《肺结核病人dna低甲基化趋势与dna去甲基化酶的相关性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中＠聲３钟《版硕±研究生学位论文■北京协和医学院研究生院 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文学校代码：１００２３学号：Ｓ２０１２０３５００４硕±学位论文肺结核病人ＤＮＡ低甲基化庭势与ＤＮＡ去甲基化巧的相巧性研究所院：中国医学科学院病原生物学研究所姓名：张洪静指导教师：刘海鹰副研究员导师小组：刘海鹰副研巧员学科专业：免疫学研究方向；肺结核病人宿主基因甲基化影响因素的研究完成日期：２０１５．０５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文目录摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ３缩略減５６引言－、肺结核病面临新的挑战，宿主免疫应答能力与肺结核病的密切关联是战胜新挑战的ｎｍ７二、ＤＮＡ甲基化对宿主免疫系统起着重要调节作用１０Ｓ、课题姐在前期实验中发现肺结核病人呈现ＤＮＡ低甲基化趋势１１四、ＤＮＡ甲基化水平受ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶调控１２於１７第一部分１７活动性肺结核病人及健康人全血ＲＮＡ中ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶表达量的分ｔｆ１７一、实验材料和方法１７二、实验结果２３三、小结２５第二部分２６５４９－体外刺激Ａ、Ｂｅａｓ２Ｂ细胞探讨ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶对ＤＮＡ低甲基化趋势的影响２６一２６、实验材料和方法二、实验结果３３Ｈ、小结３８職３９一、肺结核病人ＤＮＡ去甲基化酶影响ＤＮＡ低甲基化趋势的相关性分析３９二、肺结核病人的低甲基化趋势可能通过増强免疫应答来影响疾病的发生发展４０Ｈ、ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶在同种刺激物刺激过的不同细胞中差异表达的趋势及种类不同４１ＩＳ论４２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文参考女献４３致谢４９独创性声明和学位论文版权使用授枚４８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文搞要肺结核病（ｐｕｌｍｏｎａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＰＴＢ）是由结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ一ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＡ）感染引起的，Ｍ种与机体细免疫应答密切相关的慢性感染性疾病，在肺结核病的发病过程中，细胞介导的抗原特异性免疫应答发挥着重要作用。当结核分枝杆菌感染机体时，抗原递呈细胞（ＡｎｔｉｇｅｎｒｅｓｅｎｔｉｎｃｅｌｌｓＡＰＣ）将结核分枝ｐｇ，－－ＣＤ８０双途径激活Ｔ淋己细胞杆菌抗原通过抗原ＭＨＣ分子复合物和ＣＤ２８，同时一－１２－－分泌正、正１等细胞因子，进步刺激免疫细胞释放效应分子如ＴＮＦａ等Ｗ杀灭结核分枝杆菌。ＤＮＡ甲基化修饰作为动植物体内一种重要的表观遗传修饰形式，参与免疫应答反应的调控，对肿瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的发生发展中起着重要的作用。而ＤＮＡ甲基化主要通过ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＡｍｅ也ｒａｎｓｆｅｒａｓ的ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ犯）上调ＤＮＡ甲基化水平ｙｈ，；通过ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）下调ＤＮＡ甲基化水平，两方面的调节共同维持ＤＮＡ甲基化水平的高低。课题组在前期通过全基因姐ＤＮＡ甲基化芯片研究发现，肺结核病患者宿主基因普遍呈低ＤＮＡ甲基化状态一ＤＮＡ甲基。为进步探索肺结核病人化调节的分子机制、研究肺结核病人ＤＮＡ低甲基化状态的影响因素，本研究在前期研巧结果的基础上，收集健康对照（Ｙ干扰素释放实验，即ＩＧＲＡ阴性）和活动性肺结核病人治Ｒｅａ－疗前全血ＲＮＡ，通过实时巧光定量ＰＣＲｌｔｉｍｅＰＣＲ方法，首先对参与ＤＮＡ甲（）基化下调的ＤＮＡ去甲基化酶的４个基因进行定量检测，Ｗ初步明确ＤＮＡ低甲基化状态与ＤＮＡ去甲基化酶之间的关系。结果发现，在肺结核病人组中，参与下调ＤＮＡ甲基化水平的４个基因（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）表达均显著升高（Ｐ值＜０．０５）。为了全面探讨肺结核病人ＤＮＡ低甲基化状态的影响因素，我们又对可Ｗ被动影响ＤＮＡ低甲基化状态的ＤＮＡ甲基化转移酶的３个基因（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）进行了定量检测，结果发现：只有ＤＮＭＴ１表达显著升高（Ｐ值＜０．０５）。一为了进步验证７ＲＶＡ甲５－，我们利用Ｈ３裂解抗原Ｗ及体外降低ＤＮ基化水平的氮杂胞嚼巧核巧（５ａｚａｃ－２Ｂ）刺激物刺激Ａ５４９、Ｂｅａｓ两种细胞系，并收集刺激后不同时间点细胞ＤＮＡ、ＲＮＡ。利用甲基化敏感性限制性分析（ＭＳＲＡ）对所收集ＤＮＡ样本进行分析，结果表明，拟７Ｒｖ抗原、５ａｚａｃ导致ＤＮＡ甲基化水平降低，ｅａ－－且刺激时间越长甲基化降低越明显。我们利用民ｌｔｉｍｅＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）方法对ＲＮＡ样本进行检测。结果显示，在两株细胞中，ＤＮＡ去甲基化酶随着刺激时间的延长逐渐升高，ＤＮＡ甲基化转移酶表达的时间动态图却无明显特异性表达。且结果中１ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文在刺激第四天Ａ５４９细胞中Ｈ３７ＲＶ刺激组ＤＮＡ去甲基化酶ＴＥＴ２、ＴＥＴ３上调，而在Ｂｅａｓ－２Ｂ中为取７Ｒｖ刺激组ＤＮＡ去甲基ＴＤＧ上化酶调，即ＤＮＡ去甲基化酶表达显著升高，这与临床检测结果相符；在Ａ５４９细胞Ｈ３７ＲＶ刺激组有两种ＤＮＡ甲３Ａ－基化转移酶ＤＮＭＴ、ＤＮＭＴ３Ｂ上调，而在Ｂｅａｓ２Ｂ细胞Ｈ３７ＲＶ刺激姐中表现为ＤＮＭＴ３Ａ下调。综上所述，我们发现无论是临床肺结核病人组还是体外细胞实验Ｈ３７ＲＶ刺激姐，ＤＮＡ甲基化水平呈下降趋势，而ＤＮＡ去甲基化酶差异性表达上调。并且在细胞刺激实验中，，随刺激时间越长，ＤＮＡ去甲基化酶表达逐渐升高而ＤＮＡ甲基化降低程度逐渐明显。总之，本研巧验证了肺结核病人ＤＮＡ甲基化呈现降低趋势，并初步回答了这种ＤＮＡ低甲基化趋势可能主要受ＤＮＡ去甲基化酶调控。，ＴＥＴＴＤＧ关键词：肺结核病ＤＮＡ甲基化，ＤＮＡ去甲基化，ＤＮＭＴｓｓ，，２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＰｕｌｍｏｎａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＰＴＢｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｄｉｓｅａｓｅｓｃａｕｓｅｄｂ（）ｙｙＭＭ＊ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ｔｈ，Ｉｔｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｏｄｙｓｃｅｌｌｓｉｍｍｕｎｅ（）ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＤｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆＰＴＢｔｈｅｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｏｎｓｅｌａｓａｎｉｍｏｒｔａｎｔｐ，ｐｐｙｐｒｏｌｅ．Ｉｎｔｈｅｒｏｃｅｓｓｏｆｍｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉｅｎｒｅｓｅｎｔｉｎｃｅｌｌｓｐｙｇｐｇＡＰＣｒｅｓｅｎｔｔｈｅａｎｔｉｅｎｏｆｍｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｂｄｏｕｂｌｅｗａｓｏｆＭＨＣ（）ｐｇｙｙｙＣＤ２８－ｍｏｌｅｃｕｌｅｓｃｏｍｐｌｅｘａｎｄＣＤ８０ｔｏＴｃｅｌｌｓｔｏａｃｔｉｖａｔｅｔｈｅｍ．Ａｎｄａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅＡＰＣｓｓｅｃｒｅｔＩＬ－１２Ｌ－１、Ｉａｎｄｓｏｏｎｉｎｏｒｄｅｒ化ｆｉｉｒｔｈｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｅｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌｓ化－ｒｅｌｅａｓｅｔｈｅｅｆｌＢｃｉｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒＴＮＦａｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｋｉｌｌｔｈｅｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓａｋｉｎｄｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｍｏｆｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍａｎｙｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｅｉｔｈｅｒｉｎａｎｉｍａｌｓｏｒｍｐｌａｎｔｓ．化ｈａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｒｅａｌｉｚｅｓｉｔｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｔｈｒｏｕｈｒａｉｓｉｎａｎｄｌｏｗｅｒｉｎｉｔｓｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌａｎｄｓｕｂｓｅｕｅｎｔｌｇｇｇｙｑｙａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｉｓｍａｉｎｌｔｈｒｏｕｈＤＮＡｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｇｐｙｙｇｙｍａｉｎｌｉｎｃｌｕｄｉｎＤＮＭＴｌＤＮＭＴ３ＡａｎｄＤＮＭＴ３Ｂ化ｒａｉ化ｉｔｓＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎ（ｙｇ，）ｙｌｅｖｅｌ，ａｎｄｉｔｉｓｍａｉｎｌｙｔｈｒｏｕｈＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｓｅｓｍａｉｎｌｉｎｃｌｕｄｉｎｇＴＥＴ１％ＴＥＴ２＞ＴＥＴ３＞ｇｙ（ｙＴＤＧｔｏｌｏｗｅｒｉｔｓｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ．ＴｈｅｔｗｏａｓｅｃｔｓｏｆｒｅｕｌａｔｉｏｎＵ）ｅｔｈｅｒｌｍａｉｎｔａｉｎ）ｙｐｇｇｙｔｈｅｅｖｅｏｆＤＮＡｍｅｔｈａｔｏｎｌｌｙｌｉ．Ｉｎｏｕｒｅａｒｌｙｗｏｒｋ，ｗｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｌｌｕｍｉｎａｔｅ化ａｔＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏ凸ｌｅｖｅｌｉｓｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｅｎｏｍｅＤＮＡｇｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃｈｉｐ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｄｊｕｓｔｍｅｎｔａｎｄｆｉｎｄｏｕｔｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓｏｆｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｔｒｅｎｄ，ｏ打ｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｓｅａｒｃｈｆｉｎｄｉｎｇｓｏｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｆｉｒｓｔｌｃｏｌｌｅｃｔｈｅａｌｔｈｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｙｙｖｅ＇ＩＧＲＡｎｅｇｔｉａｎｄａｃｔｉｖｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｌｅｂｌｏｏｄＫＮＡＵ）ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌ（）ｙｄｅｔｅｃｔｆｏｕｒｅｎｅｓｏｆＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｓｅｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｆｏｒｗａｒｄｌｄｏｗｎｒｅｕｌａｔｅｔｈｅＤＮＡｇｙｙｇｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｍａｉｎｌｉｎｃｌｕｄｉｎＴＥＴ１？ＴＥＴ２、ＴＥＴ３ａｎｄＴＤＧｂｍｅａｎｓｏｆ（ｙｇ）ｙＲｅａ－ｗｅｌｔｉｍｅＰＣ民ｍｅｔｈｏｄ．虹ｔｈｉｓｓｅｃｔｉｏｎｕｒｏｓｅｌｗａｎｔ化Ｕｌｕｓｔｒａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ，ｐｐｙｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＤＮＡ＾ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｏｉＡ＊ｄｅｍｃｔｈｙｌａｓ的．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔａｌｌｔｈｅｆｏｕｒｇｅｎｅｓ（ＴＥＴＫＴＥＴ２，ＴＥＴ３，ＴＤＧ，ＤＮＭＴｌ）ｔｈａｔｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌａｐｐｅａｒｕｐｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅａｃｔｉｖｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓ＜０．０５．虹ｏｒｄｅｒ化（ｐ）ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｅｆｅｃｔｏｒｓｏｆｌｏｗＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏ。ｔｒｅｎｄ，ｗｅａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｈｒｅｅｍｅｍｂｅｒｓｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓ，ｉｎｔｈｅＴＢｇｒｏｕｐ，ｏｎｌｙＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ３ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文ＩＤＮＭＴ１ｉｓｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｕｅｘｒｅｓｓｅｄ＜０．０５？虹ｏｒｄｅｒ化ｆｉｉｒｔｈｅｒｖａｌｉｄａｔｅＯＵＴ（）ｙｐｐ（ｐ）ｆｉｎｄｉｎｇｓ，ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｗｅｕｓｅＨ３７Ｒｖｃｒａｃｋｉｎｇａｎｔｉｇｅｎａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔｉｍｕｌｕｓ（５ａｚａｃ）化ｓ－ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｍａｋｅｔｈｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｄｒｏｐｔｉｍｕｌａｔｅＡ５４９Ｂｅａｓ２ｂｔｗｏｃｅｌｌ，ｌｉｎｅｓｔｏｃｏｎｄｕｃｔｔｈｅｖａｌｉｄａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｎｄｔｈｅｎｗｅｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｃｅｌｌＤＮＡＲＮＡｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｉｎｔｓ．ＵｉｓｅｔｈｅＤＮＡｓａｍｌｅｓ！；〇ｒｏｃｅｓｓｍｅｔｈｌａｔｉｏ打，ｐｐｐｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＳＲＡ）ｔｅｓｔｉｎｏｒｄｅｒ！：〇ｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌＭＳＲＡｓｈｏｗｓ－ａｆｔｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅＨ３７Ｒｖａｎｔｉｇｅ打ａｎｄ５犯ａｃｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔｉｍｕｌｕｓｃａｎｃａｕｓｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅＰｓｄｒｏｐａｓｔｈｅｇｅｎｏｍｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃｈｉｐｓｈｏｗｓ，ａｎｄ化ｄｒｏｐｓｍｏｒｅａｓ也ｅｔｉｍｅｏｅｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒ化ｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＡｇｐｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓａｎｄＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｗｅｍａｋｅｕｓｅｏｆｔｈｅＲＮＡｓａｍｌｅｓ化化Ｓｔ化ｅ，ｐ－ｅｎｅｓｂ－ｇｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｓｍｅｎｔｉｏｎｅｄｂｅｆｏｒｅ．ＴｈｅＲｅａｌｔｉｍｅＰＣ反ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｒｅｆｌｅｃｔｔｈａｔｔｈｅＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓａｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓｔｈｅｔｉｍｅｇｒｏｗｓｉｎｔｈｅ－－化Ｈ３７ＲｖｓｔｉｒｏｕｓｏｆｂｏＡ５４９ａｎｄＢｅａｓ２Ｂ．ＡｎｄｏｎｔｈｅｆｏｕｒｔｈｄａＴＥＴ２ａｎｄＴＥＴ３ａｒｅｇｐｙ，－－ｔｄｉｆｅｒｅ打讨ｙｕｒｅｕｌａｉｏ打ｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅＨ３７ＲｖｓｔｉｒｏｕｏｆＡ５４９ｃｅｌｌＵｎｅ．ＡｎｄＴＤＧｉｓｐｇｐｇｐ－ｄｉｆｅｒｅｎ过Ｈ３ＲｖｔＢ－２ＢｃｅＡｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅ７ｓｉｒｏｕｏｆｅａｓｌｌｌｉｎｅ．ｎｄｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｏｆｇｐｐＤＮＭＴ３Ａ－、ＤＮＭＴ犯ｉｓｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅＨ３７艮ｖｓｔｉｒｏｕｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｌｉｎｅ．ｇｐ－Ｂｕ－ｔＤＮＭＴ３Ａｉｓｄｉｆｅｒｅｎｔｌｙｄｏｗｎｅ邓ｒ的ｓｉｏｎｅｄｉｎｔｈｅＨ３７ＲｖｓｔｉｇｒｏｕｐｏｆＳｅａｓ２Ｂｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓｏｎｔｈｅｄｅｃｌｉｎｅａｓｔｈｅＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓａｒｅ－ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｂｏｔｈａｃｔｉｖｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｔｉｅｎｔｓａｎｄＨ３７Ｒｖｓｔｉｃｅｌｌｓ．ＡｎｄａｓｐｐｔｈｅｔｉｍｅｏｅｓＣｏｎｃｅｒｎｉｎｔｈｅＤＮＡｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｇ，ｇｙ，ｐｏｆＤＮＡｍｅ化ｌａｔｉｏｎｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｉｓｎｏｔｓｅｃｉｆｉｃ．Ｉｎａｗｏｒｄａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｙｐ，ｇｗｅｆｉｎａｌｌｙａｎｓｗｅｒｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｑｕｅｓｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｔｉｖｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅａｒｅｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｏ巧ｌｏｗＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏ打ｔｒｅｎｄ．ＴｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｃｈａｎｇｅｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｔｉｅｎｔｓｉｓｃｌｏｓｅｌｐｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ．ＡｎｄｉｔｉｓｔｈｅｃｈｉｅｆｅｎｚｙｍｅｓｔｏｄｒｏｐｔｈｅｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏ打ｌｅｖｅｌ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｕｌｍｏｎａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ＤＮＭＴｓ，ＴＥＴｓＴＤＧ，４ 中国医学科学晓北京协和医学院硕±学位论文缩ＩＩ词巧缩写英文名務中文名巧５ａｚａｃ５－ａｚａｃｎｎｅ５－ｙｔｉｉ氮杂胞瞎惦核巧５ｈｃ５－ｈｒｏｘｔｈｉｍｙｄｙｍｅｙｌｃｙｔｏｓｎｅ５替甲基胞喀惦Ａ５４９Ａ５４９人肺腺癌细胞株ＡＰＣａｎ－ｔｉｅｎｒｅｓｅｎｇｐｔｉｎｇｃｅｌｌ抗原递呈细胞Ｂｅａｓ－２ＢＢｅａｓ－２Ｂ人支气管上皮细胞株ＣＦＰ－１０ＯｋＤａｃｕｕｒｅｒａｅｎｌＯＫＤａｌｌｔｆｉｌｔｔａｎｔｉｇｅ培养滤过蛋白抗原ＣＸＣＵ２－－ｔｈｅｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ１基质细胞衍生因子ＣＸＣＲ４ＣＸＣＬ１２ｒｅｃｅｐｔｏｒ４ＣＸＣＬ１２受体ＤＮＭＴｌＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ１ＤＮＡ甲基化转移酶１ＤＮＭＴ３ＡＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ３ＡＤＮＡ甲基化转移酶３ＡＤＮＭＴ３ＢＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ３ＢＤＮＡ甲基化转移酶３ＢＤＮＭＴａｓｅｓＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓｅｎｚｙｍｅｓＤＮＡ甲基化转移酶ＤＮＭＴｓＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓＤＮＡ甲基化转移酶ＥＬＩＥ－ｎｋｅｄＩｍｍｓＳＰＯＴｎｚｙｍｅｌｉｕｎｏｐｏｔＡｓｓ巧酶联免疫斑点检测ＥＳＡＴ－Ｄａ６６ｋｅａｒｌｓｅｃｒｅｔｏｒａｎｔｉｇｅｎｉｃｔａｒｅｔ６ｙｋＤａ早ｙｇ期分泌抗原ＧＯＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ基因本体论－－ＩＦＮＩｎｅｒｆｅｒｏｎａｍｍａ－ｙｔｇ干扰素ｙＩＬ－２ｎ－－／１０／１２Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ２／１０／１２白介素２／１０／１２－－ＩＰ１０Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｎｄｕｃｌｅｉｎ－１１ｉｉｂｒｏｔｅ０干扰素诱导蛋白０ｐＬＤＮＤｒａｎｎｍｎｏｄｅｉｉｇｌｙｐｈ引流淋己结Ｍ．ｔｂＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ结核分枝杆菌－ＭＤＲｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ多耐药结核菌ＭＨＣＭａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｎ＾ｌｅｘ主要组织相容性复合物ＭＳＲＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ甲基化敏感性限制性分祈ＰＴＢＰｕｍｏｎａｒｕｂｅｒｃｕｌｙｔｌｏｓｉｓ肺结核病ＰＲＲｐａｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ模式识别受体ＲＡＲｈｅｕｍａｔｏｉｄＡｒｔｈｒｉｔｉ风湿性关节炎ＲＴ－－ＰＣＲＲｅａＰｌｔｉｍｅＣＲ实时萊光定量ＰＣ民－－－ＳＡＨＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅＳ腺巧同型半脱氨酸ＳＡＳ－Ａｄｅｎｏｓｍ－ＭｙｌｅｔｈｉｏｎｉｎｅＳ腺昔甲硫氨酸ＴＢＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ结核病ＴＣＲＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒＴ细胞受体ＴＤＧｍｎｅＤＮＡｔｈｙｉｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ胸腺喀赌糖基酶—ＴＥＴＴ－１－ｌｅｎｅｌｅｖｅｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ十Ｈ染色体异位酶１￣—ＴＥＴ２Ｔｅｎ－ｒａｎｓｃａｎｅｎｚ－ｅｍｅ２２ｌｅｖｅｎｔｌｏｔｉｏ十ｙｉ染色体弄位酶—ＴＥＴ３Ｔｅｎ－ｅｍ－ｌｅｖｅｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｅｎｚｙｅ３十Ｈ染色体异位酶３—ＴＥＴ－ｅ－ｓＴｅｎｌｅｖｅｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ十Ｈ染色体异位酶ＴＮＦ－ａＴｕｍｏ－－ｒｉｆｔｒｌｈａ肿瘤坏死因子ｎｅｃｒｏｓｓａｃｏａｐａＶＤＲｖｉｔａｍｉｎＤｒｅｃｅｐｔｏｒ维生素Ｄ受体５ 中国医学科学院北京协和医学院硕女学位论文引言ＴｕｂＴＢ‘结核病（ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ｃｏ６ａｃｔｅｎＭ／ｗｆｔ／ｂｅｒｃｗ／ｏｓｋ，，是由结核分枝杆菌缔Ｍ沾一）引起的种慢性感染性疾病，主要感染肺部并引起Ｗ肺部肉芽肿为主要病理一特征的疾病（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＰＴＢ）。长期Ｗ来，结核病直严重危害人类健康。据ＷＨＯ统计显示，全球现有１／３（约２０亿）的人群感染了结核病，其中１０％（２０００万）可发展为原发性结核病（Ｐｒｉｍａｒｙｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），而近９０％的人体内可长期携带结核分枝巧菌成为潜伏感染者（ＬａｔｅｎｔｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓＬＴＢＩ）。近年来，，由于人口迁移、艾滋病等共感染化及耐药结核病的出现等，结核病患者数量不断增Ｗ力口，每年新发生约９００万病人，每年死亡人数高达３００万。中国是世界上结核疫一情非常严重的国家之，发病率排名世界第二５，占全球所有结核病例的１％左右。一人类对结核病的认识与研究己有个世纪之久，虽然人们在结核病领域有相当的认识与了解且有一，并定预防、诊断Ｗ及治疗手段，但是人们对结核病的认识还不够详细一、彻底，而且防、诊、治各方面也有定的局限与困难。所Ｗ面对结核病疫情一的严峻挑战，人们急需进步深入理解结核病的发病机制和免疫保护机制，这样才。能更加有效的防止结核分枝杆菌的感染，阻止结核病的发病就目前形势而言，对于快速诊断、新型治疗药物的研究与开发更是迫在眉睫。而近年来，联合应用化学治疗药物和免疫治疗更是逐渐成为研究热点Ｐ’。而结核病免疫保护和免疫调节机制不清是限制新型诊断和治疗手段研发的瓶颈问题。众所周知，宿主免疫系统对肺结核病的发展有着重要影响，虽然对宿主的免疫保护机制已经研究了近一个世纪之久，但是仍有很多免疫保护反应的特点都不清楚Ｗ。在结核分枝杆菌感染的过程中，抗原递呈细胞（ＡＰＣ）将细菌抗原递呈给Ｔ细，并产生免疫应答，，天胞，清除抗原。近年来随着各项研究的不断推进然免疫反一Ｗ步认识，研究表明应在清除结核分枝杆菌方面的作用被进，天然免疫中各种、ＮＫ、细胞成分，如单核细胞、巨嗟细胞、中性粒细胞细胞树突状细胞等，在结核分枝杆菌感染的早期及后期都发挥着重要作用。研巧显示，单核细胞、巨峰细胞、中性粒细胞、树突状细胞在肺部肉芽肿形成及后续结核分枝杆菌的清除方面起着重要作用，，而ＮＫ细胞可Ｗ导致ＣＤ８＋和ＣＤ４＋适应免疫应答对杀灭结核分枝杆菌起着重要作用一。虽然些研究成果不断充实着这个领域，Ｔ细胞介导的免疫应答仍然Ｗ是人们关注的重点。宿主免疫系统发挥作用受多种分子机制调控，主要包括信号通路与转录因子ＷｉｌＲＷｔｌ顺式作用元件、ｍｉＲＮＡ调控，表观遗传修饰等。其中，ＤＮＡ甲基化修饰作为动植物体内一种重要的表观遗传修饰形式，在调控基因表达、维持基因组的稳定６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文ｌｔｔｗ性等方面发挥重要的生物学作用。根据文献报道，ＤＮＡ甲基化修饰的催化类型多种多样，但在真核生物体内ＤＮＡ甲基化修饰主要是在ＤＮＡ的ＣｐＧ二核巧胞喀巧的第五位碳原子上面加上或去掉甲ｆＷ基。近年来，随着ＤＮＡ甲基化的研究技术不断成熟，生物学功能不断被了解，ＤＮＡ甲基化在成熟个体疾病发生发展中所发挥的重要作用不断被揭示。ＤＮＡ甲基化水平的改变会引起后续基因表达的改变从而影响疾病的发生与进展，现已表明，ＤＮＡ甲基化修饰与多种疾病密切相关。目前硏究最多、而且相对来说研究也较为成熟的，就是ＤＮＡ甲基化在肿瘤性疾病当中的作用，许多证据表明ＤＮＡ甲基化影ｉｗｓｔｉ响肿瘤的发生、进展及预后等多个方面。除了肿瘤性疾病Ｗ外，ＤＮＡ甲基化、与其他多种疾病的关系，也不断成为研究热点。例如，在感染性疾病自身免疫性ＤＮＡ甲一疾病。、慢性病、血液病等各种疾病中基化都发挥着重要作用值得提ＤＮＡ甲一的是：在前述多种疾病中，基化般是通过影响免疫细胞的分化Ｗ及调控免疫因子的表达等来促进或抑制疾病的进展的。一、肺结核病面临新的挑脈宿主免疫应答能力与肺结核病的密切关联是战胜新挑战的契机＂＂近些年来，随着结核病不断出现新的挑战，结核病似乎又回到不治之症年代。而造成这种死灰复燃的征象的主要原因是人群中感染结核分枝杆菌的人口基数非常之大，每年出现的结核病新发病例较多，死亡人口基数大；而且随着结核分Ｐ０１枝杆菌多耐药性菌株（ＭＤＲ）的增多、艾滋病的不断流行及结核分枝杆菌潜伏感染的威胁，结核病对人类健康产尘的影响越来越重。在结核分枝杆菌多耐药性菌株（ＭＤＲ）方面现在世界上约有５０００万人感染结核分枝杆菌多耐药性结核菌株一（ＭＤＲ），在些地区超过１０％的结核病例为多耐药性结核菌株。而在中国新增病例的５％、所有结核病例的１／４Ｗ上，被确定为结核分枝杆菌多耐药性结核菌株一（ＭＤＲ）。最近的项研巧表明，在ＨＩＶ血清阴性而结核分枝杆菌细茵培养及疲涂片阳性的１６６２例结核病患者当中，有％５例（５－巧６例属于８．１％）患者为耐药结核病ＤＲＴ巧，而在这些耐药结核病患者当中有（Ｐ３１Ｒ－ＴＢ６０７％多耐药结核病（ＭＤ，占耐药结核病的．，目前的两种或多种主要疗法都不能治愈该病。另外在艾滋病的威胁方面，ＨＩＶ和结核分枝杆菌双重感染是使全球结核病回４２一Ｐ’３。，１／３ＩＤＳＨＩＶ（＋）和结核升的重要原因之据统计的Ａ病人死于结核病，ＩＶ分枝杆菌两者相互影响，相互促进疾病发展，因此Ｈ感染是目前己知的结核病的一ＰＷ最大危险因素之。众所周知，在感染了结核分枝杆菌的２０亿人群，大约只有１０％发病，剩余９０％７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文可能终生携带结核分枝杆菌一大。结核分枝杆菌的潜伏感染己成为结核病防治中的隐患。在潜伏感染者体内，结核分枝杆茜的复制变得非常缓慢或已经休眠，即结核分枝杆菌己适应了宿主的免疫环境，从快速生长状态转变到非复制的缓慢生长状。态，抗原表达谱较快速生长状态时有显著差异在目前的结核病化学治疗过程中，抗结核药物杀死了快速生长的结核分枝杆菌，却无法彻底清除生长缓慢的细菌，也造成部分细菌在宿主体内残留。送些细菌生长缓慢或处于休眠状态，数目极少，产生的抗原量少，导致的炎症反应小，激起细胞免疫的能力有限，因此宿主免疫系统ｓ一ｐｉ无法将其清除这成为结核分枝杆菌反复感染的大威胁。一面临系列新的挑战，人类对肺结核病常规的预防、诊断、治疗措施逐渐捉襟一见肘。２０世纪初问世的卡介苗（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｅＧｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）是目前唯被承认的结核病疫苗，而且己经被广泛使用，其在对儿童结核性脑膜炎的预防起到了重要ｐｓｗｉ’作用，然而卡介苗对不同人群的保护效果差异很大，尤其对成人肺结核病的保护作用存在较大争议ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎｓｋｉｎｔｅｓｔ，ＴＳＴ）虽然广泛用于。结核菌素皮肤试验（临床诊断，但其特异性较差，其结果容易受到环境中非结核分枝杆菌及卡介苗的影Ｐ０１响。随着ＭＤＲ出现目前缺乏针对耐药结核病有效的治疗药物。，ＰＵ为寻求新型预防、诊断与治巧手段，结核病研究者们该朝着什么样的方向前３２［］？由于肺结核病的发生发展与宿主免疫应答能力密切相关进呢，而且结核病出现的新挑战又无不与免疫密切相关。我们认为肺结核病与免疫系统的密切关联仍然是一ＰＳＩ解决系列问题的契机所在。肺结核病的发生发展与宿主免疫应答能力密切相关。健康人在与活动性肺结核病人密切接触后，可因吸入含有结核分枝杆菌的气溶胶而被感染，吸入肺泡的结核分枝杆菌直接被特定的模式识别受体（ｐａｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＲＲｓ）识别，或者在被某些可溶性的宿主因子包被后绑定到巨峰细胞和树突细胞相应的受体上。被感染后的巨随细胞及树突细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌＤＣ），从外周血移至肺实质和引流淋己结（ｄｒａｉｎｉｎｇｌｙｍｐｈｎｏｄｅ，ＬＤＮ）而后经抗原递呈激活结核抗原特异性的Ｔ淋己细胞。这些淋己细胞连同巨幢细胞及结核分枝杆苗共同构成肺部结核性肉芽肿，防止一步复制和扩散结核分枝杆菌的进。此时宿主体内有结核分枝杆菌存在，但无任何结核病的临床体症，称为结核分枝杆菌潜伏感染者。若机体免疫反应不能再抑制肉芽肿内结核分枝杆菌的生长，导致肉芽肿坏死并引起严重的肺损害和结核分枝杆菌ｔＭｌ的扩散，则称为活动性肺结核。在结核分枝杆菌感染机体的过程当中，无论是固有免疫应答还是适应性免疫应答都对其防护、清除、抵御起着重要作用。从结核分枝杆菌侵入人体到被细胞清除，固有免疫细胞如巨睡细胞及树突状细胞细（ＤＣ）、中性粒细胞发挥了重要的作用。人体经呼吸道感染结核分枝杆菌后，固有免疫细胞通过模式识别受体（ＰＲＲ）识別结核分枝杆菌细胞壁中的化聚糖及脂多８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文糖等抗原成分。将其吞礎并诱导自身的调亡，Ｗ限制细菌的繁殖、扩散。在识别结核分枝杆菌抗原的过程中，参与其中的最重要的模式识别受体是Ｔｏｌｌ样受体ａ－ｔＲ〇ｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｐｏｒｓＴＬｓ）。在天然免疫抗结核免疫应答过程中，ＴＬＲ２、ＴＬＲ４和，ＰｗｓｉＴＬＲ９被认为发挥重要作用。固有免疫细胞识别并吞唆抗原的过程最初在用Ｈ３７Ｒａ等减毒菌株感染肺泡巨隨细胞后发现一。然而多篇文献报道，这功能在巨隧Ｐ９ＷａｒＲｅｍｏ＞ｌｄ等人最近报道细胞感染毒性菌株后则会受到限制。Ｂ沈，，巨隨细胞在感染一＂＂结核分枝杆菌后通过种被称为ｅｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ的过程快速的被未感染细菌。的巨嗤细胞吞嗤，从而到达杀伤细菌的效果中性粒细胞在抗结核免疫中具有两面性。在活动性肺结核病人中，外周血中中性粒细胞的数量増加与呼吸衰竭和病人死Ｗ’４３亡率的增加具有相关性。在固有免疫应答过程中，中性粒细胞的作用也非常重一要，中性粒细胞能够吞嗟结核分枝杆菌成为结核肉芽肿的个姐成成分，同时它也＋［４３１能促进抗原特异性的ＣＤ４Ｔ细胞激活和增强ＤＣ细胞的递呈功能。中性粒细胞也一是肺部正－１０的主要产生者之树突状细胞是主要的抗原递呈细胞－（ａｎｔｉｅｎｒｅｓｅｎｔｉｎｃｅｌｌＡＰＣ），吞峰细菌后能够激活Ｔ细胞并引发适应性免疫ｇｐｇ，。控制结核分枝杆菌的感染不仅需要天然免疫中各种免疫细胞的活化和作用，更需要适应性免疫中ＣＤ４、＼ＣＤ８叮和你ｒ淋己细胞的作用。效应Ｔ细胞的激活需要有活的结核分枝杆菌扩散并由树突状细胞和其他递呈细胞迁移至引流淋己结进行抗原呈递。而后在引流淋巴结内，抗原特异性的Ｔ细胞增殖、分化并迁移至肺部４一ｔ９４－的病灶区域发挥相应的免疫学效应。这过程大约需要１１７天的时间。ＥＦＮ－－被激活的£０４寸淋己细胞能够产生多种细胞因子（如ｙ、正２等）调节免疫功能；ＣＤ８寸和ｙＳＴ淋己细胞则能够释放颗粒酶和穿孔素等直接杀伤感染细胞和结核分枝杆菌，同时通过Ｆａｓ／ＦａｓＬ途径诱导飽细胞调亡Ｔ细胞。外周血中的被结核－－－－分枝杆菌抗原（如ＥＳＡＴ６、ＣＦＰ１０等）激活后分泌ＩＦＮＹ、ＴＮＦａ等细胞因子。另夕ｈｙＳＴ淋己细跑在细胞免疫抗结核分枝杆菌的感染中也有着重要的作用。抑Ｔ淋一－圧Ｎ－己细胞是正１７和Ｙ的主要分泌者之，能够有效的调节前炎症反应和趋化因ｆＷ子的分泌。近年来有研究发现，相对于健康对照，活动性肺结核病人体内的ｗｔｉＶｙ９／Ｖ泌Ｔ淋巴细胞显著减少。但它对天然免疫或适应性免疫的具体作用机制尚未被完全明确。Ｂ淋己细胞被激活后主要产生抗体，可Ｗ对多种细菌发挥作用。由于结核分枝杆菌是胞内细菌一直认为Ｂ细胞在抗结核分枝杆菌的感染中作用并不，所１＾＾长期来是很重要。但随着研巧的不断深入，Ｂ细胞在抗结核病免疫中的作用也越来越受到重视。研巧者在小鼠研巧模型中发现，感染结核分枝杆菌后的小鼠肺肉芽肿中有大４８Ｂｆ３量细胞的存在。非人类的灵长动物在感染结核分枝杆菌后其肉芽肿内也发现了４９ｔｌ类似的现象。同时也有研巧表明活动性肺结核病人的肺组织内也观察到了大量滤泡样Ｂ细胞的聚集。这些研究都表明，Ｂ淋己细胞及其抗体在病灶区局部免疫的防９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文御和调节中可能同样发挥重要作用，，然而其确切的免疫学效应特别是在结核病中的作用有待进一步的研究。综上所述，目前在肺结核病领域的形势非常严峻，面临的挑战非常多，我们亟需从预防、诊断、治疗等各个方面不断突破，Ｗ期待从多个方面来应对这些挑战、，解决这些问题，而由于肺结核病与而宿主免疫系统关联密切宿主的免疫应答能力１＾直接影响疾病的发生与发展，所，要想攻克肺结核病这个难题，宿主的免疫系统是我们研巧的出发点。这些新的方法包括不断研巧、开发新的疫苗，寻求新的标志物分子，开辟新型免疫治疗手段等等。但是不管是哪个方面，都应Ｗ更加明确的宿主免疫保护机制为研究重点。二、ＤＮＡ甲基化对宿主免疫系统起着重要调节作用ＤＮＡ甲基化是一种非常重要的调节机制免疫系统。目前，己有多项研究表明ＤＮＡ甲基化可（＾１通过调节机体免疫系统来影响多种疾病的发生发展从大的方面来讲，目前研巧主要从两个方面，即ＤＮＡ甲基化参与调控免疫细胞的分化和ＤＮＡ甲基化参与调控免疫因子的表达证实了ＤＮＡ甲基化参与免疫系统的调节。详细说来，ＤＮＡ甲基化主要是通过甲基化水平上调或下调的方式来影响基因的表达Ｍｔｌ。，进而影响免疫细胞的分化或者是功能蛋白的表法另外有研究证明，ＤＮＡ甲基化水平的改变可Ｗ通过多种方式，例如可Ｗ通过调一些分子节细胞表面的（如ＭＨＣ分子、ＴＬＲ）的表达来调控Ｔ细胞的分化。而且ＤＮＡ甲基化可Ｗ影响巨隨细胞的活化。在很多的疾病研究中也发现，ＤＮＡ甲基化可Ｗ通过调控免疫系统功能蛋白的表达进而影响疾病的发生发展，例如在前列腺癌中为了确定甲基化介导调节基因表达，改变、影响生物通路，继而影响疾病的发生［５５］，研巧者分析了由１２个前列腺癌样本及口个周围正常组织配对组成的样本池的１４４９５个基因中２７５７８个ＣｐＧ位点，发现前列腺癌组织中在所涉及的１０４３个差异性基因当中有９７２个ＣｐＧ位点的甲基化水平升高；相反地，只有２０９个位点甲基化水平差异性降低，而这种基因组基因特异性的高甲基化模式在其他多种癌症模型中也被发现。对这些甲基化模式发生改变的基因进斤通路分巧发现，在前列腺癌发一－－生中，与癌症相关的系列基因活性受到ＴＮＦａ的调控。结果发现与ＴＮＦａ依赖性调亡有关的细胞程序的表观遗传调节异常可能密切参与前列腺癌的发生。在乳腺癌中，ＸＣＲ４启动子区域甲基化水Ｒ４表达上ＸＣＬ１２随着Ｃ平的降低ＣＸＣ调，而随着Ｃ启动子区域甲基化水平升高，ＣＸＣＬ１２表达下调１６％。而无论是Ｗ上哪种表观遗［，］传改变，进而影响疾病的分期、大小、组织型分级、，都影响着相应蛋白的表达水平一淋己结转移及病人的预后及存活率等１６。另外在些自身免疫病Ｗ及慢性病当中，［］也证实了ＤＮＡ甲基化的重要化例如在乙型肝炎当中－，ＤＮＡ甲基化通过影响ＩＦＮ１０ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄学位论文５７在风湿性免疫病（如风湿性关节，ＲｈｅｕｍａｔｏＹ的表达来影响疾病的进展ｉｄ［］；ａｒｔｈｒｉｔｉ，ＲＡ）中，ＤＮＡ甲基化影响ＣＸ化口的表达进而影响疾病的进展［５８；值得］我们关注的是在肺结核病领域对ＤＮＡ甲基化的研巧也越来越多，已有的研究是ＤＮＡ甲基化水平影响肺结核病人体内某些天然免疫基因及维生素Ｄ受体（ＶＤＲ）的表达５９。［］Ｈ、课题组在前期实验中发现肺结核病人呈现ＤＮＡ低甲基化趋势我们前期研究结核病患者ＤＮＡ甲基化水平呈低甲基化状态。本研究主要集中在研究临床肺结核病人与健康人全基因组ＤＮＡ的甲基化水平。对两组人群（活动性肺结核病人及健康人）全基因组所有甲基化位点分析、总结，，我们发现在ＤＮＡ甲基化出现差异性改变的所有位点中，健康人中大部分位点甲基化水平高于活动性结核病人，即肺结核病人呈现ＤＮＡ低甲基趋势（见图１）。并且对这些差异位点所一涉及的基因进行聚类分析发现，这些基因有很大部分落在了抗原呈递及－－２ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｍｍａ（ＩＦＮｙ）信号介导的通路上（见图）。ｇＡＢ■１ＨｙｐｅｒＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ０ＴＢｏＨＤ圓ＨｙｐｏＭｅｔｈｙｌ如ｏｎ１．０５００。物／］］°°０＾４００－０〇〇ｌｂＩＩ：：。。ｚ＿Ｉ０．０ｉ—ａｎｏ＾Ｈ；！＿Ｄｔｔ＿＿■■■＿ｉｆｆｅｒｅｎｉａｌｌｙｎｉＥｌｌｉｌａｅｄｒｅｉｏｎｌｏｄｙｇ〇！图１；ＴＢ组ＤＮＡ低甲基化趋势Ａ组：两组人群差异性改变的ＣｐＧ位点的甲基化水平变化情况，Ｂ姐比于：相ＨＤ，ＴＢ组出现高甲基化和低甲基化的位点数目。１１ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄？学位论文ＧＯ－Ｈ〇ｇ２ＰＡｎａ）ｌｙｓｉｓ０ｉ？４６８１０１２ｉｎｅｒｆｅｒｏｎ．ａｍｍａ．ｆｎｅｄｌａｔｅ＇ｒｕｌｎｔｔｇｄｉｇｉｇｐａｈｗａｙｔｔｕｒｔｎ£ｎｕｃｌｅｏｉｄｇｃａａｂｏｌｉｃｒｏｃｅｓｓｐｐ＂ｉｒｎｉｌａｌｏｎｏｆｔａｎｙａｉｏｇｔｔｎ’ｇａａ－ｔｎｔｉｗｒｅｇｕｌＵａｎｏｆ）ｎｔ，ｒｌｅｕｋｊｎ２ｓｅｃｒｅｉｏｏｓｉｉｖｅｒｅｕｌａｉｏｎｏｆｒｔｅｌｏｓｉｓ■ｐｔｇｔｈｏｔｎｓｈｏｒｌａｉｏ＾ｐｐｙ＇ＪｔＩｒｅｇｕｌａｉｏｎｏｆｕｌｃｌｕｍｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ二ｎｅａｖｅｒｅｕｌａｉｏｎｏａｘｏｎｅｘｎｓｏｎＨｇｔｉｇｔｆ化ｉｔｎｅｒｖｏｕｓｓｓｔｅｍｄｅｖｅｌｏｍｅｎ巧ｙｐｄｅｃｌｉｏｎｏｆｂｉｏ＂【ｓｉｍｕｌｕｓ３Ｗｔｂｔｈｔｔｃ，＂ｕｆｒｅｓｏｎｓｅｏｃａｒｂｏｄｒａｅｓｉｍｕｌｕｓｐｙｔｔＩｎｔｒｉｎｓｉｃｊｐｏｐｏｉｃ＾ｉｇｔｉＡｌｉｎｇａｔｈｗａｐｙ？ｎｔｅｎｒｏｃ巧ｓｎａｎｒｅｓｅｔ。ｌｇｐｉｇ。ｐｎ。＂口ｎｅａｔｉｖｅｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆａｘｏｎｏｅｎｅｓｉｓｇｇｇｎａｃｅａｉｔｔｉｔｒｌｕｌｒｓｇｎａｌｒａｎｓｄｕｃｏｉｎｅｔ＇ｉｐｐｉｄｙｌＳｅｎｎｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｏｎｐｐｙ）ｉｔｌＮｔｉｎｉｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＾＾ｍｉ＾ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＾ｍ｜ｏｅｎｐｏｓｐｈｏｒｖｌａｏｔｔｉｔｉＭＨ［？ｒｔｉｇｅｎｒｏｃｅｓｓｉｎａｎｄｒｅｓｅｎｔａｉｏｎｏｆ，１（〇，。〇。＆ｅｐｄｅ．ｎｅｎｖｉａ．ｐｇｐ８ｐｇｅｔａｌｎｔｆｌｉｓｂｉｓｈｍｅｏｃｅｌｏｂｒｔｐｙｎｕｌｔｉｏｎｃｅｕｓｏｒｇａｎＵａｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｏｌｍｅｒａｓｅＩｔｒａｎｗｒｉｔｉｏｎｐｙｐｍｃｒｏｕｕｅｎｏｒｍａｏｎｉｔｂｌｂｕｄｋｆＨｎｅｇＭｉｗｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａ＆ｅＢｓｉｇｎａＵｎｇｎ巧ｔ，＂ｖｅ＇ｅｇｕｂｔｌｏｎｏｆｒａｎｕｌｏｃｅ扣行ｅｒｅｎ＂＂ｉｏｎｇｙｔｉｇｌｏｍｅｒｕｌ＂＂＂ｒａｏｎｄｄｈｅｉｒｅｎｓｕｎｃｔｏｎａｓｓｅｍｂｌ，ｙｎｅａｌｉｖｒｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆａｒｕｔｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｒｅｓｏｎｓｅｇｇｙｐ图２；甲基化差异改变与免疫系统密切相关芯片结果最初Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ０巧ｃｅｅｘｃｅｌ软件进行处理及筛选；聚类分析使用Ｃｌｕｓｔｅｒ３ＴｒｅｅＶｉｅｗ进行分析。ＧＯ分析结ＤＮＡ甲基．０及果盈示；化的差异位点涉及＾多种基因，而进步对这些基因的所涉及的分子功能、生物学过程等进行聚类分析发现：在ＤＮＡ甲基化有差异性改变位点所涉及的基因中，功能落在抗原递呈通路－１＾及上的最多。ＩＦＮＹ信号介导的信号通路四、ＤＮＡ甲基化水平受ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶调控ＤＮＡ甲基化是一种非常重要的、参与调控细胞转录活性的表观遗传方式，它通过多种途径影响着机体的正常发展。研巧表明，ＤＮＡ甲基化在维持基因沮完整性方面起着重要作用：主要通过体内重复序列沉默、内源性逆转录病毒的灭活Ｗ及自主基因元件（如转座子等）的失活等多种途径来实现这种维持作用；另外研究发现ＤＮＡ甲基化对Ｘ染色体灭活、组织特异性蛋白表达Ｌ：Ａ义干细胞分化诱导作用显著。很久前，ＤＮＡ甲基化就被确定为与基因沉默密切相关，而且这种表观遗传修饰一的具体生物过程也慢慢地被揭开面纱。研巧发现，ＤＮＡ甲基化是种后期合成－（ｏｓｔｓｎｔｈｅｔｃ），，ｐｙｉ修饰过程在这个修饰过程中需耍酶的参与人们将这类特殊的－类酶命名为ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴｓ）。ＤＮＡ甲基化转移酶家族主要有王类：ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３，ＤＮＭＴ１及ＤＮＭＴ２无巧他分型，ＤＮＭＴ３父包括…３ＢＩ’…ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ、ＤＮＭＴ３ＬＨ种。在这１￡类０踰甲基化转移酶当中己被证实具有ＤＮＡ甲基化酶活性的主要是ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ＢＨ种。这Ｈ种酶的甲基化酶活性表现为一：在ＤＮＡ启动子或者第外显子序列富含ＣｐＧ位点的ｗ’ｔＷＩＷ区域－，由辅助因子Ｓ腺昔甲硫氨酸（ＳＡＭ）提供甲基，在ＣｐＧ二核昔胞喀１２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论义－－巧的第五位碳原子上加上甲基，而同时Ｓ腺昔甲硫氨酸转变为Ｓ腺昔同型半脫氨酸（ＳＡＨ）。ＤＮＡ甲基化主要有两种开文式：维持性甲基化（ｍａｉｎｔａｉｎａｎｃｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）６５’６６１６］和重新甲基化（或者称为从头甲基化４１１（＾０１１１６１１巧１３１；０１１），所谓维持性甲基化就是Ｗ亲代ＤＮＡ为模板，将亲代ＤＮＡ甲基化模式遗传给子代的过程。而所谓从头甲基化是指将在机体发育过程中失掉甲基的ＣｐＧ位点上再次加上甲基的过程。在真核生物体内，参与ＤＮＡ维持性甲基化的主要的酶是ＤＮＡ甲基化转移酶１ｔＷ（ＤＮＭＴ１），而参与ＤＮＡ从头甲基化的酶主要是ＤＮＡ甲基化转移酶３（ＤＮＭＴ３），见图３（Ａ、Ｂ）。ＡＢ５－ｈｙｄｒｍｃｃｏｓｎｏｘｙｔｈｙｌｙｔｉｅｍＣ｛５ｈ）ｍｏ＾ｕｎｄｉｆｉｅｄＤＮＡＮＨ＊ｈｅｎＵ－ｍｅ２ＳｔｈｙｌａｔｅｄＤＮＡ＾？－ｍｅｔｈｙｆｕｌｌｌａｄＤＮＡ０ｔｅ止／＼ｔ１，１＼ＩＮｈ／ＮＨ２？＾＾＾义。鴻。街分＞ｍｅｃｔｉｔｈｌｃｔｓｙｏｓｎｅ５ｙｙｏｉｎｅＣ＜５ｍＣ）（）ＣＤＮＭＴｉ—ｆｃｉｉ—３９１？（Ｄ＾ＴＴＶｉｘｓＡＯＮＭＴ３ＢＯＮＭＴ３Ｌ—．ｉｍ６ＤＮＡ甲ＤＮＭＴ１＂图３基化的调控机制及ｓ结构示意图关于Ｈ种ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴＩ、ＤＮＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ３Ｂ）的研究历史较ｅ一ＩＷ为久远。Ｂｓｔｏｒ等于１９８８年克隆了第个真核生物的ＤＮＭＴｌ，该基因编码１５７３个氨基酸，蛋白质分子量为，１９０ＫＤ如前所述ＤＮＭＴ１主演负责机体内的维持性甲基化，与ＤＮＡ复制密切相关。在结构上图３（Ｃ）ＤＮＭＴ１具有被ＤＮＡ，认为是所有－胞嚼巧甲基转移酶活性的脯氨酸半脫氨酸二化，ＤＮＭＴ１主要有Ｈ种类型结构域，包括氨基端的一个富含半脱氨酸的ＣＸＸＣ巧指结构一、对漠代邮连同型异构体（ＢＡＨ）Ｗ及殘基端的保守的催化甲基化反应的催化结构域。氨基端的ＣＸＸＣ待指结构ｉＤＮＡ双螺旋的大沟内未甲基化Ｃ，，可Ｌ；？特异性识别ｐＧ模体而綾基端的催化结构域主要结合辅因子ＳＡＭ。在人体内，ＤＮＭＴ１编码１６１６个氨基酸，分子量大约为１６９ＩＣＤｄＤＮＭＴ１在体内和体外都有按照模板的甲基化模式遗传给子代的活性，、即具有维持甲基化的功能。人ＤＮＭＴ１在很多成熟组织包括屯、脑、肺、肝、肾、１３ 中国医学科学院北京协和医学院硕止学位论文ｔＷ肌肉、膜腺中都有表达。有研究发现，用全长人ＤＮＭＴｌｃＤＮＡ构建真核表达重组质粒，使之高表达，结果发现基因组中某些敏感的甲基，之后转染人成纤维细胞ｔＷ化程度大大增加而且ＤＮＭＴ１的正常与否直接影响着疾病发展，研究表明在７２７３［’３肾纤维化小鼠模型体内ＤＮＭＴ１表达明显升高。一另外类对ＤＮＡ甲基化起着重要作用的甲基化转移酶是ＤＮＭＴ３，而被证实具有ＤＮＡ甲基化酶活性的酶是其中的ＤＮＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ３Ｂ，ＤＮＭＴ３Ｌ无ＤＮＡ甲基化酶活性。与ＤＮＭＴ１相比，ＤＮＭＴ３在结构上图３（Ｃ）无ＣＸＸＣ及ＢＡＨ结构域，取而代之的是两个分别命名为ＰＷＷＰ及ＡＤＤ的结构域。对于ＤＮＭＴ３Ａ来说，ＰＷＷＰ结构域主要结合组蛋白，而ＡＤＤ结构域主要识别非甲基化的Ｈ３Ｋ４。相比较于细菌的８５个ＤＮＡ结合残基，人ＤＮＭＴ３Ａ只有５０个ＤＮＡ结合残基，而且有一二趣的是在ＤＮＭＴ３Ａ分子上有个具有聚作用界面，它使两个ＤＮＭＴ３Ａ分子的活一性位点有效的聚集在起，使ＤＮＡ结合残基达到１００个。ＤＮＭＴ３Ｂ与ＤＮＭＴ３Ａ有相似的结构，但是它幾基端的甲基化酶活性只是ＤＮＭＴ３Ａ的８０％。ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ在组织中的分布情况大致相同，ＤＮＭＴ３Ａ在胚胎干细胞中表达丰度较高，在发育成熟的组织中很低；ＤＮＭＴ３Ｂ在未分化的胚胎干细胞和睾丸组织中高表达，但在分化细胞和发育成熟的组织中几乎检测不到表达。ＤＮＭＴ３Ａ和ＤＮＭＴ３Ｂ是参与机体ＤＮＡ从头甲基化的主要酶，它们的正常与否影响着机体是正常发展还是处于疾病状态。研究发现，ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ在体外具有将甲基加到未甲基化的ＤＮＡ上的功能，小鼠白血病病毒ＤＮＡ在体外与ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ蛋白反应的ＤＮＭＴ’实验显示，在其ＤＮＡ与ＤＮＭＴ３Ａ、３Ｂ反应后其３端长末端重复序列中的Ｇ二核昔酸的胞喀惦均被其甲基化一ＤＮＭＴＡＣ，３ｐ，而进步的动物实验显示缺乏和ＤＮＭＴ一些疾病当中３Ｂ的小鼠胚胎发育不全，出生不久后死亡而且在，如在Ｍ４型及Ｍ５型急性淋己瘤（ＡＭＬＭ４／Ｍ５）Ｗ及骨髓増生异常综合征（ＭＤＳ）中ＤＮＭＴ３Ａ均发生突变异常，且突变点主要分布在关键的ＤＮＡ结合区域，在免疫ｆＭｌ缺陷性着丝点不稳定面部异常综合征（ＩＣＦｓｙｎｄｒｏｍｅ）中，ＤＮＭＴ３Ｂ结构异常；一、肌组织纤维化而在另外的些疾病当中，如特发性肺纤维化（ＩＰＦ）屯（ＣＴＦ）中一ＤＮＭＴ３Ａ及ＤＮＭＴ３Ｂ出现差异性表达上调的现象。系列的研究表明，ＤＮＭＴ３Ａ及ＤＮＭＴ化是参与ＤＮＡ甲基化的重要酶，他们的结构正常与否及蛋白表达水平的７５’７６ｔｌ正常与否直接影响生物体的功能状态及疾病的发生发展。其余两种ＤＮＡ甲基化转移酶２（ＤＮＭＴ２）及３Ｌ（ＤＮＭＴ３Ｌ），虽然在结构上具有甲基化酶结构域，，但却没有ＤＮＡ甲基化酶的活性。分开来说ＤＮＭＴ２无ＤＮＡ一甲基化酶活性，但却有甲基化ｔＲＮＡ的活性而ＤＮＭＴ３Ｌ可能作为个调节因子及辅助因子协助ＤＮＭＴ３Ａ的从头甲基化过程。作为一ＤＮＡ的甲ＮＡ种调控方式，基化修饰必然要求有相应的协调过程来平衡Ｄ甲基化过程，这就需要有ＤＮＡ去甲基化来解除ＣｐＧ二核巧酸胞嚼巧第五位碳原子１４ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄－学位论义上面的甲基，进而来解除由于甲基化的抑制作用而导致的基因沉默，最后达到激活基因的作用。在很长的时间Ｗ来，人们对ＤＮＡ去甲基化过程都处于茫然状态，直ＤＮＡ甲＾，ＤＮＡ到近年，基化的进＾＾来随着人们对步关注去甲基化的研巧也成为一一个热口领域，因为ＤＮＡ去甲基化跟ＤＮＡ甲基化样对生物体的发育、成长Ｗ及９７５ｆｉ’＾疾病的发生发展有着非常重要的作用。目前己有报道的ＤＮＡ去甲基化的机制主要分为被动去甲基化和主动去甲基化。首先被动去甲基化的过程是复制依赖性一的，主要是通过阻止新生链上发生ＤＮＡ甲基化而达到去甲基化的效果；另外种１５一１１就是非复制依赖性的主动去甲基化的过程，这方面在植物方面己有比较成熟的’研究，在动物方面的研究也日渐增多，其机制也逐渐变得明了清楚。ＤＮＡ的被动去甲基化主要是通过减弱或阻断ＤＮＭＴｓ的作用来实现，而ＤＮＡ的主动去甲基化一－方面，目前报道的ＤＮＡ主动去甲基化的潜在机制主要有Ｗ下几个过程：由十十Ｗ－ＳＩＵ染色体异位酶（ＴＥＴｓ）参与的氧化去甲基継而由胸腺嚼巧ＤＮＡ糖基酶（ＴＤＧ），一介导的碱基切除修复去除甲基，最后依赖于ＤＮＡ修复的碱基切除脱氨基及进步的核昔酸切除途径完成去甲基化（图４）＊？０Ｑ－０玉斗－Ｉ！ｖＬ０ＫＧＳｕｃｃｉｎａｔｅ．Ａ４Ｏｘｉｄａｉｏｎｔｒｉｔ。！四四４０巧０ｆ＼」巧ｗａ扣《？ｉｅｔ１应１Ｉ）＼Ｊ＼－々巧＼画０黑？０１？前？ＰｇｐＢｆｌ＾ｄｃｉＰＰＰＩ」＾图４ＤＮＡ去甲基化的调控过程及其中主要的作用酶。一－近来备受关注的个方面就是十Ｈ染色体异位酶（ＴＥＴｓ）在ＤＮＡ甲基化修ＴＥＴ一一饰中的作用。ｓ这家族的发现是加强我们对ＤＮＡ去甲基化机制的理解，这一５２一１１发现是个重要的分水岭，使我们对ＤＮＡ甲基化的理解上升到个更加复杂的一层面。ＴＥＴｓ在动物中的研究最早可追溯到１９８２年，Ｍａｒｔｉｎ等人发现了种蛋白酶１５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文ｔｗｉＷ敏感的物质，谊种物质具有去甲基化的作用，后来ｅｉｓｓ又在大鼠的成肌细胞全细胞裂解液中又发现了ＲＮａｓｅ敏感的物质，同样这种物质也具有去甲基化的活性ｔＭｌ，这是甲基化酶研究的起点，但是当时的送些发现抑制Ｗ来都没有被很全面的认一同－，直到近期Ｗ来，ＤＮＡ去甲基化酶有了突破性的进展，那就是十十染色体异位酶（ＴＥＴｓ）在ＤＮＡ去甲基化中的作用。ＴＥＴ家族主要由Ｈ个成员，即ＴＥＴ１、一一一ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、，每个成员拥有个核屯催化结构域，该结构域是个双链Ｐ折叠，一Ｐ折叠内含有个非常关键的金属结合残基，这种金属结合残基曾经在二价铁离子８￡３－依赖的加氧酶中发现。按照推测的机制，ＴＥＴ主要是将分子氧作为酶底物催化ａ二一丽戊酸的氧化脱綾基作用，进而生成个有活性的高化合价酶偶联铁的氧络中间８６ｔ化合物，这种中间化合物可Ｗ将甲基化了的胞嚼赌（５ｍＣ）喉化为矮基化的胞喀８７ｆ３５ｈｍＣ），而且ＴＥＴｓ）可５ｈｍＣ５ｈｍＣ迭巧（去甲基化酶（＾＾＾在的基础上将代重５－５ｆＣ５－５ｃａＣ复氧化成甲酷胞略巧及綾基胞喀巧（），从而实现其去甲基化的作用，（）ＴＥＴｓ将５ｍＣ氧化成５ｈｍＣ，这使得５ｍＣ在ＤＮＡ序列上有所减少，ＤＮＡ的甲基化状态通过ＤＮＡ的不断复制而将５ｍＣ被动稀释，从而降低ＤＮＡ甲基化水平；还有研巧表明ＤＮＡ甲基转移酶（ＤＮＭＴｓ）可Ｗ促进胞喀巧被氧他了的第５位碳原子上，５ｈｍＣ相互作用取代基的添加或移除在体外己经证明了ＤＮＭＴｓ可Ｗ与，所ＷＤＮＭＴｓ理论上是可Ｗ参与去甲基化过程的，但这种逆转的ＤＮＭＴｓ的作用的生物相一关性还未可知一，这方面可能是比较有趣的去甲基化机制的另个关注点。目前的研究表明由ＴＥＴｓ参与的将５ｍＣ催化氧化成５ｈｍＣ的反应过程并不是去一及最后终止的反应５甲基化过程中唯，后续的ＷｈｍＣ为中如的诸多反应在去甲基化过程中扮演着重要的角色，现在已有报道的这些后续反应主要包括由胸腺喀巧ＤＮＡ糖基酶（ＴＤＧ）参与的碱基剪切修复脱氨基等，研究表明ＴＤＧ的主要作用是将５紀及５ｃａＣ切除碱基形成脱氨基位点。ＤＮＡ一ＤＮＡ与转移酶样重要，去甲基酶对生物体的正常发育Ｗ及各种功能的维持有着非常重要的作用，他们参与维持机体ＤＮＡ甲基化水平的平衡。它们的正常与否，直接影响机体的功能状态，甚至影响着疾病的进展，目前，有很多研巧表明，很多疾病中去甲基化酶蛋白水平发生异常１６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文正文第一部分活动性肺结核病人及健康人全血ＲＮＡ中ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶表达ｉｔ的分析一肺结核病是种与机体细胞免疫应答能力密切相关的慢性感染性疾病，课题组前期部分实验收集活动性肺结核病人及健康人全血样本，并提取ＤＮＡ样本，采用ｆｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｉｎｆｉｎｉｕｍ？ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ＳｅａｄＡｒｒａｙ产品对其进行全基因组甲基化忘片检测，初步探讨肺结核病人与ＤＮＡ甲基化之间的关系。对其结果进行分析发现：在肺结核病的发生发展过程中，而ＤＮＡ甲基化通过与免疫系统的调节密切相关、对疾病有着重要影响。结果显示：相较于健康人全基因组甲基化水平，肺结核病人全基因组ＤＮＡ甲基化水平呈现差异性降低趋势一。为了进步初步探讨造成肺结核病人全基因组ＤＮＡ低甲基化水平的可能影响因素，我们收集活动性肺结核病人及健康人两沮人群全血样本，首先拟从ＲＮＡ水平上检测下调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ去甲基化酶（主要包括ＴＥＴ１、ＴＥＴｌ、ＴＥ１３、ＴＤＧ）的表达水平，Ｗ初步了解在活动性肺结核病人体内，这些己被报道的可Ｗ下调ＤＮＡ甲基化水平的几类酶的表达水平是否有着差异性的改变。为了从多个方面探索肺结核病人ＤＮＡ低甲基化趋势一，本研究进步检测了活动性肺结核病人及健康人两组人群全血ＲＮＡ样本中可Ｗ上调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ甲基化转移酶的表达量（主要包括ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）。一、实验材料和方法１．獅體结核病人和健康人入组队列’－本部分实验所用样本来自深圳市第Ｈ人民医院。收集全血样本，并贬存于８０Ｃ冰箱保存备用。。各组人数及入组条件等详细信息见下表１７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文１表：活动性肺结核病人和结核分枝杆茵潜伏感染者细胞因子检测样本信息实獲分样本性巧（男／ＥＬＩＳＰＯＴ入组平齡齡狙致女）（ＳＦＣｓ）、１初发活动性肺结核病：２姨涂片检测结果阳性、；３、胸片检查结果阳性；活动性＞４４、ＥＬＩＳＰＯＴ检査阳性（Ａ抗原ＳＦＣｓ０／Ｂ抗原－肺结核．９±３．２４３２９８１４８／６３３＞ＳＦＣｓ３０）；患者５、排除义滋病、肝炎、糖尿病及类风湿等自身免疫性疾病６、无既往结核病史。１、无结核病临床体征和症状：２、无与结核病人密切接触史；３、胸片检査结果未见异常：健康对４ＳＰ值ＳＦＣ且Ｂ抗－１．±．、ＥＬＩＯＴ阴性（Ａ抗原ｓ含１０原４７／７３０７２９２２４照、、ＳＦＣｓ＜３０）；５、、Ｓ聯艾滋病乙肝、糖尿病及类风湿等自身免疫性疾病。一注：①、活动性肺结核病人均为初次发病并且治疗时间小于周的患者。排除艾滋病、肝炎、糖尿病及类风湿等自身免疫性疾病。②、ＴＳＴ：结核菌素皮肤试验，－＞－ｌ〇。－ｍｍ为阳性③、ＥＬＩＳＰＯＴＭｔｓｓｓｅｃｃＩＦＮｍｅｌｄ实验结果；．ｕｂｅｒｃｕｌｏｉｐｉｆｉｙｅｎｚｉｎｋｅｙｏｓｏ－ｔＩＦＮｉｍｍｕｎｐ，即：用于检测结核分枝巧菌抗原特异性ｙ的酶联免疫斑点实验；ｔ－Ｆｏ－ＳＦＣｓ：ＳｐｏｒｍｉｎｇＣｅｌｌｓ表示ＥＬＩＳＰＯＴ检测中释放ＩＦＮＹ的细胞数，用于该实验的结果判定。本课题中所用ＥＬＩＳＰＯＴ检测分别用试剂食中Ａ抗原和Ｂ抗原两种结核分枝杆菌特异性刺激物对受试者ＰＢＭＣ进行刺激，结果中Ａ抗原孔ＳＦＣｓ＞４０或Ｂ抗原孔ＳＦＣｓ＞３０判定为阳化Ａ抗原孔ＳＦＣｓ谷Ｋ）且Ｂ抗原孔ＳＦＣＳ５３０为阴性。２．獅滕结该病人及健巧＞＾血ＲＮＡ样本提取本部分实验所用试剂盒是或耗材、仪器主要有ＱＩＡａｍｐＤＮＡ＾ｌｉｎｉＫｉｔ（２５０）、、ＲＮＡ２１５ｍｌ离屯管、去酶水、台式高速离也机等，详细信息见表。２１．实验中提取全血ＲＮＡ所用试剂盒或耗材、仪器详细信息１８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文表２提取全血ＲＮＡ所用试剂盒或耗材、仪器详细信息试沉金、巧材巧仪船務货号棘他来＊ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（２５０）５２３０４Ｑｉａｇ郎公司ｍｌ离也管４３０７９１购自ｃｏｒｎｉｎ公司１５ｇ去ＲＮＡ酶水Ｗ４５０２购于Ｓｉｒａａ－Ａｒｉｃｈｇｌｄ公司平板离也机巧１０Ｒ购于巧ｐｅｎｄｏｒｆ公司台式窩速冷冻离也、机５４１７Ｒ购于巧ｐｅｎｄｏｒｆ公司２２．实验步驟如下：２．２．１纯化ＰＭＢＣｙ、将预先加入抗凝剂的全血样本１ｍｌ４００ｇ离也７ｍｉｎ，将上清保存，留待后）用。（２）、加入等体积ＰＢＳ，混匀。（３）、沿管壁加入Ｆｉｃｏｌ试剂，然后再加入等体积Ｗ上混匀液体，４００ｇ，升９降４，离也３０ｍｉｎ。（４）、吸取中间白膜层枪头尖部顶及此层贴壁旋转吸取）。５、加入１倍Ｗ上体积ＰＢＳ，混匀４００ｇ离也７ｍｉｎ。（）（６）、弃上清，并再次加入ＰＢＳ清洗后计数，并留待后用。２．２．２用ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ提取细胞ＲＮＡ（１）、提前准备好下游所用试剂，备用。０、弃掉细胞培养基，每孔加入１ｍｌＰＢＳ溶液清洗后弃掉ＰＢＳ溶液。）６直接将３、根据细胞（小于５ｘｌ０个细胞），３５０ＢｕｆｅｒＲＬＴ直接加入孔內，（）叫充分裂解３ｍｉｎ。（４）、加入与１＾＞１上裂解液等体积的７０％的乙醇溶液，充分吹打，不离也。５、、将Ｗ上细胞液收入１．５ｍｌ离屯管中，１０００巧ｍ离也５ｍｉｎ。（）（６）、转移Ｗ上液体７００叫（包括任何的沉淀）到配有２ｍｌ收集管的ＲＮｅａｓｙ离，ｌｌＯＯＯ２化后也柱中，轻叩盖子ｇ离也，弃掉滤液。（７）、加入７０〇ＷＢｕｆｅｒＲＷｌ清洗柱子，轻叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２０ｓ，弃掉滤液。（８）、加入５０〇ｎｌＢｕｆｅｒＲＰＥ清洗柱子，捏叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２０ｓ，弃掉滤液。矜、再次加入５００＾１１ＢｕｆｅｒＲＰＥ１＾再次清洗柱子，轻叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２ｍｉｎ，）并弃掉滤液。（１０）、将柱子转移至新的２ｍｌ收集管中，全速离也１皿虹。１９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文１４、（１１）、将柱子转移至．５ｍｌ窝也管中，加入（Ｈｄ去ＲＮＡ酶水，ｌｌＯＯＯｇ离屯Ｉｍｉｎ，Ｗ洗脱ＲＮＡ。如果ＲＮＡ的量大于３０帖，可Ｗ再次加入仰１去ＲＮＡ酶水Ｗ重复Ｗ上洗脱步驟，或者用！＾＞１上洗脱液重复洗脱。’Ｄ１０００－８０Ｕ巧、用Ｎ微量吸光光度计检测浓度，分装并于Ｃ冰箱保存Ｗ备用。注：在提取ＲＮＡ的全过程所用水全部为去ＲＮＡ酶的水。操作全程都需要戴手套及口罩，，提取过程尽量迅速，Ｗ防止ＲＮＡ降解ＲＮＡ样本需要分装后再冻存。３？活动性肺结核病人全血ＲＮＡ定量检测本实验所用的试剂盒或耗材及仪器大部分来源于ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）公司，主要有ＰｏｗｅｒＳＹＢ民ＧｒｅｅｎＰＣ民ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、封膜、ＭｉｃｒｏＡｍｐＦａｓｔＯｔｉｃａｌ９６ｐＨＴ－孔板７９００ＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｓｔｅｍ、ＲＮＡ３。、ｙ去酶水等。详细信息见表３－．１实验中将ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ所用试剂盒或耗材及仪器详细信息－表３逆转录、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ所用试剂盆或耗材及仪器详细信息试巧金、巧材或物》名巧货号巧其他来巧。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ１ＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈ的ｓｉｓ垃ｔ６２Ｉ０Ａ购自ＡＢＩ公司ＰｏｗｅｒＳＹＢ民ＧｒｅｅｎＰＣ民ＭａｓｔｅｒＭｉｘＲＥＦ４３６７６巧购自ＡＢＩ公司封膜４３１１９７１购自ＡＢＩ公司ｓ－－－ＭｉｃｒｏＡｍｐｔＯｔｉｃａｌ９６ＷｅｌｌＲｅａｃｔｉｏｎＰｌａｔｅＲＥＦ４３４６９０６ＭＰＸＨＣＹＰ２６２ＫＦａｐ６７９００ＨＴ－ＡＢＩＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ７９００购自公司去ＲＮＡ酶水Ｗ４５０２购于Ｓ－ｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司３．２．实验步骤如下：３．２１ＤＮＡ．ｃ的合成１）、实验前将所用样本和试剂平衡至室温后置于冰上。（一２、统配置ＲＮＡ变性液：每个样本加入Ｏｌｉｇｏ肝ＰｒｉｍｅｒＷｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ各（）２５，．叫混匀。（３）、准备ＲＮＡ样本：取ＲＮＡ样本２０叫（ｔｏｔｌｅＲＮＡ总量小于１０帖），将己准备好的ＲＮＡ变性液Ｗ５叫／样本的量加入准备好的ＲＮＡ样本中，混匀。‘４、６５Ｃ变性５ｍｉｎ后迅速冰上解育。（）５一配置逆转录ＰＣＲ反应液，姐分如下、统：（）２０ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文巧分体巧Ｗ上变性ＲＮＡ及引物混合物２５ｐｌ／样本５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔ口Ｂｕｆｅｒ１〇ｌ／样本ｐＨＲＮＡ酶抑制剂１．２５ｐｌ／样本ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ逆转录醇ＳＯＯｕｎｉｔｓ／样本去ＲＮＡ酶水至５〇ｎｌ／样本６、轻轻漏匀Ｗ上逆转录ＰＣＲ反应液。（）（７）、迅速按照下体系及条件进行逆转录ＰＣＲ扩増：ＰＣＲ逆转录扩増条件如下；租度时间．４２Ｃ６０ｍｍ’－巧）、将Ｗ上逆转录ＰＣ民产物分装并置于８０Ｃ储存备用。３．２．２ＷｃＤＮＡ为模板进行７种目的基因的炎光定量ＰＣＲ检测１、实验前将所需样本及试剂平衡至室湿，并于冰上放置。（）一２－、根据所检测基因分别配置ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应液，每种基因配置管反应（）液。本实验需检测８个基因，其中包括７个目的基因（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ、一Ａ－ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３、ＤＮＭＴ犯），Ｗ及个管家基因Ｐａｃｔｉｎ具体姐分如下：组分概？ＩｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１〇Ｈｌ／样本Ｆ－ｒｉｍｅｒ（ｌＯＭ）样本ｐｐ－ＪＲｒ．ｐｉｍｅｒ（１０Ｍ）ＯＳｉｌ／样（ｊ本去ＲＮＡ酶水至２〇ｎｌ／样本（３）、将Ｗ上ＰＣＲ反应液混匀，并取１９叫加入ＡＢ巧６孔板中的每个空中。每个样本每个基因至少做２个复孔。（４）、将前期反转录好的ｃＤＮＡ模板取１叫加入９６孔板的每个孔中。５、用封膜将板子密封好。（）６、ｌＯＯＯｒｍ瞬时离也２０ｓ。（）ｐ７－（）、上机进行ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ扩增２１ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文Ｒｅａ－ｌｔｉｍｅＰＣＲ扩増体系女口下组分備ｅａ－ＲｌｔｉｍｅＣＲ反应液１／Ｐ１却孔ｃＤＮＡ模板Ｉｆｉｌ化Ｒｅａ－ｌｔｉｍｅＰＣＲ扩増条件女口下沮度时间．５６Ｃ２ｍｍ‘９５ＣＯｍｉｎｌ‘９５Ｃ１５ｓ４０Ｃｙｃｌｅｓ’６０ＣＩｍｉｎ９５Ｖ１５ｓ’６０Ｃ１５ｓＲ－ｅａｌｔｉｍｅＰＣ氏扩增引物如下引物名巧引巧巧巧产嘴Ｉ长度Ｂ－ＡＣＴ－ＩＮ２ＦＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣｂ！４２ｐＢ－ＡＣＴ－２ＲＧＴＡＣＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＩＮＡＴＴＤＮＭＴ３Ａ－ＦＣＣＧＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＴ＊５ＩｂｐＤＮＭＴ３Ａ－ＲＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＤＮＭＴ３Ｂ－ＦＡＧＧＧＡＡＧＡＣＴＣＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＷｂｐ０ＮＭＴ３Ｂ－２ＲＧＴ６ＴＧＴＡＧＣＴＴＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＤＮＭＴｌ－ＦＣＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧ１１８ｂｐＤＮＭＴｌ－ＲＡＣＴＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＥＴｌ－ＦＣＧａＡＣＧＡＡＧＣＡＣａＣＴＣＴＴＡ１７Ｉｂ下打１－ＲＣＴＴＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＣＧＡＡＴＣＡＴＴＴｐＴＥＴ２－ＦＡＴＡＣＣＣＴ６ＴＡＴ６ＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣ９７ｂｐ１ＴＥＴ２－ＲＣＴＴＡＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＴＣＴＴＴＣＴＥＴ３－ＦＡＧＴＧＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＴＴＣＡ６２１６ｂｐＴＥＴ３－ＲＧＣＡＡＡＴＡＧＣＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＤＧ－ＦＴ６ＡＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＡ〇１撕ＴＤＧ－ＲＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＡＴＧＡＴＧＣ口注一ＮＡ；①按照实验安排９６ｃＤ，还，每块孔板上除了加入待检测的临床样本外需要保证每个基因加入去ＲＮａｓｅ水，作为阴性对照。排除任何污染物的非特异性２２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文扩增，保证质控质量，确保实验结果真实、可靠。②扩増引物是用ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ软件设计，并用ＤＮＡＭＡＮ软件比对后送出由ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成，并且预实验验证过引物特异性后才用于实验。４．统计学分析实验中所得数据使用ＧｒａｐｈＰａｄｐｒｉｍ５软件进行统计学分析和做图。本部分结果使用＊Ｕｎｐａｉｒｅｄｔｔｅｓｔ方法进行分析，实验数据Ｗ相对表达量表示，，值＜〇．〇５、＊＊＊值＜０．０１及；Ｋ０．００１均被认为有显著性统计学差异。二、实验结果活动性脯结核病人和健康人全血ＲＮＡ中ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶的相对表法量我们本部分实验结果显示（见图４），相对于健康对照组，活动性肺结核病人全血ＲＮＡ中，在活动性肺结核病人全血ＲＮＡ中，己被报道参与ＤＮＡ甲基化水平下调的ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）表达全部显著升高（Ｐ值＜０．０５）（见图４Ａ）；已被报道参与ＤＮＡ甲基化水平上调的ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＤＧ）只有ＤＮＭＴ１（参与维持性甲基化）表达显著升高（Ｐ值＜０．０５），其余两种分子ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ表现为在健康人体４Ｂ）。内表达较高，但未见统计学差异（见图２３ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄？学位论文Ａ，社也４也也々＊４＋々？９去安甲ＴＥＴ２ＴＥＴ１基ＴＯＣ肺化…．酶．１‘ＵＩ？４？‘’＊ＩＩ妻至；了，’中－＂ｔ５！－？＊＿？？＿＿ｌｉ；、、＾疗＊．心去．‘去了，．＾．去。々＊々＊＾广气广ＢＤＮＭＴ１ＤＮＭＴ３ＡＳＤＮＭＴ巧０化＂＊。々巧１ＩＷ。，１。——Ｉ云｜画ｄＭＪｔｄｉＬ＾ＵｌＳｌ基々冷々公々公？移酶ＤＮＭＴ１。…口。ＤＮＭＴ３Ａ－０．０２９１Ｍ２Ｓｉ？？？．０．０２０？■巧〇．争〇？－０．０１ＳＭ８．ＧＩＳ０ｉ一一＊０．Ｖ．０１。ｈＭ１０．；表卫下？？．＇〇〇〇］－．〇．：Ｉ玉—ｏＪ尘＿＿－ｊｆｒ々公々奔々公图４活动性肺结核病人和健康人全血ＲＮＡ中ＴＥＴｓ、ＴＤＧ、ＤＮＭＴｓ检测。Ａ组：两组样本中ＤＮＡ去甲基化酶表达水平柱状图及散点图，检测；Ｂ组：两组样本ＤＮＡ甲基化转移酶相对表达情况柱状图及散点图。ＴＢ：活动性肺结核病人；２４ 中国医学科学院北京协和医学院硕止学位论文—ＡＡＵ＊＊＊ＨＤ：健康人。数据Ｗ目的基因相对表达量２表示，公值＜〇．〇５、，值＜〇．〇１及＊＊＊＜７０。／．００１均被认为有显著统计学差异兰、小结本部分实验收集并检测活动性肺结核病人及健康人全血ＲＮＡ样本中７种目的基因的相对表达量，结果显示：１、在未治疗的活动性肺结核病人全血ＲＮＡ中目前已报道的可Ｗ使ＤＮＡ甲基，化水平下调的所有ＤＮＡ去甲基化酶，主要包括ＴＥＴ１，ＴＥＴ２、ＴＥＴＴ３、ＴＤＱ表达水平均显著升高。２、在未治疗的活动性肺结核病人全血ＲＮＡ中，目前已报道的可＾？使ＤＮＡ甲基化水平上调的ＤＮＡ甲基化转移酶中只有一种酶即参与维持性甲基化的ＤＮＭ，Ｔ１表达显著升高。ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ的表达量无显著性差异。２５ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文第二巧分Ａ５４９Ｂｅａｓ－２Ｂ体外刺巧、细胞探时ＤＮＡ去甲基化巧及ＤＮＡ甲基化转移巧对ＤＮＡ低甲基化趋势的巧咱一一一一为了进步验证前部分实验结果：：ＤＮＡ，进步确定甲基化与肺结核病密切相关，且在活动性肺结核病人体内确实呈现ＤＮＡ甲基化水平降低的情况。二：参与下调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ去甲基化酶确实对肺结核病人ＤＮＡ低甲基化趋势有着重要影响。我们在体外利用阳性刺激物５ａｚａｃＷ及肺结核病相关抗原５４９Ｂ－２Ｂ联７Ｒｖ刺激Ａ、ｅａｓ两种细胞系，进行模拟实验。本部分实验整体实验方一－２Ｂ：５４９、Ｂｅａｓ两种细胞系不同刺激后法就是在体外给予Ａ，段时间Ｗ后收集细胞上清、ＤＮＡ、ＲＮＡ样本，利用甲基化敏感性限制性分析（ＭＳＲＡ）实验技术检测ＤＮＡ样本，观察ＤＮＡ甲基化水平的改变。并且同时对该时间点所收集的ＲＮＡ样本进行实时费光定量ＰＣ氏首先检测目前已报道的可Ｗ下调ＤＮＡ甲基化水平变化ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）的表达情况。然后在ＲＮＡ水平上检测可Ｗ上调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）的相对表达量。本部分实验之所Ｗ选送两种细施是因为：众所周知，肺结核病是由胞内茜结核一种慢性感染性疾病分枝杆菌引起的Ｗ肺部形成肉芽肿为主要特征的。所谓肉芽肿镜检肺组织内所形成得上皮样肉芽肿，可见肉芽肿中央有非干酪样凝固性坏死，，多核巨细胞、淋己浆细胞浸润，小血管炎其周围纤维组织增生。上皮细胞是其重要细胞成分－。Ａ５４９是来源于肺腺癌的肺上皮细胞，而Ｂｅａｓ２Ｂ细胞是来源于正９－常支气管上皮细胞的永生化细胞。因此体外实验选用Ａ５４、Ｂｅａｓ２Ｂ两种细胞系一进行刺激实验。而且诸多研巧表明，５ａｚａｃ是种可Ｗ降低ＤＮＡ甲基化水平的刺胃８８９〇］一［Ｈ３７ＲＶ激物，它是种强效生长抑制剂和细胞毒素剂。而作为抗原刺激物，一种常用的裂解蛋白是、用于体外模拟结核病的蛋白。一、实验材料和方法１．娜ｔ细胞并收集细胞上淸ＤＮＡ及ＲＮＡ、样本１１．细胞刺激实验所用试剂盒及耗材本部分实验所用试剂盒及耗材主要有Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２细胞培养基、胎牛血清（ＦＢＳ、青链霉素双抗溶液（ＰＳ）５ａｚａｃ、拟７Ｒｖ７Ｒｖｌｓｉｓ）、）、６孔板、裂解抗原（阳ｙ２６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文赎酶、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ等，所涉及仪器主要有生物安全柜、恒温解箱、水浴锅、倒置显微镜、台式商速离也机、超声破碎仪、纯水仪等。详细信息见表４表４：细胞刺激试验所用试剂盒、耗材及仪器详细信息巧刑金、耗材巧化＃名巧货号巧其他＾Ｆ１２培养基ＲＥＦ１１７６５购于Ｇ化ｃｏ公司ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＦ１２）培养基ＲＥＦｍ３０购于Ｇ化ｃｏ公司ＦＢＳＲＥＦ１００９９购于Ｇ化ｃｏ公司ＰＳ１５１４０购于Ｇｉｂｃｏ公司ＰＢＳＴ９００购于ＴａＫａＲａ公司６孔板３５化购于Ｃｏｍｉｎｇ公司购于－５ａｚａｃＡ１２８７ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司菌株来自于北京结核病胸部肿瘤研究Ｈ３７ＲＶｌｙｓｉｓ本实验室制备所赎酶ＲＥＦ１％０４购于访ｂｃｏ公司ＢＣＡＰｒｏ２２７购于Ｔｈｅｒｍｏ公司ｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔＰｒｏｄ沿３ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（２５０）５１３０６购于Ｑｉａｇｅ打公司ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（２５０）７４１０６购于Ｑｉａｇｅｎ公司生物安全柜型号；ＬＡＢＧＡＲＤ４２５购于Ｎｕａｒｉｅ公司二氧化碳培养箱型号；ＮＵ购于Ｎｕａｒｉｅ公司水浴锅一购于ＡｕａＢａｈｑｔ公司倒置显微镜ＥＣＬＩＰ巧购于Ｎｉｋｏｎ公司台式离速冷冻离也机５４１７民购于ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司超声破碎仪ＳＯＥＮＴＺ－ＩＩＤ购于ＳＣＩＥＮＴＺ公司０．２２畔滤膜ＳＬＧＰ的３ＲＢ购于ＭＨｉｐｏｒｅ公司纯水仪Ｍ购于颇尔过滤器公司１、、．２实验所用细胞种类、种植细胞数刺激物种类浓度、刺激体系、刺激方式、时间详细信息－２Ｂ两种细胞－本部分实验所用细胞主要是Ａ５４９、Ｂｅａｓ，刺激物主要是５氮杂胞嗦巧核昔（５ａｚａｃ）、狀７Ｒｖ裂解抗原。具体实验细节，见表５。２７ 中国医学科学院北京协巧医学院硕±学位论文表５：体外细胞刺激实验细节细化种谊细拥澈物抑齡前澈体系細苗樓养板抑致方式、时间及梓本化集方法种类化密度巧类巧度铺板２４ｈ后分别加入Ｈ种刺激物，＾入／Ｍ刺激６ｄ、５ｘ，分别收集铺板２４ｈｌ０ｍＳａｚａｃ２ｎ口Ａ５４９３ｍｌ／孔６孔板１、Ｉｄ、３ｄ４ｄ、６ｄ的１Ｈ３７ＲＶ０化刺激物后刺激细胞上清、ＤＮＡ、ＲＮＡ样本铺板２４ｈ后分别加入Ｈ种刺激物，４－２ｘＢｅａｓｌ〇／ｍＳａｚａｃ２Ｍ刺激６ｄ，分别收集铺板２４ｈ、加入ｐ３ｍｌ／孔６孔板、、、２Ｂ１拟７Ｒｖ后刺激Ｉｄ３ｄ４ｄ６ｄ的１０帖刺激物细胞上清、ＤＮＡ、ＲＮＡ样本注：细胞刺激实验重复Ｈ遍。１拟７ＲＶ．３抗原的制备１３１７Ｒｖ．．拟裂解－１、将于７Ｈ９培养基中培养了３４周的Ｈ３７ＲＶ煮沸１５ｍｉｎ，为保证完全灭活，（）‘再用８０Ｃ水浴，膊育３０ｍｉｎ。、口、１２０００ｉｐｍ、离也ｌＯｍｉｎ（或者４０００ｒｐｍ离屯３０ｍｉｎ）去除培养基。）（３）、加入ＰＢＳ溶液，１００叫体积空间大小沉淀约加入１ｍｌＰＢＳ溶液，混匀。°（４）、于冰水混合物中超声，２０％功率，巧Ｃ，０１巧０２模式，超声开９ｓ，关５ｓ，共超２０ｍｉｎ。‘（５）、１２０００ｒｐｍ，４Ｃ，离也ｌＯｍｉｎ，沉淀冻存，上清定量。１３２ＳＣＡ法测定总．．蛋白浓度１、按照下方法配置ＢＳＡ标准品。（）Ｖ（ＢＳＡ巧液俯＊终巧准巧触（ｎ／ｍｌ）ｉａｌ脯液欄ｐｉ）ｇＡ０３００ｏｆｓｔｏｃｋ２０００Ｂ１２５３７５ｏｆｓｔｏｃｋ１５００Ｃ３２５３２５ｏｆｓｔｏｃｋ１０００Ｄ１Ｖ１７５７５ｏｆｉａｌＢ７５０Ｅ３２５３２５ｏｆＶｉａｌＣ５００Ｆ３２５３２５ｏｆＶｉａｌＤ２５０Ｇ３２５３２５ｏｆＶｉａｌＥ１２５Ｈ４００１００ｏｆＶｉａｌＦ２５０ＱｂｌａｎｋｃｏｎｔｏｌＩ４００ｒ（）２）、按照５倍、１０倍、２０倍等比稀釋样本。（２８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文３、根据样品数量，按照每个样本２００＾１，配制ＢＣＡ工作液，按照（）＝ｒｅｇｅｎｔＢ：ｒｅｇｅｎｔＡｌ：５０比例，混匀。４２００ＢＣＡ工２５、上样，每个孔加入作液１（）叫，＾各浓度标准品及稀释样本。即＝按照王作液：待测样本８：１的比例。°５、３７Ｃ解箱放置３０ｍｉｎ。（）（巧、用酶标仪测定５６２ｎｍ波长处的吸光值。Ｗ不同浓度标准品所测吸光值为纵坐标，Ｗ各浓度标准品为横坐标。绘制标准曲线，得出计算公式。代入不同浓度样本吸光值，算出最终蛋白浓度。７、用化２２ｍ滤膜过滤掉杂菌及未裂解完全的茜株后，分装待用。（）Ｍ１．４实验所用细胞密度及刺激物浓度的确立本部分实验所用细胞密度及刺激物浓度是经过多次预实验摸索获得。细胞刺激实验的目的是，给予细胞相关刺激后，希望细胞产生不同刺激物依赖性的ＤＮＡ甲基化水平的改变。有研究表明，在进行此类实验时要求细胞Ｗ低密度种植，已达到是有限的细胞获得足够的外来刺激，并产生相应的改变的效果。１）、由于不同细胞生长速度及状态不同，本部分实验按照Ｗ下多种密度、多种（浓度进行预实验。细巧密度４９－（Ａ５）细巧密度（Ｂｅａｓ２Ｂ）＾／ｌｘｌｏＶｍＩｘｌＯｒａＩｌ４５ｘｌ〇／ｍｌ２ｘｌ〇Ｖｍｌ＾４ＩｘｌＯ／ｍｌ４ｘ／ｌｌ〇ｍ刑澈物織拥補巧度５犯ａｃ０．５、、＾ＭＩｉＭ２＾ＭｊＨ３７反Ｖ５惦、１０惦、２０帖（巧、预实验过程中发现，细胞种植密度过大，培养７天后，培养孔内细胞过度増殖、非常拥挤、细胞状态不好。而细胞数目过小，在后期收集ＤＮＡ、ＲＮＡ样本是质与量无法保证，影响实验。根据细胞生长情况，首先确定Ａ５４９种植密度为４４５ｘｌ０ｍＢ－２Ｂ２ｘ／ｌ，ｅａｓ种植密度为ｌ０／ｍｌ。３、使用Ｗ上细胞种植密度，根据刺激３ｄ后ＤＮＡ甲基化水平的变化情况（），并结合文献及前期经验，最终确定５ａｚａｃ：２叫４，Ｈ３７ＲＶ：１０ｌ。＾ｇ１．５实验步驟１．５１．刺激细胞（１）、配置Ｆ１２及ＤＦ１２完全培养基；完全培养基含Ｆ１２或ＤＦ１２培养基，１０％ＦＢＳ１％ＰＳ，２９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文２、将Ａ５４９及Ｂｅａｓ－２Ｂ按照预先摸索好的细胞密度及刺激体系铺入６孔板。（）３２４ｈ。（）、稳定后按照各刺激物浓度加入刺激物（４）、根据不同时间点，收集铺板２４ｈ、刺激Ｉｄ、３ｄ的样本，待用。１５２．．收集细胞上清、并收集细胞提取ＤＮＡ样本收集不同时间点细胞上清（留待后期检测）。收集细胞，提取全基因组ＤＮＡ。使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＢｌｏｏｄｏｒＢｏｄｙＦｌｕｉｄＳｐｉｎ全基因组ＤＮＡ纯化试剂盒（Ａ１１２５），实验步骤如下：’Ｉ、打开％Ｃ水洛锅，待用。提前准备好下游所用试剂。（）、每个组收集５００，留待后期检测。（巧叫细胞上清（３）、将剩余细胞上清弃掉，每孔加入１ｍｌＰＢＳ溶液清洗后弃掉ＰＢＳ溶液，并加‘０－１０２５３７Ｃ二４ｍｉｎ。入．．％的膀酶１００叫，于氧化碳培养箱消化（４）、加入１ｍｌＰＢＳ溶液，充分吹打，使细胞完全脱落。ｍ离屯、５、将Ｗ上细胞液收入１．５ｍｌ离也管中，ｌＯＯＯｒｐ５ｍｉｎ。（）６一、由于细胞数较少，在原孔中再次加入１ｍｌＰＢＳ溶液，再次清洗遍，收集（）ｌｉｍ离也５ｍｉｎ。残留细胞，并按顺序移入已离也细胞沉淀中，再次ＯＯＯｐ７２００ＰＢＳ。（）、每孔加入叫溶液Ｗ重悬细胞巧）、加入２０叫Ｑｉａｇｅｎ蛋白獻吹打混匀。９、加入２０〇ｎｅｒＡＬｉＵ，１５ｓ（）ｌＢｕｆ裂解细胞吹打Ｗ充分裂解细胞。°１０、将样本放入％Ｃ水浴中艘育ｌＯｍｉｎ。时间不可超过ｌＯｍｉｎ，长时间解育对（）ＤＮＡ的质与量无影响。ＩＩ、瞬时离也１化，使残留在离也管盖子上的液体甩下。（）１、添加２００１００％乙醇，吹打混匀１５ｓ，然后瞬时离也ｌＯｓｔＪｌ离也盖上残留液（巧叫体。、小也转移Ｗ上液体到配有２ｍｌ收集管的ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉ离也柱中。在转移过程当中不能弄湿管口边缘，轻叩盖子，８０００ｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ，并把柱子转移到新的２ｍｌ收集管中，弃掉滤液。１４ＩＡＭｉｎｉ离屯、、ａｍ，５００ＢｕｆｅｒＡＷ１轻轻打开Ｑ柱盖子加入溶液，保持管（）ｐ叫缘干燥，ＳＯＯＯｉｍ离也Ｉｍｉｎ，并把柱子移入新的收集管中，弃掉滤液。，轻叩盖子ｐ１５、轻轻打开ＩＡａｍｐＭｉｎｉ离也柱盖子，加入５０（ｉｌＢｕｆｅｒＡＷ２溶液，保持管（）ＱＨ、缘干燥，轻叩盖子，１４０００ｒｐｍ全速离屯３ｍｉｎ，并把柱子移入新的收集管中，全速离也Ｉｍｉｎ。ｙ６）、将ＱＩＡａｍｐＭｉｎｉ离也柱移入１．５ｍｌ离也管中，弃掉滤液，轻开盖子加入ｌＯＯｆｉｌ蒸溜水，室湿放置Ｉｍｉｎ，ＳＯＯＯｒｐｍ离也Ｉｍｉｎ。’－１７ＤＩＯＯＯ８０。（）、用Ｎ微量吸光光度计检测浓度并于Ｃ冰箱保存待用－注，２６０２８０１８１９。；用于实验的ＤＮＡ样本／：．．３０ 中国医学科学院北京协和區学院硕±学位论文１．５．３收集细胞上清、并收集细胞提取ＲＮＡ样本收集复孔细胞，提取ＲＮＡ样本。使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（２５０），货号７４１０６，具体步骤如下：１（）、提前准备好下游所用试剂，备用。、弃掉细胞培养基，每孔加入１ｍｌＰＢＳ溶液清洗后弃掉ＰＢＳ溶液。（巧６３、根据细胞（小于５ｘｌ０个细胞），直接将３５０ＢｕｆｅｒＲＬＴ直接加入孔内，充（）叫分裂解３ｍｉｎ。（４）、加入与Ｗ上裂解液等体积的７０％的乙醇溶液，充分吹打，不寓也。５、将Ｗ上细胞液收入１．５ｍｌ离也管中，ｌＯＯＯｉｐｍ离也５ｍｉｎ。（）６、转移Ｗ上液体７００（包括任何的沉淀）到配有２ｍｌ收集管的ＲＮｅａｓ也（）叫ｙ离柱中，轻叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２０ｓ后，弃掉滤液。（７）、加入７００＾ｌｌＢｕｆｅｒ民＼￥１清洗柱子，轻叩盖子，１１００〇３离也２化弃掉滤液。巧）、加入５０〇ｎｌＢｕｆｅｒＲＰＥ清洗柱子，轻叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２０ｓ，弃掉滤液。（９）、再次加入５００叫ＢｕｆｅｒＲＰＥＷ再次清洗柱子，轻叩盖子，ｌｌＯＯＯｇ离也２ｍｉｎ，并弃掉滤液。１０、２ｍＩｍｎ（）将柱子转移至新的ｌ收集管中，全速离也ｉ。＇１、１５ｍ，４０ＲＮＡ＂ＯＯＯ。将柱子转移至．ｌ离。管中力口入酶水，也Ｉｍｉｎ，）山去ｇ离洗脱ＲＮＡ。如果ＲＮＡ的量大于３０腿，可Ｗ再次加入４０叫去ＲＮＡ酶水Ｗ重复Ｗ上洗脱步骤，或者用Ｗ上洗脱液重复洗脱。’０００－（１２）、用ＮＤ１微量吸光光度计检测浓度，分装并于８０Ｃ冰箱保存Ｗ备用。注：①在提取ＲＮＡ的全过程所用水全部为去ＲＮＡ酶的水。操作全程都需要戴手套及口罩，ＲＮＡ，提取过程尽量迅速，Ｗ防止ＲＮＡ降解样本需要分装后再冻存。②所用于实验的ＲＮＡ样本，２６０／２８０：２．０左右。２．全基因组ＤＮＡ甲基化敏感性限制性分析（ＭＳＲＡ）在本实验当中，我们用于刺激细胞的阳性刺激物是已报道的可Ｗ调节ＤＮＡ甲基一５－５ａｚａｃ）ＤＮＡ甲化水平的氮杂胞嚼巧核巧（。研究表明，５ａｚａｃ是种可Ｗ让基化水平降低的阳性刺激物。而且我们知道多种技术平台与手段都可Ｗ用于评估ＤＮＡ甲基化水平一一，其中种较为方便、便利的种方法是甲基化敏感性限制性分析（ＭＳＲＡ）ＰＵ巧方法是利用两种限制性内切酶ＭｓＩ及Ｈａｌｌ，Ｍｓ议邮ａｌｌ是彼此的同列敵它ｐｐｐ们可Ｗ对不同甲基化状态的ＣｐＧ二核昔胞喀巧识别并剪切，Ｈｐａｌｌ只能识别非甲基化的ＣｐＧ二核巧胞喀晚，而ＭｓＩ既可Ｗ识别非甲基化的ＣｐＧ二核昔胞略巧ｐ，也可Ｗ识别甲基化了的ＣｐＧ二核昔胞嚼瞎。该部分实验所用的阳性对照ＤＮＡ样本为ＬａｍｂｄａＤＮＡ，该ＤＮＡ分子，大小为４８５０２ｂｐ，其分子上面各有１７个ＭｓｐＩ及Ｈｐ加的酶切位点，３１ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文Ｗ此ＤＮＡ作为鉴定酶切体系是否工作的标准。酶切过后，制备１％琼脂糖胶对酶切产物进行鉴定，被酶切的并应用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件进行灰度分析，评定ＤＮＡ甲基化率。２．１实验所用试剂盒及耗材本部分实验所用试剂主要是ＭｓｐＩ及Ｈｐａｌｌ内切酶、ＬａｍｂｄａＤＮＡ等详细信息见，表６表６：ＭＳＲＡ实验所用试剂或耗材及仪器详细信息试刑金、巧械仪當铺货号獻他＾Ｍ巧Ｉ内切酶Ｒ０１０化购于ＮＥＢ公司Ｈｐａｌｌ内切酶Ｒ０１７１Ｌ购于ＮＥＢ公司ＬａｍｂｄａＤＮＡＮ３０１１Ｓ购于ＮＥＢ公司—购于北京环宇金鹰公司ＳＯｘＴＡＥｄｉｆｅｒＷ（ＤＬ５－１ＤＮＡｒｉｄｅｒａｎｇｅ００２０００）ｍａｋｅｒＤ５胸于ＴａＫａＲａ公司１９Ａ２丄ＩＭＳＲＡ实验步骤２．１丄１酶切反应１、调整样本ＤＮＡ浓度，取叫ｇＤＮＡ样本。（）（２）、按照下体系配置酶切反应液。海巧反应组々巧ｐｌ体系ＤＮＡ模板／ｌｘ样本ｊｇＢ５１／样本ｌＯｘＮＥｕｆＦｅｒ＾限制性内切酶ｌＯｕｎｉｔｓ／样本蒸馈水至２５＾１１／样本３，（）、轻弹混匀不可祸旋震荡。’（４）、３７Ｃ金属浴，解育１小时。（５）、加入６ｘＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒ终止酶切。２丄１２配制１％琼脂糖凝胶．，并跑胶鉴定酶切情况，Ｗ判断ＤＮＡ甲基化水平１、将ＳＯｘＴＡＥ溶液稀释５０倍，配制成ＩｘＴＡＥ溶液，并称取２，（）ｇ琼脂糖（２）、并加入２００ｍｌｌｘＴＡＥ溶液，凉至微烫，加入核酸染色液。３、倒板，放置于室温，２５ｍｉｎ。（）４、上样。（）３２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文５、２００Ｖ恒压，２０ｍｉｎ。（）（６）、用凝胶成像仪照片，并用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件分析灰度，鉴定ＤＮＡ甲基化水平。－ＲＮＡＤＮＡＤＮＡ甲基３．通过ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检測受剌巧鄉胞样本中去甲基化巧及化转移庚的相对表悲量３丄本部分实验所用试剂盒及耗材，详细信息同表３．３．２实验步骤３２．ｃＤ．１ＮＡ的合成具体实验步骤同前，详见１丄３．２．１将ＲＮＡ样本逆转录为ｃＤＮＡ的过程。３２２－ｍＲｅａｔＲ检测ＴＥＴｓ、ＴＤＧ、ＤＮＭＴｓ。．．ｌｉｅＰＣ的相对表达量－具体实验步骤、扩增体系、扩增条件、扩増引物等同前，详见Ｌ１．３．２．２ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ过程。４．统计学分析１、ＭＳＲＡ实验结果应用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件进行灰度分析。２－－、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ实验数据Ｗ相对表达量２ＡＡｃｔ表示，其中的数据使用ＧｒａｐｈＰａｄｐｒｉｍ５软件进行统计学做图和分析，结果中组间差异比较的统计采用＊＊＊＊＊＊Ｕｎｐａｉｒｅｄｔｔｅｓｔ方法进行计算；ｐ值＜０．０５、ｐ值＜０．０１及ｐ值＜０．００１均被认为有显著统计学差异。二、实验结果１－…７ＲＶＤＮＡ去甲基．利用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ实验，检測两种细胞裂解抗原則澈组化巧及ＤＮＡ甲基化转移麟鋪结核病相关抗原Ｈ３７ＲＶ，对细胞的刺激作用，随着时间不同而有所差异，收集Ｒｅａ－ｔＰＣ民检ＤＮＡ甲基加入刺激物后不同时间点ＲＮＡ样本并进行ｌｉｍｅ测，对调节化水平降低的ＤＮＡ去甲基化酶及调解ＤＮＡ甲基化水平上调的ＤＮＡ甲基化转移酶的表达水平进行检测。对不同时间点基因的相对表达量进行差异分析发现：无论是５４９还ｅａｓ－２Ｂ细胞Ａ是Ｂ，再加入拟７Ｒｖ抗原刺激４ｄ后，在ＤＮＡ甲基化水平降低时，均可检测到Ｈ３７ＲＶ刺激组ＤＮＡ去甲基化酶的差异性表达上调。这与临床检测结果肺结核病人组ＤＮＡ去甲基化酶差异性表达上调相吻合。而对于ＤＮＡ甲基化转３３ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄＇学位论文移酶（ＤＮＭＴｓ）在Ａ５４９细胞中，Ｈ３７ＲＶ刺激组可检测到差异性表达上调（ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）－２ＢＨＲＶ。这与临床样本检测结果趋势相同。而在Ｂｅａｓ细胞３７刺激组中发现ＤＮＭＴｓ差异性表达下调。详见图５。ＡＡ５４９ＴＢＴ！ｍ２ＴＢＴ５？＊？？’…＂＂＂］１３ＤＮＭＯｎｍｉＡＤＴＢＴ１ＮＭ３。￣却■頓，琴，ＢＢｅａｓ－沈ＴＰＴ５ＴＥＴ３Ｔ饥ｍｅＴ１ＴＥＵ？…相心山１１１／／／／／／／／圓＂圆？ＤＮＭＴ３Ａ’．，…＂＊＊］１＾＾化ＤＮＡ基化转巧巧甲１／／／／／／５－２ＢＤＮＡ去ＤＮＡ甲基化转移图：Ｈ３７Ｒｖ刺激Ａ５４９、Ｂｅａｓ第四天甲基化酶及酶表达情况Ａ组：Ａ５４９细胞被Ｈ３７ＲＶ刺激第巧天ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶表达Ｂ组Ｂｅａ－２ＢＨ３７ＲＶＤＮＡＤＮＡ情况，ｓ细胞被刺激第四天去甲基化酶及甲基化转移酶＜０＊＊＜表达情况．０５、＜０．０１０．００１。。值值及Ｖ值均被认为有显著性统计学差异２．利用ＭＳＲＡ实验，检测不同刺激物刺激不同时间所收集的细胞ＤＮＡ样本甲基化水平对ＤＮＡ样本进行ＭＳＲＡ检测实验，结果发现５ａｚａｃ阳性刺激物都可Ｗ降低ＤＮＡ甲基化水平，这与临床全基因组甲基化芯片结果相同。具体体现为；在加入刺激物一三、四天ＤＮＡ甲基化改变较明显后第天开始出现甲基化水平下降，第，，即随３４ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文时间变化，ＤＮＡ甲基化水平降低逐渐明显。详细情况见图６。ＨＰＡ２＋ＭＳＰｌ＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋Ａ５４９－＿＿ｃｏｎ化〇１５。，。－Ｈ３７＂ｖ．ｓ‘ＢＨＧＳＢＰＢｅａ－ｓ２ＢＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ１＋ＨＰＡ２＋ＭＳＰ＋＿＿１＿＿ｃｏＷｒｏｌ５ａｚａｃ－ｓｔｉ＾｜ｇ＾｜｜Ｈ３７Ｒｖ－ｓｔｉ图６：不同刺激物不同时间对细胞ＤＮＡ甲基化的影响５ａｃａｃ３７ＲＶ５４９Ｂ－２ＢＮＡ甲及Ｈ抗原刺激Ａ、ｅａｓ细胞，Ｄ基化程度从刺激ｄｌ开始出现降低，ｄ３、ｄ４降低较明显。３．５ａｚａｃ及Ｈ３７ＲＶ裂解抗原对细胞的刺激作用的时间动态图一ＤＮＡ甲基化、为了进步明确肺结核病与之间的关系，我们分析了０点加入刺激物后Ｉｄ、３ｄ、４ｄ、６ｄ不同时间点的ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥ巧、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）及ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ的表达情况，结果显Ａ５４９细Ｂｅａ－２Ｂ，７Ｒｖ）示：无论是在胞中还是在ｓ细胞中从加入抗原刺物（Ｈ３第一一ＤＮＡ去甲基，天开始，化酶随时间变化逐渐升高详细见图７。且在刺激第天时阳性刺激物（５ａｚａｃ）和抗原刺物（Ｈ３７ＲＶ）对ＤＮＡ去甲基化酶的作用显著且相似，一，表达量湿著改变的酶ＷＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１２、ＴＥＴ３、且在剩激第天时、ＴＥＴＴＤＧ）为主。详细见图８。３５ 中国医学科学院北京协和医学院硕丄？学位论义ＡＡ５４９师丽ＴＤＧＴＥＴ３＊１？？￣——￣Ａ奉踰Ｉ］ＩＩ？…。ＤＮＡ去甲基化廣Ｉ＾，＾：：可￣—ｉ？Ｗ＾ｉ１１１ｒｆｌ．」＾＾＾＾去ＤＮＭｎＤＮＭＴ３ＡＤＮＭＴ３Ｂ。，＂？？？瓜］’口１口１口，．，？？５３Ｔ－ＷＩ＂？ＭＷＤＮＡ甲基化转務Ｒｉ…ｉ…一＾＂杉―—Ｊ——￣—，，，１Ｉ〇１１ｊ１ｉ１山Ｉ１１０々Ｉ１４４夺冷夺？４ＢＢ－化Ｓ２ＢＴＥＴ１ＴＥＨＴＥＴ３ｍｃ：卫２丑１口１叫Ｉ？访ＴＰｖＩＩ＾快＊細ＤＭ去甲麵Ｉ令＾＾１＂〇。Ｔ１１－．．■——？？７ＯＪ１ＩＩＴ主Ｍ１，ｒ，ｒ＂ＩＩ１１去Ａ夺？＊＾＾＾４去夺？？ＤＮＭＴ１ＤＮＭＴ３ＡＤＮＭＨＢ＂＇＋臨Ｉ１Ｉ？恤Ｗ／Ｉ３＂Ｉ＇ＤＮＡ甲＊’％＇基化巧巧？、＞！＂化１＾化＊—￣—？＊＂ＪＩ１ＩＩＩＪ￣Ｉ１１１ＩＯｊＩＩＩＩＩ７Ｈ３７Ｒｖ－、５ａｚａｃＡ５４９、Ｂｅａｓ２Ｂｓ、ＴＤＧ、ＤＮＭＴｓ图：刺激两种细胞不同时间ＴＣＴ的变化趋势ＨＲｖ）Ａ５、Ｉｄ、Ａ组：Ｈ組实验（ｃｏｎｔｒｏｌ组、５ａｚａｃ刺激姐、３７剩激组４９细胞Ｏｄ３ｄ、４ｄ、６ｄＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶的表达稳势。Ｂ姐：Ｈ组实验组３７ＲＶａ－２ＢＩ、、６（ｃｏｎｔｒｏｌ组、５ａｚａｃ刺激、Ｈ刺激组）Ｂｅｓ细胞Ｏｄ、ｄ、３ｄ４ｄｄＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶的表达趋势。３６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文Ａ：Ａ５４９－Ｗ巧巧Ｈ，Ｔ１川巧１０ＴＤＯ，＊＂／ｉ．＾拖报掠＇＇＊／／／／／／／／／〇ｄ１ＤＮＭＴ１ｄ１ＤＮＭＴ３Ａｄ１ＤＮＭＴ３Ｂ．－含１。？５２．０１，Ｉ１１｜ｉＩｆｉｌｉｌｌＩｍ＇／＇／／／／／／Ｂｄ１巧Ｔ２ｄ１ＴＥＴ３ｄ１ＴＤＧ－＊＊＜．１－Ｓ１５１１方￣￣１｜口－ＩＩｒ＾ｉｉｌｍｌｌｌｌｌｌｌＪｔ／／／／／／／／／ｄＩＤＮＷｎｄ１ＤＮＭＴ３Ｂｄ１ＤＮＭＴ３ＡＡ５４９Ｂｅａ－８ＩＤＮＡ图：胎７Ｒｖ及５ａｚａｃ刺激、ｓ２Ｂｄ后表达趋势相同的去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶Ａ姐：Ｈ３７ＲＶ及５ａｚａｃ刺激Ａ５４９Ｉｄ后表达趋势相同的ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲－基化转移酶。Ｂ组：Ｈ３７ＲＶ及５ａｚａｃ刺激Ｂｅａｓ２ＢＩｄ后表达趋势相同的ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶。３７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文兰、小结本部分实验，主要利用ＭＳＲＡ实验方法检测了ＤＮＡ甲基化的变化情况，同时Ｒ－应用ｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ技术检测了ＴＥＴｓ、ＴＤＧ及ＤＮＭＴｓ的相对表达量：。结果显示－１、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣ民实验中，在加入刺激物刺激４天时，两种细胞拟７Ｒｖ刺激姐都可Ｗ检测到ＤＮＡ去甲基化酶表达显著升商，这与临床样本检测结果相吻合，这提示我们ＤＮＡ去甲基化酶可能是促使形成ＤＮＡ低甲基化趋势的主要影响因素。２、在Ａ５４９细胞中Ｈ３７ＲＶ刺激组ＤＮＡ甲基化转移酶表达显著升高，这与临床Ｒ－ｔ样本检测ｅａｌｉｍｅＰＣＲ结果肺结核病人组ＤＮＡ甲基化转移酶差异表达情况相吻－合，在Ｂｅａｓ２Ｂ细胞中Ｈ３７ＲＶ刺激组ＤＮＡ甲基化转移酶差异性表达降低，这与目前理论研究相符合，但确与临床检测结果不相符，这说明Ｈ３７ＲＶ抗原对两种细胞的ＤＮＡ甲基化转移酶的刺激效果是非特异性的，这间接地说明了，ＤＮＡ甲基化转移酶可能并非肺结核病人ＤＮＡ低甲基化庭势形成的影响因素。３、在ＭＳＲＡ实验中，利用Ｈ３７民Ｖ裂解抗原刺激细胞可Ｗ使ＤＮＡ甲基化降低，即与全基因组甲基化芯片检测临床ＤＮＡ样本所发现的肺结核病人ＤＮＡ低甲基化趋－势相符，且随着随时间变化ｅａｌｔｉｍｅＣＲ实验，ＤＮＡ甲基化水平降低逐渐明显。ＲＰ７Ｒｖ一中，ＤＮＡ，在加入拟抗原刺激天后去甲基化酶随着时间变化逐渐升高。这两方面存在相关性，呈负相关。即随着时间推移，ＤＮＡ去甲基化酶表达逐渐升高，且ＤＮＡ甲基化水平逐渐降低。４一、在刺激第天时阳性刺激物５ａｚａｃ）Ｈ３７ＲＶ）ＤＮＡ（和抗原刺物（对去甲基一天时显著改变的酶ＷＤＮＡ去甲基化酶的作用显著且相似，且在刺激第，表达量３一化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ、ＴＤＧ）降低为主，这与第天ＤＮＡ甲基化无明显变化存在相关性。３８ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文讨论本文首先收集了肺结核病人及其健康人全血样本，提取ＤＮＡ，利用全基因组甲基化孩片技术平台初步明确了肺结核病人ＤＮＡ低甲基化状态。同时，我们提取全Ｒ－血ＲＮＡｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ技术检测了活动性肺结核病人即将康人群全血ＲＮＡ，利用中ＴＥＴ、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ犯的表达情况Ｗ探索导致肺结核病人ＤＮＡ低甲基化状态的可能影响因素，Ｗ初步建立ＴＥＴｓ、ＴＤＧ、ＤＮＭＴｓ与肺结核病人ＤＮＡ低甲基化状态之间的相关性。随后，我们在体外，利用Ａ５４９、一Ｂ－２ＢＤＮＡｅａｓ两种细胞系模拟肺结核病低甲基化状态，并在体外进步探求造成ＤＮＡ低甲基化状态的可能的原因。一ＤＮＡ去甲基ＤＮＡ、肺结核病人化酶ｊ彭咱低甲基化趋巧的相关性分析在本课题第一ＤＮＡ进行了全基部分中，首先我们对肺结核病人及健康人全血因组甲基化水平检测ｅａ－ｔｍｅＰＣ民实验，然后利用ＲＮＡ样本，进行Ｒｌｉ，分别检测了可Ｗ下调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ），然后为了从多个角度进行验证＞ＤＮＡ甲ＤＮＡ甲（１上，检测了可＾调基化水平的基化转移酶。结果显示，活动性肺结核病人ＤＮＡ呈现低甲基化状态。而且实时巧光定量ＰＣＲ结果显示，在已报道的可Ｗ参与调解ＤＮＡ甲基化水平改变的ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）在肺结核病人组全部差异性表达上调。ＤＮＡ甲基ＤＮＭＴ一ＤＮＡ甲化转移酶（ｓ）中只有种基化转移酶１（ＤＮＭＴ１）表达显著升髙。在体外细胞刺激试验中，在两种细胞Ｈ３７ＲＶ刺激组，首先检测ＤＮＡ样本，ＤＮＡ甲基化水平呈下调趋势，且随着时间改变，ＤＮＡ甲基化降低明显。然后检测ＲＮＡ一样本，在ＲＮＡ水平上，Ｈ３７ＲＶ刺激姐中ＤＮＡ去甲基化酶在刺激天后表达逐渐升高，ＤＮＡ去甲基化酶表达随时间无特异性表现。且两株细胞在加入Ｈ３７ＲＶ抗原刺激四天后都检测到了不同ＤＮＡ去甲基化酶差异性上调（Ａ５４９细胞ＴＥＴ２、ＴＥＴ３差异性上调Ｂｅａｓ－化中ＴＤＧ）ＤＮＡ甲差异性表达上调；同时也检测到了不同基化；３Ａ－转移酶的差异表达（Ａ５４９细胞ＤＮＭＴ、ＤＮＭＴ３Ｂ差异性表达上调、Ｂｅａｓ２Ｂ中ＤＮＭＴ３Ａ差异性下调）。首先，通过对临床检测结果及体外细胞刺激试验结果进行分析发现：在临床样本检测实验部分肺结核病人组，表达显著升高的相关调节ＤＮＡ甲基化的酶中，主要Ｗ可促使ＤＮＡ甲基化水平下调的ＤＮＡ去甲基化酶为主；而且体外细胞刺激实验肪７Ｒｖ刺激组也检测到相应ＤＮＡ去甲基化酶的表达显著升商。因为ＴＥＴｓ及ＴＤＧ主要参与ＤＮＡ的主动去甲基他过程，Ｗ上这些结果与ＤＮＡ低甲基化趋势相吻合，而且与目前研究理论相符合。所Ｗ这些结果都提示我们在肺结核病的发生发展中，３９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文肺结核病人体内ＤＮＡ低甲基化趋势可能主要是由去甲基化酶参与调节的。其次，临床检测结果及体外细胞刺激试验结果也显示：无论是临床检测结果还是体外细胞刺激实验结果，都能发现上调ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ甲基化转移酶都一有不同程度的差异性表达。方面，在临床样本肺结核病人组及Ａ５４９细胞Ｈ３７ＲＶ刺激组表现为ＤＮＭＴｓ上调。因为ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴｓ）对ＤＮＡ甲基化水平的调控也发挥着重要作用、扮演着重要角色。那它们差异性升高可能的原因是：一组ＤＮＡ低甲基化趋势是一，全基因个整体上的反映，这避免不了在这种整体低一些基因的ＤＮＡ甲基化水平是升高的些基因需要甲基化趋势的结果中，仍有，这一些功能的正常巧使那么甲基化水平升富来维持机体正常状态Ｗ及，这些基因，ＤＮＡ高甲基化水平可能就需要ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴｓ）参与调节。二，目前有研究表明ＤＮＡ甲基转移酶（ＤＮＭＴｓ）可Ｗ促进胞喀瞎被氧化了的第５位碳原子上取代基的添加或移除，在体外已经证明了ＤＮＭＴｓ可Ｗ与５ｈｍＣ相互作用，所Ｗ５２９ＤＮＭＴ［’ｓ理论上是可Ｗ参与去甲基化过程的气但这种逆转的ＤＮＭＴｓ的作用的生一一。物相关性还未可知，这方面可能是比较有趣的去甲基化机制的另个关注点另一Ｂｅａｓ－２ＢＨ３７ＲＶＤＮＭＴｓ方面在细胞中刺激组表现为差异性表达下调，这与目前研巧进展也是想符合的，ＤＮＭＴｓ是参与上调ＤＮＡ甲基化水平的主要酶，这项结果一表明，ＤＮＡ，可能在机体ＤＮＡ甲基化水平降低的过程中甲基化转移酶也起着定一作用，也是其中的调控因素之。：ｎ、肺结核病人的低甲基化趋势可能通过增强免疫应答来影响疾病的发生发展ＤＮＡ甲一ＮＡ甲基化是调节免疫系统的重要机制之，而且Ｄ基化主要是通过影响基因表达来发挥调节作用的。而且目前对于结核病宿主体内甲基化情况的报道相对较少一。因此，因此了解活动性肺结核病人ＤＮＡ甲基化水平对于进步研巧宿主免疫系统的应答机制有着重要意义。在肺结核病人体内，ＤＮＡ甲基化水平降低，而ＤＮＡ甲基化水平减低可Ｗ通过影响功能蛋白的上调表达进而影响疾病的发生发展ＰＳ’９９一。这为新型药物的研发Ｗ及新型治疗手段的探求开拓了条新的道路。在目前的研究进展当中，ＤＮＡ甲基化可Ｗ通过调节免疫系统应答来影响多种疾病的进展，，，研巧最多的就是肿瘤疾病当然近年Ｗ来ＤＮＡ甲基化设计的疾病越来越多、，种类也越来越广。比如糖尿病、屯血管疾病、风湿性疾病、乙肝、寄生虫感染等多种慢性病及感染性疾病等等一部分中对全基因姐ＤＮＡ甲。而本课题第基化苍片的方法获得的差异位点所涉及基因进行归类分析一，我们发现有相当部分基－因定位在了与肺结核病免疫应答密切相关的抗原呈递及ＩＦＮＹ介导的信号通路上。这与已报道的大量研究成果非常接近这都提示我们，肺结核病人ＤＮＡ低甲基化可能影响其免疫应答过程，而且肺结核病的发生发展与ＤＮＡ低甲基化状态密４０ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文切相关。Ｓ、ＤＮＡ去甲基化巧及ＤＮＡ甲基化转移巧在同种剌激物剌激过的不同细胞中差异表达的趋巧及种类不同一ＲＶ，实验结果表明，种刺激３７对于同，例如用Ｈ裂解抗原刺激两种细胞时ＤＮＡ甲基化转移酶ＤＮＭＴｓ在两种细胞Ｈ３７ＲＶ刺激姐中虽然表达都有显著改变，Ａ５４－，而在Ｂｅａｓ２Ｂ但其差异表达的趋势不相同，在９中表达显著升高中表达湿著一降低。而且两种细胞即便是同类酶表达量趋势相同，表达显著改变的酶的具体种一３７ＲＶＡ５４９和Ｂ－样，虽ｅａｓ２Ｂ两种类也不，具体举例来说，对于同样的Ｈ刺激然细胞均有Ｈ３７ＲＶ刺激组ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴｓ及ＴＤＧ）表达的显著升高，但具体差异表达的ＤＮＡ去甲基化酶种类却不完全相同：在Ａ５４９中表现为ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、Ｂ－２ＢＴＤＧ表达湿著升高ｅａｓ表达显著升高。这竖实验结果与目，而在中之表现为、ＤＮＡ甲前理论研究是相符合的。有研巧表明，在糖尿病屯肌细胞中基化转移酶ＤＮＭＴ一ＤＮＡ甲ＤＮＭＴＡ１ＤＮＭＴ３Ｂ表达上调３及，而另外种基化转移酶差异性ＰＳｌ一些疾病中表达下调。而在另外，如乳腺癌中，ＤＮＭＴ３Ａ却差异性表达上调送种结果可能是由于：首先，这可能与细胞类型不同，功能不同，那么参与不同功能调节的ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶类别或种类就有所不同。其次，调节ＤＮＡ甲基化水平的ＤＮＡ去甲基化酶及ＤＮＡ甲基化转移酶在不同细胞中的表达是不完全相同的，及具有细胞选择性。４１ 中国医学科学院北京协和医学院硕古学位论文结论本课题首先分析活动性肺结核病人和健康人全基因组ＤＮＡ甲基化水平，同时＇ａ－提取全血ＲＮＡ样本，进行ＲｅｌｔｉｍｅＰＣＲ实验，检测ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴ１ＪＥｌＳ、ＴＥＴ３、ＴＤＧ）及ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）的相对表达水平。随后我们在体外利用阳性刺激物５ａｚａｃＷ及肺结核病相关抗原Ｈ３７ＲＶ刺激Ａ５４９－、Ｂｅａｓ２Ｂ、ＤＮＡ、Ｒ两种细胞系，进行模拟实验，收集细胞上清ＮＡ样本，利用甲基化敏感性限制性分析（ＭＳＲＡ）实验技术检测ＤＮＡ样本，观察ＤＮＡ甲基化水平的改变。并且同时对不同时间点所收集的ＲＮＡ样本进行实时巧光定量ＰＣ氏检测目前已报道的可Ｗ调节ＤＮＡ甲基化水平降低的ＤＮＡ去甲基化酶（ＴＥＴｓ、ＴＤＧ）及可Ｗ调节ＤＮＡ甲基化水平升高的ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴｓ）的表达情况。结果发现：１、ＨＲＶ无论在活动性肺结核病人中，还是体外细胞刺激实验３７抗原刺激组中，ＤＮＡ甲基化呈现低甲基化趋势。２ＤＮＡ去甲ＤＮＡ、在在结核病人体内，基化酶可能是参与其低甲基化趋势的主要的酶。３、而对于ＤＮＡ甲基化转移酶，由于其表达变化无明显特异性，它对肺结核病人ＤＮＡ低甲基化趋势的调控作用不明确。但它确实差异性表达，这说明可能体内，其他生物过程如其他基因的高甲基化状态，需要它的维持。４２ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文的文献１．Ｇａｉｎｓｉｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌａｔｒｉｓｋｄｕｅｔｏ３ｍｉｌｌｉｏｎｍｉｓｓｅｄａｔｉｅｎｔｓａｎｄｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＰｒｏｒｅｓｓｐｇｇｉｎＴＢｃｏｎｔｒｏｌｃａｎｂｅｓｕｂｓｔａｎｔｌｌａｃｃｅｌｅｒａｅｄｂａｄｄ巧巧ｉｎｈｅｓｅｈａｌｌｅｎｅｓｅ打ｕｂ／＇ｃｉａｙｔｙｇｔｃｇ．Ｃｔ扣ｒＪＰｅｏ化－Ｈ／７２０１３２１：２％２３７．，２．Ｌｏ巧ｎｚｒｏｍｂＰｃｈａｌｍｅｄａｏｕｓａｄａＬＭａｌａｒｄｏｅ〇／ｎｒａｎａＩｉＪＣＴｏｎｅＡＲｏＣＤＡｉＬＲＴｔ．Ｉｔ巧，，，巧，，ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗ化ｈｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡａｓａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｉｎ呂ｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ：ｕｓｅａｇａｉｎｓｔｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｓ／ＷＣ执ｏｔｅｃｈ打〇／２０１０，１０＾７．＇＇ｔｅｎｄａｈ－－ｍｍｕｎ３－ｅｒｌｈｏｒｔｅｎｎｅｓｈｏｒｔｃｏｕｒｓｅｔｈｅｒａｎｓｈｔｓｎｔｏｈｏｓｔ．Ｓｃｈｏｎ１ｍＭＳ０．ＳｉｔｈｉｉｉｉｉｔＸ，ｇｐｙｇｙｍａ巧ａｍｅｎ－ｃｏｎｔｒｉｂ川ｅ化ｎｅｗｔｔｔ巧巧ｔｅｉｅｓｆｏｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．■／扣ｔｅｍＭｅｏｆ２０１３巧３：％８３８２．ｙｇ，－ｅ４ｌａｒｆｎｆ．ＫｕｎｎａｔｈＶｕｄｈａｎＳＰｏｃｅｌｌｉＳＡ．ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＤｅｉｉｎｔｈｅＩｍｍｕｎｏｒｏｔｅｏｍｅｏｙ，ｇｐＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ化ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．片ｏｎｔ／ｍｍｉｉ打〇／２０１３，４：巧５？５．ＢｏｚｚａｎｏｔＭａｒｒａｓｔＤｅＭａｒｉａＡ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆ化ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｅ曲化片７片ｅ／ｎｏｔｏ／／ｎ／ｅｃｔＤ／ｓ２０１４，６：ｅ２０１４０巧．＾州６．ＢｅｈａｒＳＭＣａｉｔｅｒＳＭ化ｏｔＭＧＢａｒｂｅｒＤｌ＿ＪａａｒａｍａｎＰ．ＯｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｕｌｍｏｎａｒＴｃｅｌｌ，ｐ，ｙ，，ｙｐｙＭ■ｍｍｕｎｉｔｄｕｒｉｎｃｏｂａｃｒｕｍｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｍｕｎｉｎ化ｒｎｊｕｓ■ｍ，打ｍｍｕｎｏ／ｉｙｇｙｔｅｉｔｉｉｔｙｉｐｔ．Ｓｅ／－２０１４２６：５５９５７７．，－Ｍｅ７．ＳｏＪＳＫＧＳｏｎＭｒｋｅｔＣｆ／６ｏｘｆｉａｖｏｎｅｎｈｂｓｉｍＣＬｅｅＣＧＰａＥＫｉｍＨＪ．ｔｈｉｉｉｔＮＦＡＴ，，ｇ，，，，ｙ巧－ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｉｎ化化ｅｎｕｃｌｅｕｓａｎｄｓｕｐｐｓｓｅｓＴｃｅｌｌａ如ｖａｔｉｏｎ．ｉ／ｍｍｕｎｏ／２０１４１９３。７７２２７８３．，ｍａｎ－．Ｂｅｏｓｔｏｓｌａｖｓｋｄｅｍｅｈｌａｏｎ：ｒｎｉｎｅｎｅｓｏｎ〇／Ｃ／ｒｅｍ巧９８巧Ｍ．ＤＮＡｔｔｉ化．扣１９９８：４０１４０７．乂ｙＲｙｇ邑，－．Ｌａｎ化ａｏｅ〇／．ｒｅｕｌａｔｏｎｏｆｃｏＲＮＡｂａｔｔｓ９ｉＤｉＸＰＺｈａｎｇＷＳｕｎＳＨ化ＧＹｔＵｐｉＭｉｒ１４６ａｉｉ化，，，ｇＸ，ｇｙＨ巧ＢＶｉｒｕｓＸＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｔｒｉｂｕ化ｓ化ＨｅｐａｔｉｔｉｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙＤｏｗｉｕｅｇｕｌａｔｉｎｇＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＦａｃｔｏｒＨ，ＭＢｉｏ２０１５，６．１０ＡｔｓｂａＭａｓｚｅｗｃｚＭｏｎｕｓｚｋｏｋｌｉｎｓｋｉＪＡｌｌａｅｒｃｒｏＲｕｌａ化ｒｓｏｆ．ＲｕｓｅｋＡＭｉＡｉＭＮｉＨ．ＭｉＮＡｍｏｄ，，巧，，，ｇｙｅｅｎｅｃｒｅｕｌａｔｉｏｎｈｅｔｕｍｏｒｍｃｒｏｅｎｖｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｉｍｍｕｓｓｅｍｎｌｕｎｃａｎｃｅｒｏｌｐｉｇｔｉｇｔｉｉｎｅｔｉ．Ｍ，ｙｇＣａｎｃｅｒ．２０１５１４：３４，＂１１．ＡｎｓｅｌＫＭ，［）ｕｉｅｔｉｃＩ，ＴａｎａｓａＢＲａｏＡ．Ｒ巧ｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｈ２ｄｉｆｆｅｗｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄ１１４ｌｏｃｕｓａｃｃｅ巧ｉｂｉｌｉｔ．ｊ，ｙＡｎｎｕ－ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２００６２４：６０７６５６．，１２．ＯｋｉｔｓｕＣＹ，ＨｓｉｅｈＣＬ．ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｄｆｉｃｉｔｙｏｆｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５－Ｍｅｔｈｌｃｔｏｓｉｎｅ．ＳＭＣ／？货Ａ／ｏｔ的２０：１５８：１０２ｙｙ．，１３ＧａｏＲａｎＬＫｏｎＪｉａｎＪＳｏｋｏｌｏｖＷａｎ乂Ａｓｓｅ巧ｍｅｎｔｏｆＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｃｈａｎｅｓｉｎ化ｓｕｅ．Ｙ，ｇ，乂Ｙｇｇｙｇ’－ｃｕ．ｌｔｕｒｅｏｆＢｎｓｓｉｃａｎａｕｓ．Ｇｅｎｅｔ／ｔｏ２０１４５０：１３３８１３４４ｐ，１４．ｉｌｄｔｉｎＶＰＳｏｉｎｔｓｅｖａＳＶＮｉｋ化ｎＰｚｒｅｖＳ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｉｎｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓＮ，，ｉＶＫｏＡｔｈ，ｙｙ巧９－ｏｆｍｅｍｏｒｒｅｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆａｍｎｅｓｉａ．Ｓｅ／？ＧＶＳｒａｍＲ巧２０１５：１４８巧４．ｙ，ｐＳａｎ－１５．ｔｏｓＦ，ＰｅａｔＪ，Ｂｕｉｇｅ巧Ｈ，ＲａｄａＣＲｅｉｋＷＤｅａｎＷ．Ａｃｔｉｖｅｄｅｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｚｏｔｅｓ，，ｙｙｇｉｎｖｏｌｖｅｓｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ．ＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓＣｈｒｏｍａｔｉｎ２０１３６：３９．，＊ａｍｏｓＥｒｏｃｈｏｓｋ－化ｉＭｒａｕｎｎｋＧＧＣａｖａｌｌＮＪ防ｂｅｒｏｅ／．ｉｅｎｅｔｉｃ．ＲＡＧＢＰ口ｄｏＫＳｅｉｓｉ，，ｉＥＭｔ〇Ｅｐ，，，，ｇｃｈａｎｇｅｓｏｆＣＸＣＲ４ａｎｄ化５ｌｉｇａｎｄＣＸＣＬ１２ａｓｒｏｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｓｏｒａｄｉｃｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．户Ｏｎｅｐｇｐ２０１１６：ｅ２９４６１．，－１７ｌｅｅｍｂｂａｓＫＭａｎａｎＭａｚｈｍｅｄＢｌｅｔ如ｅｖｉｅｗｒａｆｒｃａｎｃｅｒ．ＳａＭＡＨＡＡｉＭ．ＲＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｔｈｅｏ．，，，Ｕ，，，ｐｙ’－户ｃｆｋＪｈａｒｍ打２０巧２８：１０２３．Ｐ５１０３２，１８ａｌｔｅｒａｔｉｏｎａ巧ｅｃａｎｃｅｒ／ｏ／ｅｄＲｅ．ＦｕＤ任ＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓｉｎｌｉＲｅｖｉｅｗ．ＡｆＭ２０巧．ｇ（）ｐ巧讯ｕａｎＪ■ｌｏｎｅｓＡｅｅＳＨＮｉＩｉｋａｎｅｔａ／Ｔｈｅｄｎａｍｉｃｓａｎｄｒｏｎｏ油ｃｏｅｎｔｉａｌｏｆ．ｇＬＥＦＨＺＭ．ｔ，，，ｇ，巧，，ｙｐｇｐ４３ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文＇ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓａｔＳ化ｍｃｅｌｌｅｎｅｌｏｄｉｎｗｏｍｅｎｓｃａｎｃｅｒ．化〇５Ｇｅ打ｅｔ２０１２＾：ｅｌ００２５１７．ｇ２０．ＣｈａｎＣＹａｎＷｅｅｚｅｎｂ化ｋＣＭｏｒｉｒｓｏｎｈａｌｅｎｅｓｅｌｏｂａｌｃｏｎｒｏｌｏｆｉｇＶＥｎａＤＡ．Ｃ化化ｔ，，Ｘｇｇ化－ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｒｅ坤ｗｒｏ／ｏｇｙ２０１３１８：５９６６０４．，ＣＣＴｃｈｅｅｎＥＴＢｅ说ｒｒａＭＣＣｏｈｅｎｕｈｅｓＫＣＺｈａｎｅｔ－２１Ｏｆ／ｈｅｅｆｅｃｔｏｆＨＩＶｒｅｌａｅｄ．Ｈｕａｎｇ，ｔｇＸＨ，．Ｔｔ，，ｇｇＺ，ｍｍｕｎｏｓｕｒｅｓｓｏｎｏｎｔｈｅｒｉｓｋｏｆｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｒａｎｓｍｓｓｏｎｏｈｏｕｓｅｈｏｌｄｃｏｎＣｌｉｎｎｅｃｔｉｐｐｉｔｉｓｉｉｔｔａｃｔｓ．Ｉｆｓ４５８－Ｄ：７６５７７４．ｉ２０１，２２．ＦｒａｓｅｒＡ，ＰａｕｌＭ，ＡｔａｍｎａＡ，ＬｅｉｂｏｖｉｃｉＬＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌａｔｅｎｔｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｐｅｒｓｏｎｓａｔｒｉｓｋｆｏｒｍ－巧ｓ－ｕ化ｒｕｉｓｔａｎｔＵｉｂｅｒｃｕｌｏｓｓ：ｓｓｔｅｍａｔｃｒｅｖｅｗｎ／ｂｅｒｃｕｎ１０：巧２３．ｉｄｇｉｙｉｉ．／ｔＪＴｌＬｇＤｋ２００６，２３ａｎＳａｏ＿ｕｏｅｔ〇／ｓｋｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｏｏｒｔ巧ａｍｅｎｔｏｏｍｅｓｎａｅｎ．ＴａｎｇＳＴＹｌＬｉＬｉ？Ｒｉｔｕｔｃｉｔｉｔｓ，，，ｔＬＧＫｐｐ－ａｎｄ－ｎｈｎａ－ＯｎｅＭＤＲＴＢＸＤＲＴＢＣ：ｒｅｔｒｏｓｅｃｖｅｍｕｌｃ饥ｅｒｎｖｅｓａｔｉｏｎｗ化ｈｉｉｐｔｉｔｉｔｉｔｉｇ．２０１３足ｅ扣９４３．２４．ＣａｒｕａｔｉＭＳｃｈｉｒｏｌｉＺａｎｉｎｉＦＶａｎｏｎｉＮＧａｌｌｉＭＡｄｏｒｎｉＦｅｔａｌ．Ａｎｅｗｒｅｄｉｃｔｉｖｅｍｏｄｅｌｆｏｒａｎｇ，Ｑ，，，，ｐｍ－ｗｒｏｖｅｄｒｅｓｒａ化ｒｓｏｌａｔｏｎ巧ｒａｔｅｎＨｎｆｅｃｔｅｄａｔｅｎｗ化ｈＰＴＢ．ｆｉｂｅｒｃｊｓｉｐｐｉｙｉｉｇｙｉＩＶｉｐｉ怯／ｎ７ＴｉＬｇＤ／－拍６２０１４１＆８３１．，２５．化ｎｎａＧＲＧａｎｌｅｂｏｄｌｆｌｍｏＵ巧ＢａｍｏｎｅｌｅｉＪＮＥａＡＴ．Ｐｒｅｖａｅｎｃｅｏｎａｒｊｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ叩ｐ，ｙ，ｐｕｙ）ｇｐ（ｗ化ｈ－ｌｎＨｎｅｆａｎｄｓｅｎｖｒｏｎｓ，ｎ讯Ｃ７打／ｃｒｏ扣０／４９：２３３２３ｔｉｖｉＩＶＡＩＤＳＰＬＷＨＡｉＫｉｉｔｉ／Ｊ／Ｗ２００９ｇ／（），－巧ｓ２６ｌｅｘａｎｄｅｒｈｅｅｍｅｅｎｃｅｏｆｅｘｅｎｓｖｅｌｄｏｊｓｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓ：．ＡＰＥＤｅＰ．Ｔ巧ｔｉｉｔａｔｉＴＢＨＩＶ，ｙｇ（ＴＢ）／ｍｕ－ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｌｔｉｄｏｊｒｅｓｉｓｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈｔｈｒｅａｔｆｒｏｍｅｘｅｎｓｉｖｅｌｉ，ｇｔａｎｔＴＢａｎｇｐｔｙ－－巧ｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔｌｏｂａｌｌａｎｄｎａｎａｄａａｎ打ｅｃｔｓｅｄ／ｃｒｏｉｂ／ｏ／１８：２８９１．ｇＴＢｉＣ．ＣＪ／Ｄ／ＭＺＷ２００７，ｇｙ／，２７．ＡａｇａａｒｄＣ，ＤｉｅｔｒｉｃｈＪ，ＤｏｈｅｒｔｙＭ，ＡｎｄｅｒｓｅｎＰ．ＴＢｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｕｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，’ｍｍｕｎｏ／－Ｃｅ／／＆〇／２００９８７。７９２８６／．，ｔｏＢＰＴｈｅＧ－２８ｌｏｂａｌＰｌａｎＳｏＴＢ２００６２０１５．ａｃｉｏｎｓｆｏｒｌｉｆｅ：化ｗａｒｄｓａｗｏｒｌｄｆｒｅｅｏｆ．ＳｐＴ．化ｔｐｔ，ｔｕｂｅｒｃｕｆＤ－ｌｏｓｉｓ．ｎｔＪＴｕｂｅｒｃＬｕｎｉｓ２００６１０：２４０２４１．ｇ，２９．ＬｉｕＪＴｒａｎＬｅｕｎＡＳＡｌｅｘａｎｄｅｒＤＣＺｈｕＢ．ＢＣＧｖａｃｃｉｎｅｓ：ｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｔｅｎｕａｔｉｏｎａｎｄ，乂ｇ，，ｔ－．ｉｍａｃｔｏｎ巧ｆｅａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｉｃａｃ．ＨｕｍＷｓｃｃ／ｎ２００９５：７０７８ｐｔｙ，ｐｙ．Ｂｒｏｃｋ３０ＩＷｅｌｄｉｎｈＫＬｉｌｌｅｂａｅｋＦｏｌｌｍａｎｎＦＡｎｄｅｒｓ飢Ｐ．ＣｏｍａｒｉｓｏｎｆＵｉｂｅｒｃｕｌｉｎｓｋｉｎ化Ｓｔａｎｄ，ｇ，Ｘ，ｐｏ■－．打化扣巧．ｎｅｗｓｅｃｉｆｉｃｂｌｏｏｄｓｔｉｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｃｏｎｔａｃｔｓＡｍ７Ｒｅｓ／ＶＭｅａｆ２００４１７０：６５６９ｐｈｐ，３１．ＢｅＢｏｕｋｈｅｂｚａＨｌｌｏｎＮＬｉｍａｃｈｅｒＪＭＩｎｃｈａｕｓｅＧ．Ｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｖａｃｃｉｎａｉｏｎｔｏｔｒｅａｔｃｈｒｏｎｉｃ，，，ｐｐｔＭＶＡ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｕｓｉｎｇｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｓ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎ－／ｍｍｕｎ８．ｏ化ｅｒ２０１２：１７４６１７５７，３２．ＥｓｔｅｒｈｕｙｓｅＭＭＵｎｈａｒｔＨＧＫａｕｆｍａｎｎＳＨ．Ｃａｎ化ｅｂａｔｌｅａａｉｎ巧ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｉｎｆｒｏｍ，，ｇｇｅｉｅｎｅｔｉｃ巧巧ａｒｃｈ？ｒｒｅｎ妃Ｍ／ｃｒｏｂ，ｏ／２０１２２０：２２０Ｊ２６．ｐｇ，３３－ａｎｓ－ｒｏｎａ．ＳｉｎＣｈａｎＲＨｕｇＡ．ＤＮＭＴｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｎｈｉｇｈｒｉｓｋｐｅｄｉａｔｒｉｃｅｍｂｙｌ－ｂｒａｉｎ化ｍｏｒｓ．反ｒｐｅ／ｔＯ／ｎ７／ｊｅｒ７ｂｅｂ２０１４１８：１１的１１０７．ｐ巧，ｒｕｕｅｒ－ａｚａｃａｎｎｅｃｏｂａｃｔｅｒａｃｏ３４ｌｓａｓ．ＳｕｔＡＳｉＳＳｉｘｏｕＳＬａｋｈｄａＧｈｌＴｏａｎｅｅｌｌｅＧ．Ｍｉｌｉｉｄ，ｇ，，ｔ化Ｌｙｇｙｐｏｔｅｎｔｌａｔｈｏｅｎｃｔｆｔｏｌｔｆｓｏｃｈｅｍｔｒｐｉａｐｇｉｉｙｅｆｅｃｒｓ：ａｅｒａｔｉｏｎｏｍｏｄｅｌａｎｄｎａｔｕｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂｉｉｓｙ１９９０－８５０２巧：８４９８．，３５．ＡｌｆａｎｏＦＰｅｌｅｔｔｏＳＬｕａｂｅｌｌｉＭＧＢｏｒｒｉｅｌｌｏＧＵｒｃｉｕｏｌｏＧＭａｎｉａｃｉＭＧｅｔａ／．Ｉｄｅｎｔ巧ｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｌｅ，，，，，，ｇｎｕｃｍｏｒ－ｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｐｈｉｓｍｓｉｎＴｏｌｌｌｉｋｅ巧ｃｅｐｔｏｒＣａｎｄｉｄａ化ｇｅｎｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｗａ化ｒｂｕｆｆａｌｏ（Ｂｕｂａｌｕｓｂｕｂａｌｉｓ）？执＼４ＣＧｅｎｅｔ２０１４，巧：１巧．３６．ＭｏｒｔａｚＥ，ＡｄｃｏｃｋＩＭ，ＴａｂａｒｓｉＰ，Ｍａｓｊｅ出ＭＲ｜ＭａｎｓｏｕｒｉＤ，ＶｅｌａｙａｔｉＡＡ／ｅｔｃｒ／．Ｉｎ化巧ｃｔｉｏｎｏｆＰａｔｅｒｎ化巧．．ＲｅｃｏｎｉｔｉｏｎＲｅｃｅｗ化ｈＭｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＪ知打／ｍｍａ内〇／２０１４ｇｐｙ３７－－－－－．ＴｏｒｒｅｓＧａｒｃｉａＤＣｒｕｚＬａｕｎａｓＡＧａｒｃｉａＳａｎｃｈｏＦｉｕｅｒｏａＭＣＦｅｒｎａｎｄｅｚＰｌａＲＢａｅｚＳａｌｄａｎａＲ，ｇ，ｇ，ｔａ，，＊Ｍｅｎｄｏ巧－Ｍ－ｉｌｌａＣｅ〇／．ＶａｒｉａｎｔｓｉｎｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅＵ＞ｒ９ｅｎｅｉｎ巧ｕｅｎｃｅｓｕｓ说化ｉｌｉｔ，ｔ化ｐｇｐｔｙ化４４ 中国医学科学院北京协和医学院硕古学位论文化ｂｒｃｕ．ｅｌｏｓｉｓｉｎａＭｅｘｉｃａｎｏｕｌａｔｉｏｎＪｒｍｎｓ／Ｍｆ２０１３１１：２２０．ｐｐ饥，巧ｓｓ－３８ｕａ巧ｚＥＮｕｎ拉ＣＳａｄａＥＥｌｌｎｅｒＳｃｈｗａｎｄｅｒＳＫＴｏｒｅｓＭ．Ｄｉｆｆｅ巧ｎｉａｌｅｘｉｏｎｏｆＩｂｌｌｌｉｋｅ．Ｊ，，，化，ｔｐｒｅｃｅｐｔｏｒｓｏｎｈｕｍａｎａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．ＲｅｓｐｉｒＲｅｓ２０１０１１：２．，巧－．ＢｅｈａｒＳＭＭａｒｔｉｎＣｌＮｕｎｅｓＡｌｖｅｓＣＤｉｖａｎａｈｉＭＲｅｍｏｌｄＨＧ．Ｌｉｉｄｓｉｓｄ，，巧ｏｐｔｏｓ？加，，，ｇｐｒｏｓｒｅｓｅｎｔａ．ｃ＾ｐｔｉｏｎ：ｌｉｎｋｓｉｎｔｈｅｃｈａｉｎｏｆｈｏｓｔｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎ巧Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｔｏｒｏｂ巧－Ａ／ｎｅｃｔ２０１１１３：７４９７巧／．，＂化ａｏ４０．ＢｅｈａｒＳＭ，Ｍａｒｔｉｎａ，ＢｏｏｔｙＭＧＮｉｓｈｉｍｕｉａＸＸ，ＧａｎＨＸｅｔａ／．Ａｏ化化ｉｓａｎｉｎｎａｔｅ，，ｐｐｄｅｆｅｎｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｇａｉｎ巧Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌ－２０１１４：２巧２８７．，－４１．ＢａｒｎｅｓＰＦＬｅｅｄｏｍＪＭ〔ｈａｎＬＳＷｏｎＳＦＳｈａｈＪＶａｃｈｏｎＬＡｅｆ／．Ｐ化ｄｉｃｔｏｆｓｈｏｔｅｒｍ，，ｔｃ巧ｏｒｔ，，，ｇ，巧８－ｒｏｎｏｓｓｎａｔｅｎｗ化ｈｕｌｍｏｎａｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ打ｅｃｔ执５１９８８：３６６巧１ｐｇｉｉｐｉ怯ｐｙ．，．／４２．ＨｓｕＰＣＹａｎＣＣＹｅＨｕａｎＹＣｈｉａｎＰＣＬｅｅＭＨ．Ｐｒｏｎｏｓｉｃｆａｃｒｓｏｆｉｂｅｒｃｕｌｏｕｓｍｅｎｉｎｉｔｉｓ化，ｔｔｏＵ，ｇ，ｇＰ，ｇｇｇｎａｄｕ－ｌｓ：ａ６ｅａｒ巧ｒｏｓｅｃｖｅｓｕｄａｔａｔｅｒｔｉａｒｈｏｓ化ａｔｉｎｎｏｒｅｒｎＴａｉｗａｎ．ＪＭ／ｃｒｏｂ沁／Ｉｔｙｔｐｔｉｔｙｙｐｔｈｍｍｗｎｏ／ｎｅｃｔ／／／２０１０，巧巧ｎ－４３ｌｏｍｒｎｕｎｎｅｕｔｒｏｈｉｌｓｆａｃｉｌｉｔｅａｃｉｖａｉｏｎｏｆｎａｉｖｅａｎｉｅｎｓｅｃ讯ｃＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｓ．ＢｇＲＥ巧ＪＤ．Ｌ枯ｔｔｔ，ｇｐｇｐ－＾ｄｕｒｉｎｇＭｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ化ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．■／／ｍｍｕｎｏ／２０１１１８６：７１１０：１９．ｙ，－ＭａｎＲ４４．ＺｈａｎＸＭａｌｅｓｓｉＬＤｅｒｉａｕｄＥＬｅｃｌｅｒｃＣＬｏ．ＣｏａｉｖｉｏｎｏｆＳｋｋｉｎａ巧加ｄＭＤ８８ｇ，ｃｔａｔ，ｊ，，ｙｙａｄａｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｐａｔｈｗａｙｓｂｙｂａｃｔｅｒｉａｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２００９３１＾６１－７７１．，Ｃ＞４５ｌｉｆＪＭｆｍａｎｎＳＨＭｃＳｈａｎｅＨｖａｎＨｅｌｄｅｎＦＣＶＧａｉｒａＡ．Ｔｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｏｎｓｅ．Ｋａｕ，，，化，ｐＵ－ｉｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｃＭｔｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ａｖｉｅｗｆｒｏｍ化ｅｂｌｏｏｄ，／ｍ／ｍｉｎｏ／／？ｅｖ２０巧之６４巧８１０２．，如．化战ｉＡ，ＣａｔｅｌｌａｎｉＳ，ＭｕｓｓｏＡ，ＺｏｃｄｉｉＭＲ．ＧａｍｍａｄｅｌｔａＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇＩＦＮｇａｍｍａａｎｄＭ－ｆ＿１７ｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｏｒｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｔｉｇｅｎｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｒａｃｕｔｅ￣巧．ａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｑ／ｒｒＭｅｄＣｈｅｍ２００９：４７４３４７４９，４７－．ＳｚｅｒｅｄａＬＢａｌｉｋｏＩＳ巧ｋｅｒｅｓＢａｒｔｈｏＪ．Ｇａｍｍａ／ｄｅｌｔａＴｃｅｌｌｓｕｂｓｅｔｓｉｎａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｃｔｉｖｅｙ，，ｐＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｄｉｉｏｎａｎｄｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎａｎｅｒｇｙ．ＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ－巧２００３１３１：巧７１．，．ＨｏｗＢｃｅｔｓｅａａｎｓｔｃｏｂａｃｅｕｍ４８．ＭａｌｉｏｎｅＰＪＣｈａｎＪｌｌｓｓｈａｅｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｉＭｔｒｉｇ，ｐｇｙｂｅ－ｒｃｕｌｏｓｉｓ．ｆｕｒＪ／ｍｍｕｎｏ／２００９３９：６７６６８６．化，．ＰｈｕａｈＪＹＭａ忱円ｔｖａｄＢ说ｌｌｓｎ忱ｅｒａｎｕｌｏｍａｓｏｆｎｏｎｈｕｍａｎｒｍａｔｅｓ４９ｌａ巧ｉｎＰＬｎｎＪＬＡｃｉ化ｉｉ，Ｌ，ｙｇｐｔｈ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＡｍＪＰａｏｌ２０１２１８１：５０８５１４．ｙ，５０．ＢｉｃｋＪ，Ｎａｕｍｏｖａ０，ＨｕＭｅｒＳ，ＢａｒｂｏｔＢ，ＬｅｅＭ，Ｌｕ化ａｒＳＳ，ｅｔ如．ＣｈｉｌｄｈｏｏｄａｄｖｅｒｓｉｔｙａｎｄＤＮＡ－ａ－ａｄ巧ｎａｍｍｌａｘｓａｎｄｓｓｅｍｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ化ｅｈｙｐｏｔｈａｌｍｕｓｐ化山ｔａｒｙｉｉｕｎｅｙｔ：－－－ｌ州ｏｍｅｔｅｅｎｅｓｓｓｏｃｏｎｓ．ｅｖｓｃｈｏｏ化〇／：ｗｈｏｅａｎｄｃａｎｄｉｄａｇｉｉ如Ｄ户ｙｐ２０１２２４１４１７１４巧．ｇ，－ｈｍｍｕｎｅｓ５１ｌｔｏｎｏｎｓ化ｌｅｆｏｓｅｍ．ＫｈｏａｓｔｅｈＦａｒｄＭＴａｂｒｉｚｉＭＡｍｏｌｉＭＭ．ＩｓＤＮＡｍｅｔａｉｒｅｓｒｉｔｊ，，ｙｐｙｔ／－ｉｅｓ的巧９ｄｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｓｃｈｉｚｏｌｕｅｎｉａ？ＭｅｄＷｏ２０１１７７：５７３．ｙｐｙｐ，５２．ＫｏｈｌｉＲＭ，ＺｈａｎｇＹ．ＴＥＴｅｎｚｙｍｅｓ，ＴＤ６ａｎｄ化ｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆＤＮＡｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｗｃｆｔｕｒｅ２０１３５的－：４７２４７９．，－５３－的．ＳｕａｒｅｚＡｌｖａｒｅｚＢＲｏｄｒｉｕｅｚＲＭＦｒａａＭＦＬｏＬａｉｒｅａＣ．ＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎ：ａｒｏｍｉｓｉｎ，ｇ，ｇ，ｐｙｐｇ－－．ｌａｎｄｓｃａｅｆｏｒｉｍｍｕｎｅｓｓｔｅｍｒｅｌａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ２０１２２８：５０６５１４．ｐｙ，５４．Ｍｏ巧ｏｓｌａｖｓｋＲＢｅｍａｎ乂ＤＮＡｍｅｌａｉｏｎ：ｒｅ山ａｉｏｎｏｆｅｎｅｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎａｎｄｒｏｌｅｉｎｔｈｅｙ，ｇｔｈｙｔｇｔｇ’’’ｍ目－ｉｍｍｕｎｅｓｓｔｅｍ．执〇（加／ｏ／ｊｓＡｃ化巧巧：Ｆ巧５０．ｙｐｙ，。巧－ＫＷＫ．ｉｍＳＪＫｅｌｌＦｕＡＨａｉｎｅｓＫＨｏｆｆｍａｎＡＺｈｅｎＴｅｔ〇／Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｍｅｈｌａｉｏｎｌｓｉｓ，ｙ，，，，ｇ，ｔｙｔａｎａｙ４５ 中国医学科学院北京协和医学院硕古学位论文－ｉｄｅｎｔｉ巧ｅｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＴＮＦａｌｐｈａｍｅｄｉａｔｅｄｃａｎｃｅｒｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．〇７打ｃｅｒＬｅｔｔ２０１１３０２－：４７５３．，５６Ｗｅｎ－．ＺｈｏｕＷＪｉａｎＺＵｕＮＸｕＦｉｕＹｅ如ＤｏｗｎｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆＣＸＣＬ１２ｍＲＮＡｅｘｒｅｓｓｉｏｎｂ，ｇ，，，ｔＬ，ｔｇｐｙｐｒｏｍｏｔｅｒｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａ－ｒｃｉｎｏｍａｓ．ＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００９１３５：９１１０２．，．Ｃｈｒ５７ｉｓｔｅｎ乂ＤｕｏｎＦＢｅｒｎｓｍｅｉｅｒＣ扣ｎＤｓｓａｌＭｉＭＨ．Ｉｎｈｉｂｉｉｏｎｏｆａｌｈａｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇ，，ＮａＨｅｍｔ，，ｐｓ－ｉｎａｌｉｎｂｈａｔ化ｉｓＢｖｉｒｕｓ．／ｒｏ／２００：巧９ｇｇｙ巧７＼／７８１１６ｔ，．ＫａｒｏｕｚａｋｓｌｕｎｅｌｌｌｎａＭｃｈｅｌＢｅｔ〇／？ＤＮｅｔｈｌａｔｏｎ巧ｕｌａｔｅｓ５８ｉＥＲｅｎｇｅＹ，ＪＡＫｏｉＣＧＥｉＡ，Ａｍｉ，ｇ，ｇ，ｙＲ，ｙｇｔｈｅｅｘｐｗｓｓｉｏｎｏｆＣＸＣＬ１２ｉｎｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｓｙｎｏｖｉａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＧｅｎｅｓＩｍｍｕｎ－巧２２０１１１２：６４３．，５９．ＡｎｄｒａｏｓＣ，ＫｏｏｒｓｅｎＧ，ＫｎｉｇｈｔＪＣ，ＢｏｒｎｍａｎＬＶｉｔａｍｉｎＤｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗ－ｉｔｈｅｔｈｎｉｃｉｔｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｄＴａｏｌｍｏｒｈｓｍｕｍｍｍｉ／ｎｏ／２０１１７２：２６２２６８ｙ化Ｉｉ．Ｈ／．，，ｑｐｙｐ，６０．ＨａｙａｓｈｉＹＳｈｉ炉ｎｏｂｕＳＷａｔａｎａｂｅＤＴｏｇａＫＳａｉｋｉＲＳｈｉｍａｄａＫｅｔ〇／？Ｃｏｎ巧ｏｊｃｔｉｏｎａｎｄ，，，，，，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡｌｉｂ巧ｒｉｅｓｂｙ４５４ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｄｎｇａｎｄｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎ化ｒｅｅｄｉｓｔａｎｔｌｙｒｅｌａ化ｄｈｒｍｉ化ｓｐｅｃｉｅｓ．化ｏ５Ｏｎｅ２０１３，８：ｅ７６６７８．－－６１．ＷａｎＸＬｉＬｉａｎＪＬｉＬＪｉｎＬＣａｉＨｅｔ〇／？Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅａｎｄｓｉｎｌｅｂａ巧巧ｓｏｌｕｉｏｎＤＮＡｇ，Ｑ，，，，，ｇｔｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓｏｆｔｈｅＰａｃｉｆｉｃｏｙｓｔｅｒＣ巧ｓｓｏ巧巧ａｇｉｇａｓｐｒｏｖｉｄｅｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＣＧｍｅｔｈｌａｔｉｏｎ．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ２０１４１５：１１１９．ｐｙ，＾６２．．Ａｎ扣ｌａＳＨａｋｋｏｌａＪＴｕｏｍｉｎｅｌｏｖａａ巧ＥＨｕｓａｆｖｅ＾ｆｕｒｓｉａｉｎｅｎＫＫａｒａｌａｉｎｅｎＡｅｔ〇／，，ｎｔＥ，ｇ，，ｊＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０１Ａ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎｔｈｅｌｕｎｇｉｓａ巧ｏｃｉａｔｅｄｗ化ｈｔｏｂａｃｃｏｓｍｏｋｉｎｇ．的－Ｃｃｆ打ｃｅｒＲｅｓ２００３：８抗３８６２８．，６３化ａｎＷＭＴ．．ＢｏｒｌａｎｄＭＧＫｒｉｓｈｎａｎＰＬｅｅＣＡｌｂｒｅｃｈＰＰＢｉｌｉｔｅｔ〇／Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｒｌ，，，ｔ，，ｙ，ｙ－ｈｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｔｏｒＡＨＲｄｅｅｎｄｅｎ－ｙｐｔｓｉｎａｌｉｎｂｅｒｏｘｉｓｏｍｅｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｔｏｒ（）ｐｇｇｙｐｐｐ’－巧．ｂｅｔａ／ｄｅｌｔａＰＰＡ化ｅｔａ／ｄｅｌｔａｉｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｔｅｓ．Ｃａ／ｒ／ｎｏｅｎｅｓ／ｓ２０１４：１６０２１６口（，）ｙｇ６４．．ＫａｒＳＳｅｎｕｔａＤＤｅｂＭＳｈｉｌｉＡＰａｒｂｉｎＳＲａ化ＳＫｅｔａ／ＥｘｒｅｓｓｉｏｎｒｏｆｉｌｉｏｆＤＮＡ，ｇｐ，，ｐ，，，ｐｐｎ呂？＂ｔｈ－－巧ｌａｔｔｂ．ｍｅｙｉｏｎｍｅｄｉａｅｄｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｇｅｎｅｓＷｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｎｉｎｉｅａｃａｎｃｅｒ幻／打味旬ｅｎｅｔ／ｃｓ２０１４怎２０．．Ｍｄｏｍｅ／．６５ｉ长ｕＸＭｏｎＨＸｕＪＵＺＬｅｅＪＭＰａｔｉｌＡＡｅｔｃｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ，，，，，－．ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅＤＮＡｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＤＮＭＴ１ｆｒｏｍｓｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｘｍｏｒｉＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌｙ，ｙＯ－执／２０１５班：５５６５．，６６．ＮａｋａｓｈｉｍａＨ，ＫｉｍｕｒａＸＫａｇａ乂ＮａｋａｔａｎｉＸＳｅｋｉＹ，ＮａｋａｍｕｒａＴ，ｅｔａ／．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｐｐ巧ｏｎＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｄｙｎａｍｉｃｓｄｕｒｉｎｇｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｍｉｃｅ．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ说．２０１３：１巧，６７．ＬｉＫＫ，Ｌｕｏ巧化饥乂ＸｕＪ，ＣｈｅｎＺ，ＣｈｅｎＳＪ．ＤＮＡｍｅ化ｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａ巧ｓｉｎｈｅｍａ化ｌｏｇｉｃｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．ｅｍａｔｏ－片／２０１３５０：４８６０．，６另ＷａｌｓｈＣｅｓｏｒＴＨ．ＣｔｏｓｉｎｅｍｅｔｈｌａｔｏｎａｎｄｍａｍｍａＵａｎｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔＧｅｎｅｓＤｅｖ．ｔＢｔｙｙｉｐ．－１９９９１３：２６３４．，６９．ＸｉｅＳ，ＷａｎｇＺ，ＯｋａｎｏＭ，ＮｏｇａｍｉＭ，Ｕ乂ＨｅＷＷｅｔａ／．Ｃｌｏｎｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｇ，ｐ－ｌｏｃａｔｏｎｓｏｆ化ｅｈｕｍａｎｎｅｆａｌ．ｉＤＮＭＴ３ｇｅｍｉ．Ｇｅｎｅ巧９９２％巧７９５，ｙｒｏ巧ｎｈｏｆｅｒ－ｒａｏｎｈａｄｔ７０Ｍｕ．ｔｓｗｈｎ化ｅｍａｍｍａｌａｎ．ＭａｇｔＪＢＥｈｒＡＥＬｅｒＨＩｎｅｒａｃｔｉｏｎｉｔｉｉＤＮＡ，ｙ，？ｍｅｔｈｔａｎｓｆｅ巧ｆ．．ｌｒ化ａｍｉｌＢＭＣＭｏ／日，〇／２００３４：７ｙｙ，７１．化ＺＸａｏｈａｏＬ．ｌｔｒａｎｓｆｅ巧化ｏｉＲｅｎＪＢａｉＸＳｕｎＭｅｔａ／ＤＮＡｍｅｔｈｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎ，Ｑ，Ｚ，，，，ｙｐｓｂｆｔ化－ｐｏ巧出ｃｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗ化ｈ巧ｄｕｃｅｄｅｘｐ巧ｓｓｉｏｎｏｅｓｒｏｇｅｎ巧ｃｅｐｒａｌｐｈａ／ｂ巧ａｓｔｃａｎｃｅｒｓｕｓｃｅｔｉｂｉｌｉｔｅｎｅ１ａｎｄｏｏｒｒｏｎｏｓｉｓ．ＭｏｌＣａｒｃｉｎｏｇ２０１４，ｐｙｇｐｐｇ４６ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文＊ａｎｅｎｅｒｅｓｓ－７２ＷｉｅｏｎｏｆＫｒｕｅｌｌｋｅｔｏｒｒｏｕ．ＸｉａｏＸＴＹｕａｎＰｅｎｇＬＹｕＰ？ｉｔｉｃｉｉｆａｃ４化，ｇ，成，巧ｇｐｐｐｇｈ－Ｄｎｍｔｌ化ｎ巧ｎａｌｆ．ｃｏｎｔｒｉｂｕ化ｓＥＭＴｉｉｂｒｏｓｉｓ／打Ａ４ｏ／／Ｗｅｔｆ２０巧巧：巧９６１６０２．，７３．ＢｅｃｈｔｅｌＷ，ＭｃＧｏｏｈａｎＳＺｅｉｓｂｅ巧ＥＭＭｕｌｌｅｒＧＡＫａ化ａｃｈｅｒＨＳａｌａｎｔＤＪｅｔ〇／．Ｍｅｔｈｌａｔｉｏｎ，，，，，ｙ－ｄｅｔｅｒｍｆｂｒｏｂｌａｓｔａｃｏｎａｎｄｆｋｄｎｅｏｔｄ巧０．ｉｎｅｓｉｔｉｖａｔｉｉｂｒｏｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅｉ．ＷＭｅ２０１０巧：５４４ｇｙ，ｍｅｍｍｕｎｅ－．Ｔｅｉａｒｓｏｎｅｓｓｅｍｎｍｍｕｎｏ／７４ｉｔｅｌｌＭＲｉｄｄＢ．ＤＮＡｔｈｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｉｔ．饥／２００３１０９：２５．，ｙｙ，７５．Ｈａｍｉｄｉ巧ｎｈＡＫＣｈｅｎＴ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌ化ｒａｔｉｏｎｓｏｆＤＮＡｍ巧ｈｌａｔｉｏｎｍａｃｈｉｎｅｒｉｎｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｘｇ，ｙｙ’ｆｅ－／ｉｏｍ／ｃｓ２０１５７：２４７２巧．ｐ旬，７６．ＭｏｎｋｅｍａｎｎＨＤｅＶｒｉｅｓｅＡＳＢｌｏｍＨＪＫｌｕｉｔｍａｎＡＨｅｉｌＳＧＳｃｈｉｌｄＨＨｅｔａｔ．Ｅａｒｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ，，，ｓＬ，，，ｊｙ’ｔｈ－ｍ州ｔ．ｅｖｅｎｔｓｉｎ化ｅｄｅｖｅｌｏｏｆｅｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｏａ化Ａｍ／ｎｏＡｃ／妃２００２巧：巧１３３６．ｐｙｐｙ，７７．曰ｈａｒｄＷＳｈａｎｍｕａｍＲＪｕｒｋｏｗｓｋｔｉＴＰＪｅｌｈＡ．Ｓｏｍａｔｉｃｃａｎｃｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ化ｅＤＮＭＴ２ＲＮＡ，ｇ，，ｔｓｃｔｍｅ化－ｔｈｙｒａｎｓｆｅ巧化ａｌｔｅｒｉｔｓｃａｔａｌｙｔｉｃｒｏｅｒｔｉｅｓ．执ｏｃＷｍ／ｅ２０巧，１１２：６６７２．ｐｐ７８．ＨｅｉｌＣＳ．Ｎｏｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｅｆｅｃｔｏｆ化ｅＤＮＡｍｅ化ｙｉｔｒａｎｓｆｅ巧巧ＤＮＭＴ２ｏｎＤｒｏｓ叩ｈｉｌａｍｅｉｏｔｉｃ－巧ｃｏｍｂ．ｉｎａｔｉｏｎＧ３ｅｔ／ｉｅｓ加２０１４４：２０巧２１００．，巧Ｊ７９．ＬｅＰａｇｅＤｔＪｅｒｎ电ａｎＫＫ，Ｂｏｒｄ饥巧ｅｉｎＳＲ．Ｔｈｅ巧ｌａｔｉｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆＤＮＡｍｅ化ｙｌａｔｉｏｎａｎｄ－ｍｅｄＤｎｍ拉ｉａ化ｄｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｎＷｏ化ａｃｈｉａｄｅｎｓｉｔｉｅｓａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．化ｅｒ／２０１４，２：ｅ６７８．－．Ｏｏｃｏｏｓｏｅ８０ｉＳＫＢｅｓｔｏｒＴＨ．ＴｈｅｌｒｆｕｌｈｉｔｒｏｆａｃｔｉｖｅＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｔｉｏｎ．Ｃ／／２００８１３３：１１４５１１４８．，ｙ，ｙ８１．ＩｅｒＬＭＴａｈｉｌｉａｎｉＭＲａｏＡＡｒａｖｉｎｄＬＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｆａｍｉｌｉｅｓｏｆｅｎｚｍｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｙ，，，ｙｏｘｍｏ＿ｉｄａｔｉｖｅａｎｄｏｔｈｅｒｃｏｍｌｅｘｄ讯ｃａｔｉｏｎｓｏｆｂａｓｅｓｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ．Ｃｅ／／Ｃｙｃ／ｅ２００９８：１６９８ｒ７１０．ｐ，８２．Ｓａｓ巧Ａ，ＣａｇｌａｙａｎＭ，ＤｙｒｋｈｅｅｖａＮＳ，ＢｅａｒｄＷＡ，ＷｉｌｓｏｎＳＨ．Ｂａｓｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｏｆｔａｎｄｅｍ？ｔｔ－ｍｏｄ．．ｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎａｍｅｈｌａｅｄＣＧｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＪ执〇／Ｃ／ｉｅｍ２０１４２的：１３９９６１４００８ｙｐ，（Ｍａｒｔ．８３．ＳｅｒｓｅｔＲＡｉｎＤＷＪｒＰｒｅｓｅｎｃｅｏｆａＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｔｉｎａｃｔｉｖｉｔｉｎ化ｅｎｌｅｕｓｏｆｍｕｒｉｎｅｊ，，ｙｇｙｕｃ－ｒｔｈｒｌｌｆ／ｉｅｙｏｌｅｕｋｅｍｉｃｃｅｓ．Ｊ６／ｏＣｅｍＷ８２２５７＾５８１８５８３．，８４．．ＷｅｉｓｓＩＫＦｉｎｋＳＥｄｍｕｎｄｓＳＨａｒｒｉｓｏｎＲＤｏｎｎｅｌｌＫＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｅｒｉａｌａｓｍｏｎｉｔｏｒｉｎ：ｉｎｉｔｉａｌ，，，，ｙｒｔｇｇ＂－ｅｘｅｒ．ｉｅｎｃｅｗＫｈ化ｅＰａｒａｔ巧ｎｄ７ｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ．化ｔｅｎｓ／ＶｅＣ饥ｅＭｅｒｆ１９９６２２：１４１４１４１７ｐ，８５．ＬｏｅｎａｒｚＣＳｃｈｏｆｉｅｌｄＣＪ，Ｐｈｓｉｏｌｏｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｅｃｔｓｏｆｈｄｒｏｘｌａｔｉｏｎｓａｎｄ，ｙｇｐｙｙｄｅｍｅ－ｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｈｕｍａｎ２ｏｘｏｇｌｕｔａ巧ｔｅｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ，ｒ巧打血ＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ２０１１３６－：７：Ｌ８．，－８６．Ｍｅｔｈ．Ｔｓａａｒａ化ｕＡＲａｏＡＴＥＴＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ５ｌｃｔｏｓｉｎｅＯｘｉｄ如ｏｎｉｎｔｈｅＩｍｍｕｎｅＳｓｔｅｍ．ＣｏＷｇ，ｙｙｙＳｒｉｎＨａｒｈ．ｐｇＳｍｕａｎｔＢｉｏｌ２０１４ｙｐＱ８７．ＫｏｈＫＰＹａｂｕｕｃｈａｎｅｔ〇ｅｉＡＲａｏＳＨｕｕｎｎｉｆｆＫＮａｒｄｏｎｅＪ／．ＴｔｌａｎｄＴｅｔ２ｒｅｕｌａｔｅ，，，ｇ乂Ｃ，，ｇ－ｄｕｃｔ５ｈｄｒｏｘｍｅｔｈ．ｙｙｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅｒｏｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｌｉｎｅａｅｓｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｐｇｐｙＣｅＷＳ化ＡＴ－）Ｃｅ／／２０；ａ＆２００２１３．－８８ｌｆ．ＫｉｍＹｌ化ｉｍＪＫｉｍＢＨＬｅｅＳＪＬｅｅＨＫＣｈｏＣｅｔ〇／？Ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌｓｉｅｎｃｉｎｏ化ｅｉｎｈｉｂｉｎａｌｈａ，，，，，，ｐｇｐ－ｅｎｅｉｎｈｕｍａｎａ巧ｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ．／ｎｔＪＯｎｃｏ／２０１２４１：６９０７００．ｇ，ｇ－－８９■．ＶｌａｈｏｖｉｃＭＢｕｌｉｃＪａｋｕｓＦＪｕｒｉｃＬｅｋｉｃＧＳｅｒｍａｎ！ＳｉｎｃｉｃＮＫａＵｉｓｉｃＡ．Ｅｉｅｎｅｉｃｄｅ巧ｕｌａｔｉｏｎ，，，，，ｐｇｔｇｔｈｒｏｕｈＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｓｅｅｍｓｎｏｔｔｏｉｎｔｅｒｆｅｒｅｗｉｔｈｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｉｔｈｅｌｉａｆｒｏｍｇｙｐ－－ｎｔ．ｒｅａ３ｒｕｌａｔｍｅｍｂｒｏｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｄｅｒｍｏｔｏｖｅｎｅｒｏ／Ｃｒｏｏｔ２００８１６：巧３１８９ｐｇｇ，ｙ－－９０ＭＤ．．ＧｒａＪｅｓｃｈＳＡＳｅｉｎＧＨ５ＡｚａｃｔｉｄｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｄｅｍｅｈｌａｉｏｎｏｆＤＮＡｓｅｎｅｓｃｅｎｔｌｅｖｅｌｙ，，ｔｙｔｙｔ化ｄｏｅ－ｓｎｏｔｂｌｏｃｋｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．ＪＣｅｌｌＰｈｓｉｏｌ１９９１，１４９：４７７４８４．ｐｙ９１ＣｈａｒｌｅＪＳｃｈｎｅｋｅｎｂｕｅｒＭＢｒｏｗｎＫＷＤｉｅｄｒｉｃｈＭ．ＤＮＡｄｅｍｅｔｈｌａｉｏｎｉｎｃ巧ｓｅｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｏｆ．ｔ，ｒｇ，ｅｔａ，ｙｙ’ｎｅｕｒｏｂ沿巧巧－ｌａｓｔｏｍａ化ｌｌｓｃｈｅｍｏｈｅ巧ｅｕｉｃｄｒｕｓ．Ｓ／ｏｃＡｅ所州ａ／ｖｎｏｃｏ／２０１２８６５．化ｔｐｔｇ，９２ＨｅｃｈｔＳＳＴｏｂａｃｃｏｃａｒｃ－ｉｎｏｅｎｓｔｈｅｉｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｓａｎｄｏｂａｃｃｏｉｎｄｕｒ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ．．ｇ，ｔｃｅｄｃａｎｃｅ巧３－７４４２００３乐．４７ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文９３．ＨｅｃｈｔＳＳｒｏｒｅｓｓａｎｄｃｈａｌｅｎｅｓｎｓｅｌｅｃｅｄａｒｅａｓｏｆｏｂａｃｃｏｃａｒｃｎｏｅｎｅｓｓ．Ｐｇｌｇｉｔｔｉｇｉ．ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌ－２００８２１．：１６０１７１，．Ｌｕｅｖｃｕｔｅｔ９４ｉｔｋｉｉＺＬｕｋｉｎａｖｉｃｉｕｓＧＭａｓｅｖｉｃｉｕｓ乂ＤａｕｏｔｅＤＫｌｉｍａｓａｕｓｋａｓＳ．，，，ｊｙ－－－Ｃｙｔｏｓｎｅｍｅ化ｉｔｒａｎｓｆｅｒａ化ｓａｄｄａｌｄｅｈｄｅｓ．ｔ／ｅｍｉ５ｙｙ化ＤＮＡＷａＣｉ８虹／２００９５：４００４０２．，９５．ＫａｒｏｕｚａｋｉｓＥＴｒｅｎｋｍａｎｎＭＧａＲＥＭｉｃｈｅｌＢＡＧａＳＮｅｉｄｈａｒｔＭ．Ｅｉｅｎｏｍｅａｎａｌｓｉｓｒｅｖｅａｌｓ，，ｙ，，ｙ，ｐｇｙＴＢＸ５ａｓａｎｏｖｅｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｓｎｏｖｉａｌｙ巧ｍｍｕ打〇￣ｂｒｏｂａｓ．？ｌｔｓ／／／２０１４１９３：４９４５４９５１．，９６．ＫｉｍＳＨ，ＬｉｍＫＨ，ＰａｒｋＨＫ，ＬｅｅＳＹ，ＫｉｍＳＨ，ＫａｎｇＨＲ，ｅｔ〇／．ＲｅｄｕｃｅｄＩＲＦ７巧ｓｐｏｎｓｅ化ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｕｎｒｅａｅｄｗ化ｌｔｈＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｏｆａｄｕ化ａｓｔｈｍａｔｉｃｓ．＞４５／０Ｐａｃ－２０：．巧，５１１４１２２９７．Ｍａｒｉｃａ化ＪＸＦｕｒｔａｄｏＭＮ，ＴａｋｅｎａｋａＭＣ，ＮｕｎｅｓＥＲ，ＦｉｎｃａｔｉＰ，ＭｅｌｉｓｏＦＭ，ｅｔＯｆ／．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｏｄｕ－ＭｌａｔｏｎｓｎｃｔｖａｅｄＣｅｌｌｓａｒｌａｆｔｅｒｆｔｄＴｈｅｉｉＡｉｔＥｙＨＩＶ１Ｉｎｅｃｉｏｎａｎｉｒ化ｓｓｉｂｌｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｏｎｓｅｕｃｅｓｏ５ｎｅｑ州．ＰＬＯ２０巧，１０：ｅ０１１犯３４．ｈａｖａＵａＭｓｈｒａｃｒｏＲ－ｔ９８．Ｃ乂ＴｙｇｉＳＣｉＰＫ．ＭｉＮＡ１３３ａｒｅｕｌａｅｓＤＮＡｍｅｔｈｌａｔｉｏｎｉｎｄｉａｂｅｉｃ，ｇｙｔ－ｃａｒｄｏｍｏｃｔＷ２．ｉｅｓ．８／ｏｃｈｅ／ｎＳ／ｏ／）ｓＲｅ５Ｃｏｍｍｕｎ２０１２４２５：６６８ｙｙｐｙ，ｒｏｖａａｎａｈｎＭｔ－９９．ＷａｎｇＹＡＫａｍａＹＳｈｅｎＫＣＪｉＪＷａｎａ／．ＤＮＡｍｅｔｈｌｈａｎｓｆｅ巧巧３ａ，，，ｇＺ，Ｈ，ｇＹ，ｅｙｎｔｅｒａｃｗ化ｈｒｅｒｅｓｓｓ－ｔｉｔｓｐ５３ａｎｄｐｅｐ５３ｍｅｄｉａｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｔＴｈｅｒ２００５－：．，４１１３８１１４３佔 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文致谢惊风飘白日，光景西驰流。Ｈ年的研巧生生活在不知不觉中就到了要分别的季节。Ｈ年期间，我经历了许多，学习了许多，领悟了很多。我体验了与Ｗ往工作、学习截然不同的氛围与环境，也认识了很多帮助过我的朋友、老师、同学。在此毕一业之际直陪在我身边的朋友和关也、指导我的老师们致Ｗ真诚的感谢！，向首先，我要感谢我的导师，刘海鹰副研巧员。在Ｓ年的研究生生活中，我的导师在实验、学习和生活中给予很大的帮助。在实验及学习上，我的导师总是给予我！她Ｗ她广博的知识无微不至的指导与教诲，深厚的科研功底，精益求精的工作作风将我带进科研这条道路上来。在我的课题设计、实验计划和实验开展中都给予了很大的督促与帮助一。本论文中所涉及的课题就是在她步步的指导下完成的，凝聚了她大量的也血，在课题研巧进展过程中，刘海鹰老师多次询问研究进程，总是为我指点迷津，帮助我开拓科研思路。精也点拨、热忱鼓励，使我在遇到困难时依然能够坚定信也、不断前行。生活上，，我的导师Ｗ平易近人、朴实无华的人格魅力严Ｗ律已、宽Ｗ待人的崇高风范，为我树立了很好的榜样，从中我受益良多，学会了很多做人做事的道理。兰年时光，如白骑过隙，虽然仅历时Ｈ载，但我的导师却给Ｗ受益无穷之道。非常感谢我的导师，，对我老师的感激之情，无法用语言表达在此再次表示忠也的感谢。感谢我们研究所和所外各位专家、教授们在我开题报告、中期考核和毕业答辩过程中所给予的无私指导和耐也帮助，使我的课题和实验能够科学、合理的开展，及时发现并解决了课题中出现的问题，使课题得Ｗ朝着正确的方向发展。在此，向他们表示衷也的感谢。同时，也感谢金奇老师及所里其他各位领导、老师为我们创造了良好的学习、生活环境Ｗ及科研氛围。所里各位老师组织的科研讲座让我们开阔了眼界，，拓展了知识领域。在生活中各位老师不辞辛苦，能够及时的为我们排忧解难使我们可也学习和实验一，拥有个舒适的生活环境。在我整个课题过程中，感谢深圳市第Ｈ人民医院的陈也春教授及其所带领的团队给予的帮助。感谢他们所提供的临床样本。感谢他们在工作及生活中所给予的各种支持。在跟着陈教授学习期间，，陈教授平易近人的性格让人感到无比亲切陈教授科学严谨、实事求是的研究作风对我的科研学习产生了很大影响。为此表示真攀。、、的感谢在深圳期间也认识了杨帆张洁云朱秀云等朋友，他们无论在生活上还是在实验中都是非常亲切的良师益友。他们在我深圳学习期间给了我很大的帮助和鼓励。我还要感谢的是我们课题组的于杨老师，张艳老师，在入所之初，是两位老师手把手教我各种实验技能，教我应用各种生物软件。感谢于杨老师对我课题投入的４９ 中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文、血与指导大量屯，在于杨老师的帮助下我的课题得Ｗ进行。我还要感谢己经毕业的、我的师兄胡：ｉ：宗斩冬冬，师姐白慧君和郑晓静。感谢他们在繁忙的工作之余，给一予我实验中的指导和建议，也感谢他们对我的关也与开导。也要感谢陪我起渡过Ｈ年研究生生活的同学们：李臻、张梦、杨小洁、贾倩楠、辛赫男、李端、武闯、裴彬、乔媛媛、贾雪、李建等。有你们的陪伴，Ｈ年的研巧生生活充满了欢笑与喜！悦，Ｈ；有你们的陪伴年的研巧生生活显得弥足珍贵需要特别感谢的是我的室友张梦与李臻，感谢你们兰年生活中对我的包容与理解。也感谢不同课题组的各位师兄、师姐、师妹、师弟们，感谢你们在实验和生活中他们给我的帮助与关也。最后要特别感谢我的家人一，谢谢他们直Ｗ来对我的理解和支持。５０ 中国医学科学院北京协和医学院硕壬学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加Ｗ标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。－：学位论文作者签名；炭签字日期ｊ哀年６月冻靜Ｉ日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解韭左应租屋堂隨有关保存、使用学位论文的管理办法。有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权北京协和医学院可Ｗ将学位论义的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名；如乂脊导师签名：签字日期：Ａ年《月日签字日期：日／学位论文作者毕业后去向：齡ｊＫ．工作单位：电话：通讯地址：邮编：５１ 中国医学科学院北京协和医学院硕壬学位论文个人简历及发表文章姓名：张洪静性别：女８７３出生年月：１９年月毕业学校：北京协和医学院／中国医学科学院所院：病原生物学研究所硕±研究生专业：免疫学专业教育背景及工作经历：２００５年９月－２０１０年７月，济宁医学院，临床医学，学±一２０１０９月－２０１１３月年年，济宁市第人民医院，急诊外科２０１１４－２０１１１０年月年，巧水县计划生育服务站，妇科口诊２０１２年９－２０１５７月年月，北京协和医学院，免疫学，硕±发表文章还未发表。
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