与质粒载体的连接反应回收的酶切产物或PCR产物与目的质粒的连接反应体系（如表3-2），混匀，轻甩离心，22℃恒温箱中反应过夜。一般外源DNA片段与质粒载体连接的摩尔比例为3：1，平端连接可更高；一般粘端连接置22°C水浴过夜或至少1h-4h，取10μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，平端连接22°C连接20h-24h，取10μL连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。表3-2.连接体系（20ul）Table3-2.Theconnectionsystem（20ul）体系组分体积载体4ulPCR产物或酶切13ul10×T4DNALigaseBuffer2ulT4DNALigase1ul19 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文3.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)1)取-80°C冻存的DH5菌种划线接种于不含抗生素的LB琼脂平皿上，37°C温箱培养12h-16h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37°C250-300r/m振荡培养5h-6h。2)将适量活化后的菌液无菌转接到装有50mLLB的盐水瓶中，继续振荡培养2.5h-3h，至OD600nm值达到0.5-0.6时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，冰上静置30min。3)4°C4000r/m离心10min，弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽后，于沉淀中加入10mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，冰浴30min。4)4°C4000r/m离心10min，弃上清，沉淀中加入用冰预冷的0.1mol/LCaCl2约2mL(视细菌量而定)，轻轻重悬菌体，即为制备好的感受态细胞，可直接取少量（约100μL）马上用于转化或放冰浴中置4°C短期存放（一般于3d内用完）。可加入终浓度15%无菌甘油，分装0.1mL/管，-80°C保存备用。3.2.7连接产物的转化连接过夜后将10μL连接产物转化DH5α感受态细胞具体的转化方法如下：无菌操作将10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min，然后42°C水浴热击90s，再冰浴3min-5min，然后添加400μL液体LB，37°C摇床培养振荡培养30min-45min，4000r/m离心3min，弃去约300μL上清，剩余沉淀轻轻吹匀并用灭菌玻璃棒涂抹相应的抗性平皿，正放于37°C温箱，1h后倒置培养12h-16h，待其长出单个菌落挑取单菌落培养。3.2.8重组质粒的制备与鉴定3.2.8.1质粒的小量制备挑取单个菌落培养10h-12h后提取质粒进行酶切鉴定，质粒小提按照TIANGEN的质粒小提试剂盒说明书操作。质粒提取完成后用相应的内切酶进行酶切，经酶切鉴定片段大小正确的挑选2-3株进行测序鉴定，鉴定正确的添加15%的甘油在-20°C保存。3.2.8.2质粒的大量制备1)将-20°C冻存的已鉴定为阳性重组子菌液接种于100mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C250r/m-300r/m培养过夜（12h-16h）。20 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响2)接下来的步骤按照Omega公司中量提取试剂盒说明书进行。3.2.8.3质粒DNA的定量分光光度计ND-1000spectrophotometer测定DNA含量，以质粒DNA稀释液如ddH2O或TE（pH8.0）为空白对照。在260nm和280nm两个波长下读取核酸溶液光密度（OD）值。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度。以260nm以及280nm读数间的比值（OD260nm/OD280nm）估计核酸的纯度。DNA纯品的OD260nm/OD280nm比值为1.8。OD260nm/OD280nm比值应控制在1.8-2.0之间。3.2.8.4重组质粒（阳性质粒）的鉴定小量/大量制备而得的目的质粒，用适当的内切酶消化，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在凝胶成像系统中观察鉴定重组质粒并拍照。还可以通过PCR扩增以及测序的方法进一步鉴定重组质粒。3.2.9酵母双杂交筛选互作蛋白3.2.9.1酵母感受态细胞的制备采用LiAc法制备酵母感受态细胞，参照Clontech公司酵母双杂交转化试剂盒说明书，主要步骤如下：1)选择酵母细胞（Y2H）在YPDA琼脂平板上划线培养，30°C倒置培养3d-5d长出酵母菌落。2)接种单菌落到液体YPDA培养基中，30°C250r/m，摇12h左右。3)接入约2mL菌液到50mL的YPDA培养基中（使开始的OD≈0.1，放入30°C250r/m摇3h-5h，使OD≈0.6）。4)取50mL菌液于50mL的离心管，配平，离心，2500r/m，室温离心3min，弃上清，用30mL灭菌水重悬酵母菌沉淀。5)在离心期间，可配制2mL的1.1×TE/LiAC：1.56mLH2O＋0.22mL10×LiAC＋0.22mL10×TEBuffer。6)30mLH2O重悬配平离心管，2500r/m，离心3min，弃上清，加入1.4mL1.1×TE/LiAC（分两次吹，用之前混匀）。7)转入1.5mLEP管，配平离心，2500r/m，离心30s。8)用吸管吸出上清，用600µLTE/LiAC重悬细胞沉淀，即为酵母感受态细胞。21 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文3.2.9.2质粒转化酵母感受态细胞参照Clontech公司酵母双杂交转化试剂盒说明书，主要步骤如下：1)取出EP管，加入0.1µg质粒DNA（建议AD加入BD的2倍）2)加入5µL变性的carrierDNA，用之前煮5min使其变性，然后迅速置冰上冷却。3)加入感受态细胞50µL。4)加入500µLPEG/LiAC涡旋混匀。（8mLPEG+1mLTE+1mLLiAC=10mL）5)置30°C，30min（每10min颠倒混匀一次）。6)每管加入20µLDMSO混匀。7)42°C温浴15min，每5min混匀一次。8)2500r/m，离心30s，用吸管吸出上清。9)用1mLYPDplus重悬。10)30°C摇床孵育1h左右。11)2500r/m，30s离心，弃上清，用500µL0.9%NaCl重悬沉淀，涂布相应的平皿。3.2.9.3酵母融合质粒的自激活和毒性检测将诱饵质粒pGADT7-PIAS1/pGADT7-UBC9和空载体pGADT7分别转化Y2H菌株，转化产物分别涂于SD/-Leu平板上，观察比较菌落的大小和密度是否有明显的差异。分别取每种重组质粒的单菌落在SD/-Trp/-Leu平板上划线培养，30°C倒置培养3d-5d，观察平板上有无菌落生长。若无菌落生长则说明诱饵蛋白无自激活作用。3.2.10质粒的转染（脂质体介导的瞬时转染法）按脂质体（Lipofectine2000）转染试剂盒说明书进行，略有改进。具体步骤如下：1)转染前1d将形态良好、生长旺盛的细胞以1×105个/孔的量接入24孔细胞培养板，待细胞长至50%-60%单层准备转染。2)配制细胞转染液：取两个1.5mL无菌Ep管，A管加入50µLOPTI-MEM和2µL脂质体，混匀室温静置5min。其间于B管加入50µL无血清培养基OPTI-MEM和1µg待转染质粒DNA，混匀室温静置5min。3)将A管中的混合液滴加至管B中，混匀后于室温静置20min。其间，吸弃待转染细胞孔的培养基，用无血清DMEM基础培养基洗涤2次，再用2mL无血清培养基OPTI-MEM洗涤1次，加入400µLOPTI-MEM。22 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响4)将B管中的100µL混合液滴加到OPTI-MEM培养基中，轻轻摇匀，然后将细胞板置于37°C5%CO2培养箱中培养。5)培养4h-6h后，吸弃转染混合液，加1mL细胞维持液继续培养24h-48h。3.2.11双荧光素酶报告基因检测将细胞接种于24孔细胞培养板内，37°C5%CO2培养箱中培养，待细胞长至50%-60%时，按照脂质体转染试剂盒LipofectAMINE2000说明方法进行转染，0.1μg相应的荧光素酶报告载体以及0.02μg内参载体pRL-TK共转染细胞，特定实验还需转染1μg指定的真核表达载体，并设置空载体对照，转染12h-48h后参照Promega公司双荧光素酶检测试剂盒说明书进行双荧光检测。若有需要，转染24h后加入SeV，16h后进行双荧光素酶检测。所有实验至少重复三次。1)裂解细胞：转染24h-36h后，移去24孔板中的培养基，预冷的PBS洗涤两次（HEK293T可不用PBS洗涤直接加入裂解液），加入试剂盒中稀释好的裂解液150µL，放在摇床上摇动15min。2)收集细胞上清：收集细胞裂解液，12000r/m离心2min，收集上清。3)荧光素酶活性的测定：将20µL上清液加入100µL试剂盒中预先配好的LARⅡ中，TD-20/20luminometer上检测萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)活性。随后加入100µL试剂盒中预先配好的Stop&Glo®Reagent中检测海肾荧光素酶(Ranillaluciferase)活性。计算出其相对活性，并用GraphPad.Prism.v5.0软件绘制图表。3.2.12WesternBlot检测目的基因在真核细胞中的表达和互作3.2.12.1免疫共沉淀样品制备1)无双抗DMEM（10%血清）接平皿（100mm），待细胞长至80%时，进行细胞转染，6h后换含双抗DMEM（2%血清），再过30h后收样。2)吸出培养液，用预冷的PBS洗涤1-2次。每个皿（100mm）加入800uLCO-IP细胞裂解液（含16µLcocktail蛋白酶抑制剂和16ulNEM），摇均匀，于冰上静置5min，用细胞刮刮取细胞。将收集液于4°C摇转仪孵育20min-30min。4°C12000r/m10min-15min，取上清蛋白于新的EP管中（另取100ul含蛋白的细胞裂解液用于WesternBlot检测蛋白表达）。3)用AgaroseA+G预处理样品，每管加入30µLAgaroseA+G，以及同种属的其他抗体0.5µg（消除非特异性），于4°C摇转仪反应2h。4)加抗体发生反应，与目标蛋白反应过夜（12h）。5)3000r/m5min，弃上清，留沉淀于1.5mLEP管中。23 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文6)用预冷的裂解液洗涤上述沉淀：加入1mL裂解缓冲液，于4°C摇转仪反应10min。（重复步骤5、6两次，共3次）7)收集沉淀，加入30µL2×SampleBuffer，沸水5min，立即置于冰上，待冷却至室温后，12000r/m10min，上样。3.2.12.2蛋白表达样品制备1)无双抗DMEM（10%血清）接皿，待细胞长至80%时，质粒转染细胞，6h后换含双抗DMEM（2%血清）。2)换液后22h-28h，吸出培养液，用预冷PBS洗细胞1-2次。3)每个皿（60mm）加入200µL-300µL细胞裂解液（含Cocktail和NEM蛋白酶抑制剂），摇均匀，刮细胞。4)用一次性1mL针筒吸出裂解的细胞液，注入1.5mL离心管中，用针筒吸打使其充分裂解。5)取适量5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水10min，冰浴，12000r/m离心10min，取上清上样，剩余样品-20°C保存备用。3.2.12.3SDS-PAGE电泳1)配胶：按说明书制备12%（或10%）分离胶和5%浓缩胶。2)倒胶：夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，将制好的12%的SDS丙烯酰胺分离胶约5mL迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，在分离胶上加入一层异丁醇，置37°C聚合30min，分离胶聚合后，倾出覆盖层液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用纸巾吸净残留液体，再将刚制好的5%积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子，置37°C聚合30min，待胶全部聚合后移出梳子，用水洗去加样槽的残留液体，用针头拨掉加样槽的胶将齿弄直，固定于电泳装置。3)电泳：往电泳装置加入适量1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的样品上样，每孔上20μL样品。接通电源，电压调到80V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶时，将电压调到120V，等溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部（约需2h）时断电，结束电泳。3.2.12.4WesternBlot检测分析1)电转：当SDS-PAGE电泳结束后，取SDS-PAGE电泳后的凝胶，不经染色，直接用Bio-RAD公司MiniTrans-BlotElectrophoreticCell转印装置将蛋白带24 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响电转印到PVDF膜上，以0.65mA/cm2电转印2h。具体操作如下：戴上手套，剪2张7层滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜的大小要略大于凝胶。在一托盘中加入少量转膜缓冲液，把滤纸和海绵浸泡于其中。PVDF膜在甲醇中浸泡2min后也移入转膜缓冲液。依次在玻璃板上铺海绵，滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。将其整体转移到转膜夹上。2)12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。3)封闭：配制封闭液，在20mL1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保鲜盒中。将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下，置摇床上孵育2h。4)一抗与靶蛋白结合：把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上孵育4h。5)二抗与靶蛋白结合：在保鲜盒内加入8mL1×TBST洗3次，每次5min。倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8mL），摇床上孵育2h。6)显色：在保鲜盒内加入8mL1×TBST洗3次，每次5min。将PVDF膜放入化学发光底物（SuperSignalWestPico）的A和B液的等量混合液中进行避光显色，用化学发光成像系统进行照相。3.2.13荧光共聚焦检测蛋白质的亚细胞定位Hela细胞接入预先放置玻片的24孔细胞培养板中，待细胞长至50%-60%时转染真核表达质粒，37°C5%CO2培养箱中培养一定时间后收取样品。1)转染后的细胞吸弃培养基后，预冷的PBS洗1-2次，每次5min。2)4%多聚甲醛避光室温固定15min。3)预冷的PBS漂洗3次，每次5min。4)含0.5%Triton-X-100的PBS室温穿孔15min。5)预冷的PBS漂洗3次，每次5min。6)10%山羊血清（PBS稀释），室温封闭30min。7)加入一抗（一抗按说明书用封闭液稀释），37°C作用1h。8)预冷的PBS漂洗3次，每次5min。9)加入荧光二抗(1:300稀释)，37°C作用45min（避光）。10)预冷的PBS漂洗3次，每次5min。11)加入DAPI（1:3000稀释）细胞核染色液，室温作用15min（避光）。12)预冷的PBS漂洗3次，每次5min。13)制片观察（封片液为PBS配置的50%甘油）。25 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文3.2.14统计学方法所有数据以均值±标准差(x±s)表示。采用Excel统计软件进行统计学分析，组间差异显著性采用双样本等方差t检验进行处理，*P<0.05的统计值被认为是显著的，**P<0.01的统计值是极显著的。26 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响第4章结果与分析4.1.酵母双杂交系统分析Nsp1α与SUMO化修饰系统相关蛋白PIAS1、UBC9的相互作用4.1.1相关酵母重组质粒的构建应用生物信息学软件SUMOplot™AnalysisProgram预测PRRSV编码非结构蛋白Nsp1α，结果显示（见表4-1），Nsp1α存在两个赖氨酸位点为SUMO化修饰位点。为了进一步探究PRRSV编码非结构蛋白Nsp1α的SUMO化修饰，构建SUMO化修饰过程中的E2结合酶UBC9和E3连接酶PIAS1相关的酵母重组质粒。以HEK293T细胞的cDNA为模板，PCR扩增PIAS1、UBC9片段（引物见表4-2），PCR产物经双酶切后进行电泳鉴定，PIAS1、UBC9扩增片段的大小与预期一致（图4-1A/B），测序结果表明插入片段正确。目的片段与酵母表达载pGBKT7经酶切后，由T4连接酶连接，构建pGBKT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9质粒，酶切鉴定（图4-1C/D）与测序分析结果表明，pGBKT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9酵母重组质粒构建成功。同时，通过双酶切将PIAS1和UBC9构建到酵母pGADT7质粒上。酵母重组质粒pGBKT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9、pGADT7-PIAS1、pGADT7-UBC9的毒性及自激活检测结果表明（如图4-2），构建的重组质粒pGADT7-PIAS1、pGBKT7-UBC9无酵母毒性及自激活性，可用于下一步酵母双杂交筛选实验。PRRSV编码非结构蛋白Nsp1α的酵母重组质粒由本实验室构建，无细胞毒性和自激活现象。表4-1Nsp1α的SUMO化修饰位点的预测Table4-1ThepredictionofsumoylationsitesofNsp1αProteinNO.Pos.GroupScoreNsp1α1K169PLPQRPKPEDFCPF0.612K150SLHVSDKPFPGATH0.15表4-2用于酵母双杂交的引物Table4-2Primersusedinyeasttwo-hybrid.PrimernamePrimersequence(5′to3′)RestrictionenzymesitesBD-PIAS-FATAGAATTCGCGGACAGTGCGGAACTAAAGEcoRIBD-PIAS-RCGCGTCGACGTCCAATGAAATAATGTCTGGSalIBD-UBC9-FATAGAATTCTCGGGGATCGCCCTCAGCAGACTEcoRIBD-UBC9-RCGCGGATCCCTTATGAGGGCGCAAACTTCTTGBamHI27 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文图4-1pGBKT7-PIAS1/pGBKT7-UBC9重组质粒的构建A，PIAS1基因PCR结果；B，UBC9基因PCR结果；C，pGBKT7-PIAS1重组质粒的鉴定D，pGBKT7-UBC9重组质粒的鉴定。1.DL-5000Marker；2.为PIAS1基因PCR产物；3/6.阴性对照组;4/15.DL-2000Marker；5.为UBC9基因PCR产物.7/11.DL-15000Marker；8.pGBKT7空载体EcoRI/SalI双酶切切产物；9.pGBKT7-PIAS1重组质粒EcoRI/SalI双酶切产物；10.pGBKT7-PIAS1重组质粒的PCR产物；12.pGBKT7空载体EcoRI/BamHI双酶切切产物；13.pGBKT7-UBC9重组质粒EcoRI/BamHI双酶切产物；14.pGBKT7-UBC9重组质粒的PCR产物；Fig.4-1-1TheconstructionofrecombinantplasmidpGBKT7-PIAS1/pGBKT7-UBC9A,PIAS1genePCRresults;B,UBC9genePCRresults;C,IdentificationofrecombinantplasmidpGBKT7-PIAS1;D,IdentificationofrecombinantplasmidpGBKT7-UBC9.1.DL-5000Marker;2.PCRproductofPIAS1gene;3/6.NegativeControl;4/15.DL-2000Marker;5.PCRproductofUBC9gene.7/11.DL-5000Marker;8.pGBKT7digestedwithEcoRIandSalI;9.recombinantplasmidpGBKT7-PIAS1digestedwithEcoRIandSalI;10.PCRproductofrecombinantplasmidpGBKT7-PIAS1.12.pGBKT7digestedwithEcoRIandBamHI;13.recombinantplasmidpGBKT7-UBC9digestedwithEcoRIandBamHI;14.PCRproductofrecombinantplasmidpGBKT7-UBC9.图4-2PIAS1/UBC9蛋白的自激活和毒性检测A，PIAS1/UBC9蛋白对Y2H酵母菌的毒性作用检测；B，PIAS1/UBC9蛋白对Y2H酵母菌的自激活检测。Fig.4-2TestingPIAS1/UBC9proteinforAutoactivationandToxicityA,ToxicitydetectionofthePIAS1/UBC9proteinintheyeastY2H;B,AutoactivationdetectionofthePIAS1/UBC9proteinintheyeastY2H.28 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响4.1.2酵母双杂交系统分析Nsp1α与PIAS1、UBC9的相互作用将酵母诱饵质粒pGADT7-PIAS1/pGBKT7-UBC9分别与pGBKT7/pGADT-Nsp1α共同转化至酵母菌Y2H中，先在SD/-Trp-Leu二缺培养板上培养，然后在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu的四缺培养板上筛选阳性菌株，同时以pGADT7-T和pGBKT7-P53作为阳性对照组。酵母双杂交结果显示，Nsp1α能与SUMO化修饰的E3连接酶PIAS1发生相互作用形成蛋白质复合物（如图4-3A），但不能与SUMO化修饰的E2结合酶UBC9形成蛋白质复合物（如图4-3B）。同时，通过酵母双杂交系统进一步验证UBC9在酵母菌Y2H中能正常表达且能与PIAS1发生相互作用形成蛋白质复合物（如图4-3C）。PIAS蛋白有两种调控机制：一种是SUMO连接酶E3的功能；另一种是作为架构蛋白募集信号通路中相关蛋白(伍会健2009)。在酵母双杂交系统中，Nsp1α与PIAS1存在相互作用，与UBC9不存在相互作用，所以我们推测，Nsp1α与PIAS1的互作可能是PIAS1发挥着架构蛋白的作用。4.2免疫共沉淀验证细胞内PIAS1与Nsp1α的互作关系因为限制性内切酶XhoI和SalI属于同尾酶，所以用EcoRI/SalI酶切pGBKT7-PIAS1重组质粒，并用EcoRI/XhoI双酶切pCMV-Tag2B-Flag载体，酶切回收后，用T4连接酶将PIAS1连接至pCMV-Tag2B-Flag载体。连接产物pCMV-Tag2B-Flag-PIAS1转化至大肠杆菌DH5α菌株中。酶切鉴定pCMV-Tag2B-Flag-PIAS1构建成功。pCAGGS-HA-Nsp1α由本实验室构建保存。在HEK293T细胞中，共转染重组质粒pCAGGS-HA-Nsp1α和pCMV-Tag2B-Flag-PIAS1，同时设立相应的阴性对照组，转染32h后，用RIPA裂解液收取蛋白样品。蛋白样品经HA鼠源单克隆抗体孵育后进行免疫沉淀反应。随后蛋白样品进行WesternBlot分析，分别用HA和Flag鼠源单克隆抗体检测。结果表明，PIAS1与Nsp1α在真核细胞中未检测到相互作用(如图4-4A)。不同剂量的Nsp1α与PIAS1共转染HEK293T细胞，WesternBlot结果表明，Nsp1α能促进PIAS1蛋白的稳定性，且存在剂量依赖性(如图4-4B)。LiR等人的研究证实，PIAS1通过阻碍IRF3的DNA结合活性，负调节IFN信号通路(Lietal.2013)。实验结果显示Nsp1α蛋白能促进PIAS1的稳定性，我们猜测Nsp1α可能通过调控PIAS1来实现抑制I型IFN。目前，Nsp1α促进PIAS1蛋白稳定性的机制还有待进一步研究。29 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文图4-3酵母双杂交实验验证PIAS1与Nsp1α的相互作用A，PIAS1与Nsp1α的相互作用。阳性对照组：pGADT7-T+pGBKT7-P53；阴性对照组：pGBKT7-Nsp1α+pGADT7,pGBKT7+pGADT7-PIAS1;实验组：pGBKT7-Nsp1α+pGADT7-PIAS1；B，UBC9与Nsp1α的相互作用。阴性对照组：pGBKT7-UBC9+pGADT7,pGBKT7+pGADT7-Nsp1α;实验组：pGBKT7-UBC9+pGADT7-Nsp1α.C，UBC9与PIAS1的相互作用。阴性对照组：pGBKT7-UBC9+pGADT7,pGBKT7+pGADT7-PIAS1;实验组：pGBKT7-UBC9+pGADT7-PIAS1.Fig.4-3IdentificationofPIAS1interactingwithNsp1αbyYeasttwo-hybridassayA,TheinteractionbetweenPIAS1andNsp1α.Positivecontrolgroup：pGADT7-T+pGBKT7-P53；Negativecontrolgroup：pGBKT7-Nsp1α+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-PIAS1；Experimentalgroup：pGBKT7-Nsp1α+pGADT7-PIAS1；B,TheinteractionbetweenNsp1αandUBC9.Negativecontrolgroup：pGBKT7-UBC9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-Nsp1α；Experimentalgroup：pGBKT7-UBC9+pGADT7-Nsp1α；C,TheinteractionbetweenPIAS1andUBC9.Negativecontrolgroup：pGBKT7-UBC9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-PIAS1；Experimentalgroup：pGBKT7-UBC9+pGADT7-PIAS1.30 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响图4-4免疫共沉淀验证PIAS1和Nsp1α的相互作用A，pCAGGS-HA-Nsp1α+pCMV-Tag2B-Flag-PIAS1重组质粒共同转染HEK293T细胞后的免疫共沉淀分析；B，不同剂量pCAGGS-HA-Nsp1α（0、1、2和4μg）和pCMV-Tag2B-Flag-PIAS1(2μg)共转染HEK293T细胞（转染载体总量一致，不足部分用空载体补足），通过WestemBolt实验检测各蛋白的表达。Fig.4-4IdentificationofPIAS1interactingwithNsp1αbyCo-ImmunoprecipitationassayA，Co-ImmunoprecipitationanalysisofPIAS1andNsp1αinplasmidstransfected-HEK293Tcells;B，ProteinexpressionidentificationofdifferentdosesofNsp1αandPIAS1inplasmidstransfected-HEK293Tcells.4.3Nsp1α的SUMO化修饰的探索生物信息学软件SUMOplot™AnalysisProgram预测结果中，Nsp1α存在两个赖氨酸位点为SUMO化修饰位点（表4-1）。Nsp1α在真核细胞中不存在与PIAS1的相互作用，也可能存在一种不通过E3连接酶的SUMO化修饰，即通过E2连接酶介导的SUMO化修饰。为了证实上述猜测，通过特异性引物(见表4-3)扩增HEK293T细胞的cDNA，获得SUMO1（图4-5A），并将其构建到pCAGGS-Myc载体上，构建成pCAGGS-Myc-SUMO1真核重组表达质粒（图4-5B）。同时设计特异性引物（表4-2）将UBC9从pGBKT7-UBC9上扩增并连接到pcDNA-His载体上，构建pcDNA-His-UBC9重组质粒。在HEK293T细胞中，超表达pCAGGS-HA-Nsp1α、pCAGGS-Myc-SUMO1和pcDNA-His-UBC9三种质粒，用免疫共沉淀检测Nsp1α是否存在SUMO化修饰。免疫共沉淀的结果显示（如图4-6），未检测到Nsp1α的SUMO化修饰条带。目前，还没有相关的文献报道，Nsp1α存在某种翻译后修饰，如泛素化，乙酰化，以及本文所探索的SUMO化修饰。本实验排除了Nsp1α存在SUMO化修饰的可能。31 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文4.4Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰的探索在免疫共沉淀实验中，我们没有检测到Nsp1α的SUMO化修饰条带，但却意外的发现Nsp1α对细胞内的SUMO化修饰存在一定的影响。为了进一步探明Nsp1α对细胞内SUMO化修饰的影响，我们将不同剂量的pCAGGS-HA-Nsp1α与pCAGGS-Myc-SUMO1、pcDNA-His-UBC9共同转染HEK293T细胞，通过WesternBlot检测细胞内SUMO化修饰的水平。如图4-7A所示，在HEK293T细胞内超表达Nsp1α会导致细胞内SUMO化修饰的水平降低，且呈剂量依赖性。Nsp1α本身包含三个不同的功能基序：PCPα、ZF1和CTE(Hanetal.2013)。为了进一步探究其阻碍细胞内SUMO化修饰的活性结构域，本实验就Nsp1α已有的缺失突变体进行了进一步的探讨。N端锌指结构域ZF1氨基酸位点为1-66，C端CTE结构域氨基酸位点为167-180(Shietal.2012)（如图4-7B该突变图由井汇源博士构建）。WesternBlot结果显示（如图4-7C），N端锌指结构域ZF1对其阻碍细胞内SUMO化修饰的水平起着关键性的作用。相关文献报道，Nsp1α的N端锌指结构域ZF1具有降解CBP的功能(Hanetal.2013)。CBP具有乙酰转移酶活性，介导多种转录因子，参与转录调控。SUMO化修饰能影响CBP的亚细胞定位，从而调节CBP的生物学功能(Ryanetal.2010)。所以我们推测，Nsp1α的ZF1结构域可能是通过降解CBP的SUMO化修饰，调节IFN-β的产生。表4-3用于真核表达的引物Table4-3Primersusedineukaryoticexpression.PrimernamePrimersequence(5′to3′)RestrictionenzymesitesSUMO1-FTATGGTACCTCTGACCAGGAGGCAAAACCKpnISUMO1-RTATCTCGAGCTAAACTGTTGAATGACCCCXhoIHIS-UBC9-FATAGGATCCTCGGGGATCGCCCTCAGCAGACBamHIHIS-UBC9-RGCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAACTTCTTGGCXhoI32 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响图4-5pCAGGS-Myc-SUMO1重组质粒的构建A，SUMO1基因PCR结果；B，pCAGGS-Myc-SUMO1重组质粒的鉴定。1/4.DL-2000Marker；2.为SUMO1基因PCR产物；3.阴性对照组;5.DL-15000Marker；6.pCAGGS-Myc空载体KpnI/XhoI双酶切切产物；7.pCAGGS-Myc-SUMO1重组质粒KpnI/XhoI双酶切产物；8.pCAGGS-Myc-SUMO1重组质粒的PCR产物.Fig.4-5TheconstructionofrecombinantplasmidpCAGGS-Myc-SUMO1A,SUMO1genePCRresults;B,IdentificationofrecombinantplasmidpCAGGS-Myc-SUMO1;1/4.DL-2000Marker;2.PCRproductofSUMO1gene;3.NegativeControl;5.DL-15000Marker;6.pCAGGS-MycdigestedwithKpnIandXhoI;7.recombinantplasmidpCAGGS-Myc-SUMO1digestedwithKpnIandXhoI;8.PCRproductofrecombinantplasmidpCAGGS-Myc-SUMO1.图4-6免疫共沉淀分析Nsp1α的SUMO化修饰在HEK293T细胞中共转染Myc-SUMO、His-UBC9和HA-Nsp1α，转染后32h，RIPA裂解液裂解细胞，anti-HA抗体免疫共沉淀蛋白样品。免疫共沉淀的蛋白样品分别用anti-HA和anti-Myc单克隆抗体进行WesternBlot分析。同时用anti-HA和anti-Myc抗体对全细胞裂解液进行免疫印迹分析，鉴定互作蛋白的表达。Fig.4-6AnalysisofsumoylationofNsp1αbyCo-Immunoprecipitation.Myc-SUMO，His-UBC9andHA-Nsp1αplasmidsweresimultaneouslytransfectedintoHEK293Tcells.Thirty-twohoursaftertransfection,thecellswerelysedinRIPAbufferandcoimmunoprecipitationwasperformedusinganti-HAmonoclonalantibody,theproteinsimmunoprecipitated(IP)wereassayedwithanti-Mycandanti-HAmonoclonalantibody.Celllysateswereimmunoblotted(IB)withanti-Mycandanti-HAantibodiestoconfirmtheexpressionoftheinterestedproteins.33 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文图4-7Nsp1α阻碍细胞内蛋白的SUMO化修饰的功能分析A，Nsp1α阻碍细胞内蛋白的SUMO化修饰，且呈剂量依赖性。不同剂量的HA-Nsp1α(0,1μg,2μg,4μg,8μg)和Myc-SUMO1（2μg）以及His-UBC9（1μg）共转染HEK293T细胞。anti-HA和anti-Myc单克隆抗体对全细胞裂解液进行免疫印迹分析，鉴定蛋白的表达。B，Nsp1α缺失突变体图解。C，Nsp1α阻碍细胞SUMO化修饰的活性功能域分析。HEK293T细胞中转染Nsp1α及其突变体免疫印迹分析细胞内的SUMO化修饰水平。Fig.4-7AnalysisofNsp1αblockingSUMOmodificationofproteinsincellsfunctionA,Nsp1αblockingSUMOmodificationofproteinincells,andadosedependent.HEK293TcellsweretransfectedwithincreasingamountsofHA-Nsp1α(0,1μg,2μg,4μg,8μg),butnotofUBC9orSUMO-1.Totallysateswereanalyzedbyimmunoblottingusinganti-HAandanti-Mycmonoclonalantibodiestoconfirmtheexpressionofproteins.B,SchematicrepresentationofNsp1αdeletionmutants.C,AnalysisofNsp1αblockingSUMOmodificationactivityincells.HEK293TcellsweretransfectedwithNsp1αmutantsandanalyzedbyimmunoblottingusinganti-HAandanti-Mycmonoclonalantibodies.4.5Nsp1α通过阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进IRF3的降解细胞质内的RIG-I分子识别RNA病毒后构象发生变化，暴露出N端的CARD结构域，招募衔接蛋白MAVS/IPS-1/VISA/Cardif，将信号传递到下游的激酶TBK1，使IRF3/IRF7磷酸化，进而激活I型IFN基因。以前的研究证实PRRSVNsp1α能够拮抗RIG-I介导的β-干扰素（IFN-β）产生。为了探讨Nsp1α阻碍SUMO修饰是否在其拮抗IFN中发挥作用，将Nsp1α真核表达质粒与RIG-I介导的信号通路蛋白共转染HEK293T细胞，同时转染荧光素酶报告基因（IFN-β-Luc）以及海肾荧光素酶报告基因（TK-Luc），通过双荧光素酶报告系统检测其作用的靶点。实验结果表明（如图4-8A/B/C/D/E），Nsp1α能抑制RIG-I，RIG-IN，IPS-1，TBK1，IRF3所激活的IFN-β启动子活性，但对IRF3-5D的抑制不明显。其中，RIG-IN能直接激活下游34 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响信号通路；IRF3-5D是一种模拟磷酸化IRF3突变体，能持续激活IFN-β的启动子。所以，我们推测Nsp1α作用靶点为IRF3。图4-8Nsp1α靶向IRF3A/B/C/D/E，IFN-β-Luc，pRT-TK和pCAGGS-HA-Nsp1α与RLRs信号通路中的蛋白（RIG-I、RIG-IN、IPS-1、TBK1、IRF3、IRF3-5D）共转染HEK293T细胞，转染28h后收样，进行双荧光素酶测定。F，Nsp1α对IRF3蛋白稳定性的影响。不同剂量HA-Nsp1α和固定剂量Flag-IRF3共转染HEK293T细胞，免疫印迹分析IRF3蛋白的表达量。G，Nsp1α对IRF3蛋白SUMO化修饰的影响。HEK293T细胞中，共表达HA-Nsp1α、Flag-IRF3、Myc-SUMO和His-UBC9，免疫印迹分析IRF3蛋白SUMO化修饰水平。Fig.4-8Nsp1αtargetsforIRF3A/B/C/D/E,HEK-293TcellswerecotransfectedwithIFN-β-Luc,thepRL-TKplasmid,andpCAGGS-HA-Nsp1αtogetherwithconstructsexpressingRIG-I,RIG-IN,IPS-1,TBK1,IRF3orIRF3-5D.Luciferaseassayswereperformed28haftertransfection.F,TheinfluenceofNsp1αonIRF3proteinstability.DifferentdosesofHA-Nsp1αandafixeddoseofFlag-IRF33werecotransfectedintoHEK293T,theexpressionofIRF3proteinwasdetectedbyWesternblot.G,TheeffectofNsp1αonIRF3proteinofSUMOmodification.HEK293Tcells,coexpressionofHA-Nsp1α,Flag-IRF3,Myc-SUMOandHis-UBC9,WesternblotanalysistheSUMOmodificationlevelofIRF3protein.为了证实我们的推测，设计不同剂量pCAGGS-HA-Nsp1α和pCMV-Tag2B-Flag-IRF3共转染HEK293T细胞的实验。实验结果证实（图4-8F），Nsp1α对IRF3的稳定性具有负调节的作用。最新的文献报道，IRF3的K87为SUMO化修饰和泛素化修饰的竞争性位点，同时IRF3的SUMO化修饰能抑制其泛素化修饰(Ranetal.2011)。所以我们猜测，在细胞中过表达Nsp1α会降低IRF3的SUMO化修饰的水平，促进其泛素化修饰，从而调节IRF3蛋白的稳定性。为了证实我们的猜测，设35 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文计实验如下，在HEK293T细胞中，共转染pCMV-Tag2B-Flag-IRF3和pCAGGS-HA-Nsp1α，同时转染Myc-SUMO和His-UBC9。实验结果表明（图4-8G），过量表达Nsp1α后，IRF3的SUMO化修饰水平降低，IRF3的表达量也略有下降。上述实验证实，Nsp1α阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进IRF3的降解，参与RIG-I信号通路抑制IFN-β产生。4.6Nsp1α及其突变体的分析4.6.1Nsp1α及其突变体对细胞内SUMO化修饰的影响我们知道蛋白质的赖氨酸位点会发生多种蛋白质翻译后修饰，如乙酰化、泛素化、糖基化以及SUMO化等。我们在探究Nsp1α的赖氨酸位点是否存在SUMO化修饰时，意外的发现Nsp1α的赖氨酸对其阻碍细胞内SUMO化修饰具有一定的影响。所以我们进一步分析Nsp1α及其突变体在细胞内阻碍SUMO化修饰中的作用。根据生物信息学分析的结果，Nsp1α存在两个赖氨酸位点为SUMO化修饰位点而其本身只存在三个赖氨酸位点（K117、K150、K169），所以本实验针对其仅有的三个赖氨酸位点构建点突变，将赖氨酸残基（K）突变为丙氨酸（A）。（突变体K117A、K150A、K169A、K117/150/169A均由本实验室张欢博士构建）在HEK293T细胞中，共转染Myc-SUMO、His-UBC9和HA-Nsp1α及其突变体。WesternBlot检测细胞内SUMO化修饰的水平。实验结果表明（如图4-9），赖氨酸位点（K）突变后，Nsp1α阻碍细胞内SUMO化修饰的水平也增强，同时Nsp1α本身的蛋白水平上调。所以我们猜测，Nsp1α的K位点可能发生泛素化修饰并被降解。当赖氨酸位点（K）突变以后Nsp1α的降解被抑制，蛋白稳定性增强，其阻碍细胞内SUMO化修饰的能力也相应的增强。4.6.2Nsp1α及其突变体对IFN-β启动子的影响Nsp1α赖氨酸位点突变后，会促进细胞内SUMO化修饰水平的降低，那么这一变化对其抑制IFN-β产生怎样的影响？仙台病毒（SEV）是IRF3活化的刺激剂，能诱导IRF3C端的磷酸化。IRF3磷酸化后从细胞质转移到细胞核，形成二聚体并与转录因子（NF-κB、P300/CBP等）结合形成增强子，诱导I型干扰素的产生，实现机体的抗病毒反应。本实验，在HEK293T细胞中共转染pCAGGS-HA-Nsp1α、荧光素酶报告基因（IFN-β-Luc）以及海肾荧光素酶报告基因（TK-Luc），转染后24h接种SEV，SEV感染16h后收样，通过双荧光素酶报告系统检测IFN-β启动子活性。结果显示（如图4-9A），Nsp1α能抑制仙台病毒（SEV）介导的IFN-β启动子的激活，而它的三个赖氨酸位点突变后均对其抑制IFN-β启动子活性具有负调控的作用。IRF3-5D是一36 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响种模拟磷酸化IRF3突变体，能持续激活IFN-β的启动子。在HEK293T细胞中，通过IRF3-5D激活报告系统，检测Nsp1α及其突变体对IFN-β启动子活性的影响。结果表明（如图4-9B），Nsp1α对IRF3-5D激活的IFN-β信号通路没有明显的抑制效果，而Nsp1α的突变体（K117A、K150A、K169A）显著抑制由组成性激活体IRF3-5D引起的IFN-β启动子的激活。Nsp1α赖氨酸位点负调控的具体机制目前尚未明确，还有待进一步的探索。图4-9Nsp1α突变体对细胞内SUMO化修饰的影响Nsp1α及其突变体与SUMO和UBC9共转染HEK293T细胞，32h后裂解细胞，收取蛋白样品，WesternBlot分析，细胞内SUMO化修饰的水平。Fig.4-9EffectofNsp1αanditsmutantsonintracellularSUMOmodificationHEK293TcellswerecotransfectedwithNsp1αanditsmutantswithSUMOandUBC9,after32h,lysisofcells,collectproteinsample,WesternBlotanalysis,thelevelofintracellularSUMOmodification.37 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文图4-10Nsp1α及其突变体对IFN-β启动子的影响A，IFN-β-Luc(0.1μg)与Nsp1α及其突变体（0.8μg）真核表达载体以及pRT-TK(0.02μg)共转染HEK293T细胞，转染24h后，感染仙台病毒，18h后收样，进行双荧光素酶测定；B，将IRF3-5D(0.2μg)与报告基因IFN-β-Luc(0.1μg)，pRT-TK(0.02μg)以及Nsp1α及其突变体(0.6μg)共转293T细胞，转染32h后收样，进行双荧光素酶测定。Fig.4-10AnalysesoftheeffecttoIFN-βpromoterbytransfectingNsp1αanditsmutantsHEK293TcellswerecotransfectedwithFN-β-Luc(0.1μg),phRL-TK(0.02μg)andpCAGGSexpressingnsp1αoritsMutantsproteinsorpCAGGSemptyvectorfor24h.CellsweretheninfectedwithSendaivirus(A)for18horactivatedwithIRF3-5D(B),thenthecellswereharvestedfordualluciferasereporterassay.RelativeluciferaseactivityisdefinedasaratiooffireflyluciferasereporteractivitytoRenillaluciferaseactivity.Eachdatapointshownrepresentsameanvaluefromthreeexperiments.Errorbarsshowstandarddeviationsofthenormalizeddata.38 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响第5章讨论众所周知，PRRSV能够抑制I型干扰素，逃避宿主的天然免疫，但其作用的具体的分子机制还尚未明确。已有研究表明，SUMO化修饰参与到多种病毒蛋白的复制和增殖过程中。本研究，主要从SUMO化修饰这一角度探讨，PRRSV抑制IFN-β的分子机制。酵母双杂交技术是目前常用的蛋白互作筛选的分子技术。我们通过酵母双杂交系统，采用Y2H菌株进行点对点实验，结果表明，PRRSV编码非结构蛋白Nsp1α与pGADT7-PIAS1存在相互作用。但在此系统中，没有检测到Nsp1α与pGBKT7-UBC9存在相互作用。因为pGBKT7-PIAS1、pGADT7-UBC9在Y2H菌株中存在自激活，所以无法进行回复验证。由于酵母双杂交系统存在其自身的局限性，所以我们采用免疫共沉淀技术进一步的验证所得到的互作结果。利用免疫共沉淀技术，在HEK293T细胞中并未发现Nsp1α与PIAS1的相互作用。这可能在HEK293T细胞中Nsp1α与PIAS1的互作被其他的蛋白所阻断。同时，通过WesternBlot技术，我们检测到Nsp1α能促进PIAS1蛋白的稳定性，且存在剂量依赖性。有文献报道，PIAS1是一种多功能蛋白，它不仅含有SUMO连接酶E3的功能，还可以作为架构蛋白募集信号通路中相关蛋白(伍会健2009)。LiR等人的研究证实，PIAS1通过阻碍IRF3的DNA结合活性，负调节IFN-β信号通路(Lietal.2013)。所以我们推测，Nsp1α通过调节PIAS1蛋白的稳定性促进其阻碍IRF3的DNA结合活性，从而调控IFN-β信号通路。相关软件预测Nsp1α存在两个SUMO化修饰位点，但在本实验中并没有检测到Nsp1α的SUMO化修饰条带。虽然，我们在免疫共沉淀实验中并未检测到Nsp1α的SUMO化修饰条带，但在WesternBlot实验中我们意外地发现Nsp1α能够阻碍细胞内的SUMO化修饰。根据Nsp1α和已有截短突变进一步检测其结构域，结果证实其N端锌指基序ZF1为其阻碍细胞内SUMO化的结构功能域。ZF1结构是Nsp1α的一个重要的活性结构域，发挥着重要的生物学功能。已有文献报道，Nsp1α的ZF1对降解CBP起着关键性的作用(Hanetal.2013)，对其抑制IFN-β也有不可替代的作用(Shietal.2013)。但其在SUMO化修饰中的作用，鲜有人报道。我们推测，Nsp1α的ZF1结构域能阻碍CBP的SUMO化修饰促进CBP蛋白的降解，从而发挥其抑制IFN-β的功能。由于实验条件的限制，目前对Nsp1α阻碍CBP的SUMO化修饰还尚未探索。以前的研究证实PRRSVNsp1α能够拮抗RIG-I介导的β-干扰素（IFN-β）产生。为了进一步阐明Nsp1α在RIG-I信号通路中的作用靶点，HEK293T细胞中共转染Nsp1α和RIG-I信号通路蛋白，利用双荧光素酶报告系统检测其对IFN-β启动子活39 华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文性的影响。结果表明，Nsp1α的作用靶点为IRF3。超表达Nsp1α，IRF3的表达量显著下降。共转染Nsp1α，IRF3以及SUMO1、UBC9后，WesternBlot结果显示，Nsp1α能去阻碍IRF3的SUMO化修饰。目前的研究报道，IRF3存在SUMO化修饰和泛素化修饰的竞争性修饰(Ranetal.2011)。所以，我们推测Nsp1α阻碍IRF3的SUMO化修饰后，其泛素化修饰增强，进而导致IRF3的降解，从而抑制IFN-β的产生。BeuraLK等人证实，Nsp1β能抑制IRF3的磷酸化及核转运(Beuraetal.2010)。Nsp1α阻碍IRF3的SUMO化修饰是否会影响IRF3的磷酸化和核转运，还有待进一步的探讨。我们知道蛋白质的赖氨酸位点是其较活跃的蛋白质翻译后修饰位点，能发生乙酰化、磷酸化、泛素化和SUMO化等修饰。Nsp1α本身含有三个赖氨酸残基，且经生物信息学软件预测存在两个SUMO化修饰位点。为了探明Nsp1α的赖氨酸位点对其阻碍细胞内SUMO化修饰的影响，我们将Nsp1α的突变体（K117A、K150A、K169A）与SUMO1以及UBC9共转染HEK293T细胞。结果发现，Nsp1α的赖氨酸位点突变后其阻碍细胞内SUMO化修饰的能力增强，且其本身的蛋白表达水平也上调。所以我们推测，Nsp1α的赖氨酸位点为泛素化修饰位点，负调控其阻碍细胞内SUMO化修饰的能力。同时，通过双荧光素酶系统检测，Nsp1α的赖氨酸位点突变后，其抑制IFN-β启动子活性的能力增强。虽然，我们已经证实Nsp1α的赖氨酸负调控其去SUMO化修饰和抑制IFN-β，但其具体机制还有待进一步探索。40 PRRSV非结构蛋白Nsp1α对细胞SUMO化修饰的影响第6章小结1.酵母双杂交实验证实PRRSV编码非结构蛋白Nsp1α与PIAS1存在相互作用。2.利用免疫共沉淀技术，未检测到PIAS1与Nsp1α的互作，同时也为检测到Nsp1α存在SUMO化修饰。3.Nsp1α能阻碍HEK293T细胞内的SUMO化修饰，降低细胞内的SUMO化修饰的水平。4.Nsp1α作用于IRF3，能阻碍IRF3的SUMO化修饰，促进其降解。5.Nsp1α的赖氨酸位点对其阻碍HEK293T细胞内SUMO化修饰和抑制IFN-β启动子均具有负调控的作用。41 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华中农业大学2015届硕士研究生学位（毕业）论文致谢弹指一挥，三年的硕士研究生生活即将结束。经过三年严格的科研训练，我已褪去稚嫩，磨去棱角，剩下的是沉着和冷静，用成熟和稳重来迎接机会和挑战共存的职场。在此我要特别感谢我的导师肖少波教授。感谢导师对本论文的悉心指导和在实验过程中提出的建设性意见。切身体验了导师广阔的视野、敏锐的科学洞察力、执著的探索精神、兢兢业业的拼博精神、平易仁慈的学者风范。值此论文完成之际，向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢！感谢方六荣教授、曹罡教授、江云波副教授、罗锐副教授、王荡老师、杨芳老师对本课题给予的关心、支持和帮助，在此表示深深的感谢！他们悉心的教导和富有创新的思路与想法给予我无尽的启发，他们精心的点拨和热忱的鼓励给我无尽的动力。实验室团结友爱的氛围，相互协作、积极向上的精神，我将永远不能忘怀。感谢张欢、蔡开妹、段二珍、刘威、宋涛、安康、张若曦、赵付伟、曾松林、李莎、丁珍、井汇源等博士师兄师姐，感谢钟会娟、欧阳海平、欧阳潮、鲍鑫莹、雷莹莹、张玉娟、刘德志、蔡沂东、刘连增、施俊伟、马俊、董楠、何浩俊、朱心宇、黄梅瑾、于锦锦、高丽、吴蔚、言莹、孙妍、周艳荣、焦勇、罗静宜等硕士同学以及实验室的所有成员。他们的帮助和关怀让我有信心和勇气克服重重困难顺利完成课题，他们和我共同度过了研究生难忘的三年，愿我们的友谊长存。感谢我的家人，在这三年来所给予的关心和支持。他们的鼓励和信任是我前进最大的动力。最后，由衷的感谢所有给予我帮助的朋友们！尚敏2015年6月于狮子山南湖畔50