《2型糖尿病LncRNAs差异表达谱的筛选及功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
？分类号：Ｒ５８７．１密级：公开单位代码：１０７６０学号：１０７６０１１５０８１１新疆医科大学ＸｉｎＪｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ博士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＤＯＣＴＯＲＤＥＧＲＥＥ学术性学位（学历教育）论文题目：２型糖尿病ＬｎｃＲＮＡｓ差异表达谱的筛选及功能研究研究生王志强指导教师姚华教授学科专业名称劳动卫生与环境卫生学研究方向环境－基因－疾病研究起止时间２０１５年９月至２０１８年３月所在学院公共卫生学院２０１８年３月 2型糖尿病LncRNAs差异表达谱的筛选及功能研究研究生王志强指导教师姚华教授学科专业名称劳动卫生与环境卫生学研究方向环境-基因-疾病课题来源：新疆维吾尔自治区自然科学基金项目2018年3月 ScreeningandfunctionalstudyofdifferentialexpressionprofilesoflncRNAsintype2diabetesmellitusＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofMedicineByZhi-QiangwangOccupationalandEnvironmentalHealthDissertationSupervisor:ProfessorHuaYaoMarch,2018 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外一，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名王乙骚签字日期：謂切＾＆：签字日期导师签名：讀切关于论文使用授权的说明本人完全了解学关于保留、使用学位论文的各项规定，￥”（选择同意）以下事项：１．学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；“２．学校有权将本人的学位论文提交至清华大学中国学术期刊光盘（版”）电子杂志社用于出版和编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》或其他同类数据库。，传播本学位论文的全部或部分内容学位论文作者签名ｉ签字日期：彭邛ｊｙ蹲辦导师签名：签字日期： 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名GOGeneOntology基因本体论HGhighglucose高糖HumanumbilicalveinHUVECs人脐静脉内皮细胞endothelialcellsLncRNALongnon-codingRNA长链非编码RNAMetastasisassociatedMALAT1lungadenocarcinoma转移相关肺腺癌转录本1transcript1MaternallyexpressedMEG3母系表达基因3gene3myocardialMIATinfarction–associated心肌梗死相关转录本transcriptPrincipalComponentPCA主成分分析AnalysisReceiveroperatingROC受试者工作特征曲线characteristiccurvesiRNAsmallinterferingRNA小干扰RNAtype2diabetesT2DM2型糖尿病mellitus 目录摘要………………………………………………………………………………………1ABSTRACT…………………………………………………………………………………5前言…………………………………………………………………………………11第一部分：2型糖尿病LncRNAs差异表达谱的筛选……………………………………171研究内容与方法……………………………………………………………………181.1研究对象…………………………………………………………………………181.2主要试剂及实验设备…………………………………………………………………191.3方法……………………………………………………………………201.4统计学方法…………………………………………………………………262结果…………………………………………………………………………………263讨论……………………………………………………………………………644小结……………………………………………………………………………77第二部分：长链非编码RNAMEG3、MALAT1和MIAT在2型糖尿病患79者外周血中的表达及临床意义………………………………………………………1研究内容与方法……………………………………………………………………………801.1研究对象……………………………………………………………………………801.2主要试剂及实验设备…………………………………………………………………801.3方法……………………………………………………………………821.4质量控制…………………………………………………………………841.5统计学方法…………………………………………………………………842结果……………………………………………………………………………843讨论……………………………………………………………………………1124小结……………………………………………………………………………124第三部分：MEG3对高糖诱导的内皮细胞功能障碍的影响及作用机制…………126 1研究内容与方法……………………………………………………………………………1271.1研究材料……………………………………………………………………………1271.2主要试剂及实验设备…………………………………………………………………1271.3方法……………………………………………………………………1301.4统计学方法…………………………………………………………………1402结果……………………………………………………………………………1403讨论……………………………………………………………………………1544小结……………………………………………………………………………169结论……………………………………………………………………………………171致谢…………………………………………………………………………………172参考文献……………………………………………………………………………173综述长链非编码RNA(lncRNA)在糖尿病及其并发症中的研究进展………205攻读博士学位期间发表的学术论文………………………………………………221个人简历……………………………………………………………………………222导师评阅表………………………………………………………………………………223 新疆医科大学博士学位论文2型糖尿病LncRNAs差异表达谱的筛选及功能研究研究生：王志强导师：姚华教授摘要目的：①本研究利用基因芯片及生物信息学技术，筛选出2型糖尿病中差异表达的lncRNAs和mRNAs，初步探索差异表达的lncRNAs在2型糖尿病中的分子机制。②筛选出差异倍数FC(abs)在2.0倍以上并且P≤0.01的lncRNAs，最终在查阅文献的基础上选取MEG3、MALAT1和MIAT基因。在2型糖尿病患者及对照组外周血中检测其表达水平，分析其表达水平与2型糖尿病患者相关危险因素的关系，探讨MEG3、MALAT1和MIAT基因在2型糖尿病诊断中潜在的意义。③深度了解内皮细胞的lncRNAs，对于糖尿病并发症可能提供了全新的生物标记物和治疗靶点。理解糖尿病诱导的内皮细胞功能障碍和确定全新的治疗靶点对于预防和减少糖尿病并发症非常重要。目前，MEG3在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能障碍中发挥作用的潜在分子机制还未见报道。因此，本研究的目的是探讨MEG3是否可以作为高糖诱导内皮细胞功能障碍的潜在调控者和分子生物标记物。方法：①选择2型糖尿病患者及非2型糖尿病患者各5例，抽取各自血液样本，分别提取RNA后，利用基因芯片对lncRNAs和mRNAs进行表达分析。应用生物信息学方法，包括Pathway、Disease和基因本体论(geneontology,GO)分析，分析2型糖尿病外周血中lncRNAs及mRNAs的表达谱。同时，进一步分析差异基因可能调控的相关通路，进而发现与2型糖尿病发生发展过程相关的lncRNAs，构建lncRNAs和mRNAs的共表达网络，预测差异表达的1ncRNAs可能参与的生物功能。②选取200例2型糖尿病患者及200例非2型糖尿病患者，采用实时荧光定量PCR方法检测2型糖尿病组和对照组中MEG3、MALAT1和MIAT的表达水平，采用ROC曲线探讨外周血中MEG3、MALAT1和MIAT的表达水平在2型糖尿病中诊断的价值。③运用MEG3的特异性小干扰RNA(siRNA)和scrambledsiRNA的慢病毒载体感染HUVECs，运用实时荧光定量PCR检测炎症细胞因子、TGFβ信号通路和Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达，应用流式细胞术检测细胞凋亡率，采用MTT实验检测细胞增殖，应用westernblot检测凋亡相关蛋白、TGFβ信号通路和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。结果：①2型糖尿病患者外周血中差异表达的lncRNAs有68条，其中上调的有44条，下调的有24条；差异表达的mRNAs有74条，其中上调的有56条，下调的有18条。②表达差异的mRNAs显著富集的信号通路包括突触小泡周期通路、卵巢类固醇生成通路、癌症的microRNA通路、细胞色素P450介导的异生素代谢通1 新疆医科大学博士学位论文路和化学致癌作用通路等。显著富集的疾病包括Keutel综合征、遗传性混合性息肉病综合征、其他体液免疫缺陷疾病、脑脓肿黄瘤症和色素性视网膜炎(RP)等。③在生物过程中，显著富集的GeneOntology功能包括可见光的检测、检测光的刺激、骨矿化的调节、生物矿物组织发育的调节和解剖结构排列等。在细胞组件中，显著富集的GeneOntology功能包括内吞囊泡膜、细胞质小泡膜、囊泡膜、神经元投影和神经元的一部分等。在分子功能中，显著富集的GeneOntology功能包括脂蛋白转运蛋白活性、胆固醇羟化酶活性、胆甾烷三醇单加氧酶活性、微管蛋白-谷氨酸连接酶活性和骨的结构成分等。④与对照组MEG3基因的表达量相比，2型糖尿病组MEG3基因的表达量与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MALAT1基因的表达量相比，2型糖尿病组MALAT1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MIAT基因的表达量相比，2型糖尿病组MIAT基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。⑤在2型糖尿病组全体人群和男性中，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组女性中，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组全体人群和女性中，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组男性中，MIAT高表达组舒张压水平低于MIAT低表达组舒张压水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组女性中，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑥在2型糖尿病组全体人群和男性中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组女性中，MEG3基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群和女性中，MALAT1基因的表达量与血糖、总胆固醇和低密度脂蛋白水平呈正相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组男性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组女性中，MALAT1基因的表达量与血糖和收缩压水平呈正相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群和男性中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑦MEG3表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.818(95%CI：0.777-0.859，P<0.001)，灵敏度为94.9%，特异度为94.4%；2 新疆医科大学博士学位论文MALAT1表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.838(95%CI：0.723-0.954，P<0.001)，灵敏度为95.5%，特异度为95.2%；MIAT表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.805(95%CI：0.666-0.944，P=0.001)，灵敏度为95.0%，特异度为95.0%。⑧分别与48、72、96小时正常糖(Control，5mMD-glucose)培养的人脐静脉内皮细胞相比，高糖(HG，30mMD-glucose)刺激48、72、96小时后，MEG3的表达水平以时间依赖方式表达下降。⑨与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑩与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑪与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组TCF7L2基因的表达量相比，HG组和HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TCF7L2基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑫在48、72和96小时，与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑬与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑭与control组相比，HG组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比，HG组Bcl-2蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。⑮与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：①在2型糖尿病中，lncRNAs和mRNAs有大量的差异表达，3 新疆医科大学博士学位论文提示这些差异表达的lncRNAs参与了2型糖尿病发生发展过程，有可能成为临床诊断与治疗2型糖尿病的新靶点。通过进一步的生物功能信息探索，差异表达的lncRNAs涉及多条信号通路、多种疾病和多项生物功能，为后续2型糖尿病研究提供理论依据。②2型糖尿病患者外周血中MEG3表达水平降低、MALAT1和MIAT表达水平增加，ROC曲线分析表明MEG3、MALAT1和MIAT可以作为诊断2型糖尿病的潜在生物标记物。③本研究证明了MEG3参与高糖诱导的内皮细胞功能障碍，MEG3在高糖血症的内皮细胞模型中表达下调。此外，MEG3基因敲除能够加剧内皮细胞的炎症损伤。有趣的是，MEG3基因敲除会通过上调Bcl-2蛋白的表达，下调Bax、Caspase-3和P53蛋白的表达诱导细胞的增殖和抑制细胞的凋亡。值得注意的是，MEG3基因敲除通过上调TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因和SMAD2蛋白的表达激活TGFβ信号通路，MEG3基因敲除通过上调β-catenin和CyclinD1基因和β-catenin蛋白的表达以及下调TCF7L2基因的表达激活Wnt/β-catenin信号通路。我们的研究结果表明，对于高糖诱导的内皮细胞功能障碍，MEG3可以作为全新的治疗靶点和分子生物标记物。关键词：2型糖尿病；长链非编码RNA；基因芯片；生物标记物；内皮细胞功能障碍4 新疆医科大学博士学位论文ScreeningandfunctionalstudyofdifferentialexpressionprofilesoflncRNAsintype2diabetesmellitusPostgraduate:Zhi-QiangwangSupervisor:Prof.HuaYaoAbstractObjective:①TodetectdifferentiallyexpressedlncRNAsandmRNAsoftype2diabetesmellitusbyusinggenechipandbioinformaticstechniqueandexploretheroleoflncRNAsinthepathogenesisoftype2diabetesmellitus.②ScreenedthespecifichighexpressionoflncRNAsaccordingtoFC(abs)value>2,P≤0.01.Finally,theMEG3、MALAT1andMIATgenewereselectedinthisstudyonthebasisofpublishedstudies.③ThedeepunderstandingofendotheliallncRNAsmayprovidenovelbiomarkersortherapeutictargetsfordiabeticcomplications.Therefore,itisimportanttoincreaseourunderstandingoftheunderlyingmolecularmechanismsofdiabetes-inducesendothelialdysfunctionsandidentifynovelpotentialtherapeutictargetsforpreventingorreducingdiabeticcomplications.Tillnow,therehasbeennostudyrevealingtheunderlyingmolecularmechanismsassociatedwithMEG3inductionandhowitcouldplayakeyroleinhighglucose-inducesHUVCEsdysfunction.Therefore,theaimofthepresentstudywastoinvestigatewhetherMEG3waspotentialregulatorsandmolecularbiomarkerofhighglucose-inducedendothelialdysfunction.Methods:①5patientswithtype2diabetesmellitusand5non-type2diabetesmellituswereselected,thendrewtheblood,bloodsampleswereextractedtoRNA.TheexpressionoflncRNAsandmRNAswereanalyzedbygenemicroarray.LncRNAsandmRNAsexpressionprofileswereanalyzedbybioinformaticstools,includingPathwayDiseaseandgeneontology(GO)analysis.ThedifferentiallyexpressedlncRNAsinperipheralbloodwasdetected.Moreover,wefurtheranalyzedtherelevantpathwaysregulatedbydifferentiallyexpressedgenes,aswellaslncRNAsparticipatinginthedevelopmentoftype2diabetesmellitus.Thegeneco-expressionnetworkwasestablishedsoastopredictthebiologicalfunctionmaybeinvolvedinthedifferentialexpressionof1ncRNAs.②TomensuretheexpressionlevelofMEG3、MALAT1andMIATgeneinperipheralbloodoftype2diabetesmellitusandnon-type2diabetesmellitus,toanalyzetheassociationwiththeriskfactorsoftype2diabetesmellitus,toinvestigatethepotentialsignificanceinthediagnosisoftype25 新疆医科大学博士学位论文diabetesmellitus.Inthepresentstudies,200type2diabetesmellitusand200non-type2diabetesmellituswereenrolled.TheexpressionlevelsofMEG3、MALAT1andMIATgenewerequalifiedbyquantitativereal-timepolymerasechainreaction(qRT-PCR).Areceiveroperatingcharacteristic(ROC)curvewasadoptedtoexplorethevalueoftheexpressionofMEG3、MALAT1andMIATgeneinthediagnosisoftype2diabetesmellitus.③LentivirusvectorofMEG3-specificsmallinterferingRNA(siRNA)andscrambled(Scr)siRNAweretransfectedintoHUVECs.qRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofinflammatorycytokines,TGFβsignalingpathwayandWnt/β-cateninsignalingpathwayrelatedgenes.Thepercentageofapoptoticcellswasmeasuredbyflowcytometry.CellviabilitywasdeterminedthroughMTTassay.Detectionofapoptosisrelatedprotein,TGFβsignalingpathwayandWnt/β-cateninsignalingpathwayrelatedproteinsbyWesternblotassay.Results:①Atotalof68lncRNAswerescreened,which44wereup-regulatedand24weredown-regulatedinperipheralbloodoftype2diabetesmellitus.Atotalof74mRNAswerescreened,which56wereup-regulatedand18weredown-regulatedinperipheralbloodoftype2diabetesmellitus.②Signalpathwayenrichmentcontainedsynapticvesiclecycle、ovariansteroidogenesis、microRNAsincancer、metabolismofxenobioticsbycytochromeP450andchemicalcarcinogenesis.Enrichmentofthediseaseincludedkeutelsyndrome、hereditarymixedpolyposissyndrome、otherhumoralimmunodeficiencies、cerebrotendinousxanthomatosis、retinitispigmentosa(RP).③Inbiologicalprocess,GOTermenrichmentinthedifferentiallyexpressedmRNAsmayinvolveindetectionofvisiblelight、detectionoflightstimulus、regulationofbonemineralization、regulationofbiomineraltissuedevelopmentandanatomicalstructurearrangement.Incellularcomponent,GOTermenrichmentinthedifferentiallyexpressedmRNAsmayinvolveinendocyticvesiclemembrane、cytoplasmicvesiclemembrane、vesiclemembrane、neuronprojectionandneuronpart.Inmolecularfunction,GOTermenrichmentinthedifferentiallyexpressedmRNAsmayinvolveinlipoproteintransporteractivity、cholesterol26-hydroxylaseactivity、cholestanetriol26-monooxygenaseactivity、tubulin-glutamicacidligaseactivityandstructuralconstituentofbone.④TheexpressionlevelofMEG3wassignificantlylowerinT2DMgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.001).TheexpressionlevelofMALAT1wassignificantlyhigherinT2DMgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.001).TheexpressionlevelofMIATwassignificantlyhigherinT2DMgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.001).⑤FortotalparticipantsandmaleofT2DMgroup,theplasmaglucoselevelswaslowerin6 新疆医科大学博士学位论文MEG3highexpressiongroupthaninMEG3lowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Forfemaleofcontrolgroup,theplasmaglucoselevelswaslowerinMEG3highexpressiongroupthaninMEG3lowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).Fortotalparticipants,maleandfemaleofT2DMgroup,theplasmaglucoselevelswashigherinMALAT1highexpressiongroupthaninMALAT1lowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Fortotalparticipants,femaleofcontrolgroup,theplasmaglucoselevelswashigherinMALAT1highexpressiongroupthaninMALAT1lowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).Fortotalparticipants,maleandfemaleofT2DMgroup,theplasmaglucoselevelswashigherinMIAThighexpressiongroupthaninMIATlowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);FormaleofT2DMgroup,theDBPlevelswaslowerinMIAThighexpressiongroupthaninMIATlowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Forfemaleofcontrolgroup,theplasmaglucoselevelswashigherinMIAThighexpressiongroupthaninMIATlowexpressiongroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑥FortotalparticipantsandmaleofT2DMgroup,theexpressionlevelsofMEG3wassignificantlynegativecorrelatedwiththeplasmaglucoselevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);ForfemaleofT2DMgroup,theexpressionlevelsofMEG3wassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaLDLlevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);FortotalparticipantsandfemaleofT2DMgroup,theexpressionlevelsofMALAT1wassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaglucose,TC,LDLlevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);FormaleofT2DMgroup,theexpressionlevelsofMALAT1wassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaglucoselevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).Fortotalparticipantsofcontrolgroup,theexpressionlevelsofMALAT1wassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaglucoselevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Forfemaleofcontrolgroup,theexpressionlevelsofMALAT1wassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaglucoseandSBPlevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Fortotalparticipants,maleandfemaleofT2DMgroup,theexpressionlevelsofMIATwassignificantlypositivecorrelatedwiththeplasmaglucoselevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Fortotalparticipantsandmaleofcontrolgroup,theexpressionlevelsofMIATwassignificantlypositivecorrelatedwiththeSBPlevels,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑦TheareaunderthereceiveroperatingcharacteristiccurveofMEG3expressionlevelwas0.818(95%CI:0.777-0.859,P<0.001)7 新疆医科大学博士学位论文with94.9%ofsensitivityand94.4%ofspecificity;TheareaunderthereceiveroperatingcharacteristiccurveofMALAT1expressionlevelwas0.838(95%CI:0.723-0.854,P<0.001)with95.5%ofsensitivityand95.2%ofspecificity;TheareaunderthereceiveroperatingcharacteristiccurveofMIATexpressionlevelwas0.805(95%CI:0.666-0.944,P=0.001)with95.0%ofsensitivityand95.0%ofspecificity.⑧ComparedwithHUVECsculturedin48,72and96hoursnormalsugar(Control,5mMD-glucose),afterhighglucose(HG,30mMD-glucose)stimulated48,72,96hours,theexpressionlevelofMEG3decreasedinatime-dependentmanner.⑨TheexpressionlevelofMEG3wassignificantlylowerinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofMEG3wassignificantlylowerinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).Theexpressionlevelofα-SMA,VEGF,TNF-αandIL-6weresignificantlyhigherinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Theexpressionlevelofα-SMA,VEGF,TNF-αandIL-6weresignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑩TheexpressionlevelofTGFβ1,SMAD2andSMAD7weresignificantlyhigherinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofTGFβ1,SMAD2andSMAD7weresignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑪Theexpressionlevelofβ-cateninandCyclinD1weresignificantlyhigherinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);Theexpressionlevelofβ-cateninandCyclinD1weresignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).TheexpressionlevelofTCF7L2wassignificantlylowerinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofTCF7L2wassignificantlylowerinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑫ComparedwithHUVECsculturedin48,72and96hours,theODvalueofcellweresignificantlylowerinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);theODvalueofcellweresignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑬TheapoptoticrateofcellweresignificantlyhigherinHGandHG+MEG3siRNAgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);theapoptoticrateofcellweresignificantlylowerin8 新疆医科大学博士学位论文HG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑭TheexpressionlevelofBax、Caspase3andP53proteinweresignificantlyhigherinHGgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofBax、Caspase3andP53proteinweresignificantlylowerinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).TheexpressionlevelofBcl-2proteinwassignificantlylowerinHGgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofBcl-2proteinwassignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).⑮TheexpressionlevelofSMAD2andβ-cateninproteinweresignificantlyhigherinHGgroupthanincontrolgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05);TheexpressionlevelofSMAD2andβ-cateninproteinwassignificantlyhigherinHG+MEG3siRNAgroupthaninHGgroup,whichshowedasignificantdifference(P<0.05).Conclusion:①Intype2diabetesmellitus,lncRNAsandmRNAsaredifferentiallyexpressed,suggestingthatthesedifferentiallyexpressedlncRNAsweremayinvolvedinprocessesforthedevelopmentoftype2diabetesmellitus.LncRNAswereregardedaspossiblepotentialtargetsforclinicaldiagnosisandtreatment.Throughfurtherbiologicalfunctioninformationexploration,theexpressionofdifferentiallyexpressedlncRNAswereinvolvedinmanysignalpathwaysanddiseasesandavarietyofbiologicalfunctions.Providedthetheoreticalbasisforthefollow-upresearchoftype2diabetesmellitus.②MEG3expressionlevelinperipheralbloodoftype2diabetesmellituspatientswassignificantlydecreased.MALAT1andMIATexpressionlevelsinperipheralbloodoftype2diabetesmellituspatientsweresignificantlyincreased.ROCcurveindicatedthatMEG3,MALAT1andMIATwereregardedasapotentialbiomarkerindiagnosingtype2diabetesmellituspatients.③ThisstudydemonstratestheinvolvementoflncRNAMEG3inhighglucose-inducedendothelialdysfunction.MEG3issignificantlydownregulatedinendothelialcellmodelofhyperglycemia.Inaddition,MEG3knockdowncouldexacerbateinflammatorydamageinendothelialcell.Interestingly,MEG3knockdowninHUVECssignificantlyinducesproliferationandinhibitsapoptosisbyupregulatingBcl-2anddownregulatingBax,caspase-3andP53.ItshouldbenotedthatMEG3knockdowncouldactivateTGF-βsignalingpathwayviaupregulatingTGF-β1,SMAD2andSMAD7aswellasSMAD2protein,activateWnt/β-cateninsignalingpathwayviaupregulatingβ-cateninandCyclinD1aswellasβ-cateninproteinanddownregulatingTCF7L2.OurresultsindicatedthatMEG3canberegardedasthenoveltherapeutictargetandmolecularbiomarkerforhigh9 新疆医科大学博士学位论文glucose-inducedendothelialdysfunction.Keywords:type2diabetesmellitus;Longnon-codingRNA;Genechip;Biomarker;endothelialdysfunction10 新疆医科大学博士学位论文前言[1]伴随着全球糖尿病的流行，亚洲国家糖尿病的患病率也随之增加。过去三十年经济的迅速发展，中国糖尿病的患病率显著增加，最近的研究表明11.6%的中国人群88[2]患有糖尿病，患有糖尿病的人数为1.139×10，糖尿病前期的人数为4.934×10。由于2型糖尿病患病人数的增加，导致了总体糖尿病的患病率增加。糖尿病的流行病[3]学也发生了改变，其中青年型糖尿病的发病率和患者比例显著增加。糖尿病的早期发病会导致心血管疾病和肾脏并发症的负担增加，同时医疗保健的花费也显著增加，9中国在1993年糖尿病经济负担的花费为2.2×10人民币，然而在2007年糖尿病经济11[4]负担的花费为2.0×10人民币，占总医疗保健花费的18.2%。与此同时，估计在203011年糖尿病经济负担的花费将会高达3.6×10人民币。除了糖尿病和糖尿病前期人数的增加，糖尿病相关的代谢异常人数也显著增加。从2010年对非传染性疾病的监控发8[5]现，超过4.54×10的普通成人受到代谢综合征的影响。在美国糖尿病的患病率为8.3%，并且伴有更高的人群BMI值，尽管亚洲人群具有更低的人群BMI值，但亚洲人群具有与美国人群相似的糖尿病患病率。早期对中2国香港人群的研究表明BMI在23kg/m时，糖尿病和其他心血管代谢风险因素开始[6][7]5增加。在每个BMI分类中，亚洲人群比高加索人群更加肥胖。在涉及9×10个人群的大型横断面研究分析BMI与糖尿病风险的关系，发现肥胖的亚洲人群糖尿病的患病率增加2.5-3倍，然而肥胖的美国人群糖尿病的患病率增加6-8倍，与高加索人[8]群相比，亚洲人群糖尿病患者与增加的BMI具有较差的相关性。DECODA研究应用24515男性和29952女性人群的横断面数据，发现印度人群的糖尿病患病率最高，欧洲人群的糖尿病患病率最低，中国人群和日本人群的糖尿病患病率介于印度人群和欧洲人群之间。鉴于横断面研究的局限性，汇总分析的异质性和大量与糖尿病风险相关的因素，研究BMI与糖尿病的关系能够揭示更多的信息。对安大略和加拿大2居住的多种族人群研究发现，当具有相同糖尿病发病率时，白种人的BMI为30kg/m，22南亚人群的BMI为24kg/m，中国人群为25kg/m。与高加索人群比较，中国人群糖尿病的患病率更高、年龄更早、BMI范围更低。美国多中心前瞻性研究表明，在校正潜在的混杂因素后，与白种人群比较，亚洲人群糖尿病发生的危险比为1.86，黑种人群糖尿病发生的危险比为1.55，西班牙人群糖尿病发生的危险比为1.67。这种不同种族之间的差异可能是由于与高加索人群相比，亚洲人群的内脏更加肥胖和代[9]谢不良，从而导致脂毒性和胰岛素抵抗。β细胞功能受损和胰岛素抵抗时引起2型糖尿病重要发病机制，然而在不同人群中，这两种因素在糖尿病病因中的贡献却有所不同。通过比较不同人群胰岛素敏感性和β细胞功能发现，尽管亚洲裔美国人群11 新疆医科大学博士学位论文肥胖水平较低，但是胰岛素抵抗情况更严重。这个能与亚洲人群的内脏更加肥胖有关。在日本裔美国人群的前瞻性队列研究发现，内脏肥胖能够预测胰岛素抵抗的改[10]变。这种倾向能够进一步加剧生活方式的改变，通过与本土日本人群的比较发现，日本裔美国人群肥胖和胰岛素抵抗的水平增加。通过研究不同年龄组糖耐量受损的日本人群，发现年轻的糖耐量受损患者具有最高的胰岛素分泌指数、总胰岛素分泌和胰岛素抵抗的稳态评估，这些研究表明年轻研究对象胰岛素抵抗的显著增加已经引起了高糖血症的早期表现。脂肪组织能够激活内分泌腺，身体脂肪的分布能够影[11]响脂肪细胞因子的产生。在华裔美国人群发现，由于不同脂肪细胞因子，脂肪酸结合蛋白与胰岛素抵抗强烈相关。在中国人群的10年前瞻性研究发现，脂肪酸结合蛋白是糖尿病的独立预测因子。线粒体功能障碍参与内脏的肥胖、胰岛素抵抗和其[12]他的代谢异常。线粒体DNA(mtDNA)的突变是导致2型糖尿病的病理生理机制。在不同种族人群的研究发现，在3%亚洲年轻糖尿病患者中发现线粒体DNA3243A[13]向G的突变能够引起糖尿病。在东亚人群中发现，常见的mtDNA16189突变与2型糖尿病相关，但与欧洲人群无关。在能源环境的波动下，线粒体能够介导表观基因组，允许基因表达的可逆调节。在这些假设的基础下，表明在环境不同的情况下，[14]大多数的DNA突变能够提供遗传和稳定的适应。β细胞功能受损在糖尿病的发病机制中具有重要作用，在血糖正常的超重日本人群中发现胰岛素分泌指数的减少，表明第一时相胰岛素分泌减少。胰岛素抵抗的代偿失败表明胰岛素分泌的受损是2型糖尿病的主要原因。在系统综述和meta分析中发现，与中国和韩国糖尿病患者比较发现，日本人群的空腹血清胰岛素水平更低。鉴于这些种族具有相似的遗传背景[15]和身体结构，可能是由于不同的饮食习惯等环境因素引起这种差异。一些研究比较胰岛素分泌和胰岛素抵抗在糖尿病发病机制中的贡献。通过减少的处置指数发现糖耐量受损的患者和糖尿病患者β细胞功能减少，然而胰岛素敏感性改变较小。在亚洲人群中，通过运用估计的稳态模型评估指数也发现了相似的结果，从而强调了β细胞的功能障碍。在一项涉及非西班牙裔白种人、非洲裔美国人、华裔美国人和日本裔美国人的研究中，通过在非糖尿病绝经前期和早期围绝经期的女性人群中比较胰岛素的敏感性，发现在控制了腰围、空腹血糖受损的发生率、甘油三酯和酒精摄入量后，华裔美国人和日本裔美国人具有较低的稳态模型-β。2型糖尿病是由于多种遗传易感因素、环境和行为因素的相互作用所导致的。近年来的研究进展发现众多[16]的遗传突变与2型糖尿病显著相关。然而遗传因素经常被认为是导致不同种族糖尿病患病率和临床表型不同的主要原因，在欧洲人群中确定的2型糖尿病易感基因也在亚洲人群中得到了重复验证。大量突变存在于不同人群中遗传结构中的，因此，由于等位基因的频率不同，风险等位基因在易感区域的准确位置在不同种族中有所不同。在另一方面，首先在亚洲人群中发现的包括KCNQ1基因在内的一些2型糖尿12 新疆医科大学博士学位论文病易感基因，随后在欧洲人群中得到了重复性的验证。在一项关于2型糖尿病易感基因的meta分析中发现，在亚洲人群发现的与2型糖尿病相关的8种易感基因同时[17]也与欧洲人群相关。大部分这些突变被认为通过影响胰岛素的分泌，影响2型糖尿病的风险。众多报道的与2型糖尿病相关的位点在亚洲和欧洲人群中具有同样的效果。随着最近几十年糖尿病患病的增加，中国成为糖尿病患者最多的国家。由于疾病的巨大负担，中国大量的研究者开始从基础研究和临床的角度关注糖尿病。由于中国人群特殊遗传背景和生活方式，中国糖尿病患者具有不同的临床和病理特征。中国临床糖尿病的研究主要关注于流行病学、诊断、预防和糖尿病的治疗，其中主要的关注领域是定义诊断中国人群糖尿病合适的临界点，因为大部分的诊断标准产生于西方国家。美国糖尿病协会和WHO建议诊断糖尿病的临界点的HbA1c值为6.5%(48mmol/mol)，然而流行病学的证据表明针对于中国人群诊断糖尿病的HbA1c临界点为6.3%(45mmol/mol)，此值相比于6.5%(48mmol/mol)和空腹血糖临界点[18]7.0mmol/L有更高的敏感性。鉴于中国糖尿病患者的独特性，一些研究的目标是形[19-21]成中国人群特异的糖尿病治疗指南，而不是复制欧美国家的治疗指南。值得注意的是中国糖尿病人群β细胞功能的缺陷更为严重，导致了胰岛素分泌的严重不足[22]和更高的餐后血糖浓度。因此，治疗策略应当关注于控制餐后血糖和保护β细胞功能。一些研究表明，除了二甲双胍，速效胰岛素促分泌剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂可以用来治疗新诊断的2型糖尿病患者。此外，对于新诊断的严重高血糖患者，推[23]荐短期加强胰岛素治疗能够控制血糖和保护β细胞功能。虽然大量的研究关注于糖尿病治疗，然而存在的循证医学是不充分的，因此需要更多的前瞻性研究。目前，中国糖尿病的基础研究主要关注于糖尿病的发病机制，包括遗传学与分子机制。随着全新遗传学研究方法的发展，确定了大量的风险位点与中国人群2型糖尿病密切相关。在白种人群确定的2型糖尿病易感基因也同时与东亚人群2型糖尿病密切相关。发现的风险位点对于2型糖尿病的病因有新的见解。特别是与白种人群相比，中国人群胰腺β细胞对于有害因素更加的敏感，然而机制的潜在差异还不清楚。最近的遗传学研究强调了具体的遗传位点，联合整体的遗传风险，导致了β细胞功能障碍，这种功能障碍是引起中国人群2型糖尿病的主要原因。在未来需要对于导致2型糖尿病患者β细胞功能障碍的易感基因进行更深层的分析。在中国未来几年，有三个主要的糖尿病研究领域得到研究者的关注，第一，遗传性缺陷，包括基因组、表观遗传学和环境因素，以及这些因素之间的交互作用在整个生命周期糖尿病发病机制中的重要作用。第二，导致高糖血症分子生物学的缺陷，包括胰岛素分泌和胰岛素抵抗的功能障碍。第三，确定糖尿病及其并发症的生物标记物，以及应用它们预测糖尿病的发病、进展和预后。13 新疆医科大学博士学位论文最近几年，长链非编码RNA(lncRNAs)由于影响多种分子信号通路受到了越来越[24]多的关注。最广为人知的lncRNA是在1991年发现的Xist。这种高表达的调节型lncRNA能够通过招募X染色体的多梳抑制复合物2(PRC2)沉默复合体，进而调节X-失活。Xist在cis的这种功能导致了剩下失活X沉默复合体的广泛传播，促进了异[25]染色质形成与转录沉默。由于新一代测序技术的来临，近十年对lncRNAs的关注与日俱增。这种高分辨率敏感的方法能够揭示成千上万中非编码RNAs，大部分这些lncRNAs在正常和疾病状态时都是低转录的。然而，也有种非蛋白编码RNAs是RNA聚合酶Ⅱ依赖的转录本，类似于蛋白编码的RNAs从而被加工处理，进行5’脱帽和3’[26]多聚腺苷酸化。目前，lncRNAs被认为是大于200个核苷酸的非编码RNA，在细胞中具有多种功能。类似于Xist，其他的lncRNAs能够调节染色质修饰复合物。例如，HOTAIR转录本，来源于HOX位点的转录能够结合到PRC2复合物和赖氨酸特异性的去甲基化酶-1A/REST辅阻遏子/RE1-沉默转录因子(LSD1/REST/CoREST)复[27]合物。除了能够结合到染色质修饰物，lncRNAs能够作为蛋白复合物的支架。Linc-p21转录本与hnRNPs的相互作用进而调节p21，从而编码癌细胞中重要的肿瘤[28]抑制基因。这种lncRNAs与蛋白复合物的相互作用强调了lncRNAs与蛋白相互作用的重要性。LncRNAs与蛋白相互作用依赖于lncRNA的二级结构。相反，大量lncRNA的功能依赖于RNA的序列。Linc-MD1能够减少miRNA的功效，直接降解MEF2C和MAML1的mRNA。除了能够结合miRNA，lncRNA能够直接与目标mRNAs相互作用，影响他们的稳定性。LncRNAs由于Alu元件序列导致不完美的碱基配，结合到mRNA的目标3’UTRs，以及通过Staufen1(STAU1)-介导的信使RNA降解(SMD)从而导致RNA双链的降解，因此，lncRNAs被称为一半STAU1结合位点RNAs(1/2-sbsRNA)。有趣的是，终末分化诱导的非编码RNATINCR被认为是由[29]于SMD装置，通过25-核苷酸序列结合到目标mRNAs。这些例子表明，lncRNA能够以序列依赖的方式通过转录后水平影响基因的表达。最后，lncRNAs被描述为[30]宿主miRNAs。事实上，大约10%的lncRNAs是miRNAs的宿主转录本。LncRNAs不同的分子功能使其成为有趣的研究目标，但依旧存在研究的挑战。由于遗传和环境因素的共同作用，导致全球糖尿病的流行，高血糖的状态能够定义糖尿病和促进微血管和大血管疾病，包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾脏病变、[31]糖尿病神经病变、动脉粥样硬化和其他血管病变。这些糖尿病并发症会导致患者的死亡率增加。因此，理解高糖血症导致的分子机制及其相关的糖尿病并发症能够改善治疗糖尿病并发症的临床方法和探索全新的治疗靶点。在近几年开始在糖尿病和糖尿病并发症中评价lncRNAs的功能作用。事实上，大量研究的与人体1型糖尿[32]病和2型糖尿病相关的单核苷酸多态性位点都是坐落在lncRNA区域内，表明lncRNAs可能参与糖尿病发生的过程中。胰腺能够感觉血糖水平，通过胰腺β细胞14 新疆医科大学博士学位论文分泌胰岛素，刺激外周组织对血糖进行摄取。在2型糖尿病中，由于β细胞的功能障碍和胰岛素的抵抗导致高糖血症。在1型糖尿病中，高糖血症是由于β细胞和胰岛素产量的损失。最近几年，lncRNAs参与胰腺的发育及胰腺发挥正常的功能。事实上，高通量测序发现大于1000种基因间和反义lncRNAs在胰岛细胞中进行转录。[33]特别是，β细胞特异性表达的HI-LNC25调节GLIS3mRNA的表达。最近的研究表明lncRNAs在β细胞中的作用可能普遍存在的。分析β细胞的转录组发现lncRNAs能够控制参与β细胞的形成的主要调节网络。特别是，β细胞长链基因间非编码RNA1(βlinc1)能够调节邻近基因编码对胰岛发育具有重要作用的转录因子。βlinc1的[34]损失会导致小鼠模型血糖稳态的失调。通过RNA测序比较胰岛转录组的差异，发现血糖正常和高糖血症捐赠者的离体胰岛lncRNAs表达不同，这些lncRNAs与[35]HbA1clevels水平密切相关。对lncRNAs的功能作用进行深入分析，能够确定lncRNAs是否参与胰岛的功能失调。重要的是，通过RNA测序跨物种分析人体与[36]小鼠胰岛转录组发现在两个物种β细胞发育过程中，许多lncRNAs被调节和转录。这些分析对于优先确定lncRNAs在人体和小鼠的表达十分有用，研究者们可以运用小鼠模型评价lncRNAs在体内的作用。肝脏是参与包括脂质合成、药物代谢和糖异生在内的许多代谢过程的主要器官。在正常的肝脏发挥功能时，许多lncRNAs参与[37]此过程。特别是肝脏特异性表达的lncLSTR参与调节系统脂质代谢。这些lncRNAs结合到TDP-43调节Cyp8b1的活性，改变胆汁酸的水平影响farnesoidX受体(FXR)通路促进肝脏甘油三酯清除率。这是首次发现lncRNAs能够参与正常肝脏的代谢通路。同样的，lncRNASRA通过调节脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表达参与调节血[38]脂水平，参与肝脏甘油三酯的水解。SRA转录抑制FoxO1的表达，正常诱导ATGL的水平。综上所述，这些研究强调了这些lncRNAs在正常肝脏发挥功能的重要意义。更多的研究确定了肝脏中的lncRNAs与肝脏的疾病密切相关，例如非酒精性脂肪肝[39-41]疾病和非酒精性肝炎。糖尿病患者处于肝脏代谢的功能障碍，因此，理解lncRNAs在肝脏病理学中的作用具有重要意义。对于胰岛素的分泌，肌肉细胞对于血糖的摄取具有重要作用。LncRNAs肌肉的生成和生肌分化过程。MEG3是坐落在DLK1-MEG3位点内。在小鼠模型中，MEG3表达的损失能够导致围产期的致死和骨[42]骼肌缺陷。更多的lncRNAs参与生肌分化，包括linc-YY1和与MyoD活性相关的lncRNAs。在骨骼肌生成的过程中，linc-YY1复合物和转录因子YY1，与PRC2复合[43]物相互作用在trans过程中沉默基因。出现的人体同源的linc-YY1表明这种lncRNAs在人体和小鼠中高度保守。在生肌分化过程中，MyoD能够编码重要的转录[44][45,46]因子。MyoD能够诱导至少两种lncRNAs转录，包括Linc-RAM和Dum。Linc-RAM结合到MyoD，一起与染色质修饰物相互作用：Baf60c和Brg1，两种重[47]要的核小体重塑分子。在分化的过程中，核糖核苷酸复合物以肌源性基因为目标15 新疆医科大学博士学位论文调节基因的表达。在分化的过程中，lncRNA的转录招募DNA甲基化蛋白沉默Dppa2的表达。以上的研究揭示了lncRNA在转录水平调节肌肉的生成和生肌分化的重要意义。脂肪组织是主要的胰岛素反应组织，脂肪细胞生成主要的脂肪因子对代谢过程至关重要。在肥胖中，由于巨噬细胞的累积增加了脂肪因子的炎症，能够导致胰岛[48]素抵抗、2型糖尿病和代谢综合征。转录组分析经历脂肪生成的细胞发现，在脂肪细胞分化和成熟的过程中表达了许多的lncRNA，表明这些转录本在脂肪组织的发育[49]过程中具有重要作用。事实上，对白色脂肪组织和棕色脂肪组织的转录组进行了[50]深层测序，发现许多lncRNA事脂肪组织特异性表达的。其中，lnc-BATE1通过与hnRNPU相互作用，调节棕色脂肪细胞的发育。Blnc1也参与棕色脂肪细胞的发育，[51]Blnc1与转录因子EBF2相互作用调节产热基因调节程序。在饮食诱导肥胖的小鼠[52]模型中，SRA的敲除能够导致胰岛素敏感性和胰岛素抵抗增加。因此，许多脂肪细胞特异性表达的lncRNA参与肥胖，影响糖尿病的发生和发挥。综上所述，本研究利用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4芯片技术确定2型糖尿病中差异表达的lncRNAs和mRNAs，运用KOBAS软件对差异表达的mRNAs进行Pathway、Disease和GeneOntology功能注释富集分析，从基因整体水平探讨lncRNAs在2型糖尿病发生发展中的机制，为后续分析lncRNAs在2型糖尿病中的作用提供信息基础，同时为2型糖尿病生物治疗提供新的研究思路。构建lncRNA与mRNA共表达网络、lncRNA靶基因的预测以及转录因子的预测等生物信息学分析方法，为诊断分子标志物的筛选以及临床治疗提供理论基础和实验依据。我们在2型糖尿病lncRNAs差异表达谱中，筛选出差异倍数FC(abs)在2.0倍以上并且P≤0.01的lncRNAs，最终在查阅文献的基础上选取MEG3、MALAT1和MIAT进行荧光定量PCR进行验证。在200例2型糖尿病病患者和200例非2型糖尿病患者外周血中对MEG3、MALAT1和MIAT的表达情况进行检测，并分析其表达水平与临床指标之间的联系，以探讨其临床意义和可能的作用机制。运用受试者工作特征(ROC)曲线分析，对MEG3、MALAT1和MIAT作为早期诊断2型糖尿病生物标志物的可行性及价值进行初步探讨。以HUVECs为研究对象，高糖诱导的HUVECs作为内皮细胞功能障碍模型，模拟糖尿病内皮损伤的高糖环境，通过RNAi慢病毒载体构建和包装敲除MEG3基因的表达，采用实时荧光定量PCR技术、MTT实验、FITC-PI双染流式细胞术和Westernblot技术，观察MEG3基因敲除后，炎症细胞因子的表达、细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达、TGFβ和Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白的表达。通过观察MEG3基因敲除后，对高糖诱导的HUVECs生理功能和生物学行为的改变，从而推断MEG3在糖尿病内皮细胞损伤发生发展中的作用机制及可能的调控方式，为进一步探究糖尿病血管并发症的发病机制及防治策略提供新的思路。16 新疆医科大学博士学位论文第一部分2型糖尿病LncRNAs差异表达谱的筛选在正常和疾病状态下，lncRNAs是重要的调节型RNAs在许多细胞进展过程中发挥重要作用。最近的研究表明在糖尿病胰腺β细胞分化过程中lncRNAs功能出现失调。LncRNAs同样能通过炎症、纤维化、糖化应激、内质网应激和线粒体功能障碍导致糖尿病并发症的发生。毫无疑问，通过对糖尿病组织的转录组研究，我们将会识别更多的与糖尿病进展有关的lncRNAs。值得注意的是lncRNAs具有个体特异性。通过分析不同个体粒细胞转录组发现lncRNAs在不同个体的表达不同，表达水[53]平比蛋白编码基因更高。在糖尿病易感性人群理解特异性lncRNAs是如何表达的将会非常有意义。此外，确定的与糖尿病及其并发症相关的坐落在lncRNAs位点内的SNPs能够用来识别具有糖尿病高风险的个体。虽然在正常细胞和组织中发现了有[54]价值的lncRNAs目录，同时对于疾病组织转录组分析也揭示了部分功能失调的lncRNAs，还需要对lncRNAs的分子功能进行进一步的研究。最近，大量的研究发[55,56]现以前分类为非编码的RNAs能够编码参与肌细胞发育过程的多肽，这种未曾预料到的发现强调了需要研究lncRNAs的重要性。随着越来越多技术(ChIRP-seq、RNA-免疫沉淀偶联质谱等)手段的出现，加快了对于lncRNAs功能的分子机制、蛋[57]白结合模式和基因组靶点的研究。鉴于lncRNAs在疾病状态的影响，以lncRNAs[58]为治疗干预靶点变得非常重要。研究表明在小鼠的肾脏，化学修饰靶向特异性序列的gapmer寡核苷酸能够用来抑制lncRNAs的表达。这种相似的策略也能够应用于糖尿病肾病。此外，在临床患者体液中lncRNAs的表达可以作为早期发现糖尿病的有价值生物标记物。而且，在正常和疾病状态的组织中综合分析lncRNA和mRNA网络，可以用来了解lncRNA和mRNA的个体中的作用。最近在糖尿病的代谢组织揭示的lncRNA功能，毋庸置疑揭示了更多的与糖尿病及其并发症发展相关的lncRNA。新一代的测序彻底变革了基因组的研究，揭示出人体和小鼠的转录组。在不同的刺激下，许多lncRNA的表达模式发生了改变。研究确定了大量的lncRNA参与人类疾病的调节，但是大部分lncRNA的功能未被阐明。在未来仍然面临的挑战包括：⑴虽然可以通过NONCODE、GENCODE、lncRNAdb和LNCipedia数据库得到关于lncRNA注释的信息，但是当前的lncRNA注释还不够全面，需要对lncRNA进行准确的注释。⑵对于阐明lncRNA的分子和生物作用存在困难，特别是预测影响lncRNA功能的二级和三级结构。⑶许多lncRNA具有物种特异性，例如在小鼠和人体中lncRNA具有低保守性和序列同源性。因此，科学家们是应该研究在不同物种中具有高度保守性的lncRNA，还是只对人体特异的lncRNA进行研究？与此同时，在小鼠17 新疆医科大学博士学位论文中研究人体特异的lncRNA是否合理？运用lncRNA作为潜在的治疗靶点创造了更多的挑战和机遇。不同技术手段的发展对于确定组织或细胞特异性表达的lncRNA十分重要。生物标记物被用来测量和评价正常生理过程、病理过程和对于疾病干预的药理反应。包括lncRNA在内的候选标记物首先应当能够确定个体是否患有胰岛素抵抗和糖尿病的风险，其次确定lncRNA的表达模式，能够有助于预测最终发展为2型糖尿病的风险人群。在全世界糖尿病的负担与日俱增。糖尿病导致严重的医学问题包括失明、肾脏功能障碍、神经损伤和血管病变。众多的动物和人体研究表明lncRNA能够调节糖尿病的病理学机制。LncRNA通过调节复杂的信号节点或者网络，而不是个别基因靶点，从而能够提供治疗机会更广泛的纠正糖代谢。通过基础与临床跨学科团队研究者能更好的理解lncRNAs和其他非编码RNA在血糖代谢和糖尿病并发症的调节作用，在管理糖尿病和心血管代谢疾病患者时，有效的将实验室的研究成果转向临床。本部分利用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4芯片技术确定2型糖尿病中差异表达的lncRNAs和mRNAs，运用KOBAS软件对差异表达的mRNAs进行Pathway、Disease和GeneOntology功能注释富集分析，从基因整体水平探讨lncRNAs在2型糖尿病发生发展中的机制，为后续分析lncRNAs在2型糖尿病中的作用提供信息基础，同时为2型糖尿病生物治疗提供新的研究思路。构建lncRNA与mRNA共表达网络、lncRNA靶基因的预测以及转录因子的预测等生物信息学分析方法，为诊断分子标志物的筛选以及临床治疗提供理论基础和实验依据。1研究内容与方法1.1研究对象选取2016年10月至2017年2月在新疆医科大学第一临床附属医院入院进行就诊的汉族2型糖尿病患者作为2型糖尿病组，共5例，其中男性4例、女性1例，平均年龄(53.00±4.06)岁。纳入标准：依据2007年中国糖尿病防治指南公布的2型糖尿病诊断标准：空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2h血糖≥11.1mmol/L或既往有确切糖尿病病史、正在使用降糖药物或胰岛素者。排除标准：⑴其他特殊类型糖尿病。⑵恶性肿瘤。⑶慢性炎症等相关疾病。⑷严重的心肝肺肾等疾病。⑸自身免疫性疾病。选择同期在该院进行就诊的汉族非2型糖尿病患者作为对照组，共5例，其中男性2例、女性3例，平均年龄(57.00±5.75)岁。纳入标准：空腹血浆葡萄糖<6.1mmol/L和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2h血糖<7.8mmol/L。排除标准：⑴既往诊断为2型糖尿病。⑵合并其他内分泌疾病。⑶恶性肿瘤。⑷急、慢性感染及严重传染性疾病患者。⑸严重的心肝肺肾等疾病。⑹自身免疫性疾病。所有研究对象均为无血缘关系并且在新疆地区长久居住的常住人口，18 新疆医科大学博士学位论文排除了由于环境差异而引起的基因变异。本研究方案经新疆医科大学一附属医院医学伦理委员会批准，研究对象均自愿签署书面知情同意书。1.2主要试剂及实验设备1.2.1主要试剂1.2.1.1全血总RNA的提取的相关试剂⑴TRIzolReagent®⑵NucleoSpinRNAclean-up试剂盒⑶人外周血淋巴细胞分离液1.2.1.2总RNA合成cDNA的相关试剂⑴FirstStrandBufferMix⑵FirstStrandEnzymeMix⑶Nuclease-freeWater⑷SecondStrandBufferMix⑸SecondStrandEnzymeMix1.2.1.3体外转录合成cRNA的相关试剂⑴T7BufferMix⑵T7EnzymeMix1.2.1.4cRNA反转录的相关试剂⑴2nd-CycleBufferMix⑵2nd-CycleEnzymeMix1.2.1.5荧光标记的相关试剂⑴5×KlenowBuffer⑵Cy5-dCTP(或Cy3-dCTP)⑶KlenowFragment1.2.1.6荧光杂交的相关试剂⑴2XGExHybBuffer⑵Formamide1.2.1.7芯片清洗的相关试剂⑴10%SDS⑵20xSSC1.2.2主要实验设备⑴Centrifuge5810R(Eppendorf)⑵SpectrophotometerND-1000(NanoDrop)⑶Concentrator5301(Eppendorf)19 新疆医科大学博士学位论文⑷PeltierThermalCyclerPTC-225(MJ)⑸HybridizationOvenG2545A(Agilent)⑹AgilentG2565CAMicroarrayScanner(Agilent)⑺PipetteP-2.5,P-20,P-200,P-1000(Eppendorf)1.3方法1.3.1临床资料收集体格检查(身高、体重、腰围、臀围和血压)等由专业的人员进行测量，同时对研究对象进行面对面的询问调查，调查内容包括年龄、性别、既往史及生活习惯等。1.3.2血生化指标的测定对研究对象清晨空腹抽取静脉血，检测包括空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素(BUN)等生化指标。生化指标均由新疆医科大学第一临床附属医院检验中心统一测定。1.3.3人类lncRNA芯片实验步骤本实验利用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4，4x180K芯片，检测人物种的基因表达谱，该芯片包含41000条lncRNAs和34000条mRNAs。这些lncRNAs和mRNAs目标序列合并了多种数据库，其中有23898条来源于GENCODE/ENSEMBL数据库，14343条来源于LincRNA目录，7760条来源于RefSeq，5627条来源于UCSC，13701条来源于NRED(ncRNA表达数据库)，21488条来源于LNCipedia，1038条来源于H-InvDB，3019条来源于LncRNAs-a，1053条来源于AntisensencRNApipeline，407条来源于HoxncRNAs，962条来源于UCRs，848条来源于ChenRuishenglab。探针检测的每条RNA重复2次，芯片包含4974个Agilent对照探针(图1-1)。1.3.3.1外周血RNA提取及质量检测1.3.3.1.1外周血单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)提取⑴取新鲜抗凝血3-5ml，与生理盐水1:1混匀后，小心加入淋巴细胞分离液上层，淋巴细胞分离液约为2倍体积的全血，以1500转/分，离心20分钟。此时离心管有上至下为血浆层、白色淋巴细胞层、分离液层和红细胞层。⑵使用移液器收集白色淋巴细胞层，置于1.5ml的离心管中，以10000转/分，离心5分钟，弃上清液收集白色沉淀至管底。⑶加入1mlTrizol，反复吹打混匀至形成不粘稠的液体。1.3.3.1.2外周血淋巴细胞总RNA的提取和质检采用Trizol法提取外周血淋巴细胞总RNA，对总RNA进行过柱纯化。采用紫外分光光度计进行定量，确保所用样本RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，运用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，确保RNA完整无降解。20 新疆医科大学博士学位论文1.3.3.2总RNA合成cDNA1.3.3.2.1反转录合成FirstStrandcDNA⑴取5μL的总RNA，加入到0.2mL的离心管中。⑵全部样品加入2.0μL的SpikeA，或者加入2.0μL的SpikeB。⑶在冰上配制反转录MasterMix，反转录MasterMix总体积为5μL，包括4μL的lncRNA+mRNAFirstStrandBufferMix和1μL的FirstStrandEnzymeMix，颠倒混匀，离心后静置冰浴。⑷取5μL的反转录MasterMix，加到含有5μL的总RNA样品的0.2mL离心管中，反转录最终反应体积为10μL。⑸轻柔震荡混匀，离心后静置于冰上。⑹将反转录离心管置于PCR仪上，反应条件为25℃60秒，42℃60秒，4℃5分钟以上。取出反转录离心管，短暂离心后静置于冰上。1.3.3.2.2合成SecondStrandcDNA⑴在冰上配制SecondStrandMasterMix，SecondStrandMasterMix总体积为50μL，包括32.5μL的Nuclease-freeWater、12.5μL的SecondStrandBufferMix和5μL的SecondStrandEnzymeMix，震荡混匀，离心后静置于冰上。⑵取50μLSecondStrandMasterMix加到反转录合成FirstStrandcDNA的反应管中，混合总体积为60μL；颠倒混匀，离心后静置冰浴。⑶将第二链合成离心管置于PCR仪上，反应条件为16℃反应60秒，65℃反应10分钟，4℃保持5分钟以上。⑷反应结束后将反应管静置于冰上，或者迅速冻存于-20℃。1.3.3.3体外转录合成cRNA⑴配制体外转录MasterMix，体外转录MasterMix总体积为30μL，包括24μL的T7BufferMix和6μL的T7EnzymeMix，震荡混匀，短暂离心将溶液收集于管底。⑵取30μL体外转录MasterMix到合成SecondStrandcDNA的反应管中，轻柔震荡混匀，离心后静置于冰上。⑶将体外转录合成离心管置于PCR仪上，反应条件为40℃反应16小时，4℃保持。⑷反应结束后，短暂离心，对cRNA产物进行纯化，运用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。1.3.3.4cRNA反转录⑴取cRNA纯化产物10μg，调整体积至22μL，加入到0.2mL的离心管中，并加入2μL的RandomPrimer颠倒混匀，放入PCR仪上，反应条件为70℃5分钟，25℃5分钟，4℃2分钟，短暂离心收集液体至管底，静置冰浴。⑵配制cRNA反转录MasterMix，cRNA反转录MasterMix总体积为16μL，包括8μL2nd-CycleBufferMix和8μL2nd-CycleEnzymeMix，轻柔震荡，离心后将溶液收集于离心管底。⑶取16μL反转录MasterMix加入到cRNA和RandomPrimer反应后的离心管中，总体积为40μL，轻柔震荡混匀，短暂离心。⑷将cRNA反转录离心管放入PCR仪上，反应条件为25℃反应10分钟，40℃反应1.5小时，70℃反应10分钟，4℃反应5分钟，21 新疆医科大学博士学位论文离心后静置于冰上。⑸在cRNA反转录离心管中加入2μL的RNaseH轻柔混匀，短暂离心，放入PCR仪上，反应条件为37℃反应45分钟，95℃反应5分钟，4℃维持5分钟。⑹反应结束后，可迅速冻存于-20℃过夜，或进行纯化的实验操作。⑺进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。1.3.3.5荧光标记⑴将反转录并纯化后得到的cDNA产物体积浓缩至14μL，加入4μL的RandomPrimer混匀，离心后放入PCR仪上，反应条件为95℃变性3分钟，冰浴5分钟。⑵依次加入5μL的5×KlenowBuffer、1μL的Cy5-dCTP(或Cy3-dCTP)和1.2μL的KlenowFragment，轻轻颠倒混匀。⑶离心后，放入PCR仪上，反应条件为37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟，4℃保持。⑷荧光染料标记反应结束后，进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的荧光标记产物进行荧光掺入量和核酸定量。1.3.3.6芯片杂交⑴纯化后的标记产物，洗脱体积在30μL左右。⑵将单管标记Cy3-dCTP纯化洗脱产物抽真空浓缩或补水体积至27.5μL备用。⑶将准备好的标记产物与55.0μL的2XGExHybBuffer和27.5μL的Formamide混合。⑷取100μL杂交液加样至杂交盖片围栏中，轻轻盖上围栏，安装好杂交盒并旋转紧后，水平转动杂交盒。⑸将杂交盒安装在杂交炉上，注意对称安装，同时加入适量超纯水后，45℃杂交过夜。1.3.3.7芯片清洗及扫描⑴结束后，取出芯片在芯片洗干仪进行芯片清洗，首先应用含有0.2%SDS和2×SSC的洗液42℃120S清洗2遍，再次应用洗液42℃120S清洗3遍。清洗完成后，离心晾干，等待扫描。⑵使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。图1-1LncRNA芯片实验步骤Fig.1-1ExperimentalstepsofLncRNAchip22 新疆医科大学博士学位论文1.3.4人类lncRNA芯片实验数据分析1.3.4.1芯片实验的全样本分析全样本分析包括对全体样本表达数据的预处理(提取、整合、质控检测、归一化、添加注释)(图1-2)。1.3.4.1.1全样本的相关性分析本研究根据2型糖尿病组和对照组的样本的lncRNA和mRNA的表达量计算样本间的相关性，该分析可观察两组样本间的相关程度。1.3.4.1.2全样本的箱线图分析通过对单荧光芯片的数据进行背景清除，同时根据样本归一化前后的信号值绘制箱线图，从而评价芯片数据的分布及分散程度，展示不同样本归一化前后总体基因表达情况。1.3.4.1.3全样本的主成分分析主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)是反映样本相似程度的另一种统计方法。通过数据的降维，将样本的表达量展示在三维空间中。通过观察样本在图中的分布情况，可以判断样本间的相似程度。1.3.4.2芯片实验的比较分析2型糖尿病组和对照组样本芯片实验的比较分析是根据给定的实验方案对两组样本进行差异表达分析，完成差异比较分析后，基于获得的差异结果，进行lncRNA-mRNA联合分析。1.3.4.2.1lncRNAs和mRNAs表达量的聚类图分析聚类分析是数据建模和数据挖掘过程中的一种常用方法，并且也是结果呈现的一种手段。它依据数据的数学特性进行归类，依据样本的表达模式，表达水平越相似的样本聚为一类，从而了解样本和基因的相互关系，得出具有生物学意义的结论。1.3.4.2.2lncRNAs和mRNAs表达量的散点图分析散点图是经过log转换后的值表示，可以直观反映发生显著差异的lncRNAs和mRNAs基因的数量，以及与基因表达整体数量的大体占比，分析差异倍数FC(abs)>2以上，P<0.05，差异有统计学意义的lncRNAs和mRNAs，观察其分布及统计学的差异。1.3.4.2.3lncRNAs和mRNAs表达量的火山图分析通过差异分析得到的P值与差异倍数FC(abs)值两个因素共同绘制火山图，用于显示两组样品的显著性差异，可以观察到2型糖尿病组与对照组之间芯片表达差异的lncRNAs基因数据分布变化。1.3.4.3芯片实验的基因注释富集分析运用KOBAS(KEGGOrthologyBasedAnnotationSystem)软件对2型糖尿病组和23 新疆医科大学博士学位论文对照组差异表达的mRNAs进行信号通路Pathway、人类疾病Disease和GeneOntology功能注释富集分析，其中包括4个信号通路数据库(KEGG、BioCyc、PANTHER和Reactome)，4个人类疾病数据库(KEGG、FunDO、NHGRI和OMIM)和1个功能数据库。1.3.4.3.1信号通路的注释富集分析利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、BioCyc、PANTHER和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。1.3.4.3.2疾病的注释富集分析利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、FunDO、NHGRI和OMIM人类疾病数据库中进行疾病注释富集分析。1.3.4.3.3GeneOntology功能注释富集分析GeneOntology(简称GO)，是一个对基因和基因产物的功能进行统一的定义描述的项目。GO发展了具有三级结构的标准语言，是基因功能国际标准分类体系，根据基因产物的细胞组件、分子功能和生物过程对基因进行定义和分类。三种本体论的内容如下：细胞组件(cellularcomponent)指细胞的每个部分和细胞外环境。分子功能(molecularfunction)指基因产物在分子层次参与的活动。生物过程(biologicalprocess)指细胞内发生的，可以定义开始和结束的事件。利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在生物过程biologicalprocess、细胞组件cellularcomponent和分子功能molecularfunction三个本体论中进行GeneOntology功能注释富集分析。1.3.4.3.4GeneOntology二级条目频率图在差异基因背景和全部基因背景下GO数据库各二级功能的基因富集的情况，体现两个背景下各二级功能的地位，具有明显比例差异的二级功能说明差异基因富集与全部基因富集的不同趋势，可以重点分析此功能是否与差异相关。1.3.4.3.5GeneOntology功能层次网络图分析分别选取GeneOntology三个本体论中前20个显著富集点的GO节点以及这些节点的所有父节点绘制而成的GO功能层次网络图。1.3.4.4lncRNA-mRNA的联合分析1.3.4.4.1共表达分析共表达分析是以数学中的相关性为主要依据，从基因表达层面寻找表达谱相似的lncRNA-mRNA关系对。大量功能相关的基因在相关的条件下有类似的表达谱，特别是被同一种转录因子调控的基因，或者产物构成同一种蛋白复合体，或者参与相同的调控途径。因此，共表达分析及基于共表达结果的网络构建可以发现lncRNA与mRNA之间可能存在的作用关系，定位出lncRNA与mRNA在共表达网络上处于核心位置，找到影响mRNA表达调控的lncRNA，将lncRNA与特定的功能和信号通24 新疆医科大学博士学位论文路联系起来，从而发现网络中起中心调控作用的lncRNA及发现lncRNA可能存在的全新作用机制和功能。1.3.4.4.2靶基因预测已知lncRNA的作用机制中，lncRNA可以通过与临近基因的相互作用来调节临近基因的表达，或通过miRNA的间接影响来调控远处基因的表达。靶基因预测分析以如上两种作用机制为基础，预测lncRNA可能调控的mRNA。靶基因预测（target_predict）按方法可分为cis-预测和trans-预测。cis-预测也称顺式预测，通过lncRNA和mRNA位置比对，预测在位置上具有一定关系的lncRNA-mRNA关系对；trans-预测也称反式预测，通过序列比对的方法寻找可能存在关系的lncRNA-mRNA关系对。在lncRNA与mRNA共表达筛选结果(Correlation>0.99或者Correlation<-0.99，并且P<0.05)的基础上，cis-预测寻找基因组位置在10kb之内的lncRNA-mRNA对，trans-预测利用blat工具对lncRNA和mRNA(3’UTR)序列进行比对，筛选序列相似的lncRNA-mRNA对。1.3.4.4.3靶基因信号通路的注释富集分析利用KOBAS对靶基因mRNAs分别在KEGG和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。1.3.4.4.4转录因子预测转录因子预测(TFs_predict)利用Match-1.0Public转录因子预测工具进行预测，在共表达结果的基础上对每一个lncRNA的起始位点上游2000bp、下游500bp区域与转录因子的结合情况进行预测。图1-2LncRNA芯片实验数据分析Fig.1-2AnalysisofexperimentaldataoflncRNAchip25 新疆医科大学博士学位论文1.4统计学方法采用FeatureExtraction提数软件进行预处理分析，然后采用GeneSpringGX软件进行分位数标准化和后续处理。利用t检验计算基因表达差异和统计学显著性P值。数据处理过程主要包括：⑴芯片扫描tiff图用FeatureExtraction软件处理获得原始数据。⑵将原始数据导入GeneSpring软件，写入分组等参数信息。⑶对每个样品进行数据归一化和QC分析。⑷用Cluster3.0软件进行Cluster分析和图形化展示。⑸根据分组信息，进行差异比较，得到差异基因。⑹对差异的mRNA进行GO及Pathway分析。⑺进行lncRNA-mRNA共表达分析、靶基因预测、转录因子预测。2结果2.1T2DM组与非2型糖尿病组临床指标比较本课题选取2016年10月至2017年2月在新疆医科大学第一临床附属医院入院进行就诊的2型糖尿病患者5例，其中男性4例、女性1例，非2型糖尿病患者5例，其中男性2例、女性3例，构建2型糖尿病组和与非2型糖尿病组(对照组)血液中lncRNAs及mRNAs的表达谱，2型糖尿病组与对照组间的一般临床指标比较，结果显示2型糖尿病组的年龄、体重、SBP、DBP、血糖、TG、TC、HDL、LDL、UA、Cr和BUN与对照组间的差异均无统计学意义（P>0.05），具体结果见表1-1。表1-1T2DM组与对照组临床指标的比较(xs)Table1-1Clinicalcharacteristicsbetweenthetwogroups(xs)指标T2DM组对照组tP例数55年龄(岁）53.00±4.0657.00±5.751.2710.239体重(kg)72.00±11.7567.00±8.310.7770.239收缩压(mmHg)126.00±11.40128.80±26.590.2160.834舒张压(mmHg)83.00±12.0474.00±7.871.3990.200血糖(mmol/L)7.66±5.044.98±0.661.1820.301甘油三酯(mmol/L)2.02±1.951.58±0.880.4590.658总胆固醇(mmol/L)4.33±1.284.35±0.860.0410.969高密度脂蛋白(mmol/L)1.08±0.231.11±0.230.2210.83低密度脂蛋白(mmol/L)2.66±0.992.92±0.760.4600.658尿酸(μmol/L)300.80±77.36281.36±44.840.4860.640肌酐(μmol/L)69.00±28.1356.68±8.750.9350.377尿素(mmol/L)5.16±0.803.98±0.932.1530.06326 新疆医科大学博士学位论文2.2T2DM组和对照组样本芯片实验的全样本分析2型糖尿病组和对照组样本芯片实验的全样本分析包括对全体样本表达数据的提取、整合、质控和归一化的处理。2.2.1芯片扫描结果本实验使用Agilent芯片扫描仪对杂交后的芯片进行扫描得到图像，每张芯片有效杂交率均达到99%以上，每张芯片信号均匀清晰，没有边缘化效应，阳性定位与阴性定位对照区域结果明显，证明芯片杂交检测的一致性高及结果的真实可靠(图1-3)。图1-3芯片扫描图Fig.1-3Chipscanningdiagram2.2.2相关性本研究根据2型糖尿病组和对照组的样本的lncRNA和mRNA的表达量计算样本间的相关性，该分析可观察两组样本间的相关程度。数据来源于归一化后的数据，两组样本相关性矩阵为样本间的pearson相关系数矩阵，矩阵中的值为0-1的小数，表明两个对应样本的pearson相关系数。样本相关性图直观的反映2型糖尿病组和对照组样本间的相似性，左下方各单元格数值为所对应的两样本的相关系数，右上方圆形的颜色和面积表示所对应样本的相关程度，圆形面积越大，对应两样本的相关27 新疆医科大学博士学位论文性越高。右方的colorbar表示同数字和颜色的对照表。本研究中2型糖尿病组与对照组样本的同组内lncRNA和mRNA的表达量相关性较好，满足芯片分析的质控检测要求(图1-4)。图1-4LncRNAs和mRNAs全样本的相关性分析Fig.1-4CorrelationanalysisoffullsamplesofLncRNAsandmRNAs2.2.3箱线图通过对单荧光芯片的数据进行背景清除，同时根据样本归一化前后的信号值绘制箱线图，从而评价芯片数据的分布及分散程度，展示不同样本归一化前后总体基因表达情况。图中2型糖尿病组采用红色标记，对照组采用蓝色标记，结果显示2型糖尿病组与对照组的荧光信号强度一致，并且归一化后2型糖尿病组与对照组样本总体基因的表达水平趋于同一水平(图1-5)。图1-5全样本的箱线图分析Fig.1-5Boxplotanalysisoffullsamples28 新疆医科大学博士学位论文2.2.4主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)是反映样本相似程度的另一种统计方法。通过数据的降维，将样本的表达量展示在三维空间中。通过观察样本在图中的分布情况，可以判断样本间的相似程度。PCA3D用三维空间展示三个主成分，PC1为第一个主成分，PC2为第二个主成分，PC3为第三个主成分，坐标轴中的百分比是每个主成分的贡献率。本研究中2型糖尿病组样本用红色方形表示，对照组的样本用绿色圆形表示，在lncRNAs和mRNAs表达量的三维空间图中，2型糖尿病组样本和对照组样本的同组内lncRNA和mRNA的表达量相互汇聚，而组间样本lncRNA和mRNA的表达量相对发散，其中在lncRNAs表达量的三维空间图中，第一主成分PC1的贡献率为26.71%，第二主成分PC2的贡献率为16.93%，第三主成分PC3的贡献率为13.06%，总体贡献率为56.7%；在mRNAs表达量的三维空间图中，第一主成分PC1的贡献率为25.76%，第二主成分PC2的贡献率为17.67%，第三主成分PC3的贡献率为13.08%，总体贡献率为56.51%(图1-6)。图1-6LncRNAs和mRNAs全样本的主成分分析Fig.1-6PrincipalComponentAnalysisoffullsamplesofLncRNAsandmRNAs2.3T2DM组和对照组样本芯片实验的比较分析2型糖尿病组和对照组样本芯片实验的比较分析是根据给定的实验方案对两组样本进行差异表达分析，完成差异比较分析后，基于获得的差异结果，进行lncRNA-mRNA联合分析。2.3.1lncRNAs和mRNAs在T2DM组和对照组的表达量差异情况采用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4芯片，对2型糖尿病患者和29 新疆医科大学博士学位论文非2型糖尿病患者的外周血进行lncRNAs和mRNAs表达分析，芯片结果重复性好。为获得显著差异基因，对差异基因筛选标准设定为差异倍数FC(abs)在2.0倍以上，并且P≤0.05，FC(abs)值差异倍数越大，说明差异基因在两个样品之间的差异越大，P越小，说明差异基因的可靠性越高。在此筛选标准下，2型糖尿病患者外周血中有68条lncRNAs差异表达，上调的lncRNAs有44条，上调倍数最大的是ENST00000381108.3，上调倍数为3.85；下调的lncRNAs有24条，下调倍数最大的是RNA147244，下调倍数为3.45(表1-2)。其中lncRNAs中差异表达的Intergenic有37条，差异表达的Antisense有18条，差异表达的Sense有2条，差异表达的Intronic有1条(图1-7)。2型糖尿病患者外周血中有74条mRNAs差异表达，上调的mRNAs有56条，上调倍数最大的是Q59H50，上调倍数为3.25；下调的mRNAs有18条，下调倍数最大的是GSTM4，下调倍数为5.40(表1-3)。图1-7差异lncRNAs的种类分布Fig.1-7SpeciesdistributionofdifferentiallncRNAs表1-2T2DM组与对照组表达差异的lncRNAsTable1-2T2DMandcontrolgroupoflncRNAsdifferentiallyexpressedLncRNAsPFC(abs)RegulationENST00000381108.30.0356794813.854563658upRNA1472440.0221195933.448198716downENST00000515544.10.009863863.268844606upENST00000539543.10.0007521723.215636598upENST00000508174.10.0172372123.178989834upENST00000564527.10.0022483723.104636703up30 新疆医科大学博士学位论文LncRNAsPFC(abs)RegulationENST00000452399.10.0020536333.10362648upXR_254336.10.0011477383.089951678upTCONS_000175390.0317813932.95154151downTCONS_000099620.0387803592.91768357upuc003whs.10.0084154652.835755826upENST00000534918.10.0253731632.782102997upENST00000430001.10.0279263142.758966473upENST00000551881.20.000740542.629491971upENST00000430816.10.0346497692.617850541downENST00000533203.10.0051349122.577755544downENST00000577382.10.0450454932.533435959upENST00000416502.10.0125889182.498812658upENST00000609522.10.0074434352.497591345downENST00000587836.10.046672022.449057489downXR_108954.20.018920932.419526824upENST00000444038.20.0031433642.410060513upTCONS_000238800.0179941472.409259874upENST00000417079.10.0016457922.402100162downENST00000550029.10.0106035912.396846196upENST00000421640.10.0164607372.362767259upENST00000591223.10.0088053982.361797599downENST00000609369.10.0132811832.359129863downENST00000507558.10.0172989362.343377131upENST00000591102.10.0222175612.313019112downuc003zxn.10.0380944382.28352209upTCONS_000134730.0165596852.270739771upTCONS_000268480.0429135442.257175013upENST00000432668.10.0413112462.246466969downENST00000552663.10.0493614822.225893447upENST00000581067.10.0312400522.225760742upENST00000453636.10.0009765612.223426838upENST00000608088.10.0045352332.223134843up31 新疆医科大学博士学位论文LncRNAsPFC(abs)Regulationuc003apj.10.0029142022.222408974downNR_038285.10.0182522152.214754478upENST00000606328.10.0314535492.211122255upENST00000608389.10.0167528782.208533303upTCONS_000026610.0090721782.20628072downXR_427794.10.04033622.19438861upENST00000530600.10.0193057242.192539281upENST00000429328.20.0446372642.190569619upTCONS_000160200.0432951792.171175591downENST00000384147.10.0062866412.162772726downENST00000448412.10.0373262282.145735929downRNA336160.0072001452.138690114down注：选取前50个差异倍数FC(abs)>2且P<0.05差异表达的lncRNAs表1-3T2DM组与对照组表达差异的mRNAsTable1-3T2DMandcontrolgroupofmRNAsdifferentiallyexpressedmRNAsPFC(abs)RegulationGSTM40.0269125.396977downQ59H500.041993.253397upCYP27A10.0191572.994588upPODN0.0078482.963downDNASE1L30.0166142.855527upGRIP20.0118622.797213uplnc-TMEM18-120.0166582.630698upMROH80.0499852.602867upMGP0.0123752.587745uplnc-ZEB2-10.0401072.557452upTMEM63C0.0401672.551742upG0S20.0434642.521583upLHFP0.0086542.495357upGLYATL20.0405152.448706downZAK0.0070142.440536up32 新疆医科大学博士学位论文mRNAsPFC(abs)RegulationDNMT3B0.0343592.434458upBM6879230.0032612.405469upMFSD2A0.0164642.389625upCHML0.0447062.331657upGUCA1B0.0174122.330459upZNF7720.0170372.32426downRBP10.0001152.31116upCYP1B10.0153122.292827upMDM10.0156822.291786upBEX50.0236362.284667upCLTC0.0014922.267804downLOC1019272370.0049872.267423upCCL30.0298722.263211upBMPR1A0.0044722.259499upADNP20.0132762.254532downARHGEF40.009752.24515upSOX140.0310592.242699downPLXNA40.0047082.239824downZNF6150.0205452.236429downCHST50.0372942.22657downNSF0.0362362.225958downSMIM50.025942.222565upQPCT0.0121862.218304upBRI30.0334932.214694upIRGM0.028392.210294upTMEM1440.0455692.207058upATP6V0D10.0484972.180101downLOC1019276090.036342.176356upTTLL10.0007342.175592upSERBP10.0293162.173181upLOC1019275220.0332882.164194upSPTBN40.0101032.164026down33 新疆医科大学博士学位论文mRNAsPFC(abs)RegulationRAB33B0.0009242.162517upTHEM60.0310272.15916upUBTD10.0146012.155831up注：选取前50个差异倍数FC(abs)>2且P<0.05差异表达的mRNAs。2.3.2lncRNAs和mRNAs表达量的聚类图分析聚类图可以直观地反映2型糖尿病组与对照组差异表达的lncRNAs和mRNAs在不同样本之间的相似程度。图中：每一列代表一个样本，共有10列，代表有5例2型糖尿病患者和5例非2型糖尿病患者的外周血样本；每一行代表一个差异基因在5例2型糖尿病患者和5例非2型糖尿病患者的外周血样本中的表达程度，lncRNA的聚类图共有68行，即代表有68条lncRNAs差异表达，mRNAs聚类图共有74行，即代表有74条lncRNAs差异表达，红色表示为2型糖尿病组较对照组中相对高表达上调的lncRNAs和mRNAs基因，绿色表示为2型糖尿病组较对照组中相对低表达下调的lncRNAs和mRNAs基因；左上角的colorbar表示同数字和颜色的对照表；顶部样本树代表样本之间的相似度聚类关系；顶部颜色块代表聚类分析前人为设定的样本预期分组，其中红色代表非2型糖尿病组，绿色代表对照组，聚类分析结果提示差异谱结果可靠(图1-8)。图1-8LncRNAs和mRNAs表达量的聚类图分析Fig.1-8AnalysisoftheexpressionoflncRNAsandmRNAsbyclusterdiagram34 新疆医科大学博士学位论文2.3.3lncRNAs和mRNAs表达量的散点图分析散点图是经过log转换后的值表示，可以直观反映发生显著差异的lncRNAs和mRNAs基因的数量，以及与基因表达整体数量的大体占比，分析差异倍数FC(abs)>2以上，P<0.05，差异有统计学意义的lncRNAs和mRNAs，观察其分布及统计学的差异。横坐标表示对照组组样本的平均表达值，纵坐标表示2型糖尿病组样本的平均表达值，左上角和右下角分别给出上调的lncRNAs和mRNAs基因和下调的lncRNAs和mRNAs基因的数目。标注为红色的是2型糖尿病组样本较对照组样本表达上调的lncRNAs和mRNAs基因，标注为绿色的是2型糖尿病组样本较对照组样本表达下调的lncRNAs和mRNAs基因，标注为黑色的是两组样本间无显著差异表达的lncRNAs和mRNAs基因。红色直线X2为上调基因的阈值边界线，绿色直线X(-2)为下调基因的阈值边界线，中间灰色的线为总体表达量的拟合线，图中方程为该拟合线的方程，R表示两组样本的相关系数。本研究的芯片数据散点图显示大部分lncRNAs和mRNAs基因表达分布在45℃对角线附近，提示大部分lncRNAs和mRNAs基因的表达差异倍数FC(abs)小于2倍，且P>0.05，说明这些lncRNAs和mRNAs基因表达在2型糖尿病组样本与对照组样本间差异无统计学意义。然而，部分lncRNAs和mRNAs基因表达分布在45℃对角线范围以外甚至远离对角线，提示差异表达lncRNAs和mRNAs基因的差异倍数FC(abs)>2以上，且P<0.05，说明这些表达上调或下调的lncRNAs和mRNAs基因在2型糖尿病组样本与对照组样本间差异有统计学意义(图1-9)。图1-9LncRNAs和mRNAs表达量的散点图分析Fig.1-9ScatterplotanalysisoftheexpressionoflncRNAsandmRNAs2.3.4lncRNAs和mRNAs表达量的火山图分析通过差异分析得到的P值与差异倍数FC(abs)值两个因素共同绘制火山图，用于35 新疆医科大学博士学位论文显示两组样品的显著性差异，可以观察到2型糖尿病组与对照组之间芯片表达差异的lncRNAs基因数据分布变化。横坐标为-log10(p-values)，纵坐标为log2(foldchange)。其中标注为红色的是2型糖尿病组样本较对照组样本表达上调的lncRNAs和mRNAs基因，标注为绿色的是2型糖尿病组样本较对照组样本表达下调的lncRNAs和mRNAs基因，标注为黑色的是两组样本间无显著差异表达的lncRNAs和mRNAs基因(图1-10)。图1-10LncRNAs和mRNAs表达量的火山图分析Fig.1-10VolcanoplotanalysisoftheexpressionoflncRNAsandmRNAs2.4T2DM组和对照组样本芯片实验的基因注释富集分析运用KOBAS(KEGGOrthologyBasedAnnotationSystem)软件对2型糖尿病组和对照组差异表达的mRNA进行信号通路Pathway、人类疾病Disease和GeneOntology功能注释富集分析，其中包括4个信号通路数据库(KEGG、BioCyc、PANTHER和Reactome)，4个人类疾病数据库(KEGG、FunDO、NHGRI和OMIM)和1个功能数据库。2.4.1信号通路的注释富集分析利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、BioCyc、PANTHER和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。在KEGG信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括突触小泡周期通路、卵巢类固醇生成通路、癌症的microRNA通路、细胞色素P450介导的异生素代谢通路、化学致癌作用通路、类风湿关节炎通路、原代胆汁酸生物合成通路、溶酶体通路、α-亚麻酸代谢通路、收集胆酸分泌通路、亚油酸代谢通路、光转换通路、吞噬通路、36 新疆医科大学博士学位论文调节自噬通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路、膀胱癌通路、结核通路、色氨酸代谢通路、醚脂质代谢和加压素调控的水重吸收通路(图1-11)。图1-11在KEGG信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-11SignificantenrichedsignalingpathwaysintheKEEGsignalingpathwaysdatabase在BioCyc信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括视黄酸生物合成Ⅱ通路、视黄酸生物合成Ⅰ通路、褪黑激素降解Ⅰ通路、褪黑素降解的超级途径通路、胆汁酸生物合成的神经途径通路、视觉周期I(脊椎动物)通路、视黄醇生物合成通路、谷胱甘肽介导的解毒通路、色氨酸利用的超路径通路、磷脂通路、嘌呤核苷酸生物合成通路、嘌呤核苷酸利用的超路径通路(图1-12)。图1-12在BioCyc信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-12SignificantenrichedsignalingpathwaysintheBioCycsignalingpathwaysdatabase37 新疆医科大学博士学位论文在PANTHER信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括维生素D的代谢和通路、异三聚体G蛋白信号通路Gqα和Goα介导途径的通路、异三聚体G蛋白信号通路Giα和Gsα介导途径通路、突触小泡运输通路、离子型谷氨酸受体通路、TGF-β信号通路、阿尔茨海默病衰老通路、血管生成通路、趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症通路(图1-13)。图1-13在PANTHER信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-13SignificantenrichedsignalingpathwaysinthePANTHERsignalingpathwaysdatabase在Reactome信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括运输含有GluR2的AMPA受体通路、内源性甾醇通路、生物氧化通路、运输AMPA受体通路、谷氨酸结合通路、AMPA受体激活和突触可塑性通路、视觉光转导通路、视觉转导相关疾病通路、LPE的水解通路、维甲酸的新陈代谢和运输通路、PKB的激活通路、苯甲酸酯与甘氨酸的偶联通路、由底物类型决定排列的细胞色素P450通路、水杨酸与甘氨酸的偶联通路、氨基酸偶联通路、环氧(EET)和二羟基二十碳三烯酸(DHET)的合成通路、负性调节PI3K/AKT网络通路、LPC的水解通路、羧酸的偶联通路、羟基二十碳四烯酸(HETE)的合成通路、CYP27A1的缺陷导致脑脓肿黄瘤病(CTX)通路(图1-14)。图1-14在Reactome信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-14SignificantenrichedsignalingpathwaysintheReactomesignalingpathwaysdatabase38 新疆医科大学博士学位论文2.4.2疾病的注释富集分析利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、FunDO、NHGRI和OMIM人类疾病数据库中进行疾病注释富集分析。在KEGG人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括Keutel综合征、遗传性混合性息肉病综合征、其他体液免疫缺陷疾病、脑脓肿黄瘤症、色素性视网膜炎(RP)、原发性先天性青光眼(PCG)、青少年息肉综合征、原发性开角型青光眼、慢性粘膜念珠菌病(CMC)、彼得斯异常、前段发育不全(ASD)、胃肠疾病、其他免疫系统疾病、其他紧张和感觉系统疾病、免疫系统疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、先天性脂质/糖脂代谢紊乱、原发性免疫缺陷、骨骼疾病(图1-15)。图1-15在KEGG人类疾病数据库中显著富集的疾病Fig.1-15SignificantenricheddiseasesintheKEGGhumandiseasesdatabase在FunDO人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括癌症、曼氏血吸虫感染、肿瘤转移、牙槽骨损失、静脉曲张、毛细支气管炎、动脉粥样硬化、脑炎、家族性地中海热、HIV感染、牙周疾病、慢性单纯性青光眼、流感、结节病、哮喘、皮肤病、青光眼、硬化、先天性异常和心血管疾病(图1-16)。39 新疆医科大学博士学位论文图1-16在FunDO人类疾病数据库中显著富集的疾病Fig.1-16SignificantenricheddiseasesintheFunDOhumandiseasesdatabase在NHGRI人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括海马萎缩、戒烟、自雇、腹主动脉瘤、经济和政治偏好(环保主义)、对类风湿性关节炎中TNF-α抑制剂的反应、无先兆的偏头痛、临床偏头痛、经济和政治偏好、气质(双相性精神障碍)、β细胞功能的稳态模型评估(相互作用)、信息处理速度、血液微量元素(铜含量)、与年龄有关的听力障碍、肺功能下降、肥胖(极端)、饮食失调(通过物质清除)、先兆子痫、油酸血浆水平、偏头痛(图1-17)。图1-17在NHGRI人类疾病数据库中显著富集的疾病Fig.1-17SignificantenricheddiseasesintheNHGRIhumandiseasesdatabase40 新疆医科大学博士学位论文在OMIM人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括先天性，青少年或成人发病的青光眼和原发性开角、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、遗传性混合型的息肉病综合征、色素性视网膜炎、Smith-McCort发育异常、常染色体4隐性家族性念珠菌病、易感性曲霉病、免疫缺陷-着丝粒不稳定-面部异常综合征、色素性视网膜炎、Keutel综合征、脑脓肿黄瘤病、青少年肠息肉、彼得斯异常、结核病易感性和艾滋病抵抗力(图1-18)。图1-18在OMIM人类疾病数据库中显著富集的疾病Fig.1-18SignificantenricheddiseasesintheOMIMhumandiseasesdatabase2.4.3GeneOntology功能注释富集分析利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在生物过程biologicalprocess、细胞组件cellularcomponent和分子功能molecularfunction三个本体论中进行GeneOntology功能注释富集分析(图1-19)。在生物过程中，显著富集的GeneOntology功能包括可见光的检测、检测光的刺激、骨矿化的调节、生物矿物组织发育的调节、解剖结构排列、维甲酸代谢过程、蛋白质定位到质膜、二萜代谢过程、外部刺激的检测、中枢神经系统投射神经元轴突发生、非生物刺激的检测、对辐射的反应、萜类代谢过程、轴突的化疗药物反应、神经板内侧区域化、化脓性轴突的化学驱赶、组成性分泌途径的负调控、旁轴中胚层结构组织、中胚层结构组织、可见光转导。在细胞组件中，显著富集的GeneOntology功能包括内吞囊泡膜、细胞质小泡膜、41 新疆医科大学博士学位论文囊泡膜、神经元投影、神经元的一部分、内吞小泡、细胞质囊泡部分、树突、体树突隔室、细胞投影、吞噬囊泡膜、液泡膜、网格蛋白复合物、Rab蛋白香叶基香叶基转移酶复合物、MPP7-DLG1-LIN7复合物、整膜、膜区域、细胞器的膜、ATG1/UKL1信号复合体、质膜区域。在分子功能中，显著富集的GeneOntology功能包括脂蛋白转运蛋白活性、胆固醇羟化酶活性、胆甾烷三醇单加氧酶活性、微管蛋白-谷氨酸连接酶活性、骨的结构成分、谷氨酰胺酰-肽环转移酶活性、作用于CpG底物的DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶活性、钙依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、钙依赖性蛋白激酶C活性、蛋白质-谷氨酸连接酶活性、维生素D25-羟化酶活性、维生素D325-羟化酶活性、L27域的绑定、转移酶活性和转移烷基或芳基(除甲基以外)、网格蛋白轻链结合、钙依赖性蛋白激酶活性、亩型阿片受体结合、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶活性、甘氨酸N-酰基转移酶活性、酶激活剂活性。图1-19GeneOntology功能注释富集分析Fig.1-19FunctionalannotationenrichmentanalysisofGeneOntology2.4.4GeneOntology二级条目频率图此图展示的是在差异基因背景和全部基因背景下GeneOntology数据库中细胞42 新疆医科大学博士学位论文组件、分子功能和生物过程三个本体论功能的基因富集的情况，体现差异基因背景和全部基因背景下各本体论功能的重要性，具有明显比例差异的本体论功能说明差异基因富集与全部基因富集的不同趋势，可以重点分析此功能是否与差异相关。在图中横坐标代表GeneOntology的项目，纵坐标包含三部分：左侧的纵坐标代表基因所占百分比，右侧的纵坐标黑色数字代表本次芯片实验检测到的差异基因数目，灰色数据代表背景基因（数据库里芯片上的全部基因）的数目。实心柱子是芯片实验检测到的差异基因做的百分比图(富集到项目的基因/筛选到的总差异基因)，虚线柱子是根据数据库里数据做的百分比图(项目基因/数据库总基因)(图1-20)。在生物过程的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞成分组织或生物发生、代谢过程、多生物过程、生殖、生长、发展过程、对刺激的反应、细胞过程、生殖过程、细胞聚集、定位、生物过程的负调控、多细胞生物过程、免疫系统的过程、行为、单一生物过程、节奏的过程、生物性粘附、运动、生物过程的正调控、生物调控、信号、生物过程的调控。在细胞组件的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞器、大分子复合物、细胞、细胞外区域部分、膜封闭的管腔、细胞组分、细胞连接点、膜组分、细胞外区域、突触、膜、突触组分、细胞外基质、细胞器组分。在分子功能的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括分子转导活性、催化活性、酶调节剂活性、蛋白质结合转录因子活性、分子功能调节剂、结构分子活性、趋化活性、鸟苷酸-核苷酸交换因子活性、核酸结合转录因子活性、粘合物、转运蛋白活性。图1-20GeneOntology二级条目频率图Fig.1-20TwolevelitemfrequencydiagramofGeneOntology43 新疆医科大学博士学位论文2.4.5GeneOntology功能层次网络图分析分别选取GeneOntology三个本体论中前20个显著富集点的GO节点以及这些节点的所有父节点绘制而成的GO功能层次网络图。图中点代表GO节点，边代表节点间的关系。每个节点中第一行描述了GO节点名称，第二行描述的是GO中的节点编号，第三行描述的是矫正后的P值。节点颜色表示矫正P值的显著性程度，颜色越深表示矫正P值越显著。在生物过程的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括生长发育过程、多细胞生物过程、代谢过程、单一生物过程、细胞成分组织或生物发生、细胞过程、生物调节、定位、对刺激的反应、单一生物体发育过程、单一多细胞生物过程、有机物质代谢过程、初级代谢过程、单一生物体代谢过程、细胞代谢过程、细胞成分组织、单一有机体定位、大分子定位、生物过程的调节、细胞定位、定位的建立、刺激的检测、对非生物刺激的反应、对外部刺激的反应、解剖结构的发展、多细胞生物发育、骨化、发展过程的调节、多细胞生物过程的调节、脂质代谢过程、单生物细胞过程、膜组织、单生物细胞定位、蛋白质定位、细胞大分子定位、生物过程的负调控、输送、定位的调控、细胞中定位模式的建立、细胞过程的调节、非生物刺激的检测、外部刺激的检测、对辐射的反应等功能(图1-21)。图1-21生物过程的层次网络图Fig.1-21Hierarchicalnetworkdiagramofbiologicalprocesses44 新疆医科大学博士学位论文在细胞组件的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括细胞质、细胞器、细胞质组分、细胞内的细胞器、囊、膜界限的细胞器、细胞器组分、细胞膜、细胞质囊泡、细胞内膜结合的细胞器、膜囊泡、细胞内的细胞器组分、细胞器膜、整膜、细胞质膜结合囊泡、细胞质囊泡组分、囊泡膜、细胞器的膜、内吞小泡、细胞质小泡膜、内吞囊泡膜等功能(图1-22)。图1-22细胞组件的层次网络图Fig.1-22Hierarchicalnetworkdiagramofcellcomponents在分子功能的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括催化活性、氧化还原酶活性、单加氧酶活性、合并或减少分子氧、合并氧原子、胆甾烷三醇-单加氧酶活性等功能(图1-23)。45 新疆医科大学博士学位论文图1-23分子功能的层次网络图Fig.1-23Hierarchicalnetworkdiagramofmolecularfunction2.5lncRNA-mRNA的联合分析2.5.1共表达分析共表达分析是以数学中相关性为基础，从基因表达层面寻找表达谱相似的lncRNA-mRNA关系对。共表达(correlation)分析的基本方法是将各个探针在各个样品中的标准化后信号值作为数据源进行两两相关性计算和假设验证，得到相关系数和P值，相关性算法采用pearson。挑选2型糖尿病组和对照组样本共表达结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。黄色的圆代表lncRNA，绿色的圆代表mRNA，圆的大小代表该基因在网络中的度(邻居个数)，红线表示正相关关系，蓝线表示负相关关系，具体结果见表1-4和图1-24。46 新疆医科大学博士学位论文图1-24lncRNA-mRNA的共表达分析Fig.1-24Co-expressionanalysisoflncRNA-mRNA表1-4T2DM组与对照组表达差异的lncRNA-mRNA的共表达分析Table1-4T2DMandcontrolgroupoflncRNA-mRNAco-expressionanalysislncRNAmRNACorrelationPTCONS_00023880TTLL10.8701973260.001058789ENST00000452122.1TTLL10.8109304790.004419469XR_254336.1TTLL10.8042160380.005037675ENST00000610158.1TTLL10.9005222830.000379378ENST00000558511.1TTLL1-0.8603290260.001401817ENST00000416502.1TTLL10.8149359220.004077672uc003qqc.1TTLL10.8802247370.000777353ENST00000582858.1TTLL10.8240679330.003369746ENST00000453636.1TTLL10.887143460.000618048ENST00000552663.1TTLL10.8094296160.004552663NR_038285.1TTLL10.8537548270.001671007XR_241426.2TTLL1-0.8673564640.00115044147 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPRNA147244|p0348_imsncRNA766TTLL1-0.8691916480.001090603ENST00000608389.1TTLL10.8342815280.002687672ENST00000581067.1TTLL10.8060145580.004866391ENST00000534918.1TTLL10.8614324620.001359935ENST00000608088.1TTLL10.8560003660.001575191ENST00000564527.1TTLL10.8338872430.002711976ENST00000533203.1TTLL1-0.8190668550.003745437ENST00000417079.1TTLL1-0.8801443510.000779364ENST00000441245.1TTLL1-0.8339413760.00270863ENST00000452399.1TTLL10.8036299270.005094412ENST00000606328.1TTLL10.8840087550.000686928RNA33616|snoRNA_scaRNA_212_83TTLL1-0.8848809060.000667228ENST00000591102.1TTLL1-0.818086390.003822467ENST00000507558.1TTLL10.8125415810.004279619ENST00000551881.2TTLL10.8018990260.005264627uc003apj.1TTLL1-0.8745171130.000929767ENST00000384147.1TTLL1-0.8200332280.00367061ENST00000452122.1ADNP2-0.951179292.34E-05XR_254336.1ADNP2-0.8744554910.000931522uc003whs.1ADNP2-0.8633447120.001289517XR_108954.2ADNP2-0.8740592180.000942869ENST00000416502.1ADNP2-0.8259722040.003234085ENST00000585190.1ADNP2-0.862570380.001317705ENST00000582858.1ADNP2-0.8673263980.001151441ENST00000453636.1ADNP2-0.9050347990.000316858ENST00000552663.1ADNP2-0.8194863210.003712825XR_241426.2ADNP20.8800347460.000782111ENST00000430816.1ADNP20.8008518940.005369548RNA147244|p0348_imsncRNA766ADNP20.8626944660.001313158ENST00000608389.1ADNP2-0.8648027010.001237636ENST00000608088.1ADNP2-0.9113730730.000242263ENST00000539543.1ADNP2-0.8257981770.00324631748 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPENST00000533203.1ADNP20.8192498490.003731185ENST00000417079.1ADNP20.8444077680.002115677ENST00000441245.1ADNP20.8185751240.003783929ENST00000452399.1ADNP2-0.8611159930.001371853ENST00000606328.1ADNP2-0.8217358660.003541392XR_428603.1ADNP2-0.8632063980.00129452ENST00000591102.1ADNP20.8938566390.000487675ENST00000507558.1ADNP2-0.8078949170.004691803uc003apj.1ADNP20.8949739420.000468116ENST00000384147.1ADNP20.896987560.000434325ENST00000452122.1ZAK0.8518168380.001757035XR_254336.1ZAK0.8204425470.003639242ENST00000610158.1ZAK0.8091403850.004578657ENST00000558511.1ZAK-0.8465832460.00200535XR_108954.2ZAK0.9080919440.000279043ENST00000416502.1ZAK0.9295754059.88E-05ENST00000552663.1ZAK0.9460131543.48E-05NR_038285.1ZAK0.9132549290.000222852XR_241426.2ZAK-0.8669029490.001165589TCONS_00016020ZAK-0.827408720.003134378ENST00000608389.1ZAK0.9268494520.000114606ENST00000608088.1ZAK0.8753086710.00090743ENST00000444038.2ZAK0.812389260.004292704ENST00000533203.1ZAK-0.8667094050.001172097ENST00000417079.1ZAK-0.8198097350.003687819ENST00000441245.1ZAK-0.8584097930.00147688ENST00000606328.1ZAK0.8346343980.002666055NR_038080.1ZAK0.8568669150.001539304XR_428603.1ZAK0.8861131040.000640104ENST00000591102.1ZAK-0.8325366120.002796431ENST00000384147.1ZAK-0.8238513290.003385431ENST00000452122.1TRIB30.858309830.00148086849 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPXR_254336.1TRIB30.8488562790.001894583ENST00000610158.1TRIB30.8235913580.003404327uc003whs.1TRIB30.8329606230.002769717XR_108954.2TRIB30.8077111920.004708661ENST00000416502.1TRIB30.9182143340.000177179ENST00000585190.1TRIB30.8541716180.001652912ENST00000552663.1TRIB30.8155971910.004023123XR_427794.1TRIB30.8081865140.004665135XR_241426.2TRIB3-0.8837719660.000692349TCONS_00016020TRIB3-0.8480838430.001931714ENST00000430816.1TRIB3-0.8383068380.002448443RNA147244|p0348_imsncRNA766TRIB3-0.807916180.004689855ENST00000608389.1TRIB30.8922133920.000517521ENST00000539543.1TRIB30.8504740230.001818493ENST00000533203.1TRIB3-0.8139996780.004155806ENST00000417079.1TRIB3-0.898204240.000414795ENST00000452399.1TRIB30.9008457490.000374618ENST00000591102.1TRIB3-0.9008750650.000374189ENST00000452122.1UBTD10.9215319970.00015075XR_254336.1UBTD10.8453695520.002066374XR_108954.2UBTD10.9230157350.000139923ENST00000416502.1UBTD10.884482260.000676181ENST00000552663.1UBTD10.8570859610.001530327XR_241426.2UBTD1-0.8315978390.002856236ENST00000430816.1UBTD1-0.8241726520.003362181ENST00000448412.1UBTD1-0.8419805590.002243873ENST00000608389.1UBTD10.9305814539.34E-05ENST00000608088.1UBTD10.8533736460.001687681ENST00000533203.1UBTD1-0.8639468860.001267902ENST00000441245.1UBTD1-0.8526149850.001721226ENST00000606328.1UBTD10.8039467930.005063683NR_038080.1UBTD10.8599423590.00141671250 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPXR_428603.1UBTD10.9037441090.000333902ENST00000591102.1UBTD1-0.8771823030.00085612ENST00000384147.1UBTD1-0.8337077570.002723092XR_254336.1CLEC7A0.8925178470.000511893uc003whs.1CLEC7A0.8481455030.001928731XR_108954.2CLEC7A0.834576510.002669592ENST00000585190.1CLEC7A0.8746759620.000925253ENST00000582858.1CLEC7A0.881198960.000753289ENST00000453636.1CLEC7A0.8396137690.002374188TCONS_00016020CLEC7A-0.8050330010.004959347ENST00000608389.1CLEC7A0.8629499960.001303831ENST00000608088.1CLEC7A0.8899608060.000560577ENST00000539543.1CLEC7A0.874891070.000919165ENST00000533203.1CLEC7A-0.8069969550.004774609ENST00000452399.1CLEC7A0.86475370.001239355XR_428603.1CLEC7A0.8642080480.00125861ENST00000591102.1CLEC7A-0.8545852710.001635094ENST00000507558.1CLEC7A0.8380771220.002461665uc003apj.1CLEC7A-0.8407182090.002312717TCONS_00023880PACRGL0.9060538930.000303859ENST00000558511.1PACRGL-0.8200095660.00367243ENST00000585190.1PACRGL0.8157689310.004009042ENST00000582858.1PACRGL0.8611088870.001372121ENST00000453636.1PACRGL0.8770669330.000859217XR_241426.2PACRGL-0.8167432160.003929827RNA147244|p0348_imsncRNA766PACRGL-0.8706681490.00104413ENST00000581067.1PACRGL0.8931902450.000499622ENST00000534918.1PACRGL0.8465638230.002006316ENST00000608088.1PACRGL0.8531845360.001695998TCONS_00002661PACRGL-0.816919920.003915581ENST00000606328.1PACRGL0.8616769090.001350782RNA33616|snoRNA_scaRNA_212_83PACRGL-0.8200764040.00366729351 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPuc003zxn.1PACRGL0.8177422410.003849772ENST00000507558.1PACRGL0.8336986110.00272366uc003apj.1PACRGL-0.8711866340.001028158ENST00000452122.1CYP27A10.8174131620.003876012XR_254336.1CYP27A10.8495821050.001860165uc003whs.1CYP27A10.8179667670.003831942XR_108954.2CYP27A10.9046090.000322409ENST00000416502.1CYP27A10.8305666480.002922985ENST00000582858.1CYP27A10.803086030.005147469ENST00000552663.1CYP27A10.8942006810.00048159ENST00000608389.1CYP27A10.871577630.001016231ENST00000608088.1CYP27A10.9451571993.70E-05ENST00000539543.1CYP27A10.8038511510.005072944ENST00000533203.1CYP27A1-0.8354887210.002614235XR_428603.1CYP27A10.9306579029.30E-05uc003apj.1CYP27A1-0.8270494790.003159103ENST00000384147.1CYP27A1-0.8562960920.001562877ENST00000452122.1ULK20.8509286190.001797516XR_254336.1ULK20.8312489280.002878697ENST00000558511.1ULK2-0.8131989460.004223478XR_108954.2ULK20.9857044271.80E-07ENST00000416502.1ULK20.8367891050.002536759ENST00000582858.1ULK20.8525760940.001722958ENST00000552663.1ULK20.8841416760.000683899ENST00000608389.1ULK20.8911014880.000538459ENST00000608088.1ULK20.8691428250.001092165ENST00000441245.1ULK2-0.8453074490.002069532ENST00000606328.1ULK20.8428457260.002197552XR_428603.1ULK20.9712842122.87E-06ENST00000591102.1ULK2-0.8402938870.002336196ENST00000384147.1ULK2-0.8126593990.004269518ENST00000610158.1GUCA1B0.8169785710.00391086152 新疆医科大学博士学位论文lncRNAmRNACorrelationPENST00000558511.1GUCA1B-0.8302720990.002942255ENST00000416502.1GUCA1B0.8726871510.000982936ENST00000552663.1GUCA1B0.8845538360.000674567NR_038285.1GUCA1B0.9568894571.43E-05XR_241426.2GUCA1B-0.877885640.000837417TCONS_00016020GUCA1B-0.8226351340.003474478ENST00000608389.1GUCA1B0.920743240.00015675ENST00000533203.1GUCA1B-0.875757830.000894931ENST00000606328.1GUCA1B0.8299583810.00296288NR_038080.1GUCA1B0.8204035340.003642224ENST00000591102.1GUCA1B-0.832348810.002808322注：选取在网路图中前10个度最多且P<0.05的mRNA。2.5.2靶基因预测在lncRNA与mRNA共表达筛选结果的基础上，顺式预测寻找基因组位置在10kb之内的lncRNA-mRNA对，顺式调控的预测结果类型可分为：Sense、Antisense、Intronic、Bidirectional、Intergenic(10k)；反式预测利用blat工具对lncRNA和mRNA(3UTR)序列进行比对，筛选序列相似的lncRNA-mRNA对，反式调控的预测结果类型，目前暂时有miRNAsequestration。lncRNAXR_108954.2的mRNA靶基因为E2F2，lncRNAENST00000453636.1的mRNA靶基因为A_19_P00316911，lncRNATCONS_00026848的mRNA靶基因为A_21_P0009673，图中黄色的圆代表lncRNA，绿色的圆代表靶基因，具体结果见表1-5和图1-25。图1-25LncRNAs的靶基因预测Fig.1-25TargetgenepredictionoflncRNAs53 新疆医科大学博士学位论文表1-5T2DM与对照组表达差异的lncRNA-mRNA的靶基因预测分析Table1-5T2DMandcontrolgroupoflncRNA-mRNAtargetgenepredictionanalysislncRNAmRNACorrelationP顺/反式调控的预测结果类型XR_108954.2E2F20.8372379550.002510405miRNAsequestrationENST00000453636.1A_19_P003169110.9556711531.60115E-05SenseTCONS_00026848A_21_P00096730.9899180654.4657E-08Sense2.5.3靶基因信号通路的注释富集分析利用KOBAS对靶基因mRNAs分别在KEGG和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。在KEGG信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括膀胱癌通路、非小细胞肺癌通路、胶质瘤通路、胰腺癌通路、黑色素瘤通路、慢性粒细胞白血病通路、小细胞肺癌通路、前列腺癌通路、细胞周期通路、乙型肝炎通路、癌症中的microRNA通路、HTLV−I感染通路、癌症通路(图1-26)。图1-26靶基因mRNAs在KEGG信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-26SignificantenrichedsignalingpathwaysofthetargetgenemRNAsintheKEGGsignalingpathwaysdatabase54 新疆医科大学博士学位论文在Reactome信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括CDC6与ORC的关联通路、许可因素与预复制复合体的关联通路、癌基因诱导的衰老通路、G1阶段通路、与G1期相关的CyclinD通路、预复制复合体的组装通路、调节DNA复制通路、DNA复制预先启动通路、M/G1转换通路、DNA复制通路、氧化应激诱导衰老通路、有丝分裂G1-G1/S期通路、细胞衰老通路、细胞对压力的应激通路、有丝分裂的细胞周期通路、细胞周期通路(图1-27)。图1-27靶基因mRNAs在Reactome信号通路数据库中显著富集的信号通路Fig.1-27SignificantenrichedsignalingpathwaysofthetargetgenemRNAsintheReactomesignalingpathwaysdatabase2.5.4转录因子预测转录因子预测(TFs_predict)利用Match-1.0Public转录因子预测工具进行预测，在共表达结果的基础上对每一个lncRNA的起始位点上游2000bp、下游500bp区域与转录因子的结合情况进行预测。挑选上述转录因子预测结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。黄色的圆代表lncRNA，紫色的圆代表转录因子，圆的大小代表该基因在网络中的度(邻居个数)具体结果见图1-28和表1-6。55 新疆医科大学博士学位论文图1-28LncRNAs的转录因子预测Fig.1-28PredictionofthetranscriptionfactorofLncRNAs表1-6T2DM组与对照组表达差异的lncRNAs的转录因子预测分析Table1-6T2DMandcontrolgroupoftranscriptsfactoroflncRNAspredictedanalysislncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p13846Pax-40.9790.861ttttttccactCCTGAattcap20627Pax-40.9790.872gatctcaaactCCTGAcctcap20627Pax-410.863tgggggccaggCATGAtggccp20627Pax-40.9790.84tgagcTCAGGagtttgagaccp20627Pax-40.9860.837caggagaatcgCTTGAacccgp23792Pax-40.9020.836ggaagTGATGtgtgcataaaap26181Pax-40.9790.877tgaggTCAGGagtttgagaccp26181Pax-410.831ctgggTCATGtgtcacccgtgp2727Pax-40.9790.881aggggTCAGGagttcaggctcp3849Pax-410.847ccagctctgccCATGAcccctp3985Pax-40.9790.875ggtttcaaactCCTGAcctcap3985Pax-40.9790.834tgaccTCAGGcgatccgccctp3985Pax-40.9790.877tgaggTCAGGagtttgagacc56 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p6754Pax-40.9860.842tgggagaatcgCTTGAacacgp6754Pax-40.9790.915agaggTCAGGtgtggtggcccp6754Pax-40.9790.872tgaggTCAGGagtttgagatcp10034Pax-40.9860.83cgagaTCAAGagttagaaaagp10715Pax-40.9790.876tgaggTCAGGagttcaagaccp10715Pax-410.835tctgtaccaagCATGAaaccap13558Pax-40.8810.889ccgggttcacgCCTCAcagctp13558Pax-410.897agaggTCATGcttgtgggaggp13558Pax-40.9790.888gaccccacccgCCTGAtggcap13558Pax-40.9790.866cggggTCAGGtgggtgccgctp14361Pax-410.843gggcttgtgcaCATGAcctctp19713Pax-40.9020.863gcacgatctcgCATCAccacap19713Pax-40.9790.876agtctcaaactCCTGAcctcap19713Pax-40.9790.876ggtcttgaactCCTGAcctcap19713Pax-410.852tgcatTCATGggggcagattgp25591Pax-40.9790.878cgaggTCAGGagttcgagaccp25591Pax-40.9860.837caggagaatcgCTTGAacccap26411Pax-40.9790.872gatctcaaactCCTGAcctcap29002Pax-40.9770.861cggggctgaggCGTGAcgtcap29002Pax-40.8810.866ggggcTGAGGcgtgacgtcagp29203Pax-40.9860.889gggacTCAAGcgtagttcatap29203Pax-40.8880.834aggagTGAAGcggctcgcgcgp37433_v4Pax-40.9770.832gagtgacagctCGTGAcggccp37994_v4Pax-40.9790.837tctgctgcaggCCTGAgctctp38411_v4Pax-40.9790.876cgaggTCAGGagttcaagaccp10929Pax-40.9790.856cgccgcagacaCCTGAggaccp10929Pax-40.9770.839agcgccgcgagCGTGAccccgp14344Pax-40.9790.851tctccagccctCCTGActgctp16961Pax-40.9790.84gggggTCAGGgggcctggggap26379Pax-40.9790.878tgaggTCAGGagttcgagaccp26379Pax-410.85ttgcatacatgCATGAatgcgp37128_v4Pax-410.836cgattTCATGtgttttagctg57 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p39189_v4Pax-40.9020.836ggcccTGATGcgcgccagccap40006_v4Pax-40.9790.877tgaggTCAGGagttggagaccp40006_v4Pax-40.9860.855caggggaatcgCTTGAacccgp5763Pax-40.9790.843ccaagTCAGGtgtgtcggcctp13Pax-40.9860.837tgggtTCAAGcgattctcctgp13Pax-40.9790.875ggtcttgaactCCTGAcctctp13Pax-40.9790.84tgagcTCAGGagtttgagaccp13Pax-40.9790.878tgaggTCAGGagttcgagaccp15267Pax-40.9770.831cggccgcggcgCGTGActgggp26518Pax-40.9790.875tgaggTCAGGagttcaagacap29532Pax-40.9860.88ggtcttgaactCTTGAcctcap29532Pax-40.9790.878ggtctcgaactCCTGAcctcap29532Pax-40.7640.841atctgcacacgTCTGActcccp29532Pax-40.9790.885tgaggTCAGGggttcaagaccp3356Pax-40.9790.878agggcTCAGGagtggggaaccp37605_v4Pax-40.9790.837gagccattgcgCCTGAcctgap17538Pax-40.9770.858tggatTCACGggttatcatggp25063Pax-410.844tgtttcaccctCATGAcaccap25063Pax-40.9020.872ctgccaccccgCATCAcgaccp25063Pax-40.9790.877tgaggTCAGGagttggagaccp29102Pax-40.9790.844cctggggcaccCCTGAccctcp29779Pax-40.7890.84tgcggTCAGCcgtcagccgtgp29779Pax-40.7890.867agccgTCAGCcgtggcccgcap40303_v4Pax-40.9790.832tccctTCAGGcggggggcggcp15411Oct-110.921aaaaatGCAAAagaap15411Oct-110.941aacaatGCAAAtatap22977Oct-110.991aaggatGCAAAtaagp23792Oct-10.8830.913agccatGCCAAtgatp23792Oct-110.946cttcTTTGCatctttp2727Oct-110.945atagatGCAAAtggap36679_v4Oct-10.8380.89ttgaTTTGTatttccp36758_v4Oct-110.94tcagatGCAAAtttc58 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p36758_v4Oct-110.999tttttGCATAttcttp3849Oct-10.9460.971agcaTGGCAttttgp10034Oct-110.985gcatatGCAAAtgaap10034Oct-10.8830.912gtaaTTAGCataatap1022Oct-10.8930.909ttcaTTTTCattgaap1022Oct-110.904aattttGCAAAttacp1022Oct-110.913aggcTTTGCataactp1022Oct-110.907ggagatGCAAAgaggp1022Oct-10.9090.926tttcatGTAAAttacp10715Oct-10.9090.896agaaTTTACatctaap10715Oct-10.9820.979cttaaTTTCAtgtgp14361Oct-10.8880.91taaaatGCGAAtgaap19713Oct-10.8930.921tttaTTTTCatgtttp25591Oct-110.926atggTTTGCatgtctp25591Oct-110.965atgtatGCAAAtgccp38411_v4Oct-110.906ctttatGCAAAgccap10929Oct-10.9090.938gtgaatGTAAAttacp14344Oct-10.8930.912attaTTTTCatccaap14344Oct-10.8930.913cctaatGAAAAttatp14344Oct-10.8930.921tgaaatGAAAAtaagp40006_v4Oct-10.9090.918tttaTTTACatcccap41884_v4Oct-110.909ctcaTTTGCacagttp5763Oct-10.8830.892ggaaTTAGCatgctcp5763Oct-110.919ctgtatGCAAAaaatp6957Oct-10.8930.921gtcaTTTTCatgtggp6957Oct-10.8930.911ttgaTTTTCatggcap6957Oct-110.988ataaatGCAAAtaaap6957Oct-110.994ctaaTTTGCattcccp6957Oct-110.997ctcatGCATAttcttp1162Oct-10.8380.89ttgaTTTGTatttccp1188Oct-10.8930.916tacgatGAAAAttacp1188Oct-110.951ccaaatGCAAAtgca59 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p12778Oct-110.936tccaTTTGCatggaap24461Oct-110.936cttcTTTGCattatap24461Oct-110.895cacagtGCAAAtgaap26518Oct-10.8880.916ttcaTTTCCatgtccp29532Oct-10.8930.902ggaaTTTTCattttcp37605_v4Oct-110.898acacTTTGCatacaap37605_v4Oct-110.928tataTTTGCatcaaap38273_v4Oct-110.901ggagTTTGCatttacp40840_v4Oct-110.942tttcTTTGCatttttp40840_v4Oct-10.9090.928ttcaTTTACatattgp6671Oct-10.9090.937atgaTTTACatttctp1189Oct-10.8930.916tacgatGAAAAttacp1189Oct-110.951ccaaatGCAAAtgcap12779Oct-110.936tccaTTTGCatggaap14185Oct-110.995acactGCATAttctcp17538Oct-10.9090.927tggtatGTAAAttatp17538Oct-110.984attcatGCAAAtcaap17538Oct-10.9090.899agctatGTAAAtacap29102Oct-10.8930.93ctaaTTTTCatttccp39416_v4Oct-10.8930.916tacgatGAAAAttacp39416_v4Oct-110.951ccaaatGCAAAtgcap40303_v4Oct-110.949cggaatGCAAAtggcp15411Nkx2-511ctTAATTgp20627Nkx2-511tcAAGTGp2727Nkx2-511CACTTgap2727Nkx2-511CACTTgap36679_v4Nkx2-511tcAAGTGp3985Nkx2-511CACTTgap6754Nkx2-511CACTTgap10034Nkx2-511CACTTgap10034Nkx2-511CACTTgap1022Nkx2-511tcAAGTG60 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p10715Nkx2-511CACTTgap10715Nkx2-511CACTTgap10715Nkx2-511CACTTgap19713Nkx2-511tcAAGTGp25591Nkx2-511ctTAATTgp26411Nkx2-511tcAAGTGp38411_v4Nkx2-511tcAAGTGp14344Nkx2-511tcAAGTGp14344Nkx2-511CACTTgap24644Nkx2-511tcAAGTGp26379Nkx2-511CACTTgap26379Nkx2-511ctTAATTgp37128_v4Nkx2-511CACTTgap41884_v4Nkx2-511tcAAGTGp5763Nkx2-511tcAAGTGp6957Nkx2-511CACTTgap6957Nkx2-511CACTTgap6957Nkx2-511tcAAGTGp1162Nkx2-511tcAAGTGp13Nkx2-511CACTTgap13Nkx2-511CACTTgap13Nkx2-511CACTTgap1317Nkx2-511CACTTgap15983Nkx2-511CACTTgap26518Nkx2-511CACTTgap29532Nkx2-511tcAAGTGp29532Nkx2-511tcAAGTGp29532Nkx2-511tcAAGTGp29532Nkx2-511tcAAGTGp29532Nkx2-511CACTTgap29532Nkx2-511tcAAGTGp3356Nkx2-511CACTTga61 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p38273_v4Nkx2-511CACTTgap40840_v4Nkx2-511tcAAGTGp17538Nkx2-511tcAAGTGp25063Nkx2-511CACTTgap8531Nkx2-511tcAAGTGp932Nkx2-511tcAAGTGp36679_v4FOXD310.95taTTGTTttcttp14361FOXD30.9960.99caATGTTtgtttp19713FOXD30.9360.952taCTGTTtgtttp37994_v4FOXD310.956ttTTGTTtatttp14344FOXD310.97aaagaAACAAtgp14344FOXD30.9960.953gaATGTTttattp24644FOXD310.959aaacaAACAAagp26379FOXD30.9960.971aaATGTTtctttp37128_v4FOXD30.9360.957gaCTGTTtgtttp41884_v4FOXD30.9480.96aaacaAATAAtap41884_v4FOXD30.9440.954aaATATTtatttp6957FOXD30.9480.958aaacaAATAAtgp1162FOXD310.95taTTGTTttcttp1188FOXD310.966aaacaAACAAacp1188FOXD310.966aaacaAACAAacp1188FOXD310.966aaacaAACAAacp1188FOXD310.966aaacaAACAAacp1188FOXD310.96aaacaAACAAaap12778FOXD310.96ttTTGTTtgtttp12778FOXD310.966gtTTGTTtgtttp12778FOXD310.96ttTTGTTtgtttp13FOXD310.96ttTTGTTtgtttp26518FOXD30.9440.954aaataAATATttp29532FOXD310.988aaataAACAAtgp1189FOXD310.966aaacaAACAAacp1189FOXD310.966aaacaAACAAac62 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p1189FOXD310.966aaacaAACAAacp1189FOXD310.966aaacaAACAAacp1189FOXD310.96aaacaAACAAaap12779FOXD310.96ttTTGTTtgtttp12779FOXD310.966gtTTGTTtgtttp12779FOXD310.96ttTTGTTtgtttp14185FOXD310.953taTTGTTtggttp17538FOXD30.9960.959gaacaAACATttp17538FOXD30.9960.968caATGTTtctttp39416_v4FOXD310.966aaacaAACAAacp39416_v4FOXD310.966aaacaAACAAacp39416_v4FOXD310.966aaacaAACAAacp39416_v4FOXD310.966aaacaAACAAacp39416_v4FOXD310.96aaacaAACAAaap20627HNF-40.8830.894ttatgtcCTTTTtcctgggp22977HNF-410.9tcctgggCAAAGagccaggp23792HNF-410.963tattgaaCTTTGaacacctp23792HNF-410.942gtgtgtaCTTTGggccaaap26181HNF-410.906aggagctCTTTGacccttcp36679_v4HNF-40.9150.899ctatggtCTTTAccccaagp36758_v4HNF-40.9150.908caatgtaCTTTAtccttctp6754HNF-410.916cagagacCTTTGttcacttp10715HNF-410.913tccagatCTTTGaacttgcp13558HNF-410.99gtatgacCTTTGtcccgctp14361HNF-40.8830.899ctctgtcCTTTTccctgctp19713HNF-40.8830.892taaaggcAAAAGctcattap26411HNF-40.9150.922ctagggaTAAAGggcaaagp26411HNF-410.968taaagggCAAAGgacactgp26411HNF-410.929tgatgtgCTTTGgaccatgp26411HNF-410.956aggggagCAAAGgacagctp29203HNF-410.969cgagggtCAAAGtccagcap37994_v4HNF-40.8480.898atctgacCCTTGccctgca63 新疆医科大学博士学位论文lncRNA探针转录因子核心匹配度基序匹配度匹配的启动子序列p10929HNF-410.917gtgtgggCTTTGggcaagtp41884_v4HNF-410.922ccacggtCAAAGgcccctgp1162HNF-40.9150.899ctatggtCTTTAccccaagp24461HNF-410.924ctcagttCAAAGttcttagp24461HNF-410.94cagtgtaCTTTGagctcagp38273_v4HNF-410.891tccggttCTTTGtccactcp40840_v4HNF-410.958cccaggaCAAAGctcatttp40840_v4HNF-410.899aagtggaCAAAGggtaagap40840_v4HNF-40.8830.901ttggggaAAAAGgccaatap17538HNF-40.9150.895ctgtgcaCTTTAaacagatp17538HNF-410.942acaggacCAAAGagcaggtp25063HNF-410.931ctctgctCTTTGggctactp29779HNF-410.92ttgagatCTTTGacctcagp40303_v4HNF-410.892gggtgccCAAAGgttaactp8531HNF-410.952aaagggcCAAAGagcagccp932HNF-410.909aactgacCAAAGgcccagt注：选取在网路图中前5个度最多且P<0.05的转录因子。3讨论在基因组DNA的区域中缺少蛋白编码能力被认为是没有功能相关性，长期以来一直是生物界具有争议的话题。在最近几年，随着高通量测序平台的发展揭示出大[59]量非编码RNA(ncRNAs)对基因的调节和发展具有重要作用。有趣的是，70%基因[60]组转录成RNA，但只有1.5%的基因组具有编码蛋白的功能。而且，只有一半的人类转录组包含蛋白编码的转录本。这种相关性对于基因调节的中心法则是一种挑战，表明非编码RNA对各种生理和病理生理过程具有重要作用。非编码RNA根据序列长度一般分为两大类：短链非编码RNA，转录本长度小于200bp；长链非编码RNA(lncRNAs)，转录本长度大于200bp。短链非编码RNA包括对蛋白合成和microRNAs具有重要作用的转运RNA，通过RNA诱导的沉默复合物，是基因表达转录后重要的调节物。此外，长链非编码RNA还未被完全的了解，同时长链非编码RNA的命名也一直不断的演变。一般情况，lncRNAs通过RNA聚合酶2，5’脱帽和3’多聚腺苷酸化进行转录(蛋白编码的内含子区域或者是非编码区域)。LncRNAs基因能够像蛋白编码基因一样发生表观遗传学修饰，例如在转录起始位点的组蛋白3赖氨酸464 新疆医科大学博士学位论文[61]三甲基化(H3K4me3)。LncRNAs也会发生转录后剪接形成成熟的转录本。LncRNAs包括长链基因间非编码RNA(lincRNAs)，例如HOTAIR和HOTTIP，反义RNAs(RNA转录来源于蛋白编码基因的相反链与蛋白编码的基因具有重复的序列)，转录超级保守区域(RNAs转录来源于高度保守的基因组区域)，假基因(蛋白编码基因的非蛋白编码拷贝)和环状RNAs。第一个发现的lncRNAs是X-无效特异性转录本(XIST)。在1990年为了发现全新的与X染色体失活有关的基因，在浏览cDNA文库时发现了XIST[24]基因。研究者们为了揭示它们对于X失活过程的作用，于是研究这类基因的表达模式。随后的实验确定了XIST非编码特性以及XIST作为X失活起始的正向调节物。在过去的十年，高通量测序能够识别lncRNAs转录本，阐明lncRNAs在各种生物过程的作用。越来越多的证据表明了特殊lncRNAs的组织特异性表达方式以及lncRNAs[62]的表达失调对于人类疾病的影响。在本研究中，我们将会了解当前lncRNAs活性的潜在机制和功能以及参与2型糖尿病生物过程的lncRNAs。此外，我们将讨论运用lncRNAs作为2型糖尿病诊断标记物和治疗靶点的潜在价值。3.1LncRNAs的功能机制目前为止，功能研究表明lncRNAs具有广泛的调节作用，包括通过分子骨架发挥表观遗传调节，mRNA加工调节，分子诱捕和lncRNAs来源的肽。LncRNAs通过序列为基础发挥调节作用的机制类似于miRNAs，通过结合特异性反应原件和/或目标转录子在转录后调节基因的表达。这些相关性表明内源性lncRNAs具有的广泛功能和同时突出了非编码基因组的功能。3.2通过分子骨架的表观遗传学调节[63]早期的研究表明lncRNAs能够参与到目标基因的表观遗传调节。一些研究表[64]明lncRNAs的表观遗传修饰会导致目标基因的转录抑制。在这种调节模式中，lncRNAs把不同的蛋白单元链接起来。LncRNA具有结合不同效应分子的广泛能力特点。这种结合临近效应分子同时随后与这些单元相互作用，最终导致目标基因的典型转录抑制效果。在lncRNAs的表观遗传学参与者中，最主要的研究之一为PRC1/2多梳蛋白复合物。PRC1包括Chromobox(CBX)，RING1/2和MEL18在内的多种蛋[65]白，主要的功能是对组蛋白H2A的赖氨酸119位点进行泛素化。至于PRC2，蛋白单元包括EZH2，EED和SUZ12，主要的功能是对组蛋白H3的赖氨酸27位点进行三甲基化。越来越多的研究表明lncRNAs能够直接结合到PRC1/2蛋白。例如，lncRNAANRIL发现能够直接结合到PRC2复合物的亚基，从而招募PRC2复合物到INK4B/ARF位点通过压缩染色质抑制肿瘤抑制物p15的转录活性。尤其是EZH2和PRC1/2复合物亚基BMI1在各种实体肿瘤中发现表达水平升高，并且与肿瘤的发生[66]和发展密切相关。有趣的是，以前的研究发现PRC2复合物的结合特异性，以及EZH2的亚基结合到各种RNAs。可是，PRC2复合物表现出更有选择性的RNA结合65 新疆医科大学博士学位论文[67]行为，从而部分介导EED亚成分。尽管如此，研究强调了RNA结合对于招募和随后调节EZH2活性的重要性。LncRNAs作为骨架招募表观遗传学调节物的主要作用已经得到了普遍共识，小鼠多梳蛋白进一步证明了表观遗传学调节，在此过程中核糖核酸酶终止了整个基因组CBX7结合到异染色质的能力。此外，相关研究表明在lncRNAs上PRC2结合物包括GC丰富的发卡结构，从而证明了RNA二级结构，再加上序列保守性，因此在生理和病理状况下具有重要意义。3.3mRNA加工调节除了转录控制基因的表达，转录后水平的调节对于miRNA介导的目标基因沉默也同样重要。转录后加工包括mRNA剪切，编辑和输出。尤其重要的是坐落在染色[68]质内部空间的亚核体，细胞核paraspeckles的出现。细胞核paraspeckles通过扮演mRNA转录的暂存位点，使mRNA进一步加工优先输出进入细胞质从而导致翻译的发生，因此，能够对于调节基因的表达具有重要作用。研究揭示了包括MALAT1和NEAT1在内的lncRNAs通过识别位置参与到mRNA的加工，细胞核paraspeckles中有大量的lncRNAs。此外，基因敲除实验证明了MALAT1具有招募包括SRF1和SC35在内的SR剪切因子去细胞核paraspeckles，因此发挥了重要作用。MALAT1具有调节剪接因子磷酸化的能力，间接调节mRNA转录本的选择性剪接。在癌症中，发现在各种类型的肿瘤中MALAT1和NEAT1转录本表达水平升高，他们的表达与疾病[69]的较差预后和疾病的结果密切相关。MALAT1和NEAT1导致肿瘤发生的准确机制还未被完全了解清楚。LncRNAs通过直接RNA-RNA相互作用参与到mRNA转录调节的稳定性。相互作用的主要基础在于lncRNAs和mRNAs具有序列同源性，类似于通过miRNAs调节mRNA的表达。LncRNAs包含的Alu重复序列能够杂交mRNAs，形成短暂的dsRNA分子作为不稳定因素的信号，例如STAU1介导mRNA[70]的降解。3.4分子诱骗除了调节mRNA加工和稳定性，lncRNAs能够通过扮演分子诱骗的角色隔离特异性转录本，蛋白和miRNAs介导基因的表达，从而调节转录后基因的表达。例如lncRNAs诱骗基因，生长停滞特异性基因5(GAS5)，最近发现在细胞中具有糖皮质[71]激素抵抗的作用。通过分析GAS5的二级结构揭示了RNA茎环结构是模仿糖皮质激素抑制基因启动子区域的激素反应原件(HREs)的DNA结构。通过竞争性结合糖皮质激素受体的DNA结合域，GAS5具有防止HREs受体物理相互作用的能力，导致糖皮质激素抑制基因的转录抑制，最终调节细胞类固醇激素的活性。另一个隔离机制的发生时当lncRNAs诱骗microRNAs。RNA转录本，包含micoRNA反应原件[72](MREs)，能够通过竞争性分享micoRNAs扮演内源性海绵。在这种模式下，所有的RNA转录本包括lncRNAs和蛋白编码mRNAs可以作为竞争性内源RNA结合和66 新疆医科大学博士学位论文隔离miRNA，发挥基因表达的反式作用调节效果。在癌症中，PTEN肿瘤抑制基因的假基因PTENP1，可以通过活性竞争PTEN基因的micoRNAs结合位点作为肿瘤抑制基因。更重要的是，在前列腺癌和直肠癌中PTENP1的表达水平下降，表明在肿[73]瘤进展的过程中发生基因组的损失。同样，研究发现lncRNAFER1L4可以作为竞争性内源RNA影响视网膜母细胞瘤RB1的转录，在胃癌中lncRNAFER1L4是一种肿瘤抑制基因。相对于癌旁组织FER1L4和RB1的表达水平发生了改变。竞争性内源RNA活性对于非编码RNA和蛋白编码基因的3’-UTRs的调节功能提供新的见解。3.5LncRNA编码肽尽管lncRNAs非编码定义，一些研究表明lncRNAs包含的小型开放阅读框(ORFs)能够翻译成<100氨基酸的肽。最近的研究表明一种以氨基酸反应的小型调节多肽(SPAR)命名的全新肽，是由LINC00961编码而来。小鼠和人类的保守性，SPAR下[56]调能够促进mTORC1的激活，随后促进肌肉的再生。由于lncRNAs是以组织特异的方式表达，这种发现强调了这种隐藏肽在哺乳动物生物过程中组织或者器官特异调节的潜力。3.6LncRNA与临床疾病的相关性3.6.1疾病的生物标记成功生物标记物在于能够选择性表达，同时能够以客观的方式被测量。研究揭示了lncRNAs是具有组织特异性和/或疾病特异性的特点。前列腺癌的特异性lncRNAPCA3在前列腺癌中表达显著升高。最关键的是PCA3在前列腺癌患者的尿液中能够检测到，此种检测方法对于前列腺癌患者是无创伤的。目前，PCA3能够成功运用于[75]临床作为诊断试验的生物标记物。另一个显著的例子是PR-lncRNA-1，在结肠癌[76]中发现PR-lncRNA-1表达显著下降。幸运的是，PR-lncRNA-1能够通过增加p53的转录活性抑制直肠癌细胞的增长和促进直肠癌细胞的凋亡。因此，PR-lncRNA-1可能具有作为结肠癌的生物标记物的潜力。3.6.2疾病的治疗靶点在特定的组织和疾病中，lncRNAs具有特异性表达模式的特点，因此作为治疗的分子靶点获得了更多的关注。虽然在临床上运用RNAi为基础作为治疗疾病的方法还不成熟，然而在疾病中以表达失调的lncRNAs为治疗靶点运用于临床切实可行。例如，在90%以上的黑色素瘤患者中发现lncRNASAMMSON表达增加，在体外实验和患者来源的异体移植，沉默lncRNASAMMSON的表达能够诱导细胞的死亡，[77]同时增加黑色素瘤对MAPK抑制剂的敏感性。因此，设计短发卡RNA或者反义寡核苷酸对抗lncRNASAMMSON的水平增加具有重要的治疗价值。除了lncRNASAMMSON，研究还发现一些lncRNAs在各种类型的癌症中表达失调，在这些癌症中lncRNAs有潜力成为治疗靶点。在乳腺癌抗雌激素治疗中，BCAR4表达水平增加，67 新疆医科大学博士学位论文[78]能够促进癌细胞增殖和迁移。BCAR4能够结合和激活转录因子SNIP1和[79]PNUTS，最终导致hedgehog/GLI2转录程序的启动。因此，在乳腺癌抗雌激素治疗中，BCAR4有希望发挥治疗效果。尽管如此，lncRNA诱导细胞效果潜在机制和以lncRNA为基础的治疗安全性和有效性，在运用于临床前还需要更进一步的研究。3.7LncRNAs在血糖代谢中的重要作用2型糖尿病是以胰岛素抵抗和和胰腺β细胞胰岛素分泌受损为特征的复杂性疾病。作为调节系统血糖代谢的关键组织，胰岛依旧是当前研究者探索糖尿病病理生[80]理机制的关键。为了揭示lncRNAs在调节胰腺功能过程中的重要作用，一些研究[33]团队描述了lncRNAs在胰岛中的表达。Moran等首先发现lncRNAs在胰岛和β细胞中有表达。联合RNA测序数据和表观遗传修饰的标志H3K4me3，H3K4me3在活性启动子区域丰富表达，最后发现有1128条lncRNAs在人体胰岛细胞表达。通过比较其他组织，发现1128条lncRNAs在胰岛中特异性高表达。这些在胰岛特异性高表达的lncRNAs坐落在特定的染色质区域和编码基因。此外，在胰腺内分泌分化过程和β细胞葡萄糖培养发现lncRNAs在胰腺β细胞具有重要的功能意义。敲除lncRNAHI-LNC25导致GLIS3表达下降，GLIS3是重要的胰岛转录因子。在T2DM患者中，胰岛特异性lncRNAs的调节失调表明lncRNAs在糖尿病中具有病理生理作用。对发育过程的小鼠视网膜细胞进行牛磺酸处理，通过基因组筛选，发现了基因[81]表达上调的高度保守lncRNATUG1。随后的研究发现TUG1可以根据肿瘤的类型作为致癌基因或抑癌基因，表明TUG1在调节细胞增殖和凋亡时具有复杂的机制。[82]Yin等最近的研究表明下调的lncRNATUG1能够影响小鼠胰岛β细胞的凋亡和胰岛素分泌。在组织中，lncRNATUG1在胰腺和胰岛中高表达。TUG1在糖尿病NOD小鼠的胰腺中表达下降，同时在葡萄糖处理后的Nit-1细胞，也发现了TUG1的表达下降，表明TUG1与糖尿病的发生密切相关。在Min6和Nit-1细胞siRNA介导的lncRNATUG1基因敲除导致凋亡增加。在体内实验敲除TUG1会导致胰腺β细胞的凋亡增加，血清胰岛素分泌减少和更高的空腹血糖水平。虽然在体内外lncRNA能够直接影响胰腺细胞的功能，然而潜在的机制还未了解清楚。LncRNAH19转录来源[83]于保守的印记基因簇。LncRNAH19在成人骨骼肌和心脏中表达升高。以前的研究表明LncRNAH19可以作为肿瘤抑癌基因或者通过表观遗传修饰启动癌症的转移[84][85]。最近，Gao等发现H19在糖尿病患者和糖尿病小鼠的骨骼肌中表达下降，表明H19在肌肉的胰岛素信号中具有重要作用。在体内外胰岛素处理会直接抑制H19的表达。在肌管中敲除H19能够阻断胰岛素刺激的葡萄糖摄入。这些数据表明H19是健康个体的胰岛素信号通路重要组成部分，在糖尿病患者中H19表达下调。胰岛素能够上调let-7microRNA的表达，let-7microRNA能够抑制胰岛素-PI3K信号通路的多种成分和引起胰岛素抵抗。H19直接结合到let-7，减少了let-7的可利用性，是68 新疆医科大学博士学位论文胰岛素信号通路处于抑制状态。作为负反馈环，let-7结合H19后会导致H19的稳定性下降和减少H19的表达。因此，H19/let-7双负反馈环对肌肉细胞的糖代谢具有重[37]要影响。在体内，肝脏是控制血糖代谢的主要器官，Li等研究发现肝脏表达丰富的lncRNA，lncLSTR。肝脏特异性敲除lncLSTR后增加了TG的清除，这一过程依赖于apoC2表达的上调。LncLSTR与TDP-43形成的分子复合物调节Cyp8b1的表达，Cyp8b1是胆汁酸合成信号通路的关键酶，在体内产生的胆汁池通过FXR诱导apoC2的表达。有趣的是，敲除lncLSTR导致小鼠血糖水平的下降。未来的研究需要探索lncLSTR是怎样调节血糖的水平。一些研究表明lncRNAs能够调节脂肪细胞的分化[52]。可是，lncRNAs是如何调节脂肪细胞血糖代谢还不清楚。类固醇受体RNA激活剂(SRA)是PPARγ的一种转录共激活因子能够促进脂肪细胞的分化。Sra1基因是脂肪组织质量和功能的重要调节物。在野生大鼠中，SRA基因在脂肪组织的表达水平要高于其他器官。SRA基因敲除的小鼠能够通过减少脂肪的质量和增加瘦肉的含量抵抗高脂饮食诱导的肥胖。SRA基因敲除小鼠的瘦表型与脂肪细胞标记基因表达减少和血浆TNFα水平减少有关。SRA基因敲除胰岛素敏感性增强，此外，在高质饮食喂养后SRA基因敲除小鼠的肝脏具有较少的脂滴，脂肪生成相关的基因表达减少。综上所述，SRA对于脂肪组织质量的调节，脂肪肝，血糖稳态和代谢相关基因的调节具有重要作用。高糖血症相关的内皮细胞功能失调被认为是糖尿病相关的微血管和大血管血管并发症的关键。在高糖水平下，系统的对人体内皮细胞的lncRNAs进行转录研究。对高糖(25mmol/L)和正常糖(5mmol/L)培养下的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的lncRNAs和蛋白编码转录本进行Arraystar人体lncRNA表达芯片V3.0分析。Singh[86]等研究表明与正常糖培养人脐静脉内皮细胞相比，人脐静脉内皮细胞在高糖的培养下，100条lncRNAs表达上调同时186条lncRNAs表达下调，其中ENST00000421257(RNA长度：825bp，染色体20)是上调倍数最大的lncRNA，ENST00000559989(RNA长度：7790bp，染色体15)是下调倍数最大的lncRNA。在mRNAs中，133条mRNAs表达上调同时166条mRNAs表达下调。虽然在每个人体染色体上发现了血糖敏感的lncRNAs，大部分坐落在染色体1、11和17上。进一步探索发现，在每条染色体上都会有表达差异的lncRNAs。序列分析表明lincRNAs在表达差异的lncRNAs中具有重要的地位。虽然基因间隔区内有许多与疾病相关的多[87]态性，然而一些lincRNAs与改变血糖环境后和糖尿病的功能相关性还不清楚。有趣的是，表达相关性发现28条表达差异的lincRNAs与26条表达差异的mRNAs存在相关性。LncRNAs能够正性和负性调节基因的表达，其中15条lincRNAs改变倍数与相关的mRNAs直接相关，然而13条lincRNAs改变倍数与相关的mRNAs存在负相关。此研究对高糖血症相关的内皮细胞功能失调和糖尿病相关的血管疾病的全69 新疆医科大学博士学位论文新调节分子提出了新的见解。依据KEGG数据库的信号通路分析发现了相关性。在高糖的环境下，表达上调的mRNAs主要富集于轴突导向信号通路，然而表达下调的mRNAs主要富集于血管平滑肌细胞收缩信号通路、多巴胺能神经突触信号通路、泛素介导的蛋白水解信号通路、心肌细胞的肾上腺素信号通路、胰岛素信号通路、凋亡信号通路。这些发现与2型糖尿病患者胰岛泛素蛋白酶体系统(UPS)下游主要的基[88]因一直。去泛素化酶泛素特异性蛋白酶7对稳定的胰岛素受体底物IRS-1和IRS-2具有重要作用，是胰岛素和胰岛素样生长因子信号通路的关键介导物。胰岛泛素蛋白酶体系统与血糖控制蛋白之间存在相关性。信号通路分析发现钙通道电压依赖L型1C亚基(CACNA1C)，对小鼠胰岛素分泌具有重要作用。CACNA1C也同样编码2+2+电压依赖L型Ca通道，是血管平滑肌细胞中主要的Ca进入通道。因此，CACNA1C能够独立于它的潜在代谢效果调节血管张力。GO分析表明，mRNAs主要富集的生物过程为细胞和代谢过程，主要富集的细胞组分包括细胞组分、细胞、细胞内组分、细胞内，主要富集的分子功能包括结合和蛋白结合。转录组的分析发现一些基因参与血管平滑肌的收缩，晚期糖基化终末化产物能够通过多种途径使糖尿病相关的血管并发症发生恶化。在一方面，晚期糖基化终末化产物在细胞外空间和血管壁集聚，[89]诱导氧化应激和加强动脉粥样硬化过程。在另一方面，晚期糖基化终末化产物能[90]够促进内皮细胞凋亡。LncRNAs可能通过下调参与晚期糖基化终末化产物依赖的细胞死亡过程的抗凋亡细胞发挥血管保护作用。神经和循环系统经常在解刨和功能[91]上相互联系，轴突和毛细血管出芽更加相似。事实上，一些蛋白介导轴突导向，与血管生成过程密切相关。人脐静脉内皮细胞暴露在高糖后，增加的突导向相关的基因可以解释增殖性糖尿病视网膜病变的致病血管生成。由于临床实践方针统一强调早期和进展期血糖降低策略的重要性，缓解血管并发症的发展和进展。这些数据开创了新的关于生物标记物和治疗靶点的见解，为补充当前糖尿病血管保护的医疗设备提供新颖的策略。2型糖尿病患者的增加及其微血管和大血管的并发症会引起患者严重的心理和经济负担。糖尿病肾病是一种进行性肾脏疾病，会引起糖尿病患者发病率和死亡率的增加，是引起终末期肾功能衰竭的主要原因。糖尿病肾病的主要早期症状是微量尿蛋白。一些病理研究表明肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，系膜基质增厚是糖尿[92]病肾病的预测指标，最终会导致肾小球硬化和纤维化。在没有有效的预防和治疗措施时，20%-40%伴有微量尿蛋白的糖尿病患者会发展成为糖尿病肾病，10%-20%的糖尿病肾病患者会最终发展成为终末期肾脏疾病。糖尿病肾病复杂的发病机制会[93]增加晚期糖基化终产物，增加氧化应激和激活活性糖和多元醇通路。更好理解糖尿病肾病早期阶段和进展期失调的分子过程是发展全新的治疗措施的关键。为了进[94]一步研究lncRNAs和糖尿病肾病的关系，Wang等在糖尿病肾病和正常小鼠的肾70 新疆医科大学博士学位论文组织中，运用芯片分析筛选异常表达的lncRNAs和mRNAs，结果表明1018条lncRNAs和726条mRNAs差异表达(差异倍数﹥2.0)，包括221条上调和797条下调lncRNAs基因，289条上调和440条下调mRNAs基因。由于它们在系膜细胞增殖和纤维化中的作用，ENSMUST00000147869与邻近的Cyp4a12a被认为是糖尿病肾病的潜在的治疗靶点和分子标记物。表达下调的ENSMUST00000147869是坐落在染色体10上编码一系列转录本，过表达ENSMUST00000147869显著减少了肾小球系膜细胞增值指标(PCNA和cyclinD1)和纤维化指标(collagenI和fibronectin)的表达。CYP4蛋白使脂肪酸、类花生酸类物质和维生素D发生代谢，同时对化学防御具有重要作用。在糖尿病、怀孕、肝肾综合征和各种高血压模型中，肾脏CYP450花生[95]四烯酸代谢产物水平会发生改变，导致肾脏功能的异常。也有报道表明CYP4F表达水平的下降会促进脂肪肝向脂肪性肝炎的进展。CYP4A亚型包括CYP4A10、[96]CYP4A12a、CYP4A12b、和CYP4A14。CYP4A12a是主要的20-羟酸合成酶，对[97]决定高血压和心血管疾病易感性的性别特异性和家族特异性具有重要作用。作为ENSMUST00000147869的邻近基因，下调的CYP4A12a认为是ENSMUST00000147869的目标基因。然而，CYP4A12a是否参与小鼠系膜细胞的增殖和纤维化还不得而知。因此，需要功能获得性研究探究ENSMUST00000147869和CYP4A12a之间的关系，以便更好的理解ENSMUST00000147869在糖尿病肾病发病机制中的作用。生物医学和生物技术数据有助于我们形成关于lncRNAs在糖尿病肾病潜在功能的假设。GO分析研究表明大部分功能失调的mRNAs参与糖尿病肾病的发病机制主要包括免疫过程，类固醇脱氢酶活性和蛋白结合。Pathway分析研究表明表达差异的mRNAs参与的信号通路包括趋化因子信号通路，核苷酸结合和寡聚结构域受体信号通路。糖尿病患者缺血性心脏病和急性心肌梗死具有较高的发生率。糖尿病患者心肌梗死后的死亡率的风险增加。在2003年至2006年，英格兰和威尔士患有心肌梗死的157142人中，在最初的90天内，心肌梗死伴有糖尿病患者心肌梗死复发或者相对死亡风险为1.3(95%CI：1.26-1.33)，在校正了年龄、性别、心衰和手术后为[98]1.16(95%CI：1.1-1.2)。然而，糖尿病诱导的心肌再生能力下降和心肌损伤后的修复能力下降的相关机制还不清楚。心脏干细胞是哺乳动物心脏未成熟细胞的一种亚型，对保持心脏稳态和心脏修复能力具有重要作用，心脏干细胞能够分化成心脏组[99]织的所有组成细胞，包括心肌细胞，血管平滑肌和内皮细胞。越来越多的证据表[100]明高血糖能够抑制心脏干细胞介导的心脏修复和血管生成能力。通过运用芯片技[101]术探索心脏干细胞在高糖和正常糖培养下的lncRNA表达差异。Liu等研究表明lncRNAs和mRNAs在高糖组和低糖组的表达不同。在高糖培养以后，173条lncRNAs表达上调，227条lncRNAs表达下调；642条mRNAs表达上调，884条mRNAs表71 新疆医科大学博士学位论文达下调；GO分析表达不同的mRNAs参与的细胞组分、生物过程和分子功能包括激活JAK2激酶活性、激活Janus激酶活性、脂肪组织的发育、T细胞的分化、凋亡体、凋亡细胞的清除、凋亡细胞核的变化、凋亡过程、成纤维细胞生长因子结合、成纤维细胞生长因子受体结合、成纤维细胞生长因子激活受体活性、成纤维细胞增殖和正调控TGF-β产量。不同的lncRNAs通过顺式作用参与的生物过程包括B细胞受体信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路和氧化磷酸化。KEGG分析表达不同的mRNAs参与的信号通路包括G蛋白偶联受体信号通路、G蛋白偶联受体、B细胞受体信号通路的负调控、细胞周期蛋白分解代谢过程的负调控、受体介导的内吞作用。不同的lncRNAs通过顺式作用参与的信号通路包括炎症反应、肿瘤坏死因子的正向调节、mTOR信号通路、2型糖尿病、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、ECM-受体相互作用和VEGF信号通路。LncRNAs特殊的表达模式对于糖尿病患者心脏干细胞的心肌再生和修复能力具有重要作用。然而大部分lncRNAs的共表达网络未被注释。在未来，需要对高糖培养状态下心脏干细胞lncRNAs分子进行更深的功能分析。1型糖尿病(T1DM)是以慢性进行性胰腺β细胞凋亡为特征的器官特异的自身免疫性疾病。在1型糖尿病的初期，免疫细胞释放的细胞因子和其他炎症介质逐步渗透胰岛细胞，导致基因表达的改变，引起功能障碍，最终致使胰岛细胞凋亡。LncRNA是一种全新普遍存在的具有多种生物功能的重要基因，对疾病具有重要作用。然而，lncRNA是否对细胞因子诱导的β细胞凋亡具有功能还不清楚。长期暴露在促炎细胞[102][103]因子对于胰腺β细胞具有高毒性影响许多基因网络的表达。以前的研究主要关注各种miRNAs调节β细胞的凋亡。然而lncRNAs对β细胞凋亡的调节和对1型[104]糖尿病发生和发展的作用还未曾报道。大量的研究表明与蛋白编码基因比较，[105]lncRNAs具有较低的表达水平，大部分展现出组织特异性表达模式。Affymetrix[106]基因芯片小鼠转录组阵列1.0包含lncRNAs和mRNAs探针。Sun等运用Affymetrix基因芯片技术鉴定暴露在促炎细胞因子下的MIN6细胞lncRNAs和mRNAs的差异表达。研究显示，以差异倍数大于≥2.0位筛选标准发现444条lncRNAs表达上调和279条lncRNAs表达下调。上调倍数最大的lncRNANONMMUT036704，发现与lipocalin2基因(Lnc2)具有正义重叠，lipocalin2也称之为中性粒细胞明胶酶lipocalin[107](NGAL)。NGAL在各种疾病中具有重要作用。Jung等发现IL-10能够介导NGAL在乳腺癌细胞中的表达，导致肿瘤的进展。此外，NGAL通过诱导促炎细胞因子介质创造动脉粥样硬化的系统促炎环境。此外，在妊娠期糖尿病超重妇女的皮下脂肪组织发现NGAL的过表达，NGAL对妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的发展具有重要作用[108]。当前，没有关于NGAL在β细胞凋亡中的研究。鉴于NGAL在薄壁细胞中的作用，认为lncRNANONMMUT036704通过调节NGAL的表达在1型糖尿病的发展72 新疆医科大学博士学位论文中发挥重要作用。NONMMUT034373是另一种高表达的lncRNA。发现该转录本正义重叠CD274抗原(Cd274)，也称之为程序性死亡配体1(PD-L1)。PD-L1是PD-1的配体。最近的研究发现在转基因小鼠中增加PD-1的表达能够减少自身免疫性糖尿病[109]的发生。另外的研究表明在糖尿病前期的非肥胖糖尿病小鼠中，PD-1或者PD-L1[110]的阻断能够迅速导致糖尿病的发生。PD-L1缺乏能够通过直接作用于致病的T细胞增加糖尿病的易感性，然而调节性T细胞和B细胞通过独立于PD-1/PD-L1通路[111]的机制防治自身免疫性糖尿病的发生。因此，lncRNANONMMUT034373通过调节PD-L1导致1型糖尿病的发生。遗传易感性是1型糖尿病发展的主要病因，研究表明许多易感基因在染色体上，例如染色体1上的PTPN22，染色体2上的CTLA4，[112]染色体2上的IFIH1，染色体10上的IL2RA。相比于其他染色体，染色体1具有更高比例的上调lncRNAs，染色体2上具有更高比例的下调lncRNAs，因此，在染色体1和染色体2上的易感性lncRNAs会导致β细胞凋亡。依据GO分析，表达上调的lncRNAs富集前10的项目包括自身免疫反应、炎症反应、凋亡过程、I-κB激酶/核因子κB级联、对病毒的防御、生物过程、对病毒的反应、免疫反应、RNA聚合酶II启动子的转录正调控和内肽酶活性的负调控。表达下调的lncRNAs富集前10的项目包括运输、细胞周期、氧化还原过程、核小体装配、细胞分裂、有丝分裂、代谢过程、生物过程、蛋白运输、离子运输。这些发现与免疫介导炎症是1型糖尿病发病机制的观点一致。炎症细胞因子释放后结合到β细胞上的受体能够激活转录因子p38、c-JunN-末端激酶(JNK)、转录因子1信号传感器和激活剂(STAT-1)、NF-κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，激活内质网应激，导致功能性的[113]损伤和最终的凋亡。依据信号通路分析，表达上调的lncRNAs富集前10的信号通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、RIG-I样受体信号通路、凋亡信号通路、Jas-STAT信号通路、粘附分子信号通路、Hippo信号通路。表达下调的lncRNAs富集前10的项目包括代谢通路、病毒致癌、内质网蛋白的加工、细胞周期、N-多聚糖的生物合成、癌症转录的错误调节、嘌呤的代谢、胰岛素的分泌、非饱和脂肪酸的生物合成、青年糖尿病发病的成熟。Hippo信号通路通过抑制细胞增殖和促进凋亡在器官尺寸的控制和组织再生方面具有重要作用。在大鼠的肝切除术后，Hippo信号通[114]路能够抑制早期的肝再生。此外，Hippo信号通路的失活或者激活Hippo信号通[115]路下游的效应物，YAP转录共激活剂，改善心脏的再生。因此，激活Hippo信号通路能够诱导β细胞的凋亡，Hippo信号通路的失活能够诱导β细胞的增殖。这可能是1型糖尿病的全新治疗靶点。RIG-I样受体是主要的细胞质病原体识别受体，参与[116]识别病毒，包括RNA病毒主要感受器，促进DNA病毒的识别。虽然没有证据表明RIG-I样受体与1型糖尿病相关，环境因素(病毒感染)被认为是引起1型糖尿病的73 新疆医科大学博士学位论文主要原因。因此激活RIG-I样受体能够引起天然免疫相关的炎症反应促进β细胞的凋亡，导致1型糖尿病的发生。理解功能性lncRNAs能够帮助我们识别1型糖尿病新的诊断和治疗靶点。因此，依据lncRNAs和mRNAs的基因芯片的研究结果，在未来确定有意义靶点在1型糖尿病发病机制中的作用将会更重要和更有价值。最近的芯片技术的发展能够全面的分析精子中的lncRNAs和mRNAs的表达，有助于了解lncRNAs在糖尿病患者中的作用，发现糖尿病男性与生殖相关的临床标[117]记物。Jiang等在糖尿病中为了研究与繁殖相关的基因，在糖尿病小鼠的精子中进行了lncRNAs和mRNAs的表达分析。运用芯片分析，在6例糖尿病小鼠和6例正常小鼠精子中进行lncRNAs和转录本表达分析，构建火山图确定表达差异的lncRNAs和mRNAs。其中mRNAs的功能差异通过信号通路和基因本体论(GO)分析，lncRNAs的功能差异是通过它们与相应mRNAs物理和功能关系。研究表明，在糖尿病和正常组的精子中，7721条lncRNAs(4314上调和3407下调)和6097条mRNAs(2590上调和3507下调)具有表达差异，当发现lncRNAs和mRNAs转录本在糖尿病和对照小鼠的精子中显著改变时，表明lncRNAs与mRNAs转录本相关的基因存在相互作用。LncRNAs具有调节邻近基因表达的机制，通过分析与lncRNAs增强子邻近的mRNAs转录本的表达，发现在糖尿病小鼠的精子样本中三条lncRNA增强子(Rpl31-ps7,AB352974,和Rpl35a-ps7)下调，赖氨酸特异性组蛋白H3转甲基酶(Ezh2)上调，两条lncRNA增强子(Rn4.5s和XLOC_01985)上调。分子分析表明多梳蛋白组的蛋白Ezh2，在细胞连续传代的时候保持基因的转录抑制状态，是圆形精子细胞的分子顶端区域(特异性的表观遗传区域)的关键因子，组蛋白甲基化在此区域发挥染色质重塑的作用。反义lncRNAs是一种从反义链转录的RNA分子，与定义明确的剪接正义RNA和无内含子正义RNA部分重叠。反义lncRNAs最初被认为是转录的噪音；然而大量的证据表明反义lncRNAs能够在转录和转录后水平通过多种机制调节正义[118-120]mRNA。在许多成熟的精子中发现了反义转录本，lncRNAs能够调节精子的生[121,122]成，部分lncRNAs为反义lncRNAs。反义lncRNAs在精子成熟，受精和早期胚胎的生成阶段的功能还需要更进一步的研究。一些反义lncRNAs可能通过多种机制调节邻近基因或更远距离基因的表达。LncRNAAK144334使Hnrnpab基因在糖尿病小鼠精子中表达下调，Hnrnpab通过调节mRNAs的阶段特异性翻译，对精子的生[123]成具有重要作用。反义lncRNAs可能是糖尿病小鼠生殖力的潜在调节物。大部分lncRNAs的功能还未被确定，没有数据库具有lncRNAs的功能注释。因此，通过研究lncRNAs相对应mRNAs的功能间接确定lncRNAs的功能。信号通路和基因本体论(GO)分析表明在糖尿病小鼠的精子中表达差异的mRNAs与糖尿病进展的许多过程相关，包括糖脂代谢和氧化磷酸化，同时参与精子生成的信号通路。最近的研究强调了Wnt信号通路在代谢稳态和糖尿病中的意义。高糖能够激活Wnt信号通路74 新疆医科大学博士学位论文[124]，许多研究者关注了在胚胎发育过程中Wnt信号通路的意义。Wnt信号通路对哺[125]乳动物的精子生成具有重要作用，Wnt信号通路能够调节哺乳动物的精子生成。此外，Hippo信号通路对于器官生长的控制具有重要，共同激活物YAP和TAZ是[126]Wnt信号通路的关键介导物。有趣的是，在糖尿病小鼠的精子中，与转录相关的Hippo信号通路和Wnt信号通路表达上调，参与Hippo信号通路和Wnt信号通路的调节机制和生物功能能够揭示出治疗干预糖尿病男性生殖力的潜在靶点。精子生成是一个复杂和高度调节的过程lncRNAs调节精子生成的作用还未被完全了解。芯片数据能够提供更多参与糖尿病男性生殖力lncRNAs的预测和注释的相关信息。对于研究糖尿病男性生殖力，在增加诊断潜力方面lncRNAs能够成为具有吸引力的生物标记物。在本研究中，我们构建2型糖尿病组和与非2型糖尿病组(对照组)血液中lncRNAs及mRNAs的表达谱，发现2型糖尿病患者外周血中有68条lncRNAs差异表达，上调的lncRNAs有44条，上调倍数最大的是ENST00000381108.3，上调倍数为3.85；下调的lncRNAs有24条，下调倍数最大的是RNA147244，下调倍数为3.45。其中lncRNAs中差异表达的Intergenic有37条，差异表达的Antisense有18条，差异表达的Sense有2条，差异表达的Intronic有1条。2型糖尿病患者外周血中有74条mRNAs差异表达，上调的mRNAs有56条，上调倍数最大的是Q59H50，上调倍数为3.25；下调的mRNAs有18条，下调倍数最大的是GSTM4，下调倍数为5.40。利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、BioCyc、PANTHER和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。在KEGG信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括突触小泡周期通路、卵巢类固醇生成通路、癌症的microRNA通路、细胞色素P450介导的异生素代谢通路、化学致癌作用通路等。在BioCyc信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括视黄酸生物合成Ⅱ通路、视黄酸生物合成Ⅰ通路、褪黑激素降解Ⅰ通路、褪黑素降解的超级途径通路、胆汁酸生物合成的神经途径通路等。在PANTHER信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括维生素D的代谢通路、异三聚体G蛋白信号通路Gqα和Goα介导途径的通路、异三聚体G蛋白信号通路Giα和Gsα介导途径通路、突触小泡运输通路、离子型谷氨酸受体通路等。在Reactome信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括运输含有GluR2的AMPA受体通路、内源性甾醇通路、生物氧化通路、运输AMPA受体通路、谷氨酸结合通路等。利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在KEGG、FunDO、NHGRI和OMIM人类疾病数据库中进行疾病注释富集分析。在KEGG人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括Keutel综合征、遗传性混合性息肉病综合征、其他体液免疫缺陷疾病、脑脓肿黄瘤症、色素性视网膜炎(RP)等。在FunDO人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括癌症、曼氏血吸虫感染、肿瘤转移、牙槽骨损失、静脉75 新疆医科大学博士学位论文曲张等。在NHGRI人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括海马萎缩、戒烟、自雇、腹主动脉瘤、经济和政治偏好(环保主义)等。在OMIM人类疾病数据库中，显著富集的疾病包括先天性，青少年或成人发病的青光眼和原发性开角、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、遗传性混合型的息肉病综合征等。利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在生物过程biologicalprocess、细胞组件cellularcomponent和分子功能molecularfunction三个本体论中进行GeneOntology功能注释富集分析。在生物过程中，显著富集的GeneOntology功能包括可见光的检测、检测光的刺激、骨矿化的调节、生物矿物组织发育的调节、解剖结构排列等。在细胞组件中，显著富集的GeneOntology功能包括内吞囊泡膜、细胞质小泡膜、囊泡膜、神经元投影、神经元的一部分、内吞小泡等。在分子功能中，显著富集的GeneOntology功能包括脂蛋白转运蛋白活性、胆固醇羟化酶活性、胆甾烷三醇单加氧酶活性、微管蛋白-谷氨酸连接酶活性、骨的结构成分等。GeneOntology二级条目频率图展示了在差异基因背景和全部基因背景下GeneOntology数据库中细胞组件、分子功能和生物过程三个本体论功能的基因富集的情况。在生物过程的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞成分组织或生物发生、代谢过程、多生物过程、生殖、生长等。在细胞组件的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞器、大分子复合物、细胞、细胞外区域部分、膜封闭的管腔等。在分子功能的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括分子转导活性、催化活性、酶调节剂活性、蛋白质结合转录因子活性、分子功能调节剂等。分别选取GeneOntology三个本体论中前20个显著富集点的GO节点以及这些节点的所有父节点绘制而成的GO功能层次网络图。在生物过程的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括生长发育过程、多细胞生物过程、代谢过程、单一生物过程、细胞成分组织或生物发生等。在细胞组件的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括细胞质、细胞器、细胞质组分、细胞内的细胞器、囊等。在分子功能的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括催化活性、氧化还原酶活性、单加氧酶活性、合并或减少分子氧、合并氧原子等。挑选2型糖尿病组和对照组样本共表达结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。在lncRNA与mRNA共表达筛选结果的基础上，顺式预测寻找基因组位置在10kb之内的lncRNA-mRNA对。反式预测利用blat工具对lncRNA和mRNA(3UTR)序列进行比对，筛选序列相似的lncRNA-mRNA对。LncRNAXR_108954.2的mRNA靶基因为E2F2，lncRNAENST00000453636.1的mRNA靶基因为A_19_P00316911，lncRNATCONS_00026848的mRNA靶基因为A_21_P0009673。利用KOBAS对靶基因mRNAs分别在KEGG和Reactome信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析。在KEGG信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括膀胱癌通路、非小细胞76 新疆医科大学博士学位论文肺癌通路、胶质瘤通路、胰腺癌通路、黑色素瘤通路等。在Reactome信号通路数据库中，显著富集的信号通路包括CDC6与ORC的关联通路、许可因素与预复制复合体的关联通路、癌基因诱导的衰老通路、G1阶段通路、与G1期相关的CyclinD通路等。转录因子预测(TFs_predict)利用Match-1.0Public转录因子预测工具进行预测，挑选上述转录因子预测结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。3.8展望血糖代谢是哺乳动物重要的生物化学过程，血糖代谢在不同的组织和器官中发生复杂的调节过程，包括肠内的糖吸收，胰腺的胰岛素分泌，肝脏的葡萄糖产出，脂肪，肌肉和其他组织的糖摄取。这些过程的失调直接或者间接与糖尿病的发生密[127,128][129]切相关。LncRNAs作为重要的调节因子控制代谢组织的发展和功能。然而，lncRNAs在糖代谢中的作用这一领域仍然处于研究的初期，需要更进一步研究：⑴lncRNAs是如何被营养物质和葡萄糖和胰岛素在内的激素调节的？lncRNAs是否被肝脏中关键的转录因子，例如SREBPs，FOXOs和CREB进行调节？⑵如何预测具有调节性质的lncRNAs功能？lncRNAs是否直接参与糖代谢的关键步骤，例如胰岛素分泌，肝糖原的产生，肌肉和癌细胞的糖酵解和整个身体的胰岛素敏感性？⑶lncRNAs是如何调节人体和小鼠的糖尿病个体？表达失调的lncRNAs是否具有治疗疾病的潜力？与传统的损失和获得性功能策略比较，新颖的操作RNA表达水平的技术出现。在细胞和动物中，CRISPR/Cas9系统能够提供灵活控制RNA转录率。运[130]用新系统的功能研究能够改善功能性lncRNAs在糖代谢中的探索发现。另外一个关于研究lncRNAs生物学的问题，我们是应该关注生物特异性的lncRNAs还是物种的保守lncRNAs？物种中以测序同源性为基础的lncRNAs保守性较低，在动物模型[131]研究中的发现可能并不适用于人体研究。事实上，研究者们希望发现的lncRNAs[132]能够在不同的物种中高度保守，表明在进化过程中lncRNAs具有重要的功能。在最近的研究中发现lncRNAs通过影响基因的表达决定生物体独特的表型特点和细胞的功能。因此，人体特异性lncRNAs应当成为2型糖尿病识别和发展的全新标记物，作为治疗2型糖尿病的治疗靶点。4小结4.1采用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4芯片，对2型糖尿病患者和非2型糖尿病患者的外周血进行lncRNAs和mRNAs表达分析，2型糖尿病患者外周血中有68条lncRNAs差异表达，上调的lncRNAs有44条，下调的lncRNAs有24条。2型糖尿病患者外周血中有74条mRNAs差异表达，上调的mRNAs有56条，下调的mRNAs有18条。77 新疆医科大学博士学位论文4.2利用KOBAS对表达异常的mRNAs在KEGG信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析，显著富集的信号通路包括突触小泡周期通路、卵巢类固醇生成通路、癌症的microRNA通路、细胞色素P450介导的异生素代谢通路和化学致癌作用通路等。利用KOBAS对表达异常的mRNAs在KEGG人类疾病数据库中进行疾病注释富集分析，显著富集的疾病包括Keutel综合征、遗传性混合性息肉病综合征、其他体液免疫缺陷疾病、脑脓肿黄瘤症和色素性视网膜炎(RP)等。利用KOBAS对表达异常的mRNAs分别在生物过程、细胞组件和分子功能三个本体论中进行GeneOntology功能注释富集分析。在生物过程中，显著富集的GeneOntology功能包括可见光的检测、检测光的刺激、骨矿化的调节、生物矿物组织发育的调节和解剖结构排列等。在细胞组件中，显著富集的GeneOntology功能包括内吞囊泡膜、细胞质小泡膜、囊泡膜、神经元投影和神经元的一部分等。在分子功能中，显著富集的GeneOntology功能包括脂蛋白转运蛋白活性、胆固醇羟化酶活性、胆甾烷三醇单加氧酶活性、微管蛋白-谷氨酸连接酶活性和骨的结构成分等。在生物过程的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞成分组织或生物发生、代谢过程、多生物过程、生殖和生长。在细胞组件的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括细胞器、大分子复合物、细胞、细胞外区域部分和膜封闭的管腔等。在分子功能的二级条目频率图，差异基因富集与全部基因富集具有不同趋势的项目包括分子转导活性、催化活性、酶调节剂活性、蛋白质结合转录因子活性和分子功能调节剂等。在生物过程的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括生长发育过程、多细胞生物过程、代谢过程、单一生物过程和细胞成分组织或生物发生等。在细胞组件的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括细胞质、细胞器、细胞质组分、细胞内的细胞器和囊等。在分子功能的层次网络图中，主要的GeneOntology功能包括催化活性、氧化还原酶活性、单加氧酶活性、合并或减少分子氧和合并氧原子等。4.3挑选2型糖尿病组和对照组样本共表达结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。LncRNAXR_108954.2的mRNA靶基因为E2F2，lncRNAENST00000453636.1的mRNA靶基因为A_19_P00316911，lncRNATCONS_00026848的mRNA靶基因为A_21_P0009673。利用KOBAS对靶基因mRNAs在KEGG信号通路数据库中进行信号通路注释富集分析，显著富集的信号通路包括膀胱癌通路、非小细胞肺癌通路、胶质瘤通路、胰腺癌通路和黑色素瘤通路等。挑选转录因子预测结果中关联度最大的前1000个关系对，用Cytoscape软件绘制其网络图。78 新疆医科大学博士学位论文第二部分长链非编码RNAMEG3、MALAT1和MIAT在2型糖尿病患者外周血中的表达及临床意义在全世界范围内，虽然治疗糖尿病取得了巨大的进步，糖尿病引起的发病率和死亡率仍然很高。鼓舞人心的是众多的研究表明通过对血压、血糖和心血管风险等因素控制和及时的干预从而达到对糖尿病的早期发现，能够改善糖尿病患者的治疗[133,134]效率。因此，通过发现全新的分子标志物和药物靶点预防和治疗糖尿病刻不容[135]缓，随着新一代测序技术的应用，lncRNAs在糖尿病及其并发症进展中表达的改变是普遍存在的。由于独特的结构，lncRNAs在疾病、组织、细胞和发展阶段的特[136]异方式是更加稳定的。同时，与蛋白相比提取和发现的lncRNAs具有更高的特异性。通过荧光定量PCR和原位杂交发现lncRNAs比通过抗原抗体反应发现蛋白更具[137]有特异性和敏感性。相对于小数量的miRNAs，从成千上万种的lncRNAs筛选出敏感和特异的分子标志物可能性更大。最近大量的研究表明在正常和糖尿病动物模型中lncRNAs的表达不同。因此，[138]对于糖尿病的诊断和预后lncRNAs可以作为全新的潜在生物标记物。研究表明，GAS5可以作为预后生物标志物，受试者工作特征(ROC)曲线的分析揭示出GAS5表达是一种稳定的候选基因能够区别糖尿病和非糖尿病的血清样本，荧光定量PCR结果显示lncRNAGAS5<10ng/μl发生糖尿病的可能性更高(OddsRatio[OR]=11.79(95%CI：3.97-37.26)，P<0.001)。ROC分析诊断糖尿病和非糖尿病的曲线下面积AUC=0.81，敏感度为85.1%，灵敏度为67.3%，阳性预测值为71.4%。总之，lncRNAs可能成为有希望的分子生物标记物和未来药物的全新靶点。LncRNAs作为全新的生物标记物受到了越来越多的关注。由于lncRNAs重要的功能，是继siRNAs[139]和miRNAs之后另一个重要的研究领域。我们相信进一步研究lncRNAs的特点和功能将会在预防和治疗糖尿病中具有更大的价值。总之，越来越多的研究表明lncRNAs通过形成复杂的调控网络与糖尿病及其并发症的进展密切相关，例如胰腺β细胞的紊乱、胰岛素抵抗和表观遗传学调节等。LncRNAs作为全新的调节生物标记物，在表观遗传学、转录和转录后水平通过调节相关基因的表达参与糖尿病的多重步骤。依据糖尿病相关lncRNAs的作用和特征、我们可以通过外源性途径(基因敲除、RNA干扰和基因补充)沉默或者激活糖尿病患者体内的lncRNAs，从而预防和治疗糖尿病。虽然在过去的三十年发现了lncRNAs许多重要的生物学功能，但对绝大多数的lncRNAs还没有进行了解，确定、描述和阐明lncRNAs在糖尿病分子水平发病机制中的作用以及运用lncRNAs作为临床实践79 新疆医科大学博士学位论文和治疗干预还需要很多的努力。当前，研究lncRNAs面临两种重要的挑战。在一方面，在人体组织或细胞中通过RNA测序继续确定lncRNAs是否具有功能。此外，需要探索功能性lncRNAs确定其是否特异性的与一种或多种疾病相关，以及通过何种分子机制。当前，我们对lncRNAs的了解只是冰山一角，全新的方法以及技术手段将会揭开lncRNAs神秘的面纱，从而对干预、早期诊断和治疗糖尿病提供全新的治疗策略。第一部分，我们在5例2型糖尿病病患者和5例非2型糖尿病患者外周血中通过釆用CapitalBioTechnologyHumanLncRNAArrayv4芯片技术确定2型糖尿病中差异表达的lncRNAs和mRNAs，提示lncRNAs可以作为2型糖尿病发生、预后及治疗的全新研究靶点。本部分我们在2型糖尿病lncRNAs差异表达谱中，筛选出差异倍数FC(abs)在2.0倍以上并且P≤0.01的lncRNAs，最终在查阅文献的基础上选取MEG3、MALAT1和MIAT进行荧光定量PCR进行验证。在200例2型糖尿病病患者和200例非2型糖尿病患者外周血中对MEG3、MALAT1和MIAT的表达情况进行检测，并分析其表达水平与临床指标之间的联系，以探讨其临床意义和可能的作用机制。运用受试者工作特征(ROC)曲线分析，对MEG3、MALAT1和MIAT作为早期诊断2型糖尿病生物标志物的可行性及价值进行初步探讨。1研究内容与方法1.1研究对象选取2016年10月至2017年2月在新疆医科大学第一临床附属医院入院进行就诊的汉族2型糖尿病患者作为2型糖尿病组，共200例，其中男性144例、女性56例，平均年龄(54.56±9.63)岁。纳入标准：依据2007年中国糖尿病防治指南公布的2型糖尿病诊断标准：空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2h血糖≥11.1mmol/L或既往有确切糖尿病病史、正在使用降糖药物或胰岛素者。排除标准：⑴其他特殊类型糖尿病。⑵恶性肿瘤。⑶慢性炎症等相关疾病。⑷严重的心肝肺肾等疾病。⑸自身免疫性疾病。选择同期在该院进行就诊的汉族非2型糖尿病患者作为对照组，共200例，其中男性100例、女性100例，平均年龄(47.96±10.39)岁。纳入标准：空腹血浆葡萄糖<6.1mmol/L和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2h血糖<7.8mmol/L。排除标准：⑴既往诊断为2型糖尿病。⑵合并其他内分泌疾病。⑶恶性肿瘤。⑷急、慢性感染及严重传染性疾病患者。⑸严重的心肝肺肾等疾病。⑹自身免疫性疾病。所有研究对象均为无血缘关系并且在新疆地区长久居住的常住人口，排除了由于环境差异而引起的基因变异。本研究方案经新疆医科大学一附属医院医学伦理委员会批准，研究对象均自愿签署书面知情同意书。80 新疆医科大学博士学位论文1.2主要试剂及实验设备1.2.1主要试剂1.2.1.1全血总RNA提取的相关试剂⑴TRIzolReagent⑵氯仿⑶异丙醇⑷75%乙醇⑸RNasefreeddH2O⑹TBEBuffer⑺溴化乙淀(EB)溶液1.2.1.2RNA逆转录合成cDNA的相关试剂(Thermo公司)⑴Oligo(dT)18引物⑵5×ReactionBuffer⑶RiboLockRNaseInhibitor⑷dNTPMix⑸RevertAidM-MuLVRT⑹无核酸酶的高纯水1.2.1.3实时荧光定量PCR相关的试剂(Takara公司)TM⑴SYBR®PremixExTaqⅡ⑵PCRForwardPrimer⑶PCRReversePrimer⑷ROXReferenceDye⑸RNasefreeddH2O1.2.2主要实验设备⑴4℃低温冰箱(海尔公司)⑵-20℃低温冰箱(Thermo公司)⑶-80℃低温冰箱(Thermo公司)⑷立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)⑸高速冷冻离心机(Thermo公司)⑹凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)⑺电泳仪(上海复日科技有限公司)⑻制冰机(SANYO公司)⑼反转录仪(Thermo公司)⑽实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems公司)⑾NanoDrop(Thermo公司)81 新疆医科大学博士学位论文⑿微量移液器(Eppendorf公司)⒀离心管(AxyGen公司)⒁旋涡混合器(上海奇特分析有限责任公司)⒂鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)⒃生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)⒄微波炉(Galanz公司)1.3方法1.3.1临床资料收集体格检查(身高、体重、腰围、臀围和血压)等由专业的人员进行测量，同时对研究对象进行面对面的询问调查，调查内容包括年龄、性别、既往史及生活习惯等。1.3.2血生化指标的测定对研究对象清晨空腹抽取静脉血，检测包括空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素(BUN)等生化指标。生化指标均由新疆医科大学第一临床附属医院检验中心统一测定。1.3.3全血总RNA的提取和质检⑴取新鲜抗凝血3-5ml，加入3倍体积的Trizol试剂，充分震荡混匀。⑵每使用1mlTrizol试剂加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置5分钟。⑶以4℃，12000×g离心15分钟，样品分为黄色的有机相、中间相以及上层的无色水相，RNA主要在无色水相中，吸取上层的无色水相，移入到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置30分钟。⑷以4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液，在离心管底部发现白色的RNA沉淀。⑸加入75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，值得注意的是每使用1mlTrizol试剂需要加入1ml75%乙醇。⑹以4℃，2300×g离心5分钟，弃洗涤液。⑺室温放置干燥RNA沉淀3-5分钟，加入30-100μL的RNasefreeddH2O，反复吹打混匀RNA沉淀。⑻采用紫外分光光度计进行定量，确保所用样本RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，采用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，确保RNA完整无降解。1.3.4RNA逆转录合成cDNA⑴在解冻以后，将试剂盒中的各个组分混匀并短暂的离心，离心后静置于冰上。在置于冰上的无菌无核酸酶的离心管中，按以下顺序加入反应物：①0.1ng-5μg的模板RNA。②1μL的Oligo(dT)18引物。③加入无核酸酶的高纯水至总体为12μL。⑵如果RNA模板GC含量丰富或者包含二级结构，轻轻混匀，短暂离心后65℃孵育5分钟，静置于冰上冷却，短暂离心后再静置于冰上冷却。⑶按以下顺序加入反应物至12μL的反应体系中使总体积为20μL：①4μL的5×ReactionBuffer。②1μL的82 新疆医科大学博士学位论文RiboLockRNaseInhibitor(20U/μL)。③2μL的10mMdNTPMix。④1μL的RevertAidM-MuLVRT(200U/μL)。⑷轻轻混匀后短暂离心。⑸对于Oligo(dT)18或基因特异性引物cDNA合成，在42℃孵育60分钟。值得注意的是对于GC含量丰富的RNA模板反应温度增加至45℃。⑹通过70℃加热5分钟终止反应。逆转录反应产物直接用于PCR反应或储存于-20℃保存时间小于一周，若要长期保存，推荐-70℃保存。1.3.5实时荧光定量PCR反应TM⑴使用Takara公司的SYBR®PremixExTaqⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。LncRNA基因MEG3、MALAT1和MIAT以及内参基因β-actin的引物由上海生工生物有限公司合成(表2-1)，引物长度为18-29bp，扩增产物在250-350bp之间，引物设计跨内含子区域，退火温度为57℃至70℃。⑵实时荧光定量PCR反应TM体系为20μL，包括10μL的SYBR®PremixExTaqⅡ(2×)，0.8μL的PCRForwardPrimer(10uM)，0.8μL的PCRReversePrimer(10uM)，0.4μL的ROXReferenceDye(50×)，2μL的cDNA，6μL的RNasefreeddH2O。⑶实时荧光定量PCR反应条件为95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火30秒，扩增45个循环，延伸72-△△CT℃45秒。⑷实时荧光定量PCR的数据分析采用2法，CT值代表每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。所有样本都是以内参基因β-actin标准化后计算样品目的基因的相对表达量，每个样本检测3个复孔，计算3次重复试验的CT平均值作为该样本的实际CT值，将每个样本目的基因CT值减去其内参基因CT值即为每个样本△CT值，每个样本的△CT值减去对照组所有样本△CT的平-△△CT均值即为每个样本△△CT值，最后求得每个样本的2值即为目的基因的相对表达量。表2-1目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR引物序列Table2-1Sequenceofreal-timequantitativePCRPrimersforthetargetgeneandreferencegene基因引物序列F:5'-CATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3'MEG3R:5'-GTCCTCTTCATCCTTTGCCATCC-3'F:5'-GTGATGCGAGTTGTTCTCCG-3'MALAT1R:5'-CTGGCTGCCTCAATGCCTAC-3'F:5'-TCTCTGGTGCTTCCCTCCTT-3'MIATR:5'-GATCTAAGCTTGAGCCCCCA-3'F:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'β-actinR:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'83 新疆医科大学博士学位论文1.4质量控制1.4.1资料收集阶段⑴所有调查人员采用统一的标准、方法和技巧，对研究对象进行体格检查和询问调查。⑵研究对象的血液标本均在清晨空腹时进行采集。1.4.2实验阶段⑴血液标本在收集完成后立即进行离心、分装和冻存，遵守无菌原则，避免污染和溶血的发生。⑵血液标本以每个研究对象为单位进行冻存，样本编号严格，避免样本的混淆，每周对样本库进行整理。⑶生化指标由新疆医科大学第一附属医院检验中心的专业技术人员进行检测，从实验原理和注意事项对专业技术员进行了严格的培训。⑷RNA提取的实验操作严格按照实验步骤进行，提取完成后对RNA样本进行纯度和浓度的检测，并采用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，对于不符合标准的RNA样本进行剔除。⑸实验过程中对试管和枪头等耗材进行高压灭菌处理，避免污染。1.4.3数据录入阶段采用EpiData3.02软件建立数据库，采用双录入对数据进行录入，对收集的资料和实验数据进行复查和核对，严格把控数据的质量，保证数据的真实性和可靠性。1.5统计学方法应用SPSS17.0软件包对数据进行处理，计量资料以xs表示，两组间计量资料比较方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t’检验；实时荧光定量PCR的数据分析△△CT采用2-法，△CT=目的基因CT值－内参基因CT值，△△CT=2型糖尿病组△CT值－对照组△CT值；采用Pearson相关分析lncRNA基因表达量与临床指标之间的相关性；根据lncRNA基因的相对表达量绘制受试者工作特征(ROC)曲线，通过ROC曲线及曲线下的面积评价外周血MEG3、MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病诊断价值，判断其能否作为诊断2型糖尿病的循环标记物；采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1T2DM组与对照组临床指标的比较本研究共收集汉族研究对象400例，2型糖尿病组200例，其中男性144例(72.00%)、女性56例(28.00%)，对照组200例，其中男性100例(50.00%)、女性100例(50.00%)。2型糖尿病组和对照组间一般临床指标比较，结果显示：在全体人群中，2型糖尿病组的年龄、体重、收缩压、舒张压、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均高于对照组，HDL水平低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；2型糖尿病组的尿酸、尿素、肌酐水平与对照组间的差异没有统计学意义(P>0.05)。84 新疆医科大学博士学位论文在男性中，2型糖尿病组的年龄、体重、收缩压、舒张压、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均高于对照组，HDL水平低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；2型糖尿病组的尿酸、尿素、肌酐水平与对照组间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，2型糖尿病组的年龄、体重、收缩压、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均高于对照组，HDL水平低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；2型糖尿病组的舒张压、尿酸、尿素、肌酐水平与对照组间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-2。表2-2T2DM组与对照组临床指标的比较(xs)Table2-2Clinicalcharacteristicsbetweenthetwogroups(xs)组别指标T2DM组对照组tP全体例数200200*年龄(岁)54.56±9.6347.96±10.396.578<0.001*体重(kg)73.92±11.2067.03±1.085.922<0.001*收缩压(mmHg)127.42±17.50117.17±14.336.188<0.001*舒张压(mmHg)78.93±11.6474.74±10.383.673<0.001尿酸(μmol/L)298.88±89.38285.39±62.101.7530.080*血糖(mmol/L)9.23±2.764.90±0.4921.756<0.001*甘油三酯(mmol/L)2.16±2.001.10±0.347.366<0.001*总胆固醇(mmol/L)4.39±1.063.94±0.615.188<0.001*高密度脂蛋白(mmol/L)1.05±0.341.21±0.235.389<0.001*低密度脂蛋白(mmol/L)2.79±0.842.48±0.514.398<0.001尿素(mmol/L)5.39±1.485.13±1.441.7810.076肌酐(μmol/L)63.66±15.8861.36±12.691.5940.112男性例数144100*年龄(岁)52.85±9.3049.00±0.373.0310.003*体重(kg)77.50±10.2973.10±10.783.0570.003*收缩压(mmHg)126.80±17.70119.48±14.163.3000.001*舒张压(mmHg)80.19±11.7876.69±10.582.2910.023尿酸(μmol/L)319.48±86.16316.36±59.160.3140.754*血糖(mmol/L)9.07±2.464.90±0.4816.659<0.001*甘油三酯(mmol/L)2.33±2.251.16±0.365.127<0.001*总胆固醇(mmol/L)4.38±1.093.92±0.583.870<0.00185 新疆医科大学博士学位论文组别指标T2DM组对照组tP*高密度脂蛋白(mmol/L)1.00±0.311.14±0.243.742<0.001*低密度脂蛋白(mmol/L)2.79±0.822.50±0.473.1890.002尿素(mmol/L)5.62±1.525.53±1.510.4220.673肌酐(μmol/L)67.21±15.4268.18±2.360.5190.604女性例数56100*年龄(岁)58.95±9.1446.93±10.367.421<0.001*体重(kg)64.40±7.2961.23±7.802.3960.018*收缩压(mmHg)129.04±17.01114.85±14.215.417<0.001舒张压(mmHg)75.70±10.7072.80±9.871.6670.098尿酸(μmol/L)246.29±75.29254.41±48.110.8210.413*血糖(mmol/L)9.64±3.424.91±0.5013.620<0.001*甘油三酯(mmol/L)1.73±1.111.03±0.315.885<0.001*总胆固醇(mmol/L)4.42±1.013.96±0.643.4400.001*高密度脂蛋白(mmol/L)1.18±0.381.28±0.192.0790.039*低密度脂蛋白(mmol/L)2.78±0.902.46±0.552.7630.006尿素(mmol/L)4.82±1.204.74±1.260.4120.681肌酐(μmol/L)54.60±13.3254.62±8.860.0120.990注：*P<0.05。2.2RNA的纯度及浓度的检测所有用于实时荧光定量PCR实验的样本，对提取的总RNA进行核酸分析仪及1%琼脂糖电泳检测。核酸分析仪检测结果显示：所用样本RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，表明RNA的纯度符合质量标准；琼脂糖电泳检测结果显示：18S和28S两条带明亮、分离清晰、无拖带和扩散现象，条带均完整且28S条带亮度是18S条带亮度的两倍以上，表明RNA完整无降解，具体结果见图2-1。图2-1RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.2-1RNAagarosegelelectrophoresis86 新疆医科大学博士学位论文2.3溶解曲线和扩增曲线结果分析所有进行实时荧光定量PCR实验基因的融解曲线呈单峰，无其它杂峰，表明引物特异性良好，扩增产物具有特异性，无其它非特异性扩增产物，重复性很好，反应体系稳定，定量准确；扩增曲线的CT值均在正常范围内，表明数据真实可靠，具体结果见图2-2。图2-2MEG3、MALAT1、MIAT和β-actin基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.2-2AmplificationplotandmeltcurveplotofMEG3,MALAT1,MIATandβ-actingene2.4T2DM组与对照组中MEG3、MALAT1、MIAT的表达水平我们选择2型糖尿病患(200例)和对照组人群(200例)，提取外周血细胞中RNA，逆转录成cDNA后，再进行实时荧光定量PCR实验，以β-action基因作为内参，采-△△CT用2相对定量法，通过t检验分析2型糖尿病组和对照组中MEG3、MALAT1、MIAT的表达差异。结果显示：2型糖尿病组MEG3基因的表达量为1.31±0.10，对照组MEG3基因的表达量为4.98±0.58，与对照组MEG3基因的表达量相比，2型糖尿病组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。2型糖尿病组MALAT1基因的表达量为1.57±0.28，对照组MALAT1基因的表达量为1.21±0.26，与对照组MALAT1基因的表达量相比，2型糖尿病组MALAT1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。2型糖尿病组MIAT基因的表达量为2.07±0.38，对照组MIAT基因的表达量为1.44±0.27，与对照组MIAT基因的表达量相比，2型糖尿病组MIAT基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)，具体结果见图2-3和表2-3。87 新疆医科大学博士学位论文图2-3MEG3、MALAT1和MIAT基因在2型糖尿病组和对照组的表达水平Fig.2-3ExpressionlevelofMEG3,MALAT1andMIATinT2DMgroupandcontrolgroup表2-3T2DM组与对照组MEG3、MALAT1、MIAT基因的相对表达水平(xs)Table2-3TheexpressionlevelsofMEG3,MALAT1andMIATbetweenthetwogroups(xs)lncRNAT2DM组对照组tP*MEG31.31±0.104.98±0.5820.760<0.001*MALAT11.57±0.281.21±0.264.491<0.001*MIAT2.07±0.381.44±0.276.055<0.001*注：P<0.001。2.5MEG3、MALAT1、MIAT基因的表达水平与临床指标之间的关系2.5.1MEG3基因的表达水平与临床指标之间的关系2.5.1.1MEG3基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的关系以MEG3基因在2型糖尿病组表达的中位数1.28作为分界点，将2型糖尿病患者MEG3基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MEG3高表达组血糖水平为8.86±0.53mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为9.31±0.58mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MEG3高表达组血糖水平为8.83±0.57mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为9.25±0.58mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度88 新疆医科大学博士学位论文脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-4。表2-4T2DM组MEG3不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-4ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMEG3inT2DMgroup(xs)T2DM组组别指标tPMEG3高表达组MEG3低表达组全体例数9998年龄(岁)5.49±9.9953.22±9.841.6740.096体重(kg)73.36±10.9574.72±11.500.8360.404收缩压(mmHg)127.34±17.61127.60±17.410.1040.918舒张压(mmHg)78.26±11.5679.91±11.680.9940.322尿酸(μmol/L)305.93±84.46296.22±98.920.7410.460*血糖(mmol/L)8.86±0.539.31±0.582.9910.004甘油三酯(mmol/L)2.03±1.952.29±2.090.8780.381总胆固醇(mmol/L)4.39±1.104.42±1.020.2250.822高密度脂蛋白(mmol/L)1.06±0.351.05±0.330.2650.791低密度脂蛋白(mmol/L)2.81±0.912.78±0.760.2480.805尿素(mmol/L)5.36±1.405.47±1.560.5280.598肌酐(μmol/L)64.47±15.8864.75±20.460.1080.914男性例数7370年龄(岁)53.67±9.2151.84±9.351.1780.241体重(kg)76.72±10.2678.33±10.340.9270.355收缩压(mmHg)125.90±17.72128.07±17.640.7330.465舒张压(mmHg)79.05±11.5981.56±11.911.2730.205尿酸(μmol/L)322.87±84.86321.88±92.480.0670.947*血糖(mmol/L)8.84±0.569.25±0.582.3720.022甘油三酯(mmol/L)2.17±2.222.49±2.300.8470.398总胆固醇(mmol/L)4.35±1.144.44±1.020.4460.656高密度脂蛋白(mmol/L)1.01±0.301.01±0.310.0300.976低密度脂蛋白(mmol/L)2.79±0.932.79±0.690.0090.99289 新疆医科大学博士学位论文T2DM组组别指标tPMEG3高表达组MEG3低表达组尿素(mmol/L)5.50±1.445.76±1.611.0020.318肌酐(μmol/L)67.89±14.8268.52±21.990.2020.840女性例数2628年龄(岁)60.62±7.1156.68±10.331.1620.111体重(kg)63.92±6.4664.88±8.410.4570.650收缩压(mmHg)131.38±16.96126.43±17.081.0690.290舒张压(mmHg)76.04±11.4075.79±10.150.0860.932尿酸(μmol/L)258.36±63.50232.09±85.581.2730.209血糖(mmol/L)9.72±3.919.75±3.010.0360.972甘油三酯(mmol/L)1.64±0.721.77±1.370.4300.669总胆固醇(mmol/L)4.47±1.014.38±1.020.3330.740高密度脂蛋白(mmol/L)1.22±0.431.16±0.340.5460.587低密度脂蛋白(mmol/L)2.85±0.872.74±0.930.4550.651尿素(mmol/L)4.96±1.244.76±1.200.6100.544肌酐(μmol/L)54.84±15.0355.30±11.780.1260.900*注：P<0.05。2.5.1.2MEG3基因的表达水平与对照组临床指标之间的关系以MEG3基因在对照组表达的中位数4.87作为分界点，将对照组人群MEG3基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MEG3高表达组血糖水平为4.80±0.49mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为5.00±0.49mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MEG3高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MEG3低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-5。90 新疆医科大学博士学位论文表2-5对照组MEG3不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-5ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMEG3incontrolgroup(xs)对照组组别指标tPMEG3高表达组MEG3低表达组全体例数9899年龄(岁)48.89±10.4046.61±10.111.5620.120体重(kg)66.22±10.6969.51±16.741.5670.119收缩压(mmHg)117.21±14.96117.38±13.200.0810.936舒张压(mmHg)74.07±10.1175.86±10.261.1600.248尿酸(μmol/L)287.32±60.82282.08±62.880.5950.553血糖(mmol/L)4.86±0.554.97±0.491.4490.149甘油三酯(mmol/L)1.10±0.291.14±5.450.6460.519总胆固醇(mmol/L)3.93±0.543.96±0.670.3090.758高密度脂蛋白(mmol/L)1.22±0.221.20±0.240.3880.699低密度脂蛋白(mmol/L)2.47±0.472.50±0.590.3380.736尿素(mmol/L)9.75±3.388.21±3.050.3370.736肌酐(μmol/L)59.90±12.2963.17±14.021.7410.083男性例数4849年龄(岁)49.40±9.8647.78±10.560.7800.437体重(kg)72.10±10.5777.53±19.791.6210.109收缩压(mmHg)118.50±14.97121.33±12.090.9550.342舒张压(mmHg)75.50±9.7378.85±10.411.5460.126尿酸(μmol/L)317.39±55.57314.46±62.390.2440.807血糖(mmol/L)4.93±0.614.94±0.500.1020.919甘油三酯(mmol/L)1.15±0.271.25±0.690.9760.332总胆固醇(mmol/L)3.90±0.553.94±0.630.3110.756高密度脂蛋白(mmol/L)1.14±0.241.14±0.250.0530.958低密度脂蛋白(mmol/L)2.51±0.472.51±0.550.0500.960尿素(mmol/L)5.09±4.805.44±1.401.4070.163肌酐(μmol/L)66.76±11.2870.55±14.851.4130.16191 新疆医科大学博士学位论文对照组组别指标tPMEG3高表达组MEG3低表达组女性例数5050年龄(岁)48.40±10.9645.46±9.621.4260.157体重(kg)60.69±7.9161.89±7.710.7160.476收缩压(mmHg)115.94±15.01113.52±13.240.7960.428舒张压(mmHg)72.95±9.3472.67±10.370.1310.896尿酸(μmol/L)258.46±51.23250.36±44.930.8410.402*血糖(mmol/L)4.81±0.495.01±0.492.0480.043甘油三酯(mmol/L)1.05±0.301.02±0.320.3780.706总胆固醇(mmol/L)3.96±0.543.97±0.720.1360.892高密度脂蛋白(mmol/L)1.29±0.171.26±0.220.6750.501低密度脂蛋白(mmol/L)2.44±0.472.49±0.630.4940.622尿素(mmol/L)4.63±1.115.92±2.941.0360.303肌酐(μmol/L)53.30±9.2955.93±8.291.4900.139*注：P<0.05。2.5.2MALAT1基因的表达水平与临床指标之间的关系2.5.2.1MALAT1基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的关系以MALAT1基因在2型糖尿病组表达的中位数1.57作为分界点，将2型糖尿病患者MALAT1基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MALAT1高表达组血糖水平为8.88±0.38mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为8.22±0.42mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MALAT1高表达组血糖水平为9.00±0.47mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为8.00±0.52mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MALAT1高表达组血糖水平为8.86±0.81mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为7.95±0.66mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的92 新疆医科大学博士学位论文年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-6。表2-6T2DM组MALAT1不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-6ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMALAT1inT2DMgroup(xs)T2DM组组别指标tPMALAT1高表达组MALAT1低表达组全体例数9798年龄(岁)55.38±8.9253.63±10.031.2860.200体重(kg)73.59±11.1074.16±11.560.3410.733收缩压(mmHg)128.38±18.60126.33±16.080.8250.410舒张压(mmHg)78.66±11.7378.91±11.200.1510.880尿酸(μmol/L)310.05±89.81292.96±93.261.3030.194*血糖(mmol/L)8.86±0.388.22±0.425.167<0.001甘油三酯(mmol/L)2.16±2.002.19±2.060.0850.932总胆固醇(mmol/L)4.45±1.074.37±1.040.4980.619高密度脂蛋白(mmol/L)1.06±0.351.05±0.340.2010.841低密度脂蛋白(mmol/L)2.84±0.892.76±0.770.6660.506尿素(mmol/L)5.26±1.295.49±1.631.1100.268肌酐(μmol/L)62.60±15.4466.12±21.051.3300.185男性例数7168年龄(岁)53.34±8.6752.06±9.540.8280.409体重(kg)77.07±10.5978.10±10.270.5770.565收缩压(mmHg)126.70±19.06126.63±15.900.0240.981舒张压(mmHg)79.23±11.9580.87±11.100.8390.403尿酸(μmol/L)329.29±89.01317.85±88.280.7610.448*血糖(mmol/L)9.00±0.477.99±0.526.546<0.001甘油三酯(mmol/L)2.34±2.262.37±2.290.0620.951总胆固醇(mmol/L)4.45±1.094.36±1.070.4690.640高密度脂蛋白(mmol/L)1.01±0.301.00±0.330.2170.828低密度脂蛋白(mmol/L)2.84±0.902.77±0.710.5000.618尿素(mmol/L)5.42±1.305.79±1.701.4160.15993 新疆医科大学博士学位论文T2DM组组别指标tPMALAT1高表达组MALAT1低表达组肌酐(μmol/L)66.13±14.2370.58±22.641.3930.166女性例数2630年龄(岁)60.96±1.1657.20±10.361.5560.125体重(kg)64.12±5.6264.67±8.710.2730.786收缩压(mmHg)132.96±16.79125.63±16.731.6320.109舒张压(mmHg)77.12±11.2074.47±10.280.9230.630尿酸(μmol/L)257.52±69.75236.55±79.651.0410.303血糖(mmol/L)8.86±0.817.95±0.662.7410.013*甘油三酯(mmol/L)1.67±0.791.78±1.330.3680.714总胆固醇(mmol/L)4.45±1.054.39±1.000.1910.849高密度脂蛋白(mmol/L)1.20±0.441.17±0.330.2840.778低密度脂蛋白(mmol/L)2.84±0.882.74±0.920.4310.668尿素(mmol/L)4.81±1.174.83±1.260.0560.956肌酐(μmol/L)52.96±14.7356.01±12.050.8510.398*注：P<0.05。2.5.2.2MALAT1基因的表达水平与对照组临床指标之间的关系以MALAT1基因在对照组表达的中位数1.18作为分界点，将对照组人群MALAT1基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MALAT1高表达组血糖水平为5.02±0.49mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为4.77±0.49mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MALAT1高表达组肌酐水平为66.10±11.19μmol/L，MALAT1低表达组肌酐水平为72.19±14.75μmol/L，MALAT1高表达组肌酐水平低于MALAT1低表达组肌酐水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MALAT1高表达组血糖水平为5.00±0.59mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为4.81±0.68mmol/L，MALAT1高表达组血糖94 新疆医科大学博士学位论文水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MALAT1高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MALAT1低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-7。表2-7对照组MALAT1不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-7ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMALAT1incontrolgroup(xs)对照组组别指标tPMALAT1高表达组MALAT1低表达组全体例数9696年龄(岁)47.50±10.5247.99±10.290.3260.745体重(kg)66.52±10.8269.18±16.841.2460.215收缩压(mmHg)118.00±15.56116.30±12.560.7720.441舒张压(mmHg)75.43±10.4774.20±10.030.7790.437尿酸(μmol/L)287.66±59.68283.29±64.950.4850.628*血糖(mmol/L)5.01±0.494.77±0.492.5440.013甘油三酯(mmol/L)1.06±0.281.16±0.551.7260.086总胆固醇(mmol/L)3.91±0.523.95±0.670.4950.621高密度脂蛋白(mmol/L)1.22±0.201.19±0.251.1250.262低密度脂蛋白(mmol/L)2.45±0.482.51±0.580.7000.485尿素(mmol/L)9.89±3.428.33±3.100.3320.740肌酐(μmol/L)60.09±12.2263.38±14.431.7090.089男性例数4946年龄(岁)47.45±10.6450.30±10.131.3380.184体重(kg)72.05±10.2877.71±20.311.6500.103收缩压(mmHg)119.80±15.10120.00±12.200.0670.947舒张压(mmHg)77.12±9.9076.94±10.760.0790.937尿酸(μmol/L)318.50±50.91315.21±67.230.2700.788血糖(mmol/L)4.94±0.514.92±0.610.1390.890甘油三酯(mmol/L)1.11±0.251.30±0.711.7930.076总胆固醇(mmol/L)3.93±0.533.91±0.660.2010.841高密度脂蛋白(mmol/L)1.16±0.231.13±0.260.5580.57895 新疆医科大学博士学位论文对照组组别指标tPMALAT1高表达组MALAT1低表达组低密度脂蛋白(mmol/L)2.54±0.462.49±0.560.4790.633尿素(mmol/L)4.91±4.755.56±1.411.3320.186*肌酐(μmol/L)66.10±11.1972.19±14.752.2750.025女性例数4750年龄(岁)47.55±10.5045.86±10.070.8110.419体重(kg)60.98±8.2661.71±7.460.4320.661收缩压(mmHg)116.13±15.97112.98±12.081.0240.309舒张压(mmHg)73.66±10.8771.72±8.740.9040.369尿酸(μmol/L)255.51±50.80253.92±46.810.1640.873血糖(mmol/L)5.00±0.064.81±0.079.439<0.001*甘油三酯(mmol/L)1.00±0.301.04±0.300.6090.544总胆固醇(mmol/L)3.89±0.513.99±0.690.8670.388高密度脂蛋白(mmol/L)1.30±0.141.24±0.231.3870.169低密度脂蛋白(mmol/L)2.37±0.482.53±0.611.4320.156尿素(mmol/L)4.66±1.165.87±4.290.9900.325肌酐(μmol/L)53.82±9.9455.29±8.030.8030.424*注：P<0.05。2.5.3MIAT基因的表达水平与临床指标之间的关系2.5.3.1MIAT基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的关系以MIAT基因在2型糖尿病组表达的中位数2.02作为分界点，将2型糖尿病患者MIAT基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MIAT高表达组血糖水平为9.69±0.33mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为9.32±0.17mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MIAT高表达组血糖水平为8.76±0.47mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为8.37±0.53mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组舒张压水平为78.24±11.87mmHg，MIAT低表达组舒张压水平为82.14±11.45mmHg，MIAT高表96 新疆医科大学博士学位论文达组舒张压水平低于MIAT低表达组舒张压水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MIAT高表达组血糖水平为9.98±1.31mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为8.61±0.86mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-8。表2-8T2DM组MIAT不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-8ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMIATinT2DMgroup(xs)T2DM组组别指标tPMIAT高表达组MIAT低表达组全体例数100100年龄(岁)55.08±9.1954.03±10.070.7700.442体重(kg)73.39±10.8174.48±11.630.6810.497收缩压(mmHg)126.58±17.26128.27±17.780.6820.496舒张压(mmHg)77.63±11.6580.23±11.551.5850.115尿酸(μmol/L)307.48±88.00293.24±94.891.1000.273*血糖(mmol/L)9.69±0.339.32±0.173.1210.006甘油三酯(mmol/L)2.01±1.401.95±1.250.3280.744总胆固醇(mmol/L)4.44±1.054.34±1.080.6830.496高密度脂蛋白(mmol/L)1.05±0.301.05±0.380.1150.908低密度脂蛋白(mmol/L)2.84±0.872.73±0.810.9540.341尿素(mmol/L)5.26±1.295.52±1.651.2420.216肌酐(μmol/L)61.98±15.1566.64±20.791.8130.071男性例数7272年龄(岁)53.29±9.0952.40±9.550.5720.568体重(kg)76.80±10.3978.22±10.210.8200.414收缩压(mmHg)124.86±17.32128.74±17.991.3170.190*舒张压(mmHg)78.24±11.8782.14±11.452.0080.047尿酸(μmol/L)325.33±87.18317.45±90.940.5300.597*血糖(mmol/L)8.76±0.478.37±0.532.4580.01997 新疆医科大学博士学位论文T2DM组组别指标tPMIAT高表达组MIAT低表达组甘油三酯(mmol/L)2.13±1.582.03±1.200.4340.665总胆固醇(mmol/L)4.40±1.074.36±1.110.1990.843高密度脂蛋白(mmol/L)1.02±0.310.98±0.320.7240.470低密度脂蛋白(mmol/L)2.80±0.882.78±0.770.1650.869尿素(mmol/L)5.39±1.325.85±1.681.8280.070肌酐(μmol/L)65.84±13.8770.32±22.231.4510.149女性例数2828年龄(岁)59.68±7.8558.21±10.360.5960.554体重(kg)64.61±5.8064.16±8.790.2210.826收缩压(mmHg)131.00±16.59127.07±17.510.8620.392舒张压(mmHg)76.07±11.1175.32±10.470.2600.796尿酸(μmol/L)261.59±73.29230.99±75.421.5400.129*血糖(mmol/L)9.98±1.318.61±0.862.7520.013甘油三酯(mmol/L)1.71±0.741.75±1.400.1340.894总胆固醇(mmol/L)4.56±1.004.28±1.031.0130.316高密度脂蛋白(mmol/L)1.14±0.271.22±0.481.0130.316低密度脂蛋白(mmol/L)2.96±0.872.61±0.901.4630.149尿素(mmol/L)4.95±1.184.69±1.240.7910.432肌酐(μmol/L)52.03±13.8957.16±12.451.4570.151注：*P<0.05。2.5.3.2MIAT基因的表达水平与对照组临床指标之间的关系以MIAT基因在对照组表达的中位数1.53作为分界点，将对照组人群MIAT基因的表达水平分为高表达组和低表达组，结果显示：在全体人群中，MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在男性中，MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。在女性中，MIAT高表达组血糖水平为5.04±0.48mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为4.77±0.48mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高98 新疆医科大学博士学位论文于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组的年龄、体重、收缩压、舒张压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素、肌酐与MIAT低表达组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2-9。表2-9对照组MIAT不同表达水平之间临床指标的比较(xs)Table2-9ClinicalcharacteristicsbetweendifferentexpressionlevelofMIATincontrolgroup(xs)对照组组别指标tPMIAT高表达组MIAT低表达组全体例数9999年龄(岁)47.93±10.6647.74±10.080.1300.897体重(kg)67.74±15.3567.64±11.690.0480.962收缩压(mmHg)118.54±15.23115.71±12.601.3230.188舒张压(mmHg)75.06±10.6174.64±9.690.2710.787尿酸(μmol/L)286.38±59.96284.34±64.880.2300.818血糖(mmol/L)4.97±0.504.86±0.551.4510.148甘油三酯(mmol/L)1.10±0.291.14±0.540.6950.488总胆固醇(mmol/L)3.94±0.563.95±0.660.0980.922高密度脂蛋白(mmol/L)1.23±0.211.19±0.251.1340.258低密度脂蛋白(mmol/L)2.47±0.482.50±0.580.400.690尿素(mmol/L)5.13±1.405.18±1.440.2420.809肌酐(μmol/L)60.22±12.8663.00±13.571.4800.141男性例数4850年龄(岁)47.75±10.6549.72±9.970.9460.347体重(kg)74.86±18.1374.18±11.570.1980.843收缩压(mmHg)128.29±14.91119.13±12.330.3910.697舒张压(mmHg)76.60±10.3577.49±9.940.4030.688尿酸(μmol/L)317.93±52.29315.99±66.050.1610.872血糖(mmol/L)4.95±0.604.90±0.510.5210.604甘油三酯(mmol/L)1.15±0.271.25±0.680.9280.356总胆固醇(mmol/L)3.92±0.563.92±0.620.0010.999高密度脂蛋白(mmol/L)1.15±0.231.13±0.260.3920.696低密度脂蛋白(mmol/L)12.50±0.532.53±0.480.2640.79399 新疆医科大学博士学位论文对照组组别指标tPMIAT高表达组MIAT低表达组尿素(mmol/L)5.67±1.525.47±1.380.6980.487肌酐(μmol/L)67.14±12.3970.30±13.941.1860.238女性例数5149年龄(岁)48.10±10.7845.71±9.881.1520.252体重(kg)61.20±8.0061.27±7.650.0410.967收缩压(mmHg)116.86±15.50112.28±12.071.5190.132舒张压(mmHg)73.58±10.7471.79±8.660.8450.400尿酸(μmol/L)256.68±51.20252.04±45.080.4810.632*血糖(mmol/L)5.04±0.484.77±0.482.8000.006甘油三酯(mmol/L)1.04±0.311.03±0.310.5510.777总胆固醇(mmol/L)3.96±0.563.97±0.710.2240.886高密度脂蛋白(mmol/L)1.30±0.161.25±0.220.1920.209低密度脂蛋白(mmol/L)2.42±0.482.51±0.620.1650.450尿素(mmol/L)4.61±1.064.87±1.440.0540.313肌酐(μmol/L)53.72±9.5255.65±8.100.3600.301*注：P<0.05。2.6MEG3、MALAT1、MIAT基因的表达水平与临床指标之间的相关性分析2.6.1MEG3基因的表达水平与临床指标之间的相关性分析2.6.1.1MEG3基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的相关性分析对MEG3基因的表达水平和2型糖尿病组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关(r=-0.200，P=0.005)，差异具有统计学意义；MEG3基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在男性中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关(r=-0.206，P=0.014)，差异具有统计学意义；MEG3基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MEG3基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.297，P=0.029)，差异具有统计学意义；MEG3基因的表达量与年龄、体重、收100 新疆医科大学博士学位论文缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-10。表2-10T2DM组MEG3的表达与临床指标之间的相关性Table2-10CorrelationofMEG3expressionwithclinicalcharacteristicsinT2DMgroupMEG3组别指标rP全体年龄(岁)0.0230.751体重(kg)0.0020.984收缩压(mmHg)-0.1120.118舒张压(mmHg)-0.1060.137尿酸(μmol/L)0.1160.105*血糖(mmol/L)-0.2000.005甘油三酯(mmol/L)0.0140.848总胆固醇(mmol/L)0.0370.602高密度脂蛋白(mmol/L)0.0140.846低密度脂蛋白(mmol/L)0.0420.562尿素(mmol/L)0.0240.737肌酐(μmol/L)-0.0210.774男性年龄(岁)0.0400.632体重(kg)0.0140.865收缩压(mmHg)-0.1260.133舒张压(mmHg)-0.1440.085尿酸(μmol/L)0.1450.085*血糖(mmol/L)-0.2060.014甘油三酯(mmol/L)0.0130.874总胆固醇(mmol/L)-0.0100.901高密度脂蛋白(mmol/L)0.0080.927低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0140.864尿素(mmol/L)0.0010.991肌酐(μmol/L)-0.0210.808女性年龄(岁)-0.0510.714101 新疆医科大学博士学位论文MEG3组别指标rP体重(kg)-0.0880.537收缩压(mmHg)-0.0540.701舒张压(mmHg)0.0730.597尿酸(μmol/L)0.0200.886血糖(mmol/L)-0.0910.514甘油三酯(mmol/L)0.0150.916总胆固醇(mmol/L)0.2890.534高密度脂蛋白(mmol/L)0.0470.735*低密度脂蛋白(mmol/L)0.2970.029尿素(mmol/L)0.1660.231肌酐(μmol/L)-0.0380.787*注：P<0.05。2.6.1.2MEG3基因的表达水平与对照组组临床指标之间的相关性分析对MEG3基因的表达水平和对照组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MEG3基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在男性中，MEG3基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MEG3基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-11。表2-11对照组MEG3的表达与临床指标之间的相关性Table2-11CorrelationofMEG3expressionwithclinicalcharacteristicsincontrolgroupMEG3组别指标rP全体年龄(岁)0.1040.147体重(kg)-0.0520.498收缩压(mmHg)0.1000.187舒张压(mmHg)-0.0710.349尿酸(μmol/L)0.0230.753102 新疆医科大学博士学位论文MEG3组别指标rP血糖(mmol/L)-0.0320.653甘油三酯(mmol/L)-0.020.784总胆固醇(mmol/L)-0.0340.637高密度脂蛋白(mmol/L)0.0330.649低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0370.605尿素(mmol/L)-0.0080.907肌酐(μmol/L)-0.0910.206男性年龄(岁)-0.1280.210体重(kg)-0.0430.700收缩压(mmHg)0.0060.953舒张压(mmHg)-0.0840.438尿酸(μmol/L)0.0150.887血糖(mmol/L)0.0450.66甘油三酯(mmol/L)-0.1050.304总胆固醇(mmol/L)0.1110.277高密度脂蛋白(mmol/L)0.1070.299低密度脂蛋白(mmol/L)0.1060.302尿素(mmol/L)0.0360.725肌酐(μmol/L)-0.0180.859女性年龄(岁)0.1780.077体重(kg)-0.0270.159收缩压(mmHg)0.1590.137舒张压(mmHg)-0.0690.520尿酸(μmol/L)0.0960.340血糖(mmol/L)-0.0550.586甘油三酯(mmol/L)0.0170.866总胆固醇(mmol/L)-0.0680.499高密度脂蛋白(mmol/L)0.0000.998低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0640.524103 新疆医科大学博士学位论文MEG3组别指标rP尿素(mmol/L)-0.0160.872肌酐(μmol/L)-0.1170.247*注：P<0.05。2.6.2MALAT1基因的表达水平与临床指标之间的相关性分析2.6.2.1MALAT1基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的相关性分析对MALAT1基因的表达水平和2型糖尿病组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.611，P<0.001)，MALAT1基因的表达量与总胆固醇水平呈正相关(r=0.186，P=0.009)，MALAT1基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.201，P=0.005)，差异均具有统计学意义；MALAT1基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、高密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在男性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.908，P<0.001)，差异具有统计学意义；MALAT1基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.621，P<0.001)，MALAT1基因的表达量与总胆固醇水平呈正相关(r=0.295，P=0.027)，MALAT1基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.307，P=0.021)，差异均具有统计学意义；MALAT1基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、高密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-12。表2-12T2DM组MALAT1的表达与临床指标之间的相关性Table2-12CorrelationofMALAT1expressionwithclinicalcharacteristicsinT2DMgroupMALAT1组别指标rP全体年龄(岁)0.0000.998体重(kg)-0.1000.171收缩压(mmHg)-0.0190.789舒张压(mmHg)0.0170.811尿酸(μmol/L)0.0130.853*血糖(mmol/L)0.611<0.001甘油三酯(mmol/L)0.0010.991104 新疆医科大学博士学位论文MALAT1组别指标rP*总胆固醇(mmol/L)0.1860.009高密度脂蛋白(mmol/L)0.0780.281*低密度脂蛋白(mmol/L)0.2010.005尿素(mmol/L)0.0480.505肌酐(μmol/L)-0.0430.551男性年龄(岁)-0.0270.751体重(kg)-0.1220.157收缩压(mmHg)-0.0200.813舒张压(mmHg)-0.0150.861尿酸(μmol/L)0.1490.080*血糖(mmol/L)0.908<0.001甘油三酯(mmol/L)0.0530.539总胆固醇(mmol/L)0.1610.058高密度脂蛋白(mmol/L)0.1000.243低密度脂蛋白(mmol/L)0.1380.104尿素(mmol/L)-0.0020.977肌酐(μmol/L)0.0030.973女性年龄(岁)-0.0350.799体重(kg)-0.0840.551收缩压(mmHg)-0.0380.780舒张压(mmHg)0.0730.593尿酸(μmol/L)0.0160.906*血糖(mmol/L)0.621<0.001甘油三酯(mmol/L)-0.0110.933*总胆固醇(mmol/L)0.2950.027高密度脂蛋白(mmol/L)0.0640.638*低密度脂蛋白(mmol/L)0.3070.021尿素(mmol/L)0.1630.230肌酐(μmol/L)-0.0480.727105 新疆医科大学博士学位论文*注：P<0.05。2.6.2.2MALAT1基因的表达水平与对照组临床指标之间的相关性分析对MALAT1基因的表达水平和对照组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.850，P<0.001)，差异具有统计学意义；MALAT1基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在男性中，MALAT1基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.201，P=0.048)，MALAT1基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.223，P=0.038)，差异均具有统计学意义；MALAT1基因的表达量与年龄、体重、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-13。表2-13对照组MALAT1的表达与临床指标之间的相关性Table2-13CorrelationofMALAT1expressionwithclinicalcharacteristicsincontrolgroupMALAT1组别指标rP全体年龄(岁)0.0540.459体重(kg)-0.0540.483收缩压(mmHg)0.1050.170舒张压(mmHg)0.0280.720尿酸(μmol/L)0.0620.393*血糖(mmol/L)0.850<0.001甘油三酯(mmol/L)-0.0870.230总胆固醇(mmol/L)-0.0080.915高密度脂蛋白(mmol/L)0.0860.236低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0390.588尿素(mmol/L)0.0000.992肌酐(μmol/L)-0.1050.147男性年龄(岁)-0.1090.295体重(kg)-0.0890.427106 新疆医科大学博士学位论文MALAT1组别指标rP收缩压(mmHg)-0.0390.726舒张压(mmHg)-0.0650.554尿酸(μmol/L)0.0580.575血糖(mmol/L)-0.0790.448甘油三酯(mmol/L)-0.1310.206总胆固醇(mmol/L)0.0640.536高密度脂蛋白(mmol/L)0.1270.219低密度脂蛋白(mmol/L)0.0320.762尿素(mmol/L)0.0560.592肌酐(μmol/L)-0.1450.160女性年龄(岁)0.1950.055体重(kg)-0.0480.656*收缩压(mmHg)0.2230.038舒张压(mmHg)0.1040.336尿酸(μmol/L)0.0720.485*血糖(mmol/L)0.2010.048甘油三酯(mmol/L)-0.0450.663总胆固醇(mmol/L)-0.0680.511高密度脂蛋白(mmol/L)0.0590.567低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0980.342尿素(mmol/L)-0.0560.584肌酐(μmol/L)-0.1280.211*注：P<0.05。2.6.3MIAT基因的表达水平与临床指标之间的相关性分析2.6.3.1MIAT基因的表达水平与T2DM组临床指标之间的相关性分析对MIAT基因的表达水平和2型糖尿病组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.382，P<0.001)，差异具有统计学意义；MIAT基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性107 新疆医科大学博士学位论文(P>0.05)。在男性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.287，P<0.001)，差异具有统计学意义；MIAT基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.678，P<0.001)，差异具有统计学意义；MIAT基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-14。表2-14T2DM组MIAT的表达与临床指标之间的相关性Table2-14CorrelationofMIATexpressionwithclinicalcharacteristicsinT2DMgroupMIAT组别指标rP全体年龄(岁)0.0210.772体重(kg)0.0310.666收缩压(mmHg)-0.1100.121舒张压(mmHg)-0.1130.110尿酸(μmol/L)0.1350.058*血糖(mmol/L)0.382<0.001甘油三酯(mmol/L)0.0380.592总胆固醇(mmol/L)-0.0020.980高密度脂蛋白(mmol/L)-0.0050.946低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0030.969尿素(mmol/L)0.0150.832肌酐(μmol/L)-0.0060.930男性年龄(岁)0.0400.633体重(kg)0.0180.836收缩压(mmHg)-0.1260.133舒张压(mmHg)-0.1440.085尿酸(μmol/L)0.1460.081*血糖(mmol/L)0.287<0.001甘油三酯(mmol/L)0.0380.655总胆固醇(mmol/L)-0.0110.900高密度脂蛋白(mmol/L)0.0040.964108 新疆医科大学博士学位论文MIAT组别指标rP低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0150.863尿素(mmol/L)0.0030.975肌酐(μmol/L)-0.0200.816女性年龄(岁)-0.0450.742体重(kg)-0.0940.505收缩压(mmHg)-0.0050.969舒张压(mmHg)0.1040.447尿酸(μmol/L)0.0300.824*血糖(mmol/L)0.678<0.001甘油三酯(mmol/L)0.0110.937总胆固醇(mmol/L)0.2520.061高密度脂蛋白(mmol/L)0.0320.818低密度脂蛋白(mmol/L)0.2630.050尿素(mmol/L)0.1400.304肌酐(μmol/L)-0.0780.560*注：P<0.05。2.6.3.2MIAT基因的表达水平与对照组临床指标之间的相关性分析对MIAT基因的表达水平和对照组临床指标之间做pearson相关分析，结果显示：在全体人群中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.193，P=0.01)，差异具有统计学意义；MIAT基因的表达量与年龄、体重、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在男性中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.316，P=0.003)，差异具有统计学意义；MIAT基因的表达量与年龄、体重、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)。在女性中，MIAT基因的表达量与年龄、体重、收缩压、舒缩压、尿酸、血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、尿素和肌酐水平无相关性(P>0.05)，具体结果见表2-15。109 新疆医科大学博士学位论文表2-15对照组MIAT的表达与临床指标之间的相关性Table2-15CorrelationofMIATexpressionwithclinicalcharacteristicsincontrolgroupMIAT组别指标rP全体年龄(岁)0.0500.486体重(kg)-0.0170.821*收缩压(mmHg)0.1930.010舒张压(mmHg)0.0240.756尿酸(μmol/L)0.0380.594血糖(mmol/L)-0.0570.429甘油三酯(mmol/L)0.0030.966总胆固醇(mmol/L)0.0050.944高密度脂蛋白(mmol/L)0.0360.619低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0150.839尿素(mmol/L)0.0130.853肌酐(μmol/L)-0.0670.346男性年龄(岁)-0.1250.220体重(kg)0.0080.945*收缩压(mmHg)0.3160.003舒张压(mmHg)0.1640.130尿酸(μmol/L)0.0180.859血糖(mmol/L)-0.0340.738甘油三酯(mmol/L)-0.0040.967总胆固醇(mmol/L)0.0380.710高密度脂蛋白(mmol/L)0.0330.744低密度脂蛋白(mmol/L)0.0370.715尿素(mmol/L)0.0740.468肌酐(μmol/L)-0.0220.826女性年龄(岁)0.1460.147体重(kg)-0.0190.862110 新疆医科大学博士学位论文MIAT组别指标rP收缩压(mmHg)0.1550.148舒张压(mmHg)-0.040.711尿酸(μmol/L)0.0900.375血糖(mmol/L)0.0740.462甘油三酯(mmol/L)0.0200.843总胆固醇(mmol/L)-0.0120.909高密度脂蛋白(mmol/L)0.0330.743低密度脂蛋白(mmol/L)-0.0380.707尿素(mmol/L)-0.0080.936肌酐(μmol/L)-0.1150.255*注：P<0.05。2.7根据MEG3、MALAT1和MIAT表达的差异绘制受试者工作特征(ROC)曲线由于外周血MEG3、MALAT1和MIAT在2型糖尿病患者和和对照人群的表达水平不同，因此我们采用受试者工作特征(Receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC)曲线评价外周血MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病诊断的价值，探讨MEG3、MALAT1和MIAT是否可以作为2型糖尿病的诊断生物标记物。结果显示：MEG3表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.818(95%CI：0.777-0.859，P<0.001)，灵敏度为94.9%，特异度为94.4%；MALAT1表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.838(95%CI：0.723-0.954，P<0.001)，灵敏度为95.5%，特异度为95.2%；MIAT表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.805(95%CI：0.666-0.944，P=0.001)，灵敏度为95.0%，特异度为95.0%，提示外周血MEG3、MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病有较好的诊断价值，具体结果见图2-4和表2-16。图2-4MEG3、MALAT1和MIAT表达的ROC曲线Fig.2-4ROCcureofMEG3,MALAT1andMIATexpression111 新疆医科大学博士学位论文表2-16MEG3、MALAT1和MIAT表达的受试者工作特征曲线Table2-16ROCcureofMEG3,MALAT1andMIATexpressionlncRNA灵敏度(%)特异度(%)AUCP95%CI*MEG394.994.40.818<0.0010.777-0.859*MALAT195.595.20.838<0.0010.723-0.954*MIAT95.095.00.8050.0010.666-0.944*注：P<0.05。3讨论3.1LncRNA母系表达基因3(MEG3)与糖尿病及其并发症LncRNAMEG3在人体上是坐落于染色体14q32.3属于印记DLK1-MEG3位点的非编码转录本。在小鼠上的同源体MEG3被称为Gtl2，坐落在远端染色体12上。[140,141]MEG3在许多正常组织上都有表达，然而在许多人体肿瘤组织和肿瘤细胞系表[142]达都减少。Kameswaran等对小RNA进行了高通量测序发现一些microRNAs在T2DM患者和非糖尿病人群的胰岛中表达具有差异。我们的研究表明在染色体14q32印记位点上DLK-MEG3miRNA簇在非糖尿病人体的β细胞特异性表达，但在T2DM[143]患者的胰岛中表达下降。Wallace等研究发现染色体14q32.2上的印记DLK1-MEG3基因区域能够改变1型糖尿病的易感性。其中坐落在MEG内含子6上的rs941576位点与1型糖尿病显著相关(OR=0.75；95%CI=0.71-0.79)。MEG3的表达水平在STZ诱导的糖尿病小鼠的视网膜表达下调，同时内皮细胞在高糖和氧化应激下MEG3表达水平也下降。在体内MEG3敲除能够加剧视网膜血管的功能障碍，发生严重的毛细血管变性，增加微血管的渗漏和炎症。在体外，MEG3基因敲除能够调节视网膜内皮细胞的增殖，迁移和tube形成。MEG3在PI3K/Akt信号通路的介导[144]下在内皮细胞发挥功能。因此，MEG3的上调可能作为治疗糖尿病相关的微血管并发症的治疗策略。通过体内外研究MEG3与小鼠β细胞功能发现与外分泌腺相比，MEG3在Balb/c小鼠的胰岛表达增加。而且，MEG3表达在T1DM和T2DM小鼠模型的胰岛中表达下降。Min6细胞和分离的小鼠胰岛中，MEG3的表达水平主要受血糖的调节。在体外通过抑制MEG3的表达，胰岛素的合成和分泌受到损害，同时β细胞的凋亡增加。在体内敲除MEG3基因后会导致糖耐量受损和胰岛素分泌下降，[145]Pdx-1和MafA的mRNA和蛋白表达下降。综上所述，MEG通过影响胰岛素的合成和细胞凋亡维持β细胞的功能。在高脂饮食的小鼠和ob/ob小鼠的原代肝细胞MEG3基因的表达上调，同时在棕榈酸的刺激下原代肝细胞MEG3表达上调。MEG3112 新疆医科大学博士学位论文过表达能够增加FoxO1，G6pc和PepckmRNA的表达，增加肝脏的糖异生和抑制原代肝细胞胰岛素刺激的糖原合成，MEG3的敲除能够抑制棕榈酸诱导的FoxO1，G6pc和Pepck蛋白表达的增加。此外，高脂饮食饮食能够通过组蛋白乙酰化增加肝细胞MEG3水平。MEG3敲除能够抑制高脂饮食小鼠和ob/ob小鼠甘油三酯的增加，改善[146]糖耐量损害，抑制糖原合成的下降。3.2LncRNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)与糖尿病及其并发症最近几年，功能性基因组的概念重新包含了全新发现的多种非编码RNA转录本。[147,148]lncRNA的功能意义已经被识别。然而，lncRNA表达眼睛疾病中才开始显露。糖尿病视网膜病变是由于高血糖和胰岛素信号通路异常引起的多种病理过程，导致[105]视网膜微血管缺陷、视神经功能障碍和恶化。糖尿病视网膜病发病的潜在分子机[149]制还不清楚。Yan等构建了链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型，运用芯片分析对视网膜的lncRNAs进行表达分析。确定了303条表达异常的lncRNAs，包括214条表达下调的lncRNAs和89条表达上调的lncRNAs。这些表达差异的lncRNAs长度范围从217bp到33.5kb，从正义和反义两个方向进行转录。同时，这些表达差异的lncRNAs分布在小鼠染色体的所有方向。一般大量的lncRNAs在基因组的短片[150]段展示出拥有多个转录本的转录簇。在小鼠的染色体1上发现2条lncRNAs簇，分别从从染色体138499kb区域和182685区域进行转录；在小鼠染色体2上发现3条lncRNAs从染色体176134kb区域进行转录；在小鼠染色体3上发现3条lncRNAs从染色体84609kb区域进行转录；在小鼠染色体7上发现5条lncRNAs从染色体134369kb区域进行转录；在小鼠染色体8上发现3条lncRNAs从染色体108153kb区域进行转录。越来越多的研究揭示lncRNAs的功能意义，然而大多数lncRNAs的[151]生物作用还不清楚。生物过程和细胞调节是非常复杂的，例如蛋白、RNA和DNA。芯片数据不仅提供了糖尿病和非糖尿病小鼠视网膜lncRNAs的表达信息还提供了mRNAs的表达信息。通过构建lncRNAs/mRNAs的共表达网络，调查lncRNAs和mRNAs的潜在相互作用。79条lncRNAs和100条mRNAs构成了共表达网络，包含2675个网络节点。网络表明1个mRNA能够相互作用大量lncRNAs靶基因，lncRNAs与mRNAs在糖尿病视网膜病早期阶段存在内调节。基因富集分析决定基因和和基因产物在生物过程、细胞组分和分子功能的富集。通过lncRNAs共表达的mRNAs，最高的富集项目在生物过程为细胞的应激反应，在细胞组分为膜的组成，在分子功能为结构分子活性。KEEG信号通路分析表明lncRNAs共表达的mRNAs参与轴突导向、MAPK信号通路、补体和凝血级联反应、粘附分子信号通路和丙酮酸盐代谢。MALAT1在哺乳动物是一种高保守的lncRNA在染色体11q13上，在一些实体肿瘤[152]中错误调节，与癌症的转移和复发密切相关。MALAT1直系同源的chr19:113 新疆医科大学博士学位论文5795689-5802671在糖尿病视网膜异常表达。转录因子是控制各种类型正常细胞过程[153]和应对外部刺激时信号级联的重要做成部分。运用TRANSFAC程序预测MALAT1序列的TFBS，发现MALAT1能够结合NF-κB作为顺式作用原件。通过catRAPID分析预测MALAT1的相互作用蛋白，发现MALAT1与CPNL1存在相互作用。此外MALAT1在高血糖的RF/6A细胞模型、糖尿病患者的房水和纤维血管膜表达上调，表明MALAT1可以作为糖尿病视网膜病预后和诊断的生物标记物。糖尿病是影响儿童、青少年和成人的全球公共卫生问题。三分之一到二分之一的糖尿病患[154]者会发生器官和组织的损伤。通常，糖尿病被认为是一种血管疾病，伴有血管调[155]节机制的改变、活性氧中间产物增加、炎症反应的激活和屏障功能改变。糖尿病血管并发症包括微血管和大血管功能障碍，发生在许多器官，包括肌肉、眼睛、心[156]脏、大脑和肾脏。定期的筛选和早期发现糖尿病血管并发症对于减少糖尿病患者发病率和死亡率具有重要作用。视网膜血管可以认为是直接和无创的，为在体内研究人体健康和血管疾病，提供了独特的和容易得到的途径。在许多糖尿病患者体内，[157]主要的视网膜血管并发症—糖尿病视网膜病变被大量的研究。糖尿病视网膜病变是在视网膜微血管发生的进行性改变，包括视网膜无灌注区的增加，血管通透性的[158]增加，视网膜血管的病理性增殖。微血管和大血管并发症具有一些类似的特征。理解视网膜微血管功能障碍受到了糖尿病研究者和临床医生的大量关注。哺乳动物的基因组具有上千种lncRNAs基因。由于lncRNAs基因在许多生物过程和疾病失调中具有重要作用，lncRNAs基因受到了广泛的关注。最近lncRNAs在血管生物中的作用被逐渐识别。人体动脉平滑肌细胞的RNA测序确定了31种非注释的lncRNAs。在它们当中，lncRNASENCR是在血管细胞表达丰富的lncRNA，lncRNASENCR的敲除能够导致心肌蛋白和平滑肌收缩基因的表达下降。当敲除AngⅡ调节lncRNA，lnc-Ang362影响血管平滑肌细胞增殖，表明lnc-Ang362具有诊[159]断AngⅡ相关的心血管疾病的潜在作用。MALAT1的敲除会导致体外内皮细胞表型的平衡从增殖到迁移发生倾斜，在体内，MALAT1的遗传删除或药理性的抑制能[160]够减少血管的增殖。心血管疾病相关的lncRNA，ANRIL通过调节细胞增殖、凋亡、细胞外基质重塑和炎症反应相关的基因表达在动脉粥样硬化的进展中具有重要[161]的作用。在糖尿病的状况下，MALAT1能够激活p38/MAPK信号通路调节视网膜内皮细胞的功能和病理性微血管的增殖，总之，lncRNAs作为基因表达调控的出现毋庸置疑改变了我们对病理性血管生成的复杂调控网络的理解。糖尿病视网膜病变是长期糖尿病患者常见的血管并发症。视觉的恶化与视网膜炎症、视网膜新血管形[162,163]成、血管高通透性和血管细胞凋亡有关。高糖血症是糖尿病患者最主要的特点，在糖尿病血管并发症进展的过程中，对血管细胞具有恶化作用。高糖血症能够引起视网膜内皮细胞和糖尿病大鼠视网膜MALAT1的表达水平增加。沉默MALAT1的114 新疆医科大学博士学位论文表达后，能够显著缓解糖尿病诱导的视网膜血管化、血管的渗漏和视网膜炎症。而且，体外遗传敲除MALAT1能够影响内皮细胞典型的生物学功能，抑制内皮细胞的增殖、迁移和微管形成动力。总之，MALAT1能够缓解高糖血症诱导的视网膜变性，改善视网膜的视觉功能。最初，MALAT1的高表达会有非小细胞肺癌转移的高风险。在各种肿瘤中发现了MALAT1的表达升高，例如肺癌、肝癌、肾细胞癌、膀胱癌和[164][165]骨肉瘤。MALAT1对肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和肿瘤细胞的转移。MALAT1敲除能够减少视网膜内皮细胞的增殖、迁移和微管形成。这些结果表明MALAT1控制肿瘤细胞和内皮细胞增殖的机制类似。MAPK信号通路在细胞外高糖的刺激后会激活。MAPK的激活具有一系列的生理反应，例如细胞凋亡、细胞增殖、[166,167]有丝分裂和一些基因的转录。MAPK的异常激活能够导致细胞的连续增殖或减弱反应应对外部刺激。由于MAPK在生物学过程中的多种作用，MAPK信号通路参[167]与从癌症到肥胖多种人体疾病。MAPK敲除能够显著改变磷酸化p38MAPK的水平，但是对于磷酸化ERK和JNK并无作用。MALAT1诱导细胞增殖可能通过特异性阻断p38MAPK信号通路抑制剂或p38siRNA。这些结果表明MALAT1与p38MAPK信号通路之间存在相互联系。MALAT1调节p38MAPK信号通路影响视网膜内皮细胞的多种细胞功能。为了验证MALAT1在高糖培养内皮细胞时的改变和改变[168]的意义。Puthanveetil等在不同血糖水平培养人脐静脉内皮细胞，发现MALAT1的表达在12小时后表达增加到高峰，这种增加与血清淀粉样抗原3(SAA3)平行增加，随着炎症介导基因的TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白的增加，炎症配体和MALAT1的目标基因也随之增加。糖尿病动物的肾组织也表现出类似的改变。这种改变能够通过MALAT1的特异性siRNA转染预防。这些研究表明MALAT1能够通过激活SAA3调节血糖诱导的表达上调的炎症介导基因TNF-α和IL-6，在糖尿病诱导的微血管和大血管并发症中，确定了一个全新机制导致以MALAT1为靶点和以RNA为基础的治疗策略的发展。糖尿病性心肌病为心室功能障碍，其发生独立于冠心病和高血压，具有随后发展为心衰和死亡率增加的风险。糖尿病性心肌病具有多种形态学的改变，包括心肌细胞的肥大、肌原纤维耗尽、间质纤维化和心肌内微血管病变[169]。MALAT1是肿瘤相关的lncRNA，通过调节剪接和表观遗传学修饰控制基因的表达。越来越多的证据表明，MALAT1参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和[164]转移。在糖尿病组发现左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)增加，然而在糖尿病MALAT1-shRNA组LVEDD和LVESD下降。左心室缩短分数(LVFS)和左心室射血分数(LVEF)是左室收缩功能的指标，在糖尿病组发现LVFS和LVEF下降，然而糖尿病MALAT1-shRNA组能显著改善糖尿病诱导的心脏功能障碍。炎症是糖尿病早期和显著反应，炎症在糖尿病性心肌病的发生和发挥过程中被激活参与。在糖尿病大鼠组中发现MALAT1的mRNA表达增加，在MALAT1-shRNA组115 新疆医科大学博士学位论文发现MALAT1的mRNA表达下降。此外，TNF-α，IL-1β和IL-6水平在糖尿病心肌显著增加，当MALAT1敲除后能够显著减少炎症细胞因子的浓度，表明MALAT1参与糖尿病性心肌病的炎症过程。综上所述，抑制MALAT1的表达能够作为糖尿病性心肌病的全新治疗策略。3.3LncRNA心肌梗死相关转录本(MIAT)与糖尿病及其并发症虽然大部分的lncRNAs的表达水平比蛋白编码基因低，由于lncRNAs在生物过程和人类疾病中具有多种作用，最近lncRNAs受到了分子生物学家和临床医生的大[170]量关注。其中，MIAT参与调节内皮细胞的功能和病理性血管的生成。一些lncRNAs作为调节基因参与调节心血管疾病的发展。lncRNA-Braveheart通过激活核心心血管[171]基因网络，调节心血管疾病的发展。lncRNA-Fendrr调节染色体的修饰，影响心[172]血管系统的信号通路。此外，一些lncRNA与血管紧张素Ⅱ功能和血管疾病密切[173]相关，包括冠心病和动脉粥样硬化。MIAT作为内皮细胞功能的调节者，由于可以作为新生血管疾病治疗的潜力，值得进一步研究。糖尿病视网膜病是糖尿病的微血管并发症，视觉的恶化伴有炎症、新血管形成、血管高通透性和血管细胞的功能[174]障碍。高糖血症能够导致内皮细胞和糖尿病视网膜MIAT表达水平增加。在体外，MIAT敲除能够缓解糖尿病诱导的视网膜的新血管形成，血管渗漏和炎症。在正常视网膜血管发育的过程中，由于细胞外基质的细胞因子和炎症因素的刺激，视网膜内皮细胞的发生增殖和迁移，引起新血管的生成。在特定的疾病状态，在视网膜血管系统发生内皮细胞大量的增殖和迁移。在体外，MIAT的敲除能够引起内皮细胞的增殖和内皮细胞的动力性减少。因此，MIAT能够参与微血管功能障碍的发病机制。MIAT的表达上调是在高糖血症刺激下的一种应激反应。早期视网膜微血管功能障碍[175]包括血流破坏，基底膜增厚，周细胞丢失和无细胞毛细血管发生，伴有MIAT表达水平增加。MIAT敲除能够部分防治病理过程的的发展。随着疾病的进展，毛细管丢失导致内层视网膜缺氧，生长因子的改变，炎症反应增加和视网膜微血管生成。在这一过程中，增加的MIAT与异常的内皮细胞增殖和和迁移密切相关，引起病理[176]性血管生成。MIAT的敲除能够缓解糖尿病诱导的视网膜新血管生成，血管渗漏和炎症。高糖血症直接或间接导致毛细血管损伤。潜在的机制包括⑴通过多元醇途径增加葡萄糖到山梨醇的流出。⑵通过己糖胺通路增加的葡萄糖胺-6-磷酸⑶蛋白激酶C激活。⑷非酶糖化、糖化氧化和脂质过氧化的影响。这些不同的通路彼此存在联系或增强。高糖血症诱导的氧化应激是这些机制常见的特征。在高糖应激或氧化应激下，MIAT水平显著增加。MIAT表达上调导致内皮细胞的增殖和迁移，最终导致病理血管的生成。缺氧是引起病理血管生成的另一个应激诱导者。缺氧诱导MIAT表达上调，影响内皮细胞的功能，引起病理血管的生成。在STZ诱导的糖尿病小鼠[177]和高糖刺激的大鼠视网膜Muller细胞中，Zhang等发现MIAT和p-p65表达增加，116 新疆医科大学博士学位论文染色质免疫沉淀实验发现，高糖能够刺激NF-κB和MIAT的结合活性，然而NF-κB的抑制剂Bay11-7082能够抑制结合活性。MiR-29b是MIAT的目标基因，MIAT能够调节MiR-29b的表达，MIAT过表达抑制MiR-29b的表达，促进Sp1的表达。高糖能够刺激细胞的凋亡和减少细胞的活性，然而抑制MIAT的表达缓解高糖引起的效果。MiR-29b敲除能够缓解MIAT抑制后产生的效果。3.4LncRNA浆细胞瘤变异易位基因1(PVT1)与糖尿病及其并发症糖尿病肾病是以长期蛋白尿(>300mg/天或>200μg/分钟)，肾小球滤过率(GFR)[178]进行性下降、动脉血压力增加，最终导致肾衰竭的发生。微量白蛋白尿(每天尿中白蛋白为30-300mg)是早期糖尿病肾病的标志，蛋白尿(每天尿中白蛋白大于300mg)[179]是糖尿病肾病的进展的发生。形态学上糖尿病肾病是由于细胞外基质沉积导致以肾小管间质纤维化，肾小球基底膜增厚，足细胞足突融合和系膜扩张未特征的疾病[180]。引起糖尿病肾病的准确机制还不清楚。尽管糖尿病的类型和种族不同，然而糖[181-183]尿病的周期是糖尿病肾病最主要的决定因素。除了糖尿病的周期，其他危险因[184,185]素包括高糖血症、高血压和高脂血症也是糖尿病的危险因素。临床试验表明，[186-188]通过药物手段控制高糖血症和高血压能够减少肾病的发生率。然而，一些高糖血症并不严重，但最终发展为糖尿病肾病；一些糖尿病患者周期很长，但也不一定[189][190-192]发展为肾病。遗传因素决定了糖尿病肾病的发生和进展。目前，一些候选基因和全基因组关联研究确定了易感等位基因。研究表明，ELMO1(吞噬细胞活力1)、GLUT1(葡萄糖转运蛋白1)、脂肪细胞因子、醛糖还原酶、ACE(血管紧张素转换酶)、AGTR(血管紧张素Ⅱ受体1)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物1)、CNDP1(肌肽二[193,194]肽酶1)、PVT1(浆细胞瘤变异易位基因1)与糖尿病肾病相关联。然而，临床相关性的候选基因需要更多的验证和功能描述，从而确定这些基因导致糖尿病肾病的病理生理机制。最近发现miRNAs在糖尿病肾病的进展过程中具有重要作用，改变了我们对于糖尿病肾病分子机制的理解。浆细胞瘤变异易位基因1(PVT1)是能够编码[195]大量转录本的lncRNAs，当过表达时，增加细胞的增殖和抑制凋亡。在人体20%[196,197]的Burkitt淋巴瘤，PVT1参与染色体2和染色体22的易位，过表达PVT1导致卵巢癌与乳腺癌的发生。然而PVT1基因在糖尿病肾病的发生和发展过程中的作用还未完全了解。为了确定遗传突变对2型糖尿病患者终末期肾脏疾病的影响，[198]Hanson等进行了全基因组关联研究，在105个患有终末期肾脏疾病的2型糖尿病患者(病例组)和102个患病大于10年但没有蛋白尿的2型糖尿病患者中(对照组)，分析115352个单核苷酸多态性与2型糖尿病患者终末期肾脏疾病的相关性。研究发现在染色体8q24的200kb区域内，3个SNPs位点的等位基因频率在病例组和对照组之间存在显著差异。在研究对象中进行SNPs分型后，发现浆细胞瘤变异易位基因PVT1的rs2720709位点与2型糖尿病患者终末期肾脏疾病显著相关(P=0.000021；odds117 新疆医科大学博士学位论文ratio=2.57[95%CI=1.66-3.96])。通过测序所有的外显子，外显子-内含子的边界，PVT1的启动子区域，确定了47个突变位点，其中有11个位点的等位基因频率≥0.05。随后分析了11个突变位点和rs2720709位点侧翼319kb内87个SNPs位点，发现23个标记物与2型糖尿病患者终末期肾脏疾病相关性P<0.01，其中关联性最强的位点为PVT1基因内含子8的rs2648875(P=0.0000018；oddsratio=2.97[95%CI=1.90-4.65])。总之，PVT1基因可能导致2型糖尿病患者终末期肾脏疾病的发生。为了研究PVT1[199]基因导致糖尿病肾脏疾病发生和进展的分子机制，Alvarez等在人体系膜细胞中运用RNA干扰敲除PVT1基因的表达，通过qPCR和ELISA分子生物学技术，在RNA和蛋白水平分析纤连蛋白1(FN1)、胶原蛋白Ⅳα1(COL4α1)、转化生长因子β1(TGFβ1)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达。人体系膜细胞在高糖处理后，发现PVT1、FN1、COL4α1、TGFβ1和PAI-1表达水平增加。当敲除了PVT1基因的表达后发现细胞外基质沉积蛋白FN1和COL4α1，细胞外基质沉积蛋白调节蛋白TGFβ1和PAI-1在RNA和蛋白表达水平下降。此外，与TGFβ1比较，发现FN1、COL4α1和PAI-1的分泌水平减少的更多和更快，表明PVT1对细胞外基质沉积蛋白的作用要独立于细胞因子TGFβ1。PVT1通过参与细胞外基质沉积介导糖尿病肾病的发生和进展。miR-1204、miR-1205、miR-1206、miR-1207-5p、miR-1207-3p和miR-1208是六种在位置上映射到PVT1基因的miRNAs，通过调查六种miRNAs在人体肾近曲小管上皮细胞、足细胞和人体系膜细胞的表达，发现miR-1207-5p在三种类型肾脏细胞中表达倍数最大。在肾脏细胞miR-1207-5p是主要的PVT1来源的miRNA。在高糖的处理下，miR-1207-5p及其宿主基因PVT1表达增加，然而这两种基因的表达独立于彼此。miR-1207-5p和PVT1基因能够增加细胞外基质沉积调控基因TGF-β1和PAI-1的表达。糖尿病肾病的肾小球中有大量的细胞外基质沉积，当系膜细胞转染miR-1207-5p类似物后，TGF-β1和PAI-1的mRNA和蛋白水平表达增加。相反，当敲除miR-1207-5p基因后TGF-β1和PAI-1的mRNA和蛋白水平表达下降。当系膜细胞转染miR-1207-5p类似物或抑制剂后，系膜细胞FN1的分泌水平分别增加或减少了40%。同样，当系膜细胞转染PVT1过表达后，与阴性对照和空载体比较TGF-β1、PAI-1和FN1的mRNA和分泌蛋白水平表达增加。miR-1207-5p及其宿主基因PVT1[200]参与糖尿病肾病发展的病理过程。最近的研究表明，表观遗传修饰因素，例如DNA甲基化、组蛋白转录后修饰、microRNAs(miRNAs)和lncRNAs调节包括糖尿病肾病在内的肾脏疾病发生和发展[201]。大量研究关注miRNAs，包括miR-192、miR-216a、miR-217、miR-377、miR-21[202,203]和miR-29c，在导致糖尿病肾病发展的生物机制中具有重要作用。对于功能失调lncRNAs的研究呈现了全新层面导致人类疾病的复杂分子机制。PVT1在高糖血症中表达升高，通过参与细胞外基质沉积导致糖尿病肾病的发生和进展。然而进一步118 新疆医科大学博士学位论文描述PVT1基因，确定PVT1基因是否通过介导miRNAs映射到PVT1位点发挥效果，还是通过与RNA、DNA、和/或蛋白相互作用从而控制基因的表达而发挥效果。3.5其它lncRNAs与糖尿病及其并发症糖尿病视网膜病变是主要引起成人失明和最常见的糖尿病并发症，长久以来被认为是血管疾病。最近大量的研究发现在高糖的应激下视网膜神经细胞也有所影响。视网膜神经节细胞是用来研究糖尿病对视网膜神经细胞的影响。保护糖尿病诱导的视网膜神经节细胞受损，从而阻碍和延缓视觉功能失调，得到了越来愈多的关注。SOX2重叠转录本(SOX2OT)是坐落在人体染色体3q26.33上的长链非编码RNA。人体SOX2OT具有在小鼠和其他脊椎动物同源性的高识别核苷酸，证明了很高的进化[204]保守性。SOX2OT具有调节鸡和斑马鱼的胚胎生成的作用，与中心神经系统的结[205,206]构有关，不仅包括鱼胚胎的眼睛，也包括中胚层。在人体的qRT-PCR分析显示在人体大脑中具有很高的表达。SOX2OT通过连锁不平衡分析发现认为是近视的[207]候选基因。眼睛的视网膜和视神经认为是大脑的一部分。眼睛和大脑通常具有共[208]同的特征。Li等研究发现SOX2OT在STZ诱导糖尿病小鼠的视网膜中表达下调，同样视网膜神经节细胞在高糖培养和氧化应激下，SOX2OT的表达水平下降。在体外，SOX2OT敲除能够缓解高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤。在体内，SOX2OT敲除对糖尿病诱导的神经退行性病变具有神经保护作用。SOX2OT敲除能够调节氧化应激下的视网膜神经节细胞和糖尿病小鼠视网膜。SOX2OT敲除通过调节NRF2/HO-1信号通路活性发挥抗氧化作用。综上所述，SOX2OT敲除可能对糖尿病诱导的视网膜神经退行性病变的预防和治疗具有重要意义。视网膜非编码基因RNA3(RNCR3)，也称为LINC00599，最初在小鼠视网膜发育过程中发现了LINC00599的表达。RNCR3被报道参与神经元和少突胶质细胞的分化以及动脉粥样硬化相关的血管功能失调，虽然功能有所不同，但是神经和血管系统具有同样保持[209-211]功能的调节物。视网膜胶质细胞增生是糖尿病视网膜病变的主要病理特征，确定引起反应性角质增生的潜在机制对于开发全新糖尿病视网膜病变治疗策略具有重[212]要意义。Liu等研究发现RNCR3敲除能够抑制视网膜胶质细胞增生和细胞因子的释放显著减少。RNCR3敲除能够减少视网膜细胞的凋亡和改善视觉功能，缓解糖尿病诱导的视网膜神经退行性病变。RNCR3敲除减少胶质细胞的活力和增殖，减少胶质反应性相关的基因GFAP和vimentin在体外的表达。综上所述，RNCR3敲除可以[213]作为预防糖尿病诱导的视网膜神经退行性病变发生的有希望的治疗策略。Awata等为了探索糖尿病视网膜病的易感基因，揭示糖尿病视网膜病的发病机制，在日本人群中进行了全基因组关联研究，发现RP1-90L14.1基因的内含子位点rs9362054与糖尿病视网膜病密切相关。RP1-90L14.1是一种临近KIAA1009/QN1/CEP162基因的长链基因间非编码RNA(lincRNA)。SNPrs9362054位点坐落在染色体6上的85Mb，119 新疆医科大学博士学位论文此位点是两种编码蛋白基因KIAA1009和TBX18之间的RP1-90L14.1基因的内含子。’长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(GAS5)是一类5末端寡嘧啶基因，具有调[214]节细胞生长，增殖和生存的作用。GAS5在1q25进行编码，在黑色素瘤，前列腺[215,216]癌和系统性红斑狼疮中表现异常。然而GAS5在糖尿病中的作用还不清楚，[138]Carter等通过对5例糖尿病和5例非糖尿病血清样本进行lncRNAs表达分析，此后在96个血清样本中进行lncRNAGAS5表达分析和构建受试者工作特征(ROC)曲线，确定lncRNAGAS5诊断糖尿病的最佳截点。研究发现，在血清中水平下降的lncRNAGAS5与糖尿病患者相关，qPCR结果显示lncRNAGAS5﹤10ng/μl发生糖尿病的可能性更高(OddsRatio[OR]=11.79(95%CI：3.97-37.26)，P﹤0.001)。ROC分析诊断糖尿病和非糖尿病的曲线下面积AUC=0.81，敏感度为85.1%，灵敏度为67.3%，阳性预测值为71.4%。综上所述，lncRNAGAS5水平与2型糖尿病的发生密切相关。目前为止，巨噬细胞介导糖尿病并发症炎症反应增强的机制还未完全清楚。糖尿病促进促炎症因子和促纤维化因子以及通过参与巨噬细胞功能的转录因子功能性失调的激活巨噬细胞表型。尤其是，糖尿病会改变长链非编码RNA的表达水平。Reddy[217]等对糖尿病db/db小鼠和对照db/+小鼠分离的骨髓巨噬细胞进行RNA测序，确定了1648个表达不同的基因。由于lncRNAs在糖尿病并发症中的作用还不清楚，通过对lncRNAE330013P06的研究发现，lncRNAE330013P06在db/db小鼠和饮食诱导的胰岛素抵抗的2型糖尿病小鼠中表达增加。在2型糖尿病患者的单核细胞中也发现lncRNAE330013P06的表达增加。当给予小鼠巨噬细胞高糖和棕榈酸处理后，发现E330013P06的表达增加。巨噬细胞E330013P06的过表达会诱导炎症基因，加剧了炎症信号通路反应，增加了泡沫细胞的形成。小干扰RNA介导E330013P06基因沉默抑制了糖尿病刺激导致的炎症基因表达。研究定义了糖尿病巨噬细胞转录组和lncRNAs在巨噬细胞中的全新作用，该全新的发现能够实现以lncRNA为基础的对于糖尿病并发症炎症反应的治疗。长期暴露在促炎因子，例如IL-1β,TNF-α和IFN-γ会对β细胞的功能会有恶化作用，导致生产和分泌胰岛素的功能丧失，最终引[218-221]起β细胞的凋亡。深入了解炎症过程中发生的机制对确定全新的机制预防和治疗疾病具有重要意义。β细胞长期暴露于细胞因子能够调节基因的表达，导致关键信[103,,222,223]号通路的严重损伤。在糖尿病中，大部分研究的非编码RNAs主要是[224]microRNAs。这些分子对于控制基因的网路具有重要作用，是β细胞功能的关键[225,226]调控者，在1型糖尿病发展过程中，参与β细胞的损伤。除了microRNAs，最[227-229]近的转录组分析确定了另一类功能性分子lncRNAs。虽然lncRNAs作用还未了解清楚，RNA家族的成员参与不同基因的调节机制，例如转录，印记，剪接，蛋白[230-235][236]降解和染色质的表观遗传标志物，它们的调节失调引起了众多疾病。对于lncRNAs在保持β细胞活性还处于未知状态，同时也没有相关数据表明lncRNAs对120 新疆医科大学博士学位论文于1型糖尿病发展的影响。为了确定lncRNAs在1型糖尿病发展的病理生理过程中[104]差异表达和参与的细胞因子介导的β细胞损伤，Motterle等研究发现MIN6表达多种lncRNAs，当MIN6细胞孵育在T辅助因子1型细胞因子时，会导致大量参与炎症反应编码蛋白的基因表达发生变化，例如IFN-γ信号通路，NF-κB调节，内质网应激和凋亡过程；除此之外，大部分lncRNAs的表达在细胞因子的处理后发生了变化。在后续的实验中，发现lncRNAs在患有胰岛炎的NOD小鼠(一种常见的1型糖尿病动物模型)发育过程中表达增加，同时lncRNAs调节β细胞凋亡增加，表明lncRNAs介导1型糖尿病初级阶段β细胞功能失调。在未来的研究中，不仅需要阐明lncRNAs在1型糖尿病小鼠的发育过程中的作用，还需要评价是否同样的机制也适用于人体。这可能是一个艰巨的任务，因为在全物种lncRNAs的序列保守性只有21%。我们将需要依据二级结构分析的新的计算方法准确确定人类转录本。作为严重[237,238]的糖尿病并发症，自主神经功能障碍能够增加糖尿病患者的发病率和死亡率。糖尿病性自主性神经病变通过损害心率变异性影响伴有心脏自主神经功能障碍的交[239]感神经和副交感神经系统。颈上神经节通过对心交感神经张力的作用调节心脏自主神经功能活动，越来越多的证据表明颈上神经节不仅可以传递交感神经的神经节[240]前的信号，也可以自主神经功能产生综合效应。糖尿病患者颈上神经节的差异基因表达与大量颈上神经节的细胞改变密切相关，最终会引起糖尿病性心脏自主神经病变。胰岛素受体底物1(IRS1)是胰岛素和/或IGF-1信号传导的锚定蛋白，最近的研[241]究表明IRS1对于神经元发挥功能具有重要作用。异常的IRS丝氨酸磷酸化能够[242]损害神经元胰岛素信号通路。促炎细胞因子TNF-α能够影响IRS1的丝氨酸302磷酸化，与IRS1作为信号分子的功能失活具有相关性，同时能够参与交感神经元的生理过程。关于糖尿病神经性病变的发病机制，炎症在神经系统收到了大量的关注[243]。促炎细胞因子时神经炎症的关键介导物。特别是TNF-α对于糖尿病神经病变的[244]发生和发展具有重要作用。TNF-α能够引起神经元的。细胞因子在中枢和外周神经系统对髓鞘具有毒性。一些研究表明在糖尿病的动物模型和患者中发现了TNF-α的表达增加。研究表明NONRATT021972siRNA能够抑制糖尿病大鼠颈上神经节TNF-α的表达，阻断IRS1的丝氨酸磷酸化，增加IRS1的表达，改善心率变异性。这些发现能够全新的解释lncRNAs具有缓解神经炎症的作用，将有助于加深我们对于糖尿病性心脏自主神经病变发病机制的理解。因此，NONRATT021972可以作为糖尿病性心脏自主神经病变全新的有效生物因子，在未来具有深入研究的价值。本研究通过分析2型糖尿病组与对照组中MEG3、MALAT1、MIAT的表达水平发现2型糖尿病组MEG3基因的表达量为1.31±0.10，对照组MEG3基因的表达量为4.98±0.58，与对照组MEG3基因的表达量相比，2型糖尿病组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。2型糖尿病组MALAT1基因的表达量为121 新疆医科大学博士学位论文1.57±0.28，对照组MALAT1基因的表达量为1.21±0.26，与对照组MALAT1基因的表达量相比，2型糖尿病组MALAT1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。2型糖尿病组MIAT基因的表达量为2.07±0.38，对照组MIAT基因的表达量为1.44±0.27，与对照组MIAT基因的表达量相比，2型糖尿病组MIAT基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。本研究通过分析MEG3基因的表达水平与临床指标之间的关系发现在2型糖尿病组的全体人群中，MEG3高表达组血糖水平为8.86±0.53mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为9.31±0.58mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组的男性中，MEG3高表达组血糖水平为8.83±0.57mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为9.25±0.58mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组的女性中，MEG3高表达组血糖水平为4.80±0.49mmol/L，MEG3低表达组血糖水平为5.00±0.49mmol/L，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究通过分析MALAT1基因的表达水平与临床指标之间的关系发现在2型糖尿病组的全体人群中，MALAT1高表达组血糖水平为8.88±0.38mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为8.22±0.42mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组的男性中，MALAT1高表达组血糖水平为9.00±0.47mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为8.00±0.52mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组的女性中，MALAT1高表达组血糖水平为8.86±0.81mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为7.95±0.66mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组的全体人群中，MALAT1高表达组血糖水平为5.02±0.49mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为4.77±0.49mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组的男性中，MALAT1高表达组肌酐水平为66.10±11.19μmol/L，MALAT1低表达组肌酐水平为72.19±14.75μmol/L，MALAT1高表达组肌酐水平低于MALAT1低表达组肌酐水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组的女性中，MALAT1高表达组血糖水平为5.00±0.59mmol/L，MALAT1低表达组血糖水平为4.81±0.68mmol/L，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究通过分析MIAT基因的表达水平与临床指标之间的关系发现在2型糖尿病组的全体人群中，MIAT高表达组血糖水平为9.69±0.33mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为9.32±0.17mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组的男性中，MIAT高表达组血糖水平为8.76±0.47mmol/L，122 新疆医科大学博士学位论文MIAT低表达组血糖水平为8.37±0.53mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；MIAT高表达组舒张压水平为78.24±11.87mmHg，MIAT低表达组舒张压水平为82.14±11.45mmHg，MIAT高表达组舒张压水平低于MIAT低表达组舒张压水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组的女性中，MIAT高表达组血糖水平为9.98±1.31mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为8.61±0.86mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组的女性中，MIAT高表达组血糖水平为5.04±0.48mmol/L，MIAT低表达组血糖水平为4.77±0.48mmol/L，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。生物医学和统计研究的热门领域是构建二元的分类器(对于二分类结果的预测模型)，例如，寻找生物标记物预测是否患有确定的疾病。为了评价不同生物标记物或预测模型的预测效果，常见的举措是计算出一些量度呈现出分类的准确性，包括真阳性率和假阳性率。受试者工作特征(ROC)曲线是一种普遍的运用广泛的评价分类器，在不同阈值下能够绘制出真阳性率和假阳性率的图用于预测结果。本研究通过分析MEG3基因的表达水平与临床指标之间的相关性发现在2型糖尿病组的全体人群中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关(r=-0.200，P=0.005)；在2型糖尿病组的男性中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关(r=-0.206，P=0.014)；在2型糖尿病组的女性中，MEG3基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.297，P=0.029)。本研究通过分析MALAT1基因的表达水平与临床指标之间的相关性发现在2型糖尿病组的全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.611，P<0.001)，MALAT1基因的表达量与总胆固醇水平呈正相关(r=0.186，P=0.009)，MALAT1基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.201，P=0.005)；在2型糖尿病组的男性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.908，P<0.001)；在2型糖尿病组的女性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.621，P<0.001)，MALAT1基因的表达量与总胆固醇水平呈正相关(r=0.295，P=0.027)，MALAT1基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关(r=0.307，P=0.021)。在对照组的全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.850，P<0.001)；在对照组的女性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.201，P=0.048)，MALAT1基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.223，P=0.038)。本研究通过分析MIAT基因的表达水平与临床指标之间的相关性发现在2型糖尿病组的全体人群中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.382，P<0.001)；在2型糖尿病组的男性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.287，P<0.001)；在2型糖尿病组的女性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关(r=0.678，P<0.001)。在对照组的全体人群中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.193，P=0.01)；在123 新疆医科大学博士学位论文对照组的男性中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关(r=0.316，P=0.003)。本研究根据MEG3、MALAT1和MIAT表达的差异绘制受试者工作特征(ROC)曲线发现MEG3表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.818(95%CI：0.777-0.859，P<0.001)，灵敏度为94.9%，特异度为94.4%；MALAT1表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.838(95%CI：0.723-0.954，P<0.001)，灵敏度为95.5%，特异度为95.2%；MIAT表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.805(95%CI：0.666-0.944，P=0.001)，灵敏度为95.0%，特异度为95.0%，提示外周血MEG3、MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病有较好的诊断价值。3.6展望最近的研究对于lncRNAs的调节和功能提供了新的见解。虽然lncRNAs的调节在糖尿病模型(组织样本、人体和小鼠起源的细胞等)中已经被证明，然而功能机制研究仅限于小部分lncRNAs。首先，运用功能获得性和缺失性的方法表明lncRNAs确实在糖尿病及其并发症中具有重要作用。更重要的是，药理学的抑制研究表明lncRNAs可能作为有效的治疗靶点。这对于糖尿病及其并发症治疗策略的发展是一种重大的机会。运用lncRNAs作为潜在的治疗糖尿病的靶点能够产生新的挑战和机会，随着各种技术水平的发展，特别是新一代的测序技术对于基因组的研究是一种彻底的变革，能够揭示人体复杂的转录组，对于确定组织特异性和细胞特异性表达的lncRNAs靶基因具有重要作用。LncRNAs通过调节复杂的信号节点或网络，能够提供治疗机会改善血糖的代谢。糖尿病研究和临床医生更好的理解LncRNAs在血糖代谢和糖尿病并发症中的作用，在管理糖尿病患者时能够有效的把实验室中的全新研究成果转向于临床。4小结4.1通过分析2型糖尿病组和对照组中MEG3、MALAT1、MIAT的表达差异，结果显示，与对照组MEG3基因的表达量相比，2型糖尿病组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MALAT1基因的表达量相比，2型糖尿病组MALAT1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MIAT基因的表达量相比，2型糖尿病组MIAT基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。4.2在2型糖尿病组全体人群和男性中，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组女性中，MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组全体人群、女性中，MALAT1高表124 新疆医科大学博士学位论文达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组男性中，MIAT高表达组舒张压水平低于MIAT低表达组舒张压水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组女性中，MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.3在2型糖尿病组全体人群和男性中，MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组女性中，MEG3基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群和女性中，MALAT1基因的表达量与血糖、总胆固醇和低密度脂蛋白水平呈正相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)；在2型糖尿病组男性中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群中，MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；在对照组女性中，MALAT1基因的表达量与血糖和收缩压水平呈正相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中，MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群和男性中，MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.4根据MEG3、MALAT1和MIAT表达的差异绘制受试者工作特征(ROC)曲线，MEG3表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.818(95%CI：0.777-0.859，P<0.001)，灵敏度为94.9%，特异度为94.4%；MALAT1表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.838(95%CI：0.723-0.954，P<0.001)，灵敏度为95.5%，特异度为95.2%；MIAT表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.805(95%CI：0.666-0.944，P=0.001)，灵敏度为95.0%，特异度为95.0%，提示外周血MEG3、MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病有较好的诊断价值。125 新疆医科大学博士学位论文第三部分MEG3对高糖诱导的内皮细胞功能障碍的影响及作用机制[245]内皮细胞是血管壁的最内层，对于调节局部血管的张力具有重要作用。研究者们对内皮细胞在生理和病理状态下的意义进行了大量的研究。内皮细胞的作用包括内皮细胞衍生血管活性因子的释放、防止血小板的聚集和白细胞的粘附以及调节细胞的增殖。在血管中，通过层流组成性激活了内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。一氧化氮(NO)是局部血管张力的主要内皮调节因子，能够抑制血管收缩的前列腺素和内皮素-1(ET-1)等血管活性因子的产出和/或功能。在疾病的早期阶段，当NO介导的反应损伤后，前列环素和/或内皮依赖性超极化帮助损伤的代偿。后期由于内皮细胞释放NO的能力进行性减少，内皮细胞衍生和环氧化酶依赖的收缩因子和/或ET-1的产出变得尤为突出，有利于血管的收缩。在此期间，由于NO保护作用效果的减退，内皮细胞的血管细胞粘附分子1(VCAM-1)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达增加，[246-248]导致白细胞的粘附和渗透。[249]在糖尿病患者中观察到NO的可利用性减少和血管收缩物质增加。多元醇途[250][251][252]径的增加、甘油二酯的形成、醛糖还原酶、晚期糖基化终产物、蛋白激酶[253][254]C(PKC)和6-磷酸果糖可能是糖尿病介导血管破坏的可能机制。内皮细胞功能障碍是糖尿病血管病变的最常见的特征之一。糖尿病患者的氧化应激和eNOS解偶[255]联是内皮细胞功能障碍的基本组成。高糖血症是内皮细胞功能损害的的主要原因[256]。高糖血症导致的晚期糖基化终末产物对NO生物利用度的影响致命，因此导致[257]内皮细胞功能障碍。在内皮细胞系统中，晚期糖基化终末产物与巨噬细胞、单核细胞和血管平滑肌细胞炎症和氧化应激反应增强密切相关。由于血管内皮细胞对血[258]糖非常敏感，因此，内皮细胞是高血糖损伤的直接靶点。越来越多的证据表明lncRNAs可以作为高糖血症相关内皮细胞功能障碍或糖尿病诱导的血管疾病的全新治疗靶点。在STZ诱导的糖尿病大鼠和db/db小鼠的视网膜中，MALAT1表达水平增加。糖尿病视网膜病变包括周细胞损失、毛细血管变性、微血管渗漏和视网膜炎症。MALAT1的敲除能够明显缓解体内糖尿病视网膜病变。同时，MALAT1敲除能够上调视网膜内皮细胞的增殖、迁移和微管形成。MALAT1和p38MAPK信号通路之间的联系参与内皮细胞功能的调节。MALAT1上调是糖尿病诱导的微血管功能障碍的重要发病机制。抑制MALAT1可能是抗血管生成治疗糖尿病相关微血管并发症[259][168]的潜在靶点。Puthanveetil等在不同血糖水平培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，发现MALAT1的表达在12小时后表达增加到高峰，这种增加与血清淀126 新疆医科大学博士学位论文粉样抗原3(SAA3)平行增加，随着炎症介导基因的TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白的增加，炎症配体和MALAT1的目标基因也随之增加。在糖尿病视网膜和高糖孵育的内皮细胞中MIAT表达水平增加。在体内，MIAT敲除能够明显缓解糖尿病诱导的视网膜微血管功能障碍。在体外，抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。MIAT作为竞争内源性的RNA，与血管内皮生长因子和miR-150-5p形成了反馈环调节内皮细胞[260]的功能。深入了解内皮细胞的lncRNAs可能为糖尿病及其并发症提供了全新的生物标记物和治疗靶点。因此，增加对糖尿病诱导的内皮细胞功能障碍潜在分子机制的理解和识别全新的潜在治疗靶点预防或减少糖尿病并发症非常重要。对于大部分lncRNAs在保持内皮细胞功能和糖尿病并发症中的作用机制研究还很缺乏。基于本研究前两部分的结果，我们通过芯片技术确定了2型糖尿病中差异表达的lncRNAs，同时采用实时荧光定量PCR技术及ROC曲线分析，提示外周血MEG3、MALAT1和MIAT的相对表达量对2型糖尿病有较好的诊断价值。然而，目前有关MEG3在高糖诱导的HUVECs功能障碍中的作用机制还未见报道。因此，本部分的研究目的是调查MEG3是否是高糖诱导的HUVECs功能障碍的潜在治疗靶点和分子标志物。本部分以HUVECs为研究对象，高糖诱导的HUVECs作为内皮细胞功能障碍模型，模拟糖尿病内皮损伤的高糖环境，通过RNAi慢病毒载体构建和包装敲除MEG3基因的表达，采用实时荧光定量PCR技术、MTT实验、FITC-PI双染流式细胞术和Westernblot技术，观察MEG3基因敲除后，炎症细胞因子的表达、细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达、TGFβ和Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白的表达。通过观察MEG3基因敲除后，对高糖诱导的HUVECs生理功能和生物学行为的改变，从而推断MEG3在糖尿病内皮细胞损伤发生发展中的作用机制及可能的调控方式，为进一步探究糖尿病血管并发症的发病机制及防治策略提供新的思路。1研究内容与方法1.1研究材料人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.2主要试剂及实验设备1.2.1主要试剂1.2.1.1细胞培养相关试剂⑴胎牛血清(HyClone公司)⑵DMEM高糖培养基(HyClone公司)⑶DMEM低糖培养基(HyClone公司)⑷PBS(HyClone公司)⑸0.25%胰酶(HyClone公司)127 新疆医科大学博士学位论文⑹双抗(HyClone公司)⑺DMSO(HyClone公司)1.2.1.2慢病毒载体构建和包装相关试剂(吉凯公司)⑴10×CutSmartBuffer⑵T4DNAligase⑶2×TaqPlusMasterMix⑷pHelper1.0载体质粒⑸pHelper2.0载体质粒⑹GV载体质粒⑺AgeⅠ⑻EcoRⅠ⑼质粒DNA1.2.1.3慢病毒感染相关试剂(吉凯公司)⑴Enhancedinfectionsolution⑵Polybrene⑶MEG3siRNA⑷ScramblesiRNA1.2.1.4细胞总蛋白提取的相关试剂⑴RIPA(Thermo公司)⑵PMSF(Sigma-Aldrich公司)1.2.1.5细胞总蛋白定量的相关试剂⑴牛血清白蛋白(BCA)标准品(Thermo公司)⑵BCA试剂A(Thermo公司)⑶BCA试剂B(Thermo公司)⑷4×蛋白上样缓冲液(Solarbio公司)1.2.1.6Westernblot的相关试剂⑴SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Solarbio公司)⑵Glycine(VETEC公司)⑶Trizma®base(VETEC公司)⑷SDS(BIOFROXX公司)⑸甲醇⑹脱脂奶粉⑺TBST(上海生工生物工程有限公司)⑻anti-Bax(Abcam公司)128 新疆医科大学博士学位论文⑼anti-Bcl-2(Abcam公司)⑽anti-Caspase3(Abcam公司)⑾anti-P53(Abcam公司)⑿anti-β-catenin(Abcam公司)⒀anti-SMAD2(Abcam公司)⒁anti-GAPDH(Abcam公司)⒂goatanti-MouseIgG(Abcam公司)⒃goatanti-RabbitIgG(Abcam公司)⒄ECL超敏化学发光试剂盒(Thermo公司)1.2.1.7MTT检测细胞增殖的相关试剂(博士德生物)⑴MTT染色液⑵Formanzan溶解液1.2.1.8流式细胞术检测细胞凋亡的相关试剂(BDBiosciences公司)⑴1×BindingBuffer⑵FITCAnnexinV⑶PropidiumIodide1.2.2实验设备⑴细胞培养瓶(BD公司)⑵细胞培养板(BD公司)⑶倒置显微镜(OLYMPUS公司)⑷荧光显微镜(OLYMPUS公司)⑸CO2恒温细胞培养箱(Sanyo公司)⑹超净工作台(苏净集团安泰公司)⑺-20℃低温冰箱(Thermo公司)⑻-80℃低温冰箱(Thermo公司)⑼高速冷冻离心机(Thermo公司)⑽凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)⑾电泳槽(BIO-RAD公司)⑿转膜槽(BIO-RAD公司)⒀酶标仪(BIO-RAD公司)⒁流式细胞仪(BectonDicknson公司)⒂流式细胞管(BD公司)⒃纯水仪(Millipore)⒄电子分析天平(Sartorius公司)129 新疆医科大学博士学位论文⒅微量移液器(Eppendorf公司)⒆实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems公司)⒇NanoDrop(Thermo公司)1.3方法1.3.1人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞培养1.3.1.1细胞换液人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在含有10000units/ml青霉素、10000μg/ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中进行培养，接种于细胞培养瓶中置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行细胞培养。每两天对HUVECs进行一次细胞换液，双手消毒将培养瓶从培养箱中拿出，消毒瓶口，弃去原培养基，用灭菌的2mL的PBS清洗细胞2-3次，洗净细胞残留代谢产物后弃去PBS，重新加入4ml的完全培养基置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中继续培养。1.3.1.2细胞传代在倒置显微镜下观察细胞生长的情况，当细胞生长状态良好且细胞融合度达80%时开始细胞传代。双手消毒将培养瓶从培养箱中拿出，消毒瓶口，弃去原培养基，用灭菌的2mL的PBS清洗细胞2-3次，弃去PBS，加入1mL的0.25%胰酶进行细胞消化，使胰酶均匀的分布在细胞表面，并放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中消化1分钟后，在显微镜下观察细胞变化，待细胞胞质出现收缩﹑细胞间隙增大、胞体趋于变圆、细胞间不再连接成片时，加入2mL完全培养基终止胰酶消化。用吸管吸取瓶内培养基，反复轻柔吹打培养瓶贴壁细胞，使细胞充分分散，形成细胞悬液。将细胞悬液吸至离心管，离心机内1000rpm离心5分钟，取出离心管，弃上清液，加入2mL完全培养基反复轻柔吹打离心管中的细胞形成细胞悬液，进行细胞计数，以510个/ml分装入新的培养瓶中，标注传代次数及日期，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中继续培养，2-3天后进行细胞换液。1.3.1.3细胞复苏从-80℃超低温冰箱中取出冻存细胞，迅速置于37℃恒温水浴箱中水浴，并不时摇动使其尽量在1min内完全融化，待融化后变成细胞悬液，室温下1000rpm离心5分钟，移入超净台，酒精消毒后打开冻存管，弃去冻存液，加入完全培养基，再次5轻轻吹打混匀细胞，制成细胞悬液，然后将重新悬浮的细胞以10个/ml分装入新的培养瓶中，加入4ml完全培养基，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，次日倒置显微镜下观察细胞贴壁后进行细胞换液。1.3.1.4细胞冻存按胎牛血清:DMSO为9:1的比例配置细胞冻存液，置于常温下待用。将对数期生长状态良好的细胞进行细胞冻存，待细胞长至瓶底80%后，加入0.25%的胰酶消130 新疆医科大学博士学位论文化细胞，使胰酶均匀的分布在细胞表面，并放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中消化1分钟后，在显微镜下观察细胞变化，待细胞胞质出现收缩﹑细胞间隙增大、胞体趋于变圆、细胞间不再连接成片时，加入2mL完全培养基终止胰酶消化。用吸管吸取培养瓶中的培养基反复轻柔的吹打细胞，形成细胞悬液，将细胞悬液置于离心机内室温1000rpm离心5分钟，弃上清液，缓慢加入适量配置好的细胞冻存液，轻67轻吹打细胞，形成细胞悬液，使细胞的浓度为10-10/ml，混合均匀。将细胞悬液分装至1ml冻存管内，严格密封，标记细胞名称、代数、冻存日期和操作者的姓名。冷冻保存的方法遵循慢冻的要求，先将冻存管置于4℃冰箱30分钟，随后转入-20℃冰箱2小时，最后转移至-80℃冰箱长期保存。1.3.1.5细胞计数双手消毒将培养瓶从培养箱中拿出，消毒瓶口，弃去原培养基，用灭菌的2mL的PBS清洗细胞2-3次，弃去PBS，加入1mL的0.25%胰酶进行细胞消化，使胰酶均匀的分布在细胞表面，并放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中消化1分钟后，在显微镜下观察细胞变化，待细胞胞质出现收缩﹑细胞间隙增大、胞体趋于变圆、细胞间不再连接成片时，加入2mL完全培养基终止胰酶消化。用吸管吸取瓶内培养基，反复轻柔吹打培养瓶贴壁细胞，使细胞充分分散，形成细胞悬液。将细胞悬液吸至离心管，离心机内1000rpm离心5分钟，取出离心管，弃上清液，加入1mL完全培养基反复轻柔吹打离心管中的细胞形成细胞悬液，进行细胞计数，取待测混匀的1mL细胞悬液从血球计数板上方的凹槽加入，盖上盖玻片，细胞悬液在虹吸作用下向内移动，将计数板移至的倒置显微镜下观察，待细胞静置后开始计数，移动计数板，分别计算出四个大格子内的细胞数目并记录数值。若细胞位于线上，只计算上线与4右线的细胞。按照公式计算细胞密度：细胞密度=(四个大格子的细胞总数/4)×10×稀释倍数=细胞数/ml。1.3.2RNAi慢病毒载体构建和包装1.3.2.1RNAi慢病毒克隆的制备利用限制性内切酶消化获得线性化载体。引物退火制备目的片段。所设计引物在其两端添加酶切位点。该引物退火后与线性化克隆载体两末端含有相同的酶切位点。以线性化载体和退火产物配制反应体系，进行连接反应，产物直接进行转化。挑取平板上的单克隆PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒用于下游病毒包装(图3-1)。1.3.2.1.1目的基因及工具载体的信息⑴目的基因的靶点序列为UUAGGUAAGAGGGACAGCUGGCUGG。⑵工具载体为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin(图3-2)。1.3.2.1.2载体酶切131 新疆医科大学博士学位论文⑴配制50μl的酶切体系，包括41μl的ddH2O、5μl的10×CutSmartBuffer、2μl的纯化质粒DNA、1μl的AgeⅠ和1μl的EcoRⅠ。⑵用移液器轻柔吹打混匀，短暂离心，37℃反应1小时或过夜。⑶对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。1.3.2.1.3目的基因片段的获取⑴病毒载体构建框架。⑵合成单链引物。⑶引物退火形成双链DNA。1.3.2.1.4退火产物与载体进行连接通过T4DNAligase将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，16℃连接反应1小时或过夜。1.3.2.1.5转化⑴将10μl交换反应产物加入到100μl的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，放置于冰上30分钟，42℃热刺激90秒，冰水浴2分钟。⑵加入500μl的LB培养基，置于37℃摇床震荡培养1小时。⑶取适量菌液均匀涂抹在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中培养12-16小时。1.3.2.1.6菌落PCR鉴定配制20μl的反应体系，包括9.20μl的ddH2O、10μl的2×TaqPlusMasterMix、0.4μl的上游引物和0.4μl的下游引物。PCR反应条件包括94℃反应3分钟，94℃反应30秒，55℃反应30秒，72℃反应30秒，扩增22个循环，72℃反应5分钟。1.3.2.1.7测序将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB培养基中，37℃培养12-16小时，取适量菌液进行测序。1.3.2.1.8质粒抽提将测序正确的菌液转接于含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，进行质粒抽提，抽提合格的质粒用于下游病毒包装。图3-1RNAi慢病毒克隆的制备流程Fig.3-1PreparationprocessofRNAilentivirusclone132 新疆医科大学博士学位论文图3-2hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin载体图谱Fig.3-2VectormapofhU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin1.3.2.2RNAi慢病毒包装与质粒检测采用二代自失活型慢病毒包装系统完成包装过程。采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72小时进行病毒收获，采用浓缩纯化方式得到高低度的慢病毒保存液(图3-3)。图3-3RNAi慢病毒包装与质粒检测流程RNAilentiviruspackagingandplasmiddetectionprocess133 新疆医科大学博士学位论文1.3.2.2.1质粒转染与慢病毒收获⑴转染前24小时，用0.25%胰蛋白酶消化293T细胞，以含10%胎牛血清的培养6基调整细胞密度约10细胞/15ml，重新接种于细胞培养皿，置于37℃、5%CO2恒温培养箱内。⑵转染前2小时换为无胎牛血清的培养基。⑶向离心管中加入所制备的各DNA溶液包括GV载体质粒、pHelper1.0载体质粒和pHelper2.0载体质粒(图3-4)，与相应的转染试剂混匀，使终体积为1ml，室温下孵育15分钟。⑷将反应液加至293T细胞培养液中，混合均匀，置于37℃、5%CO2恒温培养箱内。⑸培养6小时后弃培养基，加入PBS清洗细胞，轻柔晃动后弃PBS。⑹加入适量含有10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%CO2恒温培养箱内继续培养2-3天。1.3.2.2.2慢病毒浓缩与纯化⑴收集转染后的293T细胞上清液。⑵置于离心机内4℃、4000g离心10分钟。⑶用滤器过滤上清液至超速离心管中。⑷将带有病毒的上清液置于超速离心机，4℃、25000rpm离心2小时。⑸弃上清液，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬细胞。⑹混合均匀后，以10000rpm高速离心5分钟，取上清液分装。1.3.2.2.3慢病毒质量检测⑴通过颜色和粘稠度的物理指标检测慢病毒的质量，慢病毒呈粉红色澄清的液体且粘稠感或吸液滞后现象。⑵将慢病毒加入293T细胞，正常培养24小时，无任何细菌污染情况，培养基澄清透明。⑶通过荧光法和药筛法检测滴度。1.3.3RNAi慢病毒感染实验1.3.3.1RNAi慢病毒感染预实验1.3.3.1.1接种人脐静脉内皮细胞4用含有10%胎牛血清的完全培养基制备密度为3-5×10个/ml的人脐静脉内皮细胞悬液，分为A：常规培养基组、B：常规培养基+Polybrene组、C：Enhancedinfection134 新疆医科大学博士学位论文solution(ENi.S.)组、D：ENi.S.+Polybrene组和E：空白对照组，取100μl/孔加入96孔板中，继续培养24小时。1.3.3.1.2感染87⑴用ENi.S.将慢病毒稀释为三种浓度，分别为1×10TU/ml、1×10TU/ml和16×10TU/ml。⑵分别制备含50μg/mlPolybrene的常规培养基、含50μg/mlPolybrene87的ENi.S.溶液，各200μl。⑶弃掉各孔中的上清液，在1×10TU/ml、1×10TU/ml6和1×10TU/ml三种浓度下分别制备A：常规培养基组、B：常规培养基+Polybrene组、C：ENi.S.组、D：ENi.S.+Polybrene组和E：空白对照组，其中常规培养基组中常规培养基为90μl、慢病毒为10μl，常规培养基+Polybrene组中常规培养基为80μl、Polybrene为10μl、慢病毒为10μl，ENi.S.组中ENi.S.为90μl、慢病毒为10μl，ENi.S.+Polybrene组中ENi.S.为80μl、Polybrene为10μl、慢病毒为10μl，空白对照组中常规培养基为100μl，各组中混匀溶液继续培养。⑷感染后12小时换回常规培养基，过程中观察细胞形态，发生变化时可以提前进行细胞换液，保持细胞正常生长。1.3.3.1.3继续培养继续培养人脐静脉内皮细胞3-4天，进行常规的细胞换液，保持细胞活性。1.3.3.1.4感染效果确认感染72小时后，荧光表达丰度较高时，用倒置荧光显微镜观察细胞，当感染效率为80%左右时，且生长转态良好的组所对应的的感染条件和MOI即可作为后续实验的依据。1.3.3.2RNAi慢病毒感染正式实验1.3.3.2.1接种人脐静脉内皮细胞4用含有10%胎牛血清的完全培养基制备密度为3-5×10个/ml的人脐静脉内皮细胞悬液，取2ml/孔加入到6孔板中，继续培养24小时。1.3.3.2.2感染⑴按照预实验结果，更换完全培养基1ml/孔。⑵添加Polybrene，使Polybrene的终浓度为5μg/ml。⑶加入相应的慢病毒，病毒体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。⑷感染后12小时换回常规培养基，继续培养。1.3.3.2.3继续培养继续培养人脐静脉内皮细胞3-4天，进行常规的细胞换液，保持细胞活性。1.3.3.2.4感染效果确认按照预实验中确认的感染时间，观察感染效率，进行后续实验。1.3.4细胞分组4接种人脐静脉内皮细胞：用含有10%胎牛血清的完全培养基制备密度为3-5×10个/ml的人脐静脉内皮细胞悬液，取2ml/孔加入到6孔板中，继续培养24小时，根135 新疆医科大学博士学位论文据实验需要进行实验分组，分为A：Control组(5mMD-葡萄糖)、B：HG组(30mMD-葡萄糖)、C：HG+MEG3siRNA组、D：HG+scramblesiRNA组。1.3.5细胞中总RNA的提取和质检⑴取对数生长期的细胞，加入0.25%的胰酶消化收集细胞，弃上清液，PBS洗涤细胞2-3次，加入1ml的Trizol试剂，充分震荡混匀。⑵加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置5分钟。⑶以4℃，12000×g离心15分钟，样品分为黄色的有机相、中间相以及上层的无色水相，RNA主要在无色水相中，吸取上层的无色水相，移入到新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置30分钟。⑷以4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液，在离心管底部发现白色的RNA沉淀。⑸加入1ml75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤。⑹以4℃，2300×g离心5分钟，弃洗涤液。⑺室温放置干燥RNA沉淀3-5分钟，加入30-100μL的RNasefreeddH2O，反复吹打混匀RNA沉淀。⑻采用紫外分光光度计进行定量，确保所用样本RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，采用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，确保RNA完整无降解。1.3.6RNA逆转录合成cDNA⑴在解冻以后，将试剂盒中的各个组分混匀并短暂的离心，离心后静置于冰上。在置于冰上的无菌无核酸酶的离心管中，按以下顺序加入反应物：①0.1ng-5μg的模板RNA。②1μL的Oligo(dT)18引物。⑶加入无核酸酶的高纯水至总体为12μL。⑵如果RNA模板GC含量丰富或者包含二级结构，轻轻混匀，短暂离心后65℃孵育5分钟，静置于冰上冷却，短暂离心后再静置于冰上冷却。⑶按以下顺序加入反应物至12μL的反应体系中使总体积为20μL：①4μL的5×ReactionBuffer。②1μL的RiboLockRNaseInhibitor(20U/μL)。③2μL的10mMdNTPMix。④1μL的RevertAidM-MuLVRT(200U/μL)。⑷轻轻混匀后短暂离心。⑸对于Oligo(dT)18或基因特异性引物cDNA合成，在42℃孵育60分钟。值得注意的是对于GC含量丰富的RNA模板反应温度增加至45℃。⑹通过70℃加热5分钟终止反应。逆转录反应产物直接用于PCR反应或储存于-20℃保存时间小于一周，若要长期保存，推荐-70℃保存。1.3.7实时荧光定量PCR反应TM⑴使用Takara公司的SYBR®PremixExTaqⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。目的基因以及内参基因β-actin的引物由上海生工生物有限公司合成(表3-1)，引物长度为18-29bp，扩增产物在250-350bp之间，引物设计跨内含子区域，退火温度为57℃至70℃。⑵实时荧光定量PCR反应体系为20μL，包括10μL的SYBR®TMPremixExTaqⅡ(2×)，0.8μL的PCRForwardPrimer(10uM)，0.8μL的PCRReversePrimer(10uM)，0.4μL的ROXReferenceDye(50×)，2μL的cDNA，6μL的RNasefreeddH2O。⑶实时荧光定量PCR反应条件为95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火30秒，扩增45个循环，延伸72℃45秒。⑷实时荧光定量PCR的数据分析采136 新疆医科大学博士学位论文-△△CT用2法，CT值代表每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。所有样本都是以内参基因β-actin标准化后计算样品目的基因的相对表达量，每个样本检测3个复孔，计算3次重复试验的CT平均值作为该样本的实际CT值，将每个样本目的基因CT值减去其内参基因CT值即为每个样本△CT值，每个样本的△CT值减去对照组所有样本△CT的平均值即为每个样本△△CT值，最后求得每个样本-△△CT的2值即为目的基因的相对表达量。表3-1目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR引物序列Table3-1Sequenceofreal-timequantitativePCRPrimersforthetargetgeneandreferencegene基因引物序列F:5'-CATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3'MEG3R:5'-GTCCTCTTCATCCTTTGCCATCC-3'F:5'-GTGATGGTGGGAATGGG-3'α-SMAR:5'-CAGGGTGGGATGCTCTT-3'F:5'-CCCTGATGAGATCGAGTACA-3'VEGFR:5'-AGGAAGCTCATCTCTCCTAT-3'F:5'-GTCCAGGCTTGTCCTGCTAC-3'TNF-αR:5'-CTGAGTCCGTTGAGGGAGAG-3'F:5'-CGGGAACGAAAGAGAAGCTCTA-3'IL-6R:5'-GAGCAGCCCCAGGGAGAA-3'F:5'-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3'TGF-β1R:5'-GTGGGTTTCCACCATTAGCAC-3'F:5'-CTTTTGTTGTGTAAGCTCTCACTG-3'SMAD2R:5'-GACCTTCTACCACTTTCAGAGTTG-3'F:5'-GGACAGCTCAATTCGGACAAC-3'SMAD7R:5'-GTACACCCACACACCATCCAC-3'F:5'-GTGTGGCGACATATGCAGCT-3'β-cateninR:5'-CAAGATCAGCAGTCTCATTC-3'F:5'-CAATAATCTCCGCTCCCAGA-3'TCF7L2R:5'-CGCTCGGATTTGAGTGAGTT-3'F:5'-GTGCATCTACACCGACAACTCCA-3'CyclinD1R:5'-TGAGCTTGTTCACCAGGAGCA-3'F:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'β-actinR:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'137 新疆医科大学博士学位论文1.3.8细胞总蛋白的提取⑴收集六孔板中的细胞于离心管中，用PBS洗涤细胞2-3遍，离心机内室温1000rpm离心5分钟，取出离心管，弃上清液。⑵按RIPA:PMSF=100:1的比例配制细胞裂解液，混合均匀后冰上静置备用。⑶向离心管中的细胞中加入细胞裂解液，反复吹打细胞混匀，冰上裂解20-30分钟。⑷置于离心机内4℃、15000rpm离心20分钟，离心完毕后，收集上清液即为所提取的细胞总蛋白，置于-80℃冰箱保存备用。1.3.9细胞总蛋白的定量⑴将2mg/ml的牛血清白蛋白(BCA)标准品梯度稀释，使标准品的浓度依次为2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml、0μg/ml。⑵按公式计算所需BCA工作液的总体积，工作液的总体积=(标准品的个数+待测蛋白样品的个数)×重复次数×用于每个样品工作液的体积，按试剂A:试剂B=50:1的比例制备工作液，当试剂B加入到试剂A中时，开始有浑浊产生，随后浑浊迅速消失，得到绿色澄清的工作液。⑶取各个稀释的牛血清白蛋白(BCA)标准品和待测蛋白质样品各25μl，加入到96孔板中。⑷每孔中加入200μl工作液，并在振荡器上震荡1分钟，使其混匀均匀。⑸将96孔板密封，在37℃孵育30分钟。⑹将96孔板冷却至室温，用酶标仪测量样品在562nm波长的吸光度，根据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。⑺根据蛋白样品的浓度确定蛋白上样体积，按蛋白上样体积:4×蛋白上样缓冲液=4:1的比例混匀，100℃煮沸5分钟变性，冷却至室温，放置-80℃冰箱保存备用。1.3.10Westernblot检测蛋白表达1.3.10.1SDS-PAGE凝胶制备⑴用少量清洗剂洗净玻璃板，室温下晾干，固定于支架后加满ddH2O，观察10分钟后若液面保持不变，则玻璃板密封良好，可以进行后续实验。⑵按SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书制备分离胶，依次加入4ml的ddH2O、3.3ml的30%丙烯酰胺(29:1)、2.5ml的1.5MTris-HCl(PH8.8)、100μl的10%SDS、10μl的TEMED和100μl的10%过硫酸铵，缓慢加入无水乙醇，室温放置30-40分钟，当无水乙醇和胶面交界处出现了折水线，说明下层的分离胶已经凝固，弃无水乙醇，用吸水纸吸干无水乙醇。⑶按SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书制备浓缩胶，依次加入3.42ml的ddH2O、0.83ml的30%丙烯酰胺(29:1)、0.625ml的1MTris-HCl(PH6.8)、50μl的10%SDS、7.5μl的TEMED和75μl的10%过硫酸铵，将浓缩胶缓慢加入分离胶之上直至玻璃板顶端，迅速将上样梳插入浓缩胶中。1.3.10.2上样⑴胶槽固定于电泳槽中，向电泳槽内注满1×电泳缓冲液，拔掉上样梳，避免气泡的产生。⑵向浓缩胶的上样孔中加入待测蛋白样品及蛋白Marker，上样量为各138 新疆医科大学博士学位论文20ul，避免样品扩散到电泳液中。1.3.10.3电泳⑴盖好电泳槽盖，核对正负极，连接电泳仪与电泳槽，接通电源。⑵恒压90V，待样品跑至分离胶时，电压调制120V，继续电泳，电泳的时间取决于蛋白分子量，待样品跑至胶底部时关闭电泳仪，从电泳槽中拿出玻璃板，小心取出SDS-PAGE凝胶，切勿损伤凝胶。1.3.10.4转膜⑴根据Marker说明书，按所需蛋白分子量大小对应的条带切去上层浓缩胶和无用的分离胶。⑵剪取与所切分离胶面积相仿的PVDF膜，放入甲醇浸泡活化10分钟。⑶将滤纸、转膜夹、海绵垫放置转膜液中一起浸泡，在转膜夹中由下至上依次放入海绵垫、3层滤纸、分离胶、PDVF膜、3层滤纸和海绵垫。用玻璃棒去除产生的气泡，注意动作轻柔防止胶裂。将转膜夹放入转膜电泳槽中，转膜槽内注满转膜缓冲液，盖上转膜电泳槽盖，核对正负极，保证槽内PVDF膜面向正极，分离胶面向负极。将组装好的转膜槽放在预先用碎冰覆盖四周的冰盒中，便于加速散热。⑷连接电泳仪与转膜槽，接通电源，以200mA恒流转膜约1.5小时。⑸转膜完毕后关闭电源。1.3.10.5封闭⑴将2.5g的脱脂奶粉溶于50ml的TBST缓冲液中，配制成5%封闭液。⑵电转膜结束后，将PVDF膜放置于10ml的5%封闭液中进行封闭，室温下放置于摇床摇动约1小时。⑶TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。1.3.10.6一抗孵育⑴按照一抗的使用说明书，用TBST缓冲液稀释一抗，配制anti-Bax(1:1000稀释)、anti-Bcl-2(1:2000稀释)、anti-Caspase3(1:200稀释)、anti-P53(1:200稀释)、anti-β-catenin(dilutionin1:5000稀释)、anti-SMAD2(1:2000稀释)、anti-GAPDH(1:10000稀释)，将PVDF膜放入稀释的一抗中，放置4℃摇床上孵育过夜。⑵次日TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。1.3.10.7二抗孵育⑴按照二抗的使用说明书，用TBST缓冲液稀释二抗，配制goatanti-MouseIgG(1:1000稀释)和goatanti-RabbitIgG(1:20000稀释)，将PVDF膜放入稀释的二抗中，室温下放置于摇床上孵育1小时。⑵TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。1.3.10.8曝光显影将ECL超敏化学发光试剂盒中的A液与B液按1:1的比例混匀，将制备好的显色液滴加在PVDF膜上，孵育2分钟，在曝光机中进行曝光显影。139 新疆医科大学博士学位论文1.3.11MTT检测细胞增殖4⑴收集对数期细胞，通过计数板计数，调整细胞悬液的浓度为2×10个/ml，在96孔板中每孔加入200μl的细胞悬液，每组设置6个复孔。⑵放入37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，显微镜下观察细胞的形态和活力。⑶分别在培养0、24、48、72和96小时后，每孔加入10μl的MTT染色液，继续培养4小时。⑷弃细胞培养基，每孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育10分钟。⑸在酶联免疫检测仪570nm测定吸光度，实验重复3次，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线，计算每组的增殖能力。1.3.12AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡⑴取对数生长期的细胞，加入0.25%的胰酶消化收集细胞，弃上清液，PBS洗涤6细胞2-3次，用1×BindingBuffer重悬细胞，使细胞悬液的浓度为1×10个/ml。⑵取100μl的细胞悬液加入到流式管中。⑶加入5μl的FITCAnnexinV和5μl的PI至100μl的细胞悬液中，轻柔混匀，在避光的室温下孵育15分钟。⑷加入400μl的1×BindingBuffer至离心管中，1小时内放置流式细胞仪中对其进行检测。⑸应用CellQuest软件对结果进行分析，实验重复3次。1.4统计学方法应用SPSS17.0软件包对数据进行处理，计量资料以xs表示，两组间计量资料比较方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t’检验；多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法分析，采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1RNA的纯度及浓度的检测所有用于实时荧光定量PCR实验的样本，对提取的总RNA进行核酸分析仪及1%琼脂糖电泳检测。核酸分析仪检测结果显示：所用样本RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，表明RNA的纯度符合质量标准；琼脂糖电泳检测结果显示：18S和28S两条带明亮、分离清晰、无拖带和扩散现象，条带均完整且28S条带亮度是18S条带亮度的两倍以上，表明RNA完整无降解，具体结果见图3-5。图3-5RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.3-5RNAagarosegelelectrophoresis140 新疆医科大学博士学位论文2.2溶解曲线和扩增曲线结果分析所有进行实时荧光定量PCR实验基因的融解曲线呈单峰，无其它杂峰，表明引物特异性良好，扩增产物具有特异性，无其它非特异性扩增产物，重复性很好，反应体系稳定，定量准确；扩增曲线的CT值均在正常范围内，表明数据真实可靠，具体结果见图3-6、3-7、3-8和3-9。图3-6MEG3和β-actin基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.3-6AmplificationplotandmeltcurveplotofMEG3andβ-actingene图3-7α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.3-7Amplificationplotandmeltcurveplotofα-SMA,VEGF,TNF-αandIL-6gene141 新疆医科大学博士学位论文图3-8TGF-β1、SMAD2和SMAD7基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.3-8AmplificationplotandmeltcurveplotofTGF-β1,SMAD2andSMAD7gene图3-9β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.3-9Amplificationplotandmeltcurveplotofβ-catenin,TCF7L2andCyclinD1gene142 新疆医科大学博士学位论文2.3MEG3基因在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的表达情况为探讨MEG3与高糖诱导的内皮细胞功能障碍的关系，本研究首先观察高糖刺激48、72、96小时对体外培养的人脐静脉内皮细胞中MEG3表达影响。实时荧光定-△△CT量PCR的实验结果(2)表明，分别与48、72、96小时正常糖(Control，5mMD-glucose)培养的人脐静脉内皮细胞相比，高糖(HG，30mMD-glucose)刺激48、72、96小时后，MEG3的表达水平以时间依赖方式表达下降。在48小时，Control组MEG3的表达量为1.01±0.07，HG组MEG3的表达量为0.95±0.08，差异具有统计学意义(P<0.05)；在72小时，Control组MEG3的表达量为1.00±0.16，HG组MEG3的表达量为0.87±0.15，差异具有统计学意义(P<0.05)；在96小时，Control组MEG3的表达量为1.00±0.12，HG组MEG3的表达量为0.66±0.20，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-10和表3-2。图3-10MEG3在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中的表达水平Fig.3-10ExpressionlevelofMEG3inhighglucose-inducedHUVECs表3-2MEG3在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞中的表达水平(xs)Table3-2ExpressionlevelofMEG3inhighglucose-inducedHUVECs(xs)TimeControlHighglucose*48h1.01±0.070.95±0.08*72h1.00±0.160.87±0.15*96h1.00±0.120.66±0.20注：*Control组与Highglucose组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。143 新疆医科大学博士学位论文2.4慢病毒MEG3siRNA和scramblesiRNA感染高糖诱导的人脐静脉内皮细胞后，MEG3基因敲除效果的验证为了进一步研究MEG3在高糖诱导的内皮细胞损伤机制和功能方面的意义，我们设计小干扰RNA，进行慢病毒载体的构建和包装，敲除MEG3的表达，进而给予高糖培养的人脐静脉内皮细胞转染慢病毒MEG3siRNA和scramblesiRNA，在慢病毒转染48h后，我们提取转染后不同组细胞的RNA，逆转录成cDNA进行实时荧光-△△CT定量PCR实验，检测MEG3的敲除效率，实时荧光定量PCR的实验结果(2)显示，HG组MEG3的表达量为1.00±0.18，HG+scramblesiRNA组MEG3的表达量为1.01±0.17，HG+MEG3siRNA组MEG3的表达量为0.50±0.20。与HG组和HG+scramblesiRNA组比较，HG+MEG3siRNA组MEG3的表达量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，敲除效果为50.13%；HG组与HG+scramblesiRNA组相比，MEG3的表达量在两组间表达量未发生变化，差异无统计学意义(P﹥0.05)，具体结果见图3-11和表3-3。同时，我们还通过观察慢病毒转染人脐静脉内皮细胞后绿色荧光染料标记的MEG3siRNA和scramblesiRNA来验证转染效率，实验表明慢病毒的转染效率较高，具体结果见图3-12。图3-11MEG3基因敲除效果的验证Fig.3-11ValidationofMEG3knockouteffect表3-3MEG3基因敲除效果的验证(xs)Table3-3ValidationofMEG3knockouteffect(xs)geneHighglucoseScramblesiRNAMEG3siRNA*#MEG31.00±0.181.01±0.170.50±0.20*#注：MEG3siRNA组与Highglucose组比较，MEG3siRNA组与scramblesiRNA组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。144 新疆医科大学博士学位论文图3-12绿色荧光染料标记的MEG3siRNA和scramblesiRNAFig.3-12MEG3siRNAandscramblesiRNAmarkedbygreenfluorescentdyes2.5MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症细胞因子表达的影响为了研究MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞的炎症反应，我们观察炎症细胞因子α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6在MEG3基因敲除后的表达水平的变化。实-△△CT时荧光定量PCR研究结果(2)显示，control组MEG3基因的表达量为1.03±0.12，HG组MEG3基因的表达量为0.59±0.14，HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量为0.14±0.13，HG+scramblesiRNA组MEG3基因的表达量为0.59±0.10，与control组MEG3基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组MEG3基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组α-SMA基因的表达量为1.00±0.10，HG组α-SMA基因的表达量为1.47±0.34，HG+MEG3siRNA组α-SMA基因的表达量为2.26±0.19，HG+scramblesiRNA组α-SMA基因的表达量为1.48±0.10，与control组α-SMA基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组α-SMA基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组α-SMA基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组α-SMA基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组VEGF基因的表达量为1.01±0.18，HG组VEGF基因的表达量为1.37±0.20，HG+MEG3siRNA组VEGF基因的表达量为1.73±0.15，HG+scramblesiRNA组VEGF基因的表达量为1.36±0.07，与control组VEGF基因的表达量相比，145 新疆医科大学博士学位论文HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组VEGF基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组VEGF基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组VEGF基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组TNF-α基因的表达量为1.02±0.25，HG组TNF-α基因的表达量为3.34±0.59，HG+MEG3siRNA组TNF-α基因的表达量为6.31±1.35，HG+scramblesiRNA组TNF-α基因的表达量为3.35±0.68，与control组TNF-α基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组TNF-α基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TNF-α基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TNF-α基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组IL-6基因的表达量为1.00±0.14，HG组IL-6基因的表达量为1.36±0.11，HG+MEG3siRNA组IL-6基因的表达量为1.61±0.12，HG+scramblesiRNA组IL-6基因的表达量为1.26±0.15，与control组IL-6基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组IL-6基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-13和表3-4。图3-13MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症细胞因子表达的影响Fig.3-13MEG3knockdownaffectstheexpressionofinflammatorycytokinesinhighglucose-inducedHUVECs146 新疆医科大学博士学位论文表3-4MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症细胞因子表达的影响(xs)Table3-4MEG3knockdownaffectstheexpressionofinflammatorycytokinesinhighglucose-inducedHUVECs(xs)GeneControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA**#*MEG31.03±0.120.59±0.140.14±0.130.59±0.10**#*α-SMA1.00±0.101.47±0.342.26±0.191.48±0.10**#*VEGF1.01±0.181.37±0.201.73±0.151.36±0.07**#*TNF-α1.02±0.253.34±0.596.31±1.353.35±0.68**#*IL-61.00±0.141.36±0.111.61±0.121.26±0.15*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。2.6MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞TGFβ信号通路相关基因表达的影响为探讨MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞TGFβ信号通路相关基因表达，我们观察TGFβ信号通路基因TGFβ1，SMAD2和SMAD7在MEG3基因敲除后的表-△△CT达水平的变化。实时荧光定量PCR研究结果(2)显示，Control组TGFβ1基因的表达量为1.01±0.20，HG组TGFβ1基因的表达量为1.60±0.28，HG+MEG3siRNA组TGFβ1基因的表达量为3.52±0.25，HG+scramblesiRNA组TGFβ1基因的表达量为1.65±0.33，与control组TGFβ1基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组TGFβ1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TGFβ1基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TGFβ1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组SMAD2基因的表达量为1.00±0.09，HG组SMAD2基因的表达量为1.30±0.15，HG+MEG3siRNA组SMAD2基因的表达量为1.72±0.07，HG+scramblesiRNA组SMAD2基因的表达量为1.24±0.14，与control组SMAD2基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组SMAD2基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组SMAD2基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组SMAD2基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组SMAD7基因的表达量为1.01±0.19，HG组SMAD7基因的表达量为1.58±0.29，HG+MEG3siRNA组SMAD7基因的表达量为2.29±0.12，HG+scramblesiRNA组SMAD7基因的表达量为1.48±0.09，与control组SMAD7基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组SMAD7基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组SMAD7基因147 新疆医科大学博士学位论文的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-14和表3-5。图3-14MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞TGF-β信号通路相关基因表达的影响Fig.3-14MEG3knockdownaffectstheexpressionofTGF-βpathwaygenesinhighglucose-inducedHUVECs表3-5MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞TGF-β信号通路相关基因表达的影响(xs)Table3-5MEG3knockdownaffectstheexpressionofTGF-βpathwaygenesinhighglucose-inducedHUVECs(xs)GeneControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA**#*TGF-β11.01±0.201.60±0.283.52±0.251.65±0.33**#*SMAD21.00±0.091.30±0.151.72±0.071.24±0.14**#*SMAD71.01±0.191.58±0.292.29±0.121.48±0.09*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。2.7MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响为探讨MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达，我们观察Wnt/β-catenin信号通路基因β-catenin、TCF7L2和CyclinD1在MEG3-△△CT基因敲除后的表达水平的变化。实时荧光定量PCR研究结果(2)显示，Control组β-catenin基因的表达量为1.00±0.15，HG组β-catenin基因的表达量为1.36±0.14，HG+MEG3siRNA组β-catenin基因的表达量为1.74±0.07，HG+scramblesiRNA组β-catenin基因的表达量为1.33±0.14，与control组β-catenin基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组β-catenin基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组β-catenin基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；148 新疆医科大学博士学位论文Control组TCF7L2基因的表达量为1.00±0.09，HG组TCF7L2基因的表达量为0.72±0.05，HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量为0.48±0.12，HG+scramblesiRNA组TCF7L2基因的表达量为0.80±0.10，与control组TCF7L2基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TCF7L2基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组CyclinD1基因的表达量为1.00±0.18，HG组CyclinD1基因的表达量为1.34±0.25，HG+MEG3siRNA组CyclinD1基因的表达量为2.19±0.15，HG+scramblesiRNA组CyclinD1基因的表达量为1.35±0.18，与control组CyclinD1基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组CyclinD1基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-15和表3-6。图3-15MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响Fig.3-15MEG3knockdownaffectstheexpressionofWnt/β-cateninpathwaygenesinhighglucose-inducedHUVECs表3-6MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响(xs)Table3-6MEG3knockdownaffectstheexpressionofWnt/β-cateninpathwaygenesinhighglucose-inducedHUVECs(xs)GeneControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA**#*β-catenin1.00±0.151.36±0.141.74±0.071.33±0.14**#*TCF7L21.00±0.090.72±0.050.48±0.120.80±0.10**#*CyclinD11.00±0.181.34±0.252.19±0.151.35±0.18*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。149 新疆医科大学博士学位论文2.8MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞细胞增殖的影响为探讨MEG3是否对高糖诱导的内皮细胞的增殖功能产生影响，我们进行了MTT实验，以490nm波长的OD值表示内皮细胞的增值活力，OD值越大表示内皮细胞的增殖能力越高。MTT实验结果显示在48h时，Control组的细胞OD值为0.77±0.02，HG组的细胞OD值为0.56±0.01，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值为0.65±0.02，HG+scramblesiRNA组的细胞OD值为0.58±0.04，与control组的细胞OD值相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞OD值相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；72h时，Control组的细胞OD值为1.05±0.04，HG组的细胞OD值为0.83±0.02，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值为0.95±0.03，HG+scramblesiRNA组的细胞OD值为0.86±0.04，与control组的细胞OD值相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞OD值相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；96h时，Control组的细胞OD值为1.26±0.03，HG组的细胞OD值为1.11±0.01，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值为1.21±0.03，HG+scramblesiRNA组的细胞OD值为1.13±0.03，与control组的细胞OD值相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞OD值相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-16和表3-7。图3-16MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的影响Fig.3-16EffectofMEG3knockdownoncellproliferationinhighglucose-inducedHUVECs150 新疆医科大学博士学位论文表3-7MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的影响(xs)Table3-7EffectofMEG3knockdownoncellproliferationinhighglucose-inducedHUVECs(xs)TimeControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA**#*48h0.77±0.020.56±0.010.65±0.020.58±0.04**#*72h1.05±0.040.83±0.020.95±0.030.86±0.04**#*96h1.26±0.031.11±0.011.21±0.031.13±0.03*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。2.9MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响为了研究MEG3基因与高糖培养的人脐静脉内皮细胞凋亡之间的潜在机制，我们进行了FITC-PI双染流式细胞术，FITC-PI双染流式细胞术分选FITC+/PI-和FITC+/PI+的早、晚期凋亡细胞进行统计分析。结果显示慢病毒转染48h后，Control组的细胞凋亡率为(6.31±1.23)%，HG组的细胞凋亡率为(23.52±2.61)%，HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率为(13.47±1.63)%，HG+scramblesiRNA组的细胞凋亡率为(24.23±2.55)%，与control组的细胞凋亡率相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞凋亡率相比，HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-17。图3-17MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响Fig.3-17EffectofMEG3knockdownoncellapoptosisinhighglucose-inducedHUVECs2.10MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Bax、Bcl-2、Caspase3和P53蛋白表达的影响为了探究MEG3基因敲除对高糖培养的人脐静脉内皮细胞增殖增加和凋亡下降的潜在分子机制，我们运用Westernblot技术检测Bax、Bcl-2、Caspase3和P53凋151 新疆医科大学博士学位论文亡相关蛋白的表达水平。Westernblot技术检测结果显示慢病毒转染人脐静脉内皮细胞48h后，Control组Bax蛋白的表达量为1.00±0.35，HG组Bax蛋白的表达量为1.97±0.54，HG+MEG3siRNA组Bax蛋白的表达量为1.02±0.11，HG+scramblesiRNA组Bax蛋白的表达量为1.96±0.56，与control组Bax蛋白的表达量相比，HG组和HG+scramblesiRNA组Bax蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bax蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bax蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组Bcl-2蛋白的表达量为1.00±0.12，HG组Bcl-2蛋白的表达量为0.20±0.01，HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量为1.01±0.14，HG+scramblesiRNA组Bcl-2蛋白的表达量为0.18±0.01，与control组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG组和HG+scramblesiRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组Caspase3蛋白的表达量为1.00±0.17，HG组Caspase3蛋白的表达量为6.94±0.48，HG+MEG3siRNA组Caspase3蛋白的表达量为4.44±0.27，HG+scramblesiRNA组Caspase3蛋白的表达量为6.88±0.66，与control组Caspase3蛋白的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA组和HG+scramblesiRNA组Caspase3蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Caspase3蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Caspase3蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；Control组P53蛋白的表达量为1.00±0.18，HG组P53蛋白的表达量为5.99±0.91，HG+MEG3siRNA组P53蛋白的表达量为1.04±0.36，HG+scramblesiRNA组P53蛋白的表达量为6.00±0.92，与control组P53蛋白的表达量相比，HG组和HG+scramblesiRNA组P53蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组P53蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组P53蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图3-18和表3-8。表3-8MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Bax、Bcl-2、Caspase3和P53蛋白表达的影响(xs)Table3-8MEG3knockdownaffectstheproteinexpressionofBax,Bcl-2,Caspase3andP53inhighglucose-inducedHUVECs(xs)ProteinControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA*#*Bax1.00±0.351.97±0.541.02±0.111.96±0.56*#*Bcl-21.00±0.120.20±0.011.01±0.140.18±0.01**#*Caspase31.00±0.176.94±0.484.44±0.276.88±0.66*#*P531.00±0.185.99±0.911.04±0.366.00±0.92*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。152 新疆医科大学博士学位论文图3-18MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Bax、Bcl-2、Caspase3和P53蛋白表达的影响Fig.3-18MEG3knockdownaffectstheproteinexpressionofBax,Bcl-2,Caspase3andP53inhighglucose-inducedHUVECs2.11MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞TGFβ信号通路SMAD2蛋白和Wnt/β-catenin信号通路β-catenin蛋白表达的影响Westernblot技术检测TGFβ信号通路SMAD2蛋白在MEG3基因敲除后的表达水平的变化。研究结果显示Control组SMAD2蛋白的表达量为1.00±0.28，HG组SMAD2基因的表达量为2.54±0.13，HG+MEG3siRNA组SMAD2基因的表达量为4.12±0.38，HG+scramblesiRNA组SMAD2基因的表达量为2.58±0.13，与control组SMAD2蛋白的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组SMAD2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组SMAD2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组SMAD2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，具体结果见图？。Westernblot技术检测Wnt/β-catenin信号通路β-catenin蛋白在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，研究结果显示Control组β-catenin蛋白的表达量为1.00±0.24，HG组β-catenin蛋白的表达量为2.90±0.21，HG+MEG3siRNA组β-catenin蛋白的表达量为3.88±0.35，HG+scramblesiRNA组β-catenin蛋白的表达量为2.86±0.15，与control组β-catenin蛋白的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组β-catenin蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，153 新疆医科大学博士学位论文具体结果见图3-19和表3-9。图3-19MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞SMAD2和β-catenin蛋白表达的影响Fig.3-19MEG3knockdownaffectstheproteinexpressionofSMAD2andβ-catenininhighglucose-inducedHUVECs表3-9MEG3基因敲除对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞SMAD2和β-catenin蛋白表达的影响(xs)Table3-9MEG3knockdownaffectstheproteinexpressionofSMAD2andβ-catenininhighglucose-inducedHUVECs(xs)ProteinControlHGHG+MEG3siRNAHG+scramblesiRNA**#*SMAD21.00±0.282.54±0.134.12±0.382.58±0.13**#*β-catenin1.00±0.242.90±0.213.88±0.352.86±0.15*#注：与Control组比较，HG+MEG3siRNA组与HG组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。3讨论3.1糖尿病内皮细胞功能障碍血管内皮细胞通过调节自分泌和旁分泌物质的释放，是血管稳态的主要功能调[261]节物，对于保持血管壁的张力、获得性免疫和血细胞屏障功能具有重要作用。在[262]正常生理状况下，内皮细胞是血管内皮细胞的主要成分。在剪应力、炎症、病原体和损伤信号的伤害刺激下，内皮细胞的功能得到破坏，最终导致血管疾病的发生和进展。在心血管疾病中，内皮细胞的功能破坏包括氧化应激、炎症反应、白细胞黏附、血小板活化与血栓形成。内皮细胞的功能障碍是动脉粥样硬化、高血压和糖尿病发生的主要基础。内皮细胞功能障碍也是心血管疾病的独立风险因素。正常的[263]内皮细胞具有多种生物功能包括极化结构、血管生成和血管重构。正常的内皮细胞在血管炎症中具有保护作用。在内皮细胞中促炎因子对于白细胞黏附具有重要作154 新疆医科大学博士学位论文用，然而氮氧化物通过抑制促炎细胞因子、血小板聚集或者细胞粘附分子的表达发挥内皮细胞的保护作用。内皮损伤是引起血管炎症级联反应的关键事件。活性氧簇和促炎因子的增加、氮氧化物生物活性的缺乏是内皮细胞功能障碍的标志。内皮细胞的功能障碍会增加白细胞的粘附、内皮细胞的渗透性增加、炎症细胞释放和脂质[264]沉积加剧动脉粥样硬化性斑块的形成。此外，内皮细胞的增殖、迁移和凋亡与心血管疾病内皮细胞功能障碍密切相关。内皮细胞释放的收缩和舒张因子不平衡对于内皮细胞功能障碍至关重要。内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化、衰老、糖尿病、血脂异常、高血压和肥胖密切相关。内皮细胞功能障碍被认为是心血管事件的独立预测因子。糖尿病是一种血糖代谢的异质性疾病。内皮细胞功能障碍，是重要的心血管危险因素。由于内皮细胞功能障碍是血管疾病的起始因素和关键，因此在糖尿病动物和人体中进行了大量研究。糖尿病大血管疾病在形态和功能上类似于动脉粥样硬化病变，然而糖尿病微血管疾病主要以视网膜病变、肾脏病变、神经病变和下肢血管[265]异常而呈现，导致视觉的损伤、肾衰竭、中风、糖尿病心肌病和下肢功能障碍。小动脉或毛细血管，由于缺乏血管平滑肌细胞，因此不能发展张力，又由于太小而不能在肌动描记器或器官槽中检测它们的功能。因此，通过估计内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和粘附分子的表达、白细胞的渗透、毛细血管密度的改变和损伤的出现，[266]估计微血管内皮功能障碍的程度或者异常内皮激活的程度。特别是，糖尿病通过下调细胞的连接蛋白和上调整合素的表达破坏了内皮细胞的屏障(包括血脑屏障、视[267]网膜屏障和肾小球屏障)，导致了血管渗漏和异常的渗透性。血管的NO生物利用度下降，eNOS的表达和NO的产出在微血管也同样减少。因此，糖尿病啮齿类动物[268][269]模型的心肌组织、脑血管、肾小球和视网膜内皮细胞也发现eNOS的表达减少。小鼠敲除了eNOS的表达会增加促炎细胞因子和晚期病理性改变。小鼠eNOS的磷酸化水平下降会展现出脑血管功能减退和梗死面积增加。相反，糖尿病小鼠过表达eNOS会改善脑血管的反应。由于糖尿病患者和动物微血管的线粒体崩溃，NADPH[270]氧化酶、环加氧酶、脂氧合酶和羰基蛋白的增加，锰超氧化物歧化酶表达减少，糖尿病ROS水平的增加会导致氧自由基产生增加和抗氧化防御的损坏。增加的氧化应激和增加的炎症反应是引起糖尿病血管功能障碍的主要原因，特别是微血管并发症。在糖尿病的动物和人体中，血清中的细胞因子和炎症因子(TNF-α、IL-6、可溶性CD40L、可溶性ICAM、可溶性E-选择素、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1、单[271]核细胞趋化蛋白、高敏C反应蛋白)水平升高。在糖尿病啮齿类动物的视网膜和皮肤损害当中，TNF-α的表达水平增加。在糖尿病患者的肾小球损伤和视网膜中，TNF受体(TNFR)表达增加。在微血管，阻断TNF信号通路能够减轻白细胞粘附和毛[272][273]细血管变性，同时改善糖尿病大鼠的血管性痴呆，提高认知表现。在糖尿病155 新疆医科大学博士学位论文小鼠中，内皮素-1由于阻断了ETA受体减少视网膜的凋亡，减少蛋白尿和恢复脑血[274]管的功能参与糖尿病微血管并发症。糖尿病患者的血清VEGF的浓度增加。可是，在糖尿病的组织中VEGF的表达水平不同。在糖尿病患者的肾脏和视网膜中，VEGF的表达水平增加。这种VEGF的表达增加是糖尿病视网膜病进展的标志，导致局部[275]缺血状态和缺氧诱导因子(HIF)-1α的激活。在糖尿病的脑微血管中，VEGF和同源受体的表达水平下降，导致海马体的血管渗透性增加，这可以解释空间记忆的缺陷。同样，皮肤损伤时发现VEGF的表达水平下降。糖尿病小鼠脯氨酰羟化酶域蛋白(PHD：控制HIF降解的氧传感器)的敲除会导致HIF-1α和VEGF的水平增加，导[276][277]致后肢灌注恢复的加速。在糖尿病的心肌病，VEGF的表达被报道增加或者减少。抑制VEGF的受体会导致对照组大鼠大量的蛋白尿，但是糖尿病大鼠的尿蛋白[278]排泄减少。糖尿病患者组织VEGF表达模式差异的潜在机制还不清楚。局部缺氧、毛细血管密度和缺氧状况下邻近细胞的反应参与此病理过程。血管内皮生长因子和NO一起参与血管生成的过程。在细胞培养过程中，VEGF通过上调内皮细胞eNOS[279]的表达增加NO的产物，然而VEGF诱导的血管生成被L-NAME(eNOS的抑制剂)[280]+所拮抗。在糖尿病大鼠中，肾小球内皮细胞的CD34数量增加，这与VEGF的表达水平增加相一致，然而肾的亚硝酸盐水平下降。在糖尿病大鼠体内，阻断VEGF受体的表达会减少蛋白尿的水平，当给予L-NAME的处理后会颠倒这一过程。当糖[281]尿病患者患有视网膜病，高水平的VEGF会伴有eNOS的解偶联和炎症增加。氧[282]化应激的增加，精氨酸酶的活性和/或表达增加会导致糖尿病视网膜病和肾病的血管异常生成。总之，现有数据表明糖尿病会破坏VEGF和NO的偶联。内皮细胞功能障碍特别是微血管水平是糖尿病最恶化的事件。减少NO的生物利用度，增加的氧化应激，VEGF和NO的不平衡，内皮修复的损害是导致内皮细胞功能损害的罪魁祸首。由于更好的理解了糖尿病的潜在机制，全新的治疗方法应用于临床。然而，一些研究工作主要应用于动物模型，但是并没有应用于患者。给予针对miRNAs的靶点治疗，干扰VEGF和NO之间的平衡以及内皮祖细胞的功能，可能有希望成为糖尿病内皮细胞功能障碍的治疗方法。在本研究中，为探讨MEG3与高糖诱导的内皮细胞功能障碍的关系，首先观察高糖刺激48、72、96小时对体外培养的人脐静脉内皮细胞中MEG3表达影响。实时-△△CT荧光定量PCR的实验结果(2)表明，分别与48、72、96小时正常糖(Control，5mMD-glucose)培养的人脐静脉内皮细胞相比，高糖(HG，30mMD-glucose)刺激48、72、96小时后，MEG3的水平以时间依赖方式表达下降。为了进一步研究MEG3在高糖诱导的内皮细胞损伤机制和功能方面的意义，我们设计小干扰RNA，进行慢病毒载体的构建和包装，敲除MEG3的表达，进而给予高糖培养的人脐静脉内皮细胞转染慢病毒MEG3siRNA和scramblesiRNA，在慢病毒转染48h后，我们提取转染后不156 新疆医科大学博士学位论文同组细胞的RNA，逆转录成cDNA进行实时荧光定量PCR实验，检测MEG3的敲除效率，结果显示与HG组和HG+scramblesiRNA组比较，HG+MEG3siRNA组MEG3的表达量明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，敲除效果为50.13%，同时，我们还通过观察慢病毒转染人脐静脉内皮细胞后绿色荧光染料标记的MEG3siRNA和scramblesiRNA来验证转染效率，实验表明慢病毒的转染效率较高。3.2炎症反应与糖尿病炎症反应被定义为组织损伤的一种反应，以免疫细胞的侵袭，细胞因子和粘附分子的释放并且伴有侵袭组织的功能和结构损伤为特点。炎症对于预防感染的传播或者促进再生具有益处。同样，由于炎症介质、活性氧簇、和补体成分导致组织的[283]破坏会加剧疾病。心血管疾病是引起糖尿病患者发病率和死亡率最常见的原因。当前，除了高血压、肥胖和血脂异常等传统的心血管危险因素，其他的危险因素包括慢性低度炎症，晚期糖基化终产物和内皮细胞功能障碍不仅参与糖尿病和胰岛素抵抗的发展，而且能够涉及糖尿病相关的并发症，从而导致心血管的危险因素增加[284]。增加的炎性标志物包括C反应蛋白、IL-1、IL-6、TNF-α、间质细胞粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和E-选择素与糖尿病肾病、糖尿病视网[285]膜病和糖尿病心血管疾病密切相关。除了增加的血清炎症介质，中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)和血小板与淋巴细胞比率(NLR)，最近被认为是炎症的潜在标志物[286]。而且NLR与糖尿病患者肾功能的恶化密切相关[13]。慢性进行性的炎症可能引[287]起内皮的功能障碍继发于血管舒张因子(前列腺素和一氧化氮)下降。在另一方面，这种慢性损害改变了血管舒张和收缩的稳定状态，导致内皮细胞抗动脉粥样硬化和抗血栓形成性能的恶化；在另一方面，高血压的情况恶化继发于一氧化氮的水平减[288]少，这一过程独立于其他因素影响糖尿病患者血压的水平。最近的研究表明激活的血小板能够促进动脉粥样硬化的形成，特别是炎症常见的慢性病。血小板能够相互作用不同的细胞类型包括内皮细胞、树突细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞和单核吞噬细胞。同时，血小板与不同类型的细胞相互作用能够加剧动脉壁的炎症。而且，激活血小板能够激活白细胞的募集到血管壁和引起炎症反应，导致动脉粥样硬化发病机制的组成。血糖是一种胰岛素分泌的生理调节物。除了急性效果，血糖能够通过影响β细胞，调节胰岛素产物的长期适。应事实上，β细胞短期暴露于增加的血糖[289]浓度能够诱导增殖。然而在2型糖尿病的动物模型和人体，在长期暴露于升高的[290]血糖浓度，β细胞的增殖能力受到抑制。而且，升高的血糖浓度诱导了胰岛的β细胞的凋亡。IL-1β是一种自身免疫性1型糖尿病促炎细胞因子。IL-1β通过激活转录因子NF-κB抑制β细胞的功能和促进Fas引起的凋亡。IL-1β介导血糖对于β细胞的恶化作用。在体外，非糖尿病的胰岛暴露于高糖会导致IL-1β的产生和释放，随后伴有NF-κB激活、Fas上调，DNA破碎，损害β细胞的分泌功能。IL-1受体拮抗剂157 新疆医科大学博士学位论文保护人体胰岛防治恶化。这些研究表明炎症过程发生在2型糖尿病细胞毒性发病机制，确定了IL-1β通路作为保存β细胞质量和功能的靶点。肥胖是一种糖尿病发展的一种危险因素。同样，也是代谢综合征的一部分，经常伴有血脂异常和循环瘦素和细胞因子水平增加。所有这些因素都会调节β细胞的功能和存活。影响β细胞的血脂异常依赖于个体特异的血脂特点。一些脂肪酸和脂蛋白能够促进β细胞的凋亡。长期暴露于脂肪酸(棕榈酸)的β细胞具有高毒性，然而单不饱和脂肪酸(油酸)能够防[291]止棕榈酸和血糖诱导的β细胞凋亡。脂蛋白也同样影响β细胞的存活和功能，VLDL和LDL具有促凋亡作用，然而HDL具有保护作用。最初，瘦素确定作为脂肪细胞来源的因子。瘦素由于结构类似于其他细胞因子，同时瘦素的受体能够诱导信号通路，因此被认为是促炎细胞因子。有趣的是，瘦素能够恶化NOD小鼠的自身[292]免疫性糖尿病。瘦素能够促进其他自身免疫性疾病，包括炎症性肠病、多发性硬化症和类风湿性关节炎。瘦素除了与胰岛素分泌存在负效应之外，还能通过增加IL-1β的释放和减少IL-1Ra释放诱导β细胞的凋亡。脂肪细胞其他细胞因子的释放包括TNF-α和IL-6能够调节β细胞的存活。2型糖尿病患者的胰岛呈现淀粉样蛋白[293]沉积、纤维化和增加的细胞死亡。所有这些标志与炎症反应密切相关。事实上，鉴于2型糖尿病患者胰腺β细胞质量的下降，免疫系统与这些凋亡或坏死的内分泌细胞的清除密切相关。然而，在大量细胞死亡和免疫浸润前，胰岛通过炎症因子应对代谢应激。人体的胰腺β细胞产生增长的IL-1β应对细胞血糖毒性。各种其他炎症[294]细胞因子和营养物能够诱导胰岛的炎症反应。在GK大鼠、高脂饮食喂养的小鼠、db/db小鼠和2型糖尿病患者的胰岛发现巨噬细胞浸润。鉴于2型糖尿病华患者的高糖血症、血脂异常和增加的循环系统炎症因子(低度炎症)，越来越多的细胞应激在体内参与胰岛炎症。胰岛来源的炎症细胞因子和胰岛炎症反应对β细胞功能和质量的[295]影响是有益处和/或恶化的。低浓度的IL-1β能够促进β细胞的功能和存活。肥胖患者和2型糖尿病患者的其他慢性升高的细胞因子和粘附分子，例如IL-6、IL-8和[296]单核细胞趋化蛋白质(MCP)-1，在胰岛适应中具有重要作用。事实上，免疫系统是参与适应和修复。然而，如果这种反应是长期的，对器官功能将是一种恶化。所有这些证据表明，胰岛的炎症参与调节2型糖尿病患者β细胞的功能和存活。为了研究MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞的炎症反应，我们观察炎症细胞因子α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，结果显示，高糖培养的人脐静脉内皮细胞转染慢病毒MEG3siRNA后，与control组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异158 新疆医科大学博士学位论文具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明MEG3参与高糖诱导内皮细胞的炎症反应。因此，我们的研究强调了MEG3作为全新治疗靶点的潜力，缓解高糖血症相关的内皮细胞功能障碍。这种发现对于lncRNAs在对抗炎症反应中起关键作用提出了合理的解释，将有助于加深我们对于糖尿病诱导内皮细胞功能障碍的分子发病机制的理解。3.3TGFβ信号通路与糖尿病TGFβ信号通路的信号通过两种跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体(Ⅰ型和Ⅱ型TGFβ受体)传达到五种受体调节SMAD转录因子(SMAD1-3，5，8)，从而转移到细胞核，[297]招募共活化因子和共抑制因子调节基因的表达。TGFβ信号通路包括超过60种成[298]分，在多种细胞过程的组合中发生微调。Ⅰ型受体家族包括激活素类似激酶(ALK)受体1到7。TGFβ家族配体激活两种主要的信号通路：BMPs通过ALK1-3和ALK6激活SMAD1，5和8；TGFβ，激活素和Nodal通过ALK4，ALK5和ALK7激活SMAD2和3；ALK对SMAD2和3的磷酸化是TGFβ信号通路最具特征的效果，与上皮细胞间质转化主要相关，然而间质上皮细胞转化与SMAD1，5和8的磷酸化相关。[299]ALK5/SMAD2和3依赖的信号通路分支组成了癌症主要的治疗靶点。此外，除了主要参与上皮细胞间质转化SMAD依赖的经典TGFβ信号通路，越来越多的证据表明非经典TGFβ信号通路，激活GTPases，MAP激酶，生长和存活促进激酶PI3K，[300]AKT/PKB和mTOR，在许多细胞过程中具有重要作用。许多研究表明TGFβ信[301]号通路在胰腺的发育过程和胰腺疾病中(胰腺炎和胰腺癌等)具有重要作用。在胚胎形成过程中，TGFβ信号通路通过促进内分泌细胞的分化和成熟以及抑制腺泡细胞增殖，调节内分泌胰腺和外分泌胰腺的平衡。在成人的胰腺中，腺泡细胞的TGFβ信号通路对于细胞的分化具有重要作用。相比较腺泡细胞，TGFβ信号通路在成人胰[302]腺β细胞中的效果截然相反。首先，当暴露在浓度为200mg/dL的葡萄糖时，TGFβ在没有影响β细胞的复制时，能够增加胎鼠胰岛的胰岛素的释放。相反，当暴露在浓度为300mg/dL的葡萄糖时，TGFβ能够抵消有丝分裂的效果，不再诱导胰岛素的[303][304]分泌。Xiao等研究表明TGFβ受体信号通路对于基线β细胞增殖具有重要作用，通过提供大量葡萄糖或给予外源性胰岛素处理后，能够进一步证明炎症和增加的β细胞负担都能刺激β细胞的增殖，然而TGFβ受体信号通路通过依赖和非依赖性两种方式。给予人体胰岛TGFβ受体Ⅰ抑制剂SB-431542(SB)，能够显著改善β细[305]胞的C肽分泌，通过增加β细胞的增殖增加β细胞的数量。此外，SB能够增加人体β细胞的细胞周期激活和减少细胞周期抑制。移植SB处理过的人体胰岛到糖尿病免疫缺陷的小鼠导致血糖控制的显著改善，显著增加血清和移植胰岛素的含量，在移植的体内增加β细胞的增殖。因此，短暂的抑制TGFβ受体信号通路能够改善人体胰岛移植的结果，可能是通过增加β细胞的数量和功能。β细胞来源(BCD)的细159 新疆医科大学博士学位论文胞增殖与上皮细胞间质转化和表型损失密切相关。尽管如此，BCD细胞能够保持β细胞基因的染色体结构公开，表明BCD细胞容易再分化。TGFβ信号通路参与各种细胞的上皮细胞间质转化。在体外，上调的TGFβ信号通路参与人体胰岛细胞的增殖。运用短发卡RNA沉默TGFβ受体1的转录，阻断TGFβ信号通路的激活，从而[306]抑制BCD细胞的增殖和分化。转基因和基因敲除的小鼠强调了TGFβ信号通路[307]在胰岛发育中的重要作用，最近的研究强调了TGFβ信号通路在β细胞的功能和成熟中的作用。TGFβ信号通路的成员Nodal通过SMAD2、SMAD3和SMAD3在胚胎形成和有丝分裂信号通路发挥重要作用。基因工程小鼠模型提供了新的见解。终生基因敲除的小鼠在整个有机组织能够提供关于基因功能的信息。TGFβ信号通路对β细胞稳态的作用开始越来越多的出现。携带各种TGFβ信号通路基因突变的小鼠糖尿病时能够减少β细胞的质量，损害糖耐量。在Pdx-1表达细胞，敲除TGFβ信号[308]通路下游负调控基因SMAD7，在发育的晚期能够减少激素阳性细胞。在Pdx-1表达的细胞，过表达SMAD7能够改变β细胞的特征和减少胰腺胰岛素的产出和释[309]放，导致糖尿病。部分胰腺切除后，SMAD7对β细胞的增殖具有重要作用。TGFβ信号通路效应分子具有相反的效果，SMAD3作为胰岛素分泌和血糖耐受的负性调节者。总之，许多研究表明TGFβ信号通路在调节β细胞质量和功能中具有重要作用。许多基因敲除小鼠研究需要阐明具体的细胞靶点和TGFβ信号通路对胰腺细胞的作用机制。在体外，能够直接检测TGFβ超家族配体对成人胰腺β细胞的效果。例如，在人体和大鼠胰岛，急性激活素A处理能够增加血糖刺激的胰岛素分泌，然而小鼠胰岛延长处理能够减少血糖刺激的胰岛素分泌。激活素A处理大鼠胰岛和小鼠β细胞能够增加β细胞的增殖。有趣的是，胰岛表达以及激活素A和TGFβ1的功能在物种间存在差异。虽然TGFβ1能够刺激大鼠胰岛血糖刺激的胰岛素释放，给予人体胰岛延长TGFβ1的处理，对于影响β细胞功能的重要基因表达具有负性作用，可能是[310]通过SMAD3通路。有趣的是，Boerner等没有报道β细胞的去分化，虽然β细胞在此模型中进行了严格调查。虽然研究运用了遗传操作的动物模型是非常重要的，然而人体胰岛中的研究结果对于揭示物种差异和未来的临床移植具有重要作用。Boerner研究的最重要贡献是运用了人体捐赠的胰岛。研究人体胰岛对于原代β细胞增殖机制相关基础知识局限的临床移植具有重要作用。在体内对于β细胞的质量和功能的控制，TGFβ超家族配体是否是有用的治疗靶点还不清楚，因为它们可能具有脱靶的系统效果。大部分的TGFβ超家族配体能够分享同样的受体下游的效应分子[311]和拮抗剂，同时能够在包括胰岛组织在内的各种组织中进行表达。在体外，Nodal和其他的TGFβ超家族成员在胰腺β细胞的分化，增殖和成熟方面能够成为有希望的效应分子。然而，人体体外β细胞的增殖成为临床相关，强有力的有丝分裂和/或效应分子协同发挥作用保持β细胞成熟、活力和功能的特性还有待研究。这将需要β160 新疆医科大学博士学位论文细胞的生物学家和医生共同完成这一艰巨的任务。在糖尿病视网膜病变中，高糖血症会导致内皮细胞的损伤是主要的致病因素。内皮细胞损伤通过减少内皮标志物的[312]表达和增加间质细胞标记物表达导致细胞的表型改变。Cao等发现高糖通过减少miR-200b的表达，导致内皮细胞标记物的mRNA和蛋白表达减少，间质细胞标记物的mRNA和蛋白表达增加。TGFβ1肽具有与葡萄糖类似的效果。其中，miR-200b和p300介导这种改变。在野生型糖尿病小鼠的视网膜，miR-200b转基因糖尿病小鼠能够预防内皮细胞间质转化。因此，在体内外TGFβ介导以及miR-200b和p300调节高糖诱导的内皮细胞间质转化。炎症促炎因子TGFβ作为糖尿病肾病进展的主要介导物。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是主要的调节脂肪酸和胆固醇合成的转录因子，最近发现与糖尿病肾病密切相关。运用小分子抑制剂fatostatin阻断TGFβ诱导的SMAD2/3的C末端磷酸化和SMAD3激活，从而抑制SREBP的表达。负性SREBP1结构域过表达能够缓解SMAD2/3的磷酸化，这种抑制不是增加的SMAD2/3去磷酸化比例的结果，也不是SMAD2/3降解作用。SREBP抑制导致TβR1蛋白表达损失，但并没有影响TβR1的转录水平。SREBP1通过作用于Ⅰ型受体调节TGFβ信号通路。在未来的研究中，需要继续阐明这一调节机制。KLF4在许多类型的细胞中减少了炎症反应。HK2细胞在高糖的暴露下，KLF4的mRNA表达水平下降。高糖增加了TGFβ1表达的增加，从而增加了巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的分泌。TGFβ1能够显著增加纤连蛋白和胶原蛋白Ⅳ的表达。KLF4过表达减少TGFβ介导的MIF和MCP-1，但对于TGFβ介导的纤连蛋白和胶原蛋白Ⅳ的mRNA和蛋白表达没有效果。KLF4的mRNA在糖尿病肾脏中表达下降，在糖尿病动物的肾小管中KLF4的蛋白表达减少。KLF4能够减少TGFβ1诱导的炎症，表明KLF4对糖尿病[313]肾病具有治疗效果。LncRNAs通过与染色体的相互作用调节基因的表达。Mondal[314]等运用免疫沉淀耦合高通量测序确定了276个lncRNAs在乳腺癌的抑制性染色体表达丰富。发现MEG3和EZH2分享同样的目标基因，包括TGFβ信号通路基因。MEG3结合位点的全基因组图谱揭示MEG3通过结合远端调控元件调节TGFβ信号通路基因的活性。MEG3低表达乳腺癌肿瘤组织的TGFB2、TGFBR1和SMAD2高表达，进一步在体外培养乳腺癌细胞发现MEG3负性调控TGFβ信号通路基因。MEG3结合位点具有RA丰富的序列，通过RNA-DNA的三链形成，导向MEG3结合染色体。我们发现RNA-DNA的三链形成广泛分布，具有与TGFβ信号通路相关的MEG3的结合位点。为探讨MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞TGFβ信号通路相关基因表达，我们观察TGFβ信号通路基因TGFβ1、SMAD2和SMAD7在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，结果显示与control组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TGFβ1、161 新疆医科大学博士学位论文SMAD2和SMAD7基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot技术检测TGFβ信号通路SMAD2蛋白在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，研究结果显示与control组SMAD2蛋白的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组SMAD2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组SMAD2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组SMAD2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明MEG3基因敲除能够通过上调TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达激活TGFβ信号通路。3.4Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病Wnt家族蛋白是一组分泌性脂质修饰蛋白，在其氨基酸序列上包含高度保守的[315]半胱氨酸残基。在人体和小鼠体内已经确认了19种不同的Wnt蛋白。Wnt信号通路分为经典的Wnt/β-catenin信号通路和非经典信号通路。经典的Wnt/β-catenin信号通路上调目标基因T细胞因子/和淋巴增强因子1(TCF/LEF-1)的表达，调节细胞的增殖、分化、存活和凋亡。Wnt的配体结合到由frizzled受体和LRP6组成的共受体复合物，引起LRP6的磷酸化和募集一个由酪蛋白激酶1(CK-1)、GSK-3β和结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)组成的降解复合物。当缺乏Wnt配体时，激酶复合物磷酸化β-catenin，导致β-catenin在细胞质的降解。当Wnt配体激活了信号通路导致GSK-3β磷酸化，抑制了GSK-3β的活性。失活的GSK-3β引起了β-catenin在细胞质的去磷酸化和稳定。增加的β-catenin水平使β-catenin向细胞核转位，与转录因子LEF和[316]TCF相互作用激活目标基因的表达。Wnt信号通路拮抗剂包括分泌性frizzled相关蛋白(sFRPs)和Dickkopf(DKK)蛋白，被认为是Wnt/β-catenin信号通路的负反馈调[317,318]节物。众多的研究表明Wnt配体通过细胞膜结合受体和共受体在多种器官和细[319]胞系发挥多种生理和病理生理功能，包括器官的形成、肿瘤的发生和纤维化等。更重要的是，Wnt信号通路与TGFβ/Smad信号通路、Notch信号通路等信号通路具有相互作用，对胚胎的增殖、分化、细胞粘附、细胞存活和凋亡具有重要影响，同时参与器官的发育和疾病。越来越多的研究表明Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病密切相关。为了研究β细胞在胰岛素受体过表达后的治疗效果和机制，大鼠的胰岛素瘤(INS-1)细胞改造成稳定表达人体胰岛素受体(INS-IR细胞)，随后移植到链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠。与INS-1细胞比较后发现，INS-IR细胞能够改善糖尿病大鼠β细胞的功能，包括增加血糖的利用，钙的动员和胰岛素的分泌，细胞的增值率增加和降低血糖。这些结果由于增加的β-catenin/PPARγ复合物结合到大鼠的过氧化物酶体增殖物反应元件葡萄糖激酶启动子，通过cyclinD1延长细胞周期的S阶段。这些结果由于更快和磷酸化水平更高的胰岛素信号中间产物，包括胰岛素受体底物-1(IRS-1)/胰岛素受体底物-2(IRS-2)/磷脂酰肌醇3激酶/v-akt小鼠胸腺瘤病毒源瘤基162 新疆医科大学博士学位论文因同源物(AKT)1，β-catenin核转移和Wnt反应基因包括GK和cyclinD1增强的结果。事实上，INS-IR细胞的功能和增殖被抵消因为β-catenin、cyclinD1、GK、AKT1和[320]IRS-2基因敲除。此外，INS-IR细胞当胰岛素处理以后，能够激活Wnt信号通路，启动细胞增殖和胰岛素的分泌。在这方面，转移INS-IR细胞到糖尿病动物是一种有效可行的糖尿病治疗。因此，鉴于胰岛素对于糖尿病患者的不良反应(体重增加的风险和低糖血症)，这种方法对于治疗糖尿病可能是一种有希望的治疗策略。此外，胰岛素与Wnt信号通路之间的联系在IR过表达的β细胞具有更高治疗效率中具有重要作用。miR-22-3p在肝脏丰富表达的microRNA，在胰岛素抵抗和2型糖尿病的小鼠模型中表达异常增加。研究发现升高的肝脏miR-22-3p表达与糖尿病db/db小鼠糖异生损害密切相关，miR-22-3p结合到TCF7的3’非翻译区域，下调TCF7的表达。在HepG2细胞，miR-22-3p介导调节TCF7增加糖异生信号通路酶的表达。小干扰RNA介导敲除TCF7在HepG2的表达，引起糖异生基因的表达。而且，在体内沉默miR-22-3p的表达能够降低糖尿病小鼠的随机和空腹血糖水平。拮抗miR-22-3p的作用能够改善血糖的耐受和胰岛素敏感性。重要的是，肝脏TCF7水平恢复伴随着肝脏血糖输出的减少，糖异生基因的表达减少能够反映肝脏血糖输出的减少。miR-22-3p及其靶基因TCF7通过提升糖异生，在糖尿病的发病机制中具有重要作用。治疗2型糖尿病和胰岛素抵抗过程中肝脏生理学的改变，以miR-22/Tcf7/Wnt轴为靶点可能[321]具有治疗潜力。Wnt/β-catenin信号通路在一些组织和器官细胞的增殖和分化中具有重要作用。在人体中，2型糖尿病与Wnt/β-catenin信号通路中编码转录因子TCF7L2[322]的基因突变密切相关。Maschio等研究发现，高质饮食喂养60天的糖尿病前期小鼠发生胰岛组织的增生，同时活性β-catenin核转位发生与β-catenin、cyclinD1、cyclinD2和c-Myc(Wnt/β-catenin信号通路目标基因)的基因和蛋白表达增加密切相关。这些数据表明糖尿病前期的胰岛组织激活了Wnt/β-catenin信号通路。因此，在2型糖尿病的早期Wnt/β-catenin信号通路对于诱导代偿性β细胞增生具有重要作用。Ghrelin是第一个被发现的生长激素促分泌物质受体(GSH-R)的内源性配体，最近几[323]年，Ghrelin对于血糖稳态的调节引起了大量的关注。Liu等研究揭示了Ghrelin通过上调Wnt/β-catenin信号通路增加cyclinD1蛋白的表达，防止高糖培养下的人支气管上皮细胞(16HBE)的凋亡，这可能是Ghrelin保护糖尿病肺疾病的可能机制。因此，Wnt/β-catenin信号通路和下游的目标基因cyclinD1，可能是治疗糖尿病肺疾病患者的治疗靶点。丙二醛(MDA)主要是由活性氧簇产生，肥胖、高脂血症、高血压和慢性炎症都会提高外周血中MDA的水平。证据表明丙二醛(MDA)水平与糖尿病不同病理阶段密切相关。MDA在适中水平(5和10μM)能够启动葡萄糖刺激的胰岛素分2+泌，并且伴随胰岛ATP/ADP比例，细胞溶质Ca水平和关键调节分子(GK、GLUT2、PDX1和UCP2)的改变。Wnt信号通路的上游信号分子PI3K和p-AKT，下游信号分163 新疆医科大学博士学位论文子TCF7L2发生了最大的改变。敲除了TCF7L2能够阻断MDA诱导的葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平升高。丙二醛(MDA)作为信号通路的信使分子能够通过Wnt/β-catenin[324]信号通路调节胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌。因此，MDA水平的提高和Wnt/β-catenin信号通路的上调可能是2型糖尿病和高胰岛素血症发生和发展的病因。由于Wnt/β-catenin信号通路在心肌损伤中具有重要作用，糖尿病心肌病(DCM)是主要的糖尿病心血管并发症。组织病理学分析发现糖尿病导致严重的心肌损伤和进展性的心肌细胞凋亡。在糖尿病后的4、8和12周，发现Wnt2、β-catenin和c-Myc的在mRNA和蛋白水平进行性增加。T细胞因子4和磷酸化的GSK3β的表达增加。然而，在STZ注射以后，内源性Wnt抑制剂Dickkopf-1表达增加会引起糖尿病心肌病[325]发展下降。Wnt/β-catenin信号通路能够激活糖尿病心肌病的发展。未来对于糖尿病心肌病发展过程中Wnt/β-catenin信号通路的深入研究能够最终找到糖尿病心肌病的全新治疗靶点。2型糖尿病能够损害骨髓基质细胞(BMSCs)的骨生成。骨形态生成蛋白2(BMP2)被大量应用于骨缺陷的修复，同时能够激活Wnt信号通路。在2型糖尿病的骨髓基质细胞中，BMP2能够增加细胞的增殖和成骨细胞的分化。在BMP2诱导的2型糖尿病大鼠BMSCs中，Wnt信号通路的相关蛋白β-catenin、cyclinD1、Runx2和c-myc的表达增加，然而GSK3β的表达水平下降。BMP2蛋白能够通过刺激Wnt信号通路，使β-catenin累积增加和GSK3β表达减少，促进糖尿病BMSCs骨[326]再生。转录因子7类似物2(TCF7L2，以前成为TCF-4)属于高迁移率组盒的T细[327,328]胞因子，是经典Wnt信号通路主要的效应分子。当刺激Wnt的配体后，一种TCF蛋白结合到细胞核β-catenin形成双向的转录因子cat/TCF，导致Wnt目标基因[329]表达的激活。cat/TCF可以作为其他信号通路分子的效应分子，包括某些肽类激[330,331]素运用cAMP作为第二信使、IGF-I、胰岛素和脂质代谢产物溶血磷脂酸(LPA)。以前的研究证明了TCF7L2和Wnt信号通路在胚胎发育和肿瘤发生中的重要作用。[332-335]然而最近发现TCF7L2基因和Wnt信号通路在激素基因表达中的作用。在过去几年，大量的基因组研究表明TCF7L2基因的内含子区域的单核苷酸多态性与2型[336,337][337]糖尿病的风险密切相关。在2006年，Grant等确定了在冰岛人群中，TCF7L2基因内含子3上的一个微卫星基因DG10S478与2型糖尿病显著相关，随后在丹麦和美国人群中得到了重复性的验证。作者随后发现TCF7L2基因内含子3和内含子4上的92.1kb连锁不平衡区域内的五个单核苷酸多态性位点(rs12255372、rs7903146、rs7901695、rs11196205和rs7895340)与冰岛、丹麦和美国人群显著相关。此后，在[338][339][340]墨西哥裔美国人，非洲裔美国人和亚洲人群中确定了该基因与2型糖尿病显著相关。一些研究表明，TCF7L2对于β细胞的增殖、胰岛素分泌和肠促胰岛素激[341-343]素受体表达具有益处。然而，还有研究表明TCF7L2对于β细胞具有恶化作用[344,345]。患者在进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹技术和肝脏胰岛素抵抗时，TCF7L2164 新疆医科大学博士学位论文[346,347]的2型糖尿病风险单核苷酸多态性与升高的肝葡萄糖的产出密切相关。而且，小鼠肝脏的β-catenin缺陷会导致血糖产出和关键限速糖异生酶表达的改变，包括磷[348]酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(G-6-Pase)。在TOPGAL小鼠的肝细胞周围发现Wnt的激活，在人体和小鼠的肝细胞发现TCF7L2基因的表达。在体内外，胰岛素和喂养能够刺激肝脏TCF7L2基因的表达。此外，胰岛素能够激675活β-cateninSer的磷酸化。在体内，腹腔注射锂后Wnt信号通路的激活能够抑制肝脏糖异生基因的表达，然而在体外，锂和Wnt-3a能够减少糖异生基因的表达和肝细胞血糖的产出。在体外培养肝细胞，小干扰RNA介导的TCF7L2基因敲除后能够增加血糖的产出和糖异生基因的表达。Wnt信号通路和TCF7L2作为肝脏糖异生的[349][350]负性调节分子，TCF7L2是肝脏细胞胰岛素下游的效应分子。Gao等研究发现MEG3能够通过负性调节Wnt/β-catenin信号通路的活性抑制视网膜母细胞瘤的增殖和促进其凋亡。MEG3对视网膜母细胞瘤的抑制具有重要作用，能够作为视网膜母细胞瘤全新的预后标记物和治疗靶点。为探讨MEG3是否介导高糖诱导的内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达，我们观察Wnt/β-catenin信号通路基因β-catenin、TCF7L2和CyclinD1在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，结果显示与control组β-catenin和CyclinD1基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组β-catenin和CyclinD1基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Westernblot技术检测Wnt/β-catenin信号通路β-catenin蛋白在MEG3基因敲除后的表达水平的变化，研究结果显示与control组β-catenin蛋白的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组β-catenin蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组TCF7L2基因的表达量相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TCF7L2基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明MEG3基因敲除能够通过上调β-catenin和CyclinD1基因的表达和下调TCF7L2基因的表达激活Wnt/β-catenin信号通路。3.5线粒体信号通路与P53基因在糖尿病中的作用凋亡是很重要的生理性细胞死亡过程，调节细胞的稳态和发育生物学。一些蛋白参与凋亡的过程，最重要的是Caspase酶和Bcl-2家族蛋白。Caspase酶是凋亡的关键调控者，Caspase-3是最主要的Caspase酶，在促进细胞凋亡过程中具有重要作[351]用。Bcl-2家族的两种主要的蛋白Bcl-2和Bax蛋白是功能相反的，Bcl-2是主要165 新疆医科大学博士学位论文[352]的细胞凋亡抑制蛋白，然而Bax主要作用是促进凋亡。通过细胞色素C的释放，Bax获得功能，然后激活Caspase-3，与Bcl-2形成异质二聚体。白藜芦醇能够缓解链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的认知衰退。潜在机制可能是通过Bcl-2、Bax和Caspase-3信号通路抑制海马的凋亡，改善突触的功能障碍。线粒体信号通路是经典的凋亡信号通路，外层线粒体膜渗透性增加导致转换孔的通透性开放，引起凋亡分[353,354]子从内膜空间向细胞质的释放。Bcl-2的主要作用是稳定线粒体膜的潜力和抑制细胞色素C的释放和Caspase的激活，然而Bax与Bcl-2的作用相反。乌司他丁能够显著糖尿病小鼠的心肌功能，乌司他丁能够显著下调促炎细胞因子高迁移率族蛋白1(HMGB1)、TNF-α和IL-6的表达，通过减少Caspase-3的激活和Bax/Bcl-2的比例显著减少凋亡心肌细胞的百分比。此外，乌司他丁能够缓解MAPK信号通路的激[355]活。总之，乌司他丁对糖尿病诱导的心肌功能障碍具有保护作用。这种保护作用可能是通过MAPK信号通路发挥抗炎和抗凋亡的作用。心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病的主要的发病机制。当前并没有有效的糖尿病心肌病的治疗方法。研究表明GLP‑1能够缓解晚期蛋白质氧化产物诱导的细胞毒性和凋亡。在H9c2细胞，晚期蛋白质氧化产物能够使Akt磷酸化失活，减少磷酸化的Bad，减少Bcl-2的表达，增加Bax的表达，使Caspase-3失活。GLP‑1能够缓解以上晚期蛋白质氧化产物诱导的改变。能够发挥心肌保护作用对抗晚期蛋白质氧化产物诱导的凋亡，主要通过PI3K/AktBad[356]信号通路。胰腺β细胞的功能障碍和减少可能输由于血糖毒性在2型糖尿病患者发展中具有重要作用。鸢尾素是一种全新的锻炼诱导产生的myokine，通过促进白色脂肪组织的燃烧，减少肥胖，改善胰岛素抵抗和降低血糖，增加生热作用和增加能量的消耗。最近的研究表明鸢尾素能够促进细胞的增殖和防治细胞的凋亡。在体外(INS-1细胞)和2型糖尿病大鼠模型时发现，鸢尾素能够通过ERK和p38MAPK信号通路显著增加INS-1细胞的增殖，通过调节Caspase、Bad、Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表达，保护高糖诱导的细胞凋亡，改善胰腺β细胞的功能。鸢尾素能够显著减少糖尿病大鼠的体重和血糖，增加血清胰岛素的水平。口服血糖耐量试验表明鸢尾素能够改善2型糖尿病大鼠葡萄糖耐量。综上所述，鉴于鸢尾素对胰腺β细胞分泌功能[357]的保护作用，鸢尾素可用来作为2型糖尿病的预防和治疗。增加的Bax和Caspase-3的表达增加，细胞质细胞色素C的水平增加与肾组织损伤密切相关。这种情况在糖尿病早期阶段出现，是由于肾组织肾素血管紧张素系统的激活引起的损伤。细胞质[358]细胞色素C、Caspase-3和Ku7在肾小管的表达提示凋亡的发生。TP53(以后称之[359]为P53)长期被认为是基因组的守卫者，是一种抑癌基因被广泛研究。一半以上的人类癌症发生P53的突变或者编码的蛋白控制P53的活性(MDM2或CDKN2A)。随着遗传毒性或者致癌的作用，P53作为转录因子反式激活基因的表达发挥肿瘤抑制的作用。激活P53的活性能够诱导生长停滞基因的表达，例如CDKN1A/P21，有利于166 新疆医科大学博士学位论文DNA损伤的修复。当遇到延长或者重大的DNA损伤，P53能够通过编码促凋亡蛋白的反式激活基因，例如BBC3(PUMA)和PMAIP1(NOXA)，引起程序性的细胞死亡(凋亡)。此外，P53的意义不仅仅局限于癌症的生物学。在许多生理过程中都发现了[360-364]P53的意义，包括衰老、先天性和适应性免疫、发育、繁殖和神经变性。此外，[365-367]P53、代谢和代谢性疾病之间的关系成为了P53型的研究领域。第一个发现P53[368]y与2型糖尿病的发展相关的研究出现在2009年，Minamino等证明了在A转基因小鼠中，P53介导的饮食诱导胰岛素抵抗，更容易发生糖尿病。在细胞中通过siRNA敲除或TP53基因敲除的小鼠抑制P53的活性，能够缓解衰老和引起小鼠脂肪组织中促炎细胞因子表达下降，最终防止它们发展成为胰岛素抵抗。一年以后，关注非同源末端连接(NHEJ)DNA修复机制和P53之间关系的研究发现P53与糖尿病之间存在[369]联系。在小鼠中敲除Lig4基因后，导致NHEJ缺陷和胚胎致死，然而P53的缺陷会恢复胚胎致死。这些研究表明在胰岛素抵抗和糖尿病时，P53介导脂肪细胞和胰腺β细胞的衰老。引起糖尿病的主要原因包括⑴胰腺胰岛素产出的功能缺陷⑵血糖稳态的异常⑶胰岛素抵抗的发展。体内外研究表明P53对这三个方面产生重要影响。1型糖尿病和2型糖尿病的最常见的特征是胰腺β细胞的功能障碍。胰腺β细胞对于[370]胰岛素分泌到血液中和通过刺激血糖的摄入降低循环血糖水平具有重要作用。胰腺β细胞的损失会减少胰岛素的分泌和导致高糖血症和糖尿病。多种研究表明许多[371]信号通路聚集于P53调节胰腺β细胞的功能。Wrede等研究表明脂肪酸通过减少磷酸化/活性AKT(PKB)增加胰腺β细胞的凋亡；AKT通过磷酸化和激活主要的P53[372,373]负性调节者发挥保护细胞的作用。脂肪酸处理的β细胞模仿体内肥胖诱导的胰腺功能障碍和凋亡，P53激活导致miR34a的表达，使敏感的β细胞凋亡和抑制胰岛[374]素的胞吐作用信号通路，导致胰岛素分泌损害。在胰腺β细胞系和产生胰岛素的胰岛细胞，促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α具有协同功能增加活性氧簇的产出、P53[375]的诱导和凋亡。最后，ROS能够参与脂肪酸介导的β细胞凋亡，ROS的产生和[376,377]P53的激活是NADPH氧化酶2(NOX2)的下游效应分子。总之，脂肪酸、炎症细胞因子和ROS都可以作为P53的下游信号分子，诱导P53介导的胰腺β细胞的凋亡。一些调节P53的蛋白也影响胰腺β细胞的凋亡，包括ARF-BP1、转录因子TCF7L2[378]和miR-200。ARF-BP1是P53的一个E3泛素连接酶控制β细胞P53的功能。β细胞特异性敲除ARF-BP1的转基因小鼠能够发展成为β细胞功能障碍和死于严重的[379]糖尿病。胰腺β细胞P53的敲除能够改变表型和延长小鼠的生命。Hinault等发现小鼠异位过表达P53的delta40p53异构体能够导致低胰岛素血症。delta40p53是典型[380]的P53转录活性的负性调节者，但在一些细胞类型中能够正向调节P53的功能。在胰腺β细胞中，delta40p53导致P53的目标基因细胞周期的抑制者P51/CDKN1A的表达增加。在胰腺中P53能够被TCF7L2基因调节。TCF7L2能够通过结合到P53167 新疆医科大学博士学位论文[381]启动子区域下调P53基因的表达，保持胰腺β细胞的存活。沉默TCF7L2基因通过诱导P53基因的表达和P53的促凋亡目标基因p53INP1导致凋亡的发生。最近的[382]研究表明在胰腺β细胞和2型糖尿病患者体内，P53与miR-200密切相关。在糖尿病小鼠体内，β细胞miR-200的过表达能够激活P53和产生促凋亡基因。miR-200抑制其目标基因YPEL2的表达，YPEL2对于保持DUSP26的表达具有重要责任。DUSP26是P53的负性调节基因，miR-200介导DUSP26的减少诱导P53激活和凋亡[383]。人肝星状细胞系LX-2在TGFβ1的刺激下MEG3以剂量和时间的方式表达下调。MEG3过表达能够激活P53信号通路，随后导致Caspase3和Caspase9的表达增加。为了探究MEG3的凋亡是否通过线粒体依赖的凋亡通路，研究发现MEG3过表达会[384]诱导Bax/Bcl-2的比例增加，并且伴有细胞色素C释放到细胞质。为探讨MEG3是否对高糖诱导的内皮细胞的增殖功能产生影响，我们进行了MTT实验，MTT实验结果显示在48h、72h和96h时，与control组的细胞OD值相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞OD值相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。为了研究MEG3基因与高糖培养的人脐静脉内皮细胞凋亡之间的潜在机制，我们进行了FITC-PI双染流式细胞术，结果显示与control组的细胞凋亡率相比，HG组、HG+MEG3siRNA和HG+scramblesiRNA组的细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组的细胞凋亡率相比，HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。为了探究MEG3基因敲除对高糖培养的人脐静脉内皮细胞增殖增加和凋亡下降的潜在分子机制，我们运用Westernblot技术检测Bax、Bcl-2、Caspase3和P53凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示与control组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量相比，HG组和HG+scramblesiRNA组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG组和HG+scramblesiRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。这些研究结果表明MEG3基因敲除通过下调Bax、Caspase3和P53蛋白的表达和上调Bcl-2蛋白的表达调节内皮细胞的增殖和凋亡。3.6展望内皮细胞功能障碍可能是心血管事件的发病机制。改善内皮细胞功能可能成为[385]血管疾病有希望的治疗方法。确定的lncRNAs可能是治疗心血管疾病的候选基因[386-388]。最近几年，提出了lncRNAs在糖尿病中作用的见解。然而，在糖尿病中168 新疆医科大学博士学位论文lncRNAs作为内皮功能障碍生物标记物的可利用性还不清楚。此外，lncRNAs在内皮功能障碍中(内皮细胞炎症、血管紧张、ROS产出、NO的生物利用度、白细胞粘附和内皮细胞通透性)发挥效应的潜在机制在未来还需要深入研究。在糖尿病中，特别是NO的生物利用度减少可能是内皮功能障碍的罪魁祸首。尽管如此，lncRNAs发挥血管保护的准确机制还未完全清楚。有一个较大的挑战是lncRNAs具有较差的保守性，因此，lncRNAs从糖尿病动物模型的发现向人体的临床转化具有一定的限制性。此外，lncRNAs有许多转录本和多种目标基因，在糖尿病中对于确定lncRNAs的具体功能存在一定的障碍。其次，与内皮细胞功能障碍相关的具有表观遗传修饰的lncRNAs数量是有限的。在糖尿病的内皮细胞功能障碍中，lncRNAs可能作为全新的标志物和治疗策略。对于糖尿病的内皮细胞功能障碍的药理学治疗，lncRNAs基因的表观遗传可能提供全新的治疗靶点。理解组织或细胞特异性的lncRNAs有助于阐明糖尿病中lncRNAs的功能作用。在未来需要对lncRNAs在基因网络，以及lncRNAs在细胞与细胞之间交流方面进行研究，系统的阐明糖尿病中内皮细胞的功能障碍。4小结4.1分别与48、72、96小时正常糖(Control，5mMD-glucose)培养的人脐静脉内皮细胞相比，高糖(HG，30mMD-glucose)刺激48、72、96小时后，MEG3的表达水平以时间依赖方式表达下降。4.2与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.3与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.4与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组β-catenin和CyclinD1基因的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组TCF7L2基因的表达量相比，HG组和HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组TCF7L2基因的表达量相比，HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低，差异具有统计学意义169 新疆医科大学博士学位论文(P<0.05)。4.5在48、72和96小时，与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.6与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.7与control组相比，HG组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组Bax、Caspase3和P53蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比，HG组Bcl-2蛋白的表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组Bcl-2蛋白的表达量相比，HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。4.8与control组相比，HG组和HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与HG组相比，HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。170 新疆医科大学博士学位论文结论1在2型糖尿病中，lncRNAs和mRNAs有大量的差异表达，提示这些差异表达的lncRNAs参与了2型糖尿病发生发展过程，有可能成为临床诊断与治疗2型糖尿病的新靶点。通过进一步的生物功能信息探索，差异表达的lncRNAs涉及多条信号通路、多种疾病和多项生物功能，为后续2型糖尿病研究提供理论依据。2T2DM患者外周血中MEG3表达水平降低、MALAT1和MIAT表达水平增加，ROC曲线分析表明MEG3、MALAT1和MIAT可以作为诊断2型糖尿病的潜在生物标记物。3本研究证明了MEG3参与高糖诱导的内皮细胞功能障碍。MEG3在高糖血症的内皮细胞模型中表达下调。此外，MEG3基因敲除能够加剧内皮细胞的炎症损伤。有趣的是，MEG3基因敲除会通过上调Bcl-2蛋白的表达，下调Bax、Caspase-3和P53蛋白的表达诱导细胞的增殖和抑制细胞的凋亡。值得注意的是，MEG3基因敲除通过上调TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因和SMAD2蛋白的表达激活TGFβ信号通路，MEG3基因敲除通过上调β-catenin和CyclinD1基因和β-catenin蛋白的表达以及下调TCF7L2基因的表达激活Wnt/β-catenin信号通路。我们的结果表明，对于高糖诱导的内皮细胞功能障碍，MEG3可以作为全新的治疗靶点和分子生物标记物。171 新疆医科大学博士学位论文致谢三年的博士学习生活即将结束，回顾走过的岁月，在这段磨炼与成长的道路上，虽然迷茫过、痛苦过、挣扎过，但坚持与执着始终相伴左右。除了自己的坚持和努力，更多的是得到了很多人的支持和无私的帮助，借此论文即将完成之际，向他们表达我最崇高的敬意和最诚挚的感谢。感谢我的恩师姚华教授在我学习和生活上的严格要求和悉心指导。姚老师严谨的治学态度，精益求精的工作作风，严格的科研思维，平易近人的人格魅力，深深的感动和激励着我，是我学习的榜样。论文从选题到最后的定稿都凝聚着姚老师的心血和智慧，每一步都是在导师耐心的指导下完成的。姚老师不仅在学业上给我精心指导，在生活方面给予了我无微不至的关系和帮助。在此，谨向我的导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！非常庆幸这些年来我遇到了许多的良师益友，无论在学习、生活还是工作上都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在诸多方面都有所成长。感谢代谢性疾病重点实验室的马琦老师和王黎老师在实验技术方面给予的支持和协助；感谢苏银霞同学在学习、生活和实验中给予我的热情帮助和无私的指导；感谢新疆医科大学第一附属医院检验科和各临床科室的所有老师，感谢他们在课题的顺利进展和完成方面给予我的支持和帮助；感谢劳动卫生与环境卫生学教研室的所有老师和同学，在博士三年共同的学习和生活中，你们对学术研究的执着追求深深感染着我，你们身上的优点增加了我追求知识的信心和克服困难的决心和勇气；感谢2015级博士科研班的老师和同学们在学习生活中带给我的快乐和感动。感谢我的家人在我读博士研究生期间给予我极大的鼓励和无私的帮助，家人的支持和奉献给予了我心灵上的安慰和完成课题研究的动力，使我能够顺利完成学业。最后，衷心的祝愿我的家人、导师和同学们身体健康，万事如意。172 新疆医科大学博士学位论文参考文献[1]RamachandranA,MaRC,SnehalathaC.DiabetesinAsia.[J].Lancet,2010,375(9712):408-418.[2]XuY,WangL,HeJ,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults[J].JamatheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,2013,310(9):948.[3]YeungRO,ZhangY,LukA,etal.Metabolicprofilesandtreatmentgapsinyoung-onsettype2diabetesinAsia(theJADEprogramme):across-sectionalstudyofaprospectivecohort.[J].LancetDiabetes&Endocrinology,2014,2(12):935-943.[4]ZhengYM,LinongJI,JingWU.Cost-of-illnessstudiesofdiabetesmellitusinChina:Asystematicreview[J].Chin.j.end.met,2012.[5]LuJ,WangL,LiM,etal.MetabolicSyndromeAmongAdultsinChina:The2010ChinaNoncommunicableDiseaseSurveillance[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2017,102(2):507.[6]KoGT,ChanJC,CockramCS,etal.Predictionofhypertension,diabetes,dyslipidaemiaoralbuminuriausingsimpleanthropometricindexesinHongKongChinese[J].InternationalJournalofObesity&RelatedMetabolicDisordersJournaloftheInternationalAssociationfortheStudyofObesity,1999,23(11):1136.[7]MckeiguePM,ShahB,MarmotMG.RelationofcentralobesityandinsulinresistancewithhighdiabetesprevalenceandcardiovascularriskinSouthAsians.[J].Lancet,1991,337(8738):382.[8]KohbanerjeeP,WangY,HuFB,etal.ChangesinbodyweightandbodyfatdistributionasriskfactorsforclinicaldiabetesinUSmen.[J].AmericanJournalofEpidemiology,2004,159(12):1150-9.[9]DavidG.McMillan,AlanSpeight.AsiansaredifferentfromCaucasiansandfromeachotherintheirbodymassindex/bodyfatpercentrelationship.[J].ObesityReviewsAnOfficialJournaloftheInternationalAssociationfortheStudyofObesity,2002,3(3):141-6.[10]BoykoEJ,FujimotoWY,LeonettiDL,etal.Visceraladiposityandriskoftype2diabetes:aprospectivestudyamongJapaneseAmericans.[J].DiabetesCare,2000,23(4):465.[11]AhimaRS,FlierJS.AhimaRS,FlierJS.Adiposetissueasanendocrineorgan[J].TrendsinEndocrinology&Metabolism,2000,11(8):327-332.173 新疆医科大学博士学位论文[12]Abdul-GhaniMA,DefronzoRA.Mitochondrialdysfunction,insulinresistance,andtype2diabetesmellitus[J].CurrDiabRep,2008,8(3):173-178.[13]NgMC;LeeSC;KoGT;LiJK;SoWY;HashimY;BarnettAH;MackayIR;CritchleyJA;CockramCS;ChanJC.FamilialEarly-OnsetType2DiabetesinChinesePatients[J].DiabetesCare,2001,24(4):663-671.[14]WallaceDC.Bioenergeticsandtheepigenome:interfacebetweentheenvironmentandgenesincommondiseases[J].DevelopmentalDisabilitiesResearchReviews,2010,16(2):114–119.[15]TakeuchiM,OkamotoK,TakagiT,etal.Ethnicdifferenceinpatientswithtype2diabetesmellitusininter-EastAsianpopulations:asystematicreviewandmeta-analysisfocusingonfastingseruminsulin[J].JournalofDiabetes,2008,1(4):370-376.[16]MccarthyMI.Genomics,type2diabetes,andobesity.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2010,363(24):2339.[17]ChoYS,ChenCH,HuC,etal.Meta-analysisofgenome-wideassociationstudiesidentifieseightnewlocifortype2diabetesineastAsians[J].NatureGenetics,2012,44(1):67-72.[18]BaoYQ,MaXJ,LiHT,etal.GlycatedhaemoglobinA1cfordiagnosingdiabetesinChinesepopulation:crosssectionalepidemiologicalsurvey.[J].BMJ(Clinicalresearched.),2010,340(7757):c2249.[19]LiJ,TianH,LiQ,etal.Improvementofinsulinsensitivityandbeta-cellfunctionbynateglinideandrepaglinideintype2diabeticpatients-arandomizedcontrolleddouble-blindanddouble-dummymulticentreclinicaltrial[J].DiabetesObesity&Metabolism,2007,9(4):558.[20]ChanJC,ChanKW,HoLL,etal.AnAsianMulticenterClinicalTrialtoAssesstheEfficacyandTolerabilityofAcarboseComparedWithPlaceboinType2DiabeticPatientsPreviouslyTreatedWithDiet[J].DiabetesCare,1998,21(7):1058.[21]YangW,LiuJ,ShanZ,etal.Acarbosecomparedwithmetforminasinitialtherapyinpatientswithnewlydiagnosedtype2diabetes:anopen-label,non-inferiorityrandomisedtrial.[J].LancetDiabetes&Endocrinology,2014,2(1):46.[22]TorrénsJI,SkurnickJ,DavidowAL,etal.Ethnicdifferencesininsulinsensitivityandbeta-cellfunctioninpremenopausalorearlyperimenopausalwomenwithoutdiabetes:theStudyofWomen'sHealthAcrosstheNation(SWAN).[J].DiabetesCare,2004,27(2):354.174 新疆医科大学博士学位论文[23]MaRCW,HuC,TamCH,etal.Genome-wideassociationstudyinaChinesepopulationidentifiesasusceptibilitylocusfortype2diabetesat7q32nearPAX4[J].Diabetologia,2013,56(6):1291-305.[24]BrownCJ,BallabioA,RupertJL,etal.AgenefromtheregionofthehumanXinactivationcentreisexpressedexclusivelyfromtheinactiveXchromosome.[J].Nature,1991,349(6304):38-44.[25]FrobergJE,YangL,LeeJT.GuidedbyRNAs:X-inactivationasamodelforlncRNAfunction[J].JournalofMolecularBiology,2013,425(19):3698-706.[26]KhalilAM,GuttmanM,HuarteM,etal.ManyhumanlargeintergenicnoncodingRNAsassociatewithchromatin-modifyingcomplexesandaffectgeneexpression.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2009,106(28):11667-72.[27]TsaiMC,ManorO,WanY,etal.LongnoncodingRNAasmodularscaffoldofhistonemodificationcomplexes[J].Science,2010,329(5992):689.[28]KhalilAM,GuttmanM,HuarteM,etal.ManyhumanlargeintergenicnoncodingRNAsassociatewithchromatin-modifyingcomplexesandaffectgeneexpression.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2009,106(28):11667-72.[29]KretzM,SiprashviliZ,ChuC,etal.Controlofsomatictissuedifferentiationbythelongnon-codingRNATINCR.[J].Nature,2013,493(7431):231-5.[30]KapranovP,ChengJ,DikeS,etal.RNAmapsrevealnewRNAclassesandapossiblefunctionforpervasivetranscription.[J].Science,2007,316(5830):1484-1488.[31]ReddyMA,ZhangE,NatarajanR.Epigeneticmechanismsindiabeticcomplicationsandmetabolicmemory[J].Diabetologia,2015,58(3):443-55.[32]VoightBF,ScottLJ,SteinthorsdottirV,etal.Twelvetype2diabetessusceptibilitylociidentifiedthroughlarge-scaleassociationanalysis[J].NatureGenetics,2010,42(7):579-89.[33]MoránI,İldemAkerman,BuntMVD,etal.HumanβCellTranscriptomeAnalysisUncoverslncRNAsThatAreTissue-Specific,DynamicallyRegulated,andAbnormallyExpressedinType2Diabetes[J].CellMetabolism,2012,16(4):435-48.[34]ArnesL,AkermanI,BalderesDA,etal.betalinc1encodesalongnoncodingRNAthatregulatesisletbeta-cellformationandfunction[J].GenesDev,2016,30(5):502-507.175 新疆医科大学博士学位论文[35]FadistaJ,VikmanP,LaaksoEO,etal.Globalgenomicandtranscriptomicanalysisofhumanpancreaticisletsrevealsnovelgenesinfluencingglucosemetabolism[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(38):13924.[36]BennerC,MeulenTVD,CacéresE,etal.Thetranscriptionallandscapeofmousebetacellscomparedtohumanbetacellsrevealsnotablespeciesdifferencesinlongnon-codingRNAandprotein-codinggeneexpression[J].BmcGenomics,2014,15(1):620.[37]LiP,RuanX,YangL,etal.ALiver-EnrichedLongNon-CodingRNA,lncLSTR,RegulatesSystemicLipidMetabolisminMice.[J].CellMetabolism,2015,21(3):455.[38]GangC,YuD,XueN,etal.LncRNASRApromoteshepaticsteatosisthroughrepressingtheexpressionofadiposetriglyceridelipase(ATGL):[J].ScientificReports,2016,6:35531.[39]AtanasovskaB,RensenSS,MrVDS,etal.Aliver-specificlongnon-codingRNAwitharoleincellviabilityiselevatedinhumannon-alcoholicsteatohepatitis[J].Hepatology,2017.[40]SookoianS,RohrC,SalatinoA,etal.GeneticvariationinlongnoncodingRNAsandtheriskofnonalcoholicfattyliverdisease[J].Oncotarget,2017,8(14):22917-22926.[41]SunC,LiuX,YiZ,etal.Genome-wideanalysisoflongnoncodingRNAexpressionprofilesinpatientswithnon-alcoholicfattyliverdisease[J].IubmbLife,2015,67(11):847-852.[42]ZhouY,CheunsuchonP,NakayamaY,etal.ActivationofpaternallyexpressedgenesandperinataldeathcausedbydeletionoftheGtl2gene[J].Development,2010,137(16):2643.[43]ZhouL,SunK,ZhaoY,etal.Linc-YY1promotesmyogenicdifferentiationandmuscleregenerationthroughaninteractionwiththetranscriptionfactorYY1[J].NatureCommunications,2015,6:10026.[44]BuckinghamM,RigbyPW.Generegulatorynetworksandtranscriptionalmechanismsthatcontrolmyogenesis.[J].DevelopmentalCell,2014,28(3):225.[45]WangL,ZhaoY,BaoX,etal.LncRNADuminteractswithDnmtstoregulateDppa2expressionduringmyogenicdifferentiationandmuscleregeneration[J].CellResearch,2015,25(3):335-50.[46]YuX,ZhangY,LiT,etal.Longnon-codingRNALinc-RAMenhancesmyogenicdifferentiationbyinteractingwithMyoD[J].NatureCommunications,2017,8:14016.176 新疆医科大学博士学位论文[47]ForcalesSV,AlbiniS,GiordaniL,etal.Signal-dependentincorporationofMyoD-BAF60cintoBrg1-basedSWI/SNFchromatin-remodellingcomplex.[J].EmboJournal,2012,31(2):301.[48]LackeyDE,OlefskyJM.Regulationofmetabolismbytheinnateimmunesystem.[J].NatureReviewsEndocrinology,2016,12(1):15.[49]SunL,GoffLA,TrapnellC,etal.LongnoncodingRNAsregulateadipogenesis.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(9):3387.[50]Alvarez-DominguezJ,BaiZ,XuD,etal.DeNovoReconstructionofAdiposeTissueTranscriptomesRevealsLongNon-codingRNARegulatorsofBrownAdipocyteDevelopment[J].CellMetabolism,2015,21(5):764.[51]ZhaoXY,LiS,WangGX,etal.AlongnoncodingRNAtranscriptionalregulatorycircuitdrivesthermogenicadipocytedifferentiation[J].MolecularCell,2014,55(3):372.[52]LiuS,ShengL,MiaoH,etal.SRAgeneknockoutprotectsagainstdiet-inducedobesityandimprovesglucosetolerance.[J].JournalofBiologicalChemistry,2014,289(19):13000.[53]KornienkoAE,DotterCP,GuenzlPM,etal.Longnon-codingRNAsdisplayhighernaturalexpressionvariationthanprotein-codinggenesinhealthyhumans[J].GenomeBiology,2016,17(1):14.[54]HonCC,RamilowskiJA,HarshbargerJ,etal.Anatlasofhumanlongnon-codingRNAswithaccurate5'ends[J].Nature,2017,543(7644):199.[55]AndersonDM,AndersonKM,ChangCL,etal.AmicropeptideencodedbyaputativelongnoncodingRNAregulatesmuscleperformance.[J].Cell,2015,160(4):595.[56]MatsumotoA,PasutA,MatsumotoM,etal.mTORC1andmuscleregenerationareregulatedbytheLINC00961-encodedSPARpolypeptide[J].Nature,2017,541(7636):228.[57]ChuC,QuK,ZhongFL,etal.GenomicmapsoflincRNAoccupancyrevealprinciplesofRNA-chromatininteractions[J].MolecularCell,2011,44(4):667.[58]KatoM,MeiW,ZhuoC,etal.Anendoplasmicreticulumstress-regulatedlncRNAhostingamicroRNAmegaclusterinducesearlyfeaturesofdiabeticnephropathy[J].NatureCommunications,2016,7:12864.[59]MattickJS.RNAregulation:anewgenetics?[J].NatureReviewsGenetics,2004,177 新疆医科大学博士学位论文5(5):316-323.[60]ClaverieJM.Fewergenes,morenoncodingRNA.[J].Science,2005,309(5740):1529.[61]QuinnJJ,ChangHY.Uniquefeaturesoflongnon-codingRNAbiogenesisandfunction.[J].NatureReviewsGenetics,2016,17(1):47.[62]PandeyRR,MondalT,MohammadF,etal.Kcnq1ot1antisensenoncodingRNAmediateslineage-specifictranscriptionalsilencingthroughchromatin-levelregulation.[J].MolecularCell,2008,32(2):232-246.[63]RinnJL.lncRNAs:linkingRNAtochromatin.[J].ColdSpringHarborPerspectivesinBiology,2014,6(8).[64]RinnJL,KerteszM,WangJK,etal.FunctionaldemarcationofactiveandsilentchromatindomainsinhumanHOXlocibynoncodingRNAs[J].Cell,2007,129(7):1311.[65]ReinbergD,MargueronR.ThePolycombcomplexPRC2anditsmarkinlife[J].Nature,2011,469(7330):343.[66]KotakeY,NakagawaT,KitagawaK,etal.Longnon-codingRNAANRILisrequiredforthePRC2recruitmenttoandsilencingofp15INK4Btumorsuppressorgene[J].Oncogene,2011,30(16):1956.[67]Cifuentes-RojasC,HernandezA,SarmaK,etal.RegulatoryInteractionsbetweenRNAandPolycombRepressiveComplex2[J].MolecularCell,2014,55(2):171.[68]BondCS,FoxAH.Paraspeckles:nuclearbodiesbuiltonlongnoncodingRNA.[J].JournalofCellBiology,2009,186(5):637.[69]WestJA,DavisCP,SunwooH,etal.ThelongnoncodingRNAsNEAT1andMALAT1bindactivechromatinsites.[J].MolecularCell,2014,55(5):791.[70]GongC,MaquatLE.lncRNAstransactivateStaufen1-mediatedmRNAdecaybyduplexingwith3'UTRsviaAluelements[J].Nature,2011,470(7333):284-8.[71]KinoT,HurtDE,IchijoT,etal.NoncodingRNAGas5IsaGrowthArrestandStarvation-AssociatedRepressoroftheGlucocorticoidReceptor[J].ScienceSignaling,2010,3(107):ra8.[72]SalmenaL,PolisenoL,TayY,etal.AceRNAHypothesis:TheRosettaStoneofaHiddenRNALanguage?[J].Cell,2011,146(3):353-8.[73]LauraP,LeonardoS,ZhangJ,etal.Acoding-independentfunctionofgeneandpseudogenemRNAsregulatestumourbiology[J].Nature,2010,465(7301):1033-8.[74]XiaT,LiaoQ,JiangX,etal.LongnoncodingRNAassociated-competing178 新疆医科大学博士学位论文endogenousRNAsingastriccancer[J].ScientificReports,2014,4:6088.[75]LeeGL,DobiA,SrivastavaS.Prostatecancer:diagnosticperformanceofthePCA3urinetest.[J].NatureReviewsUrology,2011,8(3):123.[76]SánchezY,SeguraV,Marín-BéjarO,etal.Genome-wideanalysisofthehumanp53transcriptionalnetworkunveilsalncRNAtumoursuppressorsignature[J].NatureCommunications,2014,5(5):5812.[77]LeucciE,VendraminR,SpinazziM,etal.Melanomaaddictiontothelongnon-codingRNASAMMSON[J].Nature,2016,531(7595):518-522.[78]GodinhoM,MeijerD,Setyono-HanB,etal.CharacterizationofBCAR4,anoveloncogenecausingendocrineresistanceinhumanbreastcancercells†[J].JournalofCellularPhysiology,2011,226(7):1741.[79]XingZ,LinA,LiC,etal.LncRNADirectsCooperativeEpigeneticRegulationDownstreamofChemokineSignals[J].Cell,2014,159(5):1110.[80]GuayC,JacovettiC,NescaV,etal.Emergingrolesofnon-codingRNAsinpancreaticβ-cellfunctionanddysfunction[J].DiabetesObesity&Metabolism,2012,14(s3):12-21.[81]YoungTL,MatsudaT,CepkoCL.ThenoncodingRNAtaurineupregulatedgene1isrequiredfordifferentiationofthemurineretina.[J].CurrentBiologyCb,2005,15(6):501.[82]YinDD,ZhangEB,YouLH,etal.DownregulationoflncRNATUG1affectsapoptosisandinsulinsecretioninmousepancreaticβcells.[J].CellularPhysiology&BiochemistryInternationalJournalofExperimentalCellularPhysiologyBiochemistry&Pharmacology,2015,35(5):1892.[83]GaboryA,JammesH,DandoloL.TheH19locus:roleofanimprintednon-codingRNAingrowthanddevelopment.[J].BioessaysNews&ReviewsinMolecularCellular&DevelopmentalBiology,2010,32(6):473-80.[84]LuoM,LiZ,WangW,etal.Longnon-codingRNAH19increasesbladdercancermetastasisbyassociatingwithEZH2andinhibitingE-cadherinexpression[J].CancerLetters,2013,333(2):213-21.[85]GaoY,WuF,ZhouJ,etal.TheH19/let-7double-negativefeedbackloopcontributestoglucosemetabolisminmusclecells[J].NucleicAcidsResearch,2014,42(22):13799.[86]SinghKK,MantellaLE,PanY,etal.Aglobalprofileofglucose-sensitiveendothelial-expressedlongnon-codingRNAs[J].CanadianJournalofCardiology,179 新疆医科大学博士学位论文2016,32(10):S232-S233.[87]LiX,WuZ,FuX,etal.lncRNAs:insightsintotheirfunctionandmechanicsinunderlyingdisorders[J].MutationResearchReviewsinMutationResearch,2014,762:1.[88]BuglianiM,LiechtiR,CheonH,etal.Microarrayanalysisofisolatedhumanislettranscriptomeintype2diabetesandtheroleoftheubiquitin–proteasomesysteminpancreaticbetacelldysfunction[J].Molecular&CellularEndocrinology,2013,367(1–2):1-10.[89]BastaG,SchmidtAM,DeCaterinaR.Advancedglycationendproductsandvascularinflammation:implicationsforacceleratedatherosclerosisindiabetes[J].CardiovascularResearch,2004,63(4):582.[90]ShenC,LiQ,ZhangYC,etal.AdvancedglycationendproductsincreaseEPCapoptosisanddecreasenitricoxidereleaseviaMAPKpathways.[J].Biomedicine&pharmacotherapy=Biomedecine&pharmacotherapie,2010,64(1):35.[91]KlagsbrunM,EichmannA.Aroleforaxonguidancereceptorsandligandsinbloodvesseldevelopmentandtumorangiogenesis[J].Cytokine&GrowthFactorReviews,2005,16(4-5):535.[92]LehmannR,SchleicherED.Molecularmechanismofdiabeticnephropathy[J].ClinicaChimicaActa,2000,297(1):135-144.[93]Hai-JianMA,Guan-ZhongWU,PharmacologyDO,etal.MolecularMechanismsinthePathogenesisofDiabeticNephropathy[J].ProgressinModernBiomedicine,2014,4(8):444-452.[94]WangM,YaoD,WangS,etal.Longnon-codingRNAENSMUST00000147869protectsmesangialcellsfromproliferationandfibrosisinducedbydiabeticnephropathy[J].Endocrine,2016,54(1):1-12.[95]ZhaoX,ImigJD.KidneyCYP450enzymes:biologicalactionsbeyonddrugmetabolism[J].CurrentDrugMetabolism,2003,4(1):73.[96]ZhangY,KlaassenCD.HormonalregulationofCyp4aisoformsinmouseliverandkidney[J].Xenobiotica;thefateofforeigncompoundsinbiologicalsystems,2013,43(12):1055.[97]MullerD,SchmidtC,Barbosa-SicardEM,etal.MouseCyp4aisoforms:enzymaticproperties,gender-andstrain-specificexpression,androleinrenal20-hydroxyeicosatetraenoicacidformation[J].BiochemicalJournal,2007,403(1):109-118.180 新疆医科大学博士学位论文[98]BrophyS,CookseyR,GravenorMB,etal.Populationbasedabsoluteandrelativesurvivalto1yearofpeoplewithdiabetesfollowingamyocardialinfarction:Acohortstudyusinghospitaladmissionsdata[J].BmcPublicHealth,2010,10(1):1-8.[99]SenyoSE,SteinhauserML,PizzimentiCL,etal.Mammalianheartrenewalbypre-existingcardiomyocytes.[J].Nature,2013,493(7432):433.[100]MolgatAS,TilokeeEL,RafatianG,etal.Hyperglycemiainhibitscardiacstemcell-mediatedcardiacrepairandangiogeniccapacity.[J].Circulation,2014,130(11Suppl1):S70.[101]LiuW,PuY,WangC,etal.ExpressionprofilesoflongnoncodingRNAsincardiacstemcellsunderhyperglycemicconditions[J].InternationalJournalofCardiology,2016,222:933.[102]SinghB,NikoopourE,HuszarikK,etal.ImmunomodulationandregenerationofisletBetacellsbycytokinesinautoimmunetype1diabetes.[J].JournalofInterferon&CytokineResearchtheOfficialJournaloftheInternationalSocietyforInterferon&CytokineResearch,2011,31(10):711-9.[103]OrtisF,NaamaneN,FlamezD,etal.Cytokinesinterleukin-1betaandtumornecrosisfactor-alpharegulatedifferenttranscriptionalandalternativesplicingnetworksinprimarybeta-cells.[J].Diabetes,2010,59(2):358.[104]MotterleA,GattescoS,CailleD,etal.Involvementoflongnon-codingRNAsinbetacellfailureattheonsetoftype1diabetesinNODmice[J].Diabetologia,2015,58(8):1827.[105]KutterC,WattS,StefflovaK,etal.RapidturnoveroflongnoncodingRNAsandtheevolutionofgeneexpression[J].PlosGenetics,2012,8(7):e1002841.[106]SunC,XueL,ZhuZ,etal.InsightsfromlncRNAsProfilingofMIN6BetaCellsUndergoingInflammation.[J].MediatorsofInflammation,2016,2016:1-10.[107]JungM,WeigertA,TausendschönM,etal.Interleukin-10-InducedNeutrophilGelatinase-AssociatedLipocalinProductioninMacrophageswithConsequencesforTumorGrowth[J].Molecular&CellularBiology,2012,32(19):3938-48.[108]LouY,WuC,WuM,etal.Thechangesofneutrophilgelatinase-associatedlipocalininplasmaanditsexpressioninadiposetissueinpregnantwomenwithgestationaldiabetes[J].DiabetesResearch&ClinicalPractice,2014,104(1):136-42.[109]WonTJ,YuJJ,KwonSJ,etal.Forcedexpressionofprogrammeddeath-1geneonTcelldecreasedtheincidenceoftype1diabetes[J].ArchivesofPharmacalResearch,2010,33(11):1825-1833.181 新疆医科大学博士学位论文[110]AnsariMJI,SalamaAD,ChitnisT,etal.TheProgrammedDeath-1(PD-1)PathwayRegulatesAutoimmuneDiabetesinNonobeseDiabetic(NOD)Mice[J].JournalofExperimentalMedicine,2003,198(1):63.[111]GuleriaI,GubbelsBuppM,DadaS,etal.MechanismsofPDL1-mediatedregulationofautoimmunediabetes.[J].ClinicalImmunology,2007,125(1):16-25.[112]BottiniN,MusumeciL,AlonsoA,etal.AfunctionalvariantoflymphoidtyrosinephosphataseisassociatedwithtypeIdiabetes[J].NatureGenetics,2004,36(4):337.[113]PirotP,CardozoAK,EizirikDL.Mediatorsandmechanismsofpancreaticbeta-celldeathintype1diabetes.[J].ArquivosBrasileirosDeEndocrinologiaEMetabologia,2008,52(2):156.[114]GrijalvaJL,HuizengaM,MuellerK,etal.DynamicalterationsinHipposignalingpathwayandYAPactivationduringliverregeneration[J].AmericanJournalofPhysiologyGastrointestinal&LiverPhysiology,2014,307(2):196-204.[115]DelDR.Thehipposignalingpathway:implicationsforheartregenerationanddisease[J].Clinical&TranslationalMedicine,2015,4(1):1-1.[116]KellAM,JrGM.RIG-IinRNAvirusrecognition.[J].Virology,2015,479-480:110.[117]JiangGJ,ZhangT,AnT,etal.DifferentialExpressionofLongNoncodingRNAsbetweenSpermSamplesfromDiabeticandNon-DiabeticMice[J].PlosOne,2016,11(4):e0154028.[118]JodarM;SelvarajuS;SendlerE;DiamondMP;KrawetzSA;ReproductiveMedicineNetwork.Thepresence,roleandclinicaluseofspermatozoalRNAs.[J].HumanReproductionUpdate,2013,19(6):604.[119]OstermeierGC,GoodrichRJ,MoldenhauerJS,etal.ASuiteofNovelHumanSpermatozoalRNAs[J].JournalofAndrology,2005,26(1):70-74.[120]AravinAA,KlenovMS,VaginVV,etal.DissectionofanaturalRNAsilencingprocessintheDrosophilamelanogastergermline.[J].Molecular&CellularBiology,2004,24(15):6742.[121]EdwardS,JohnsonGD,MaoS,etal.Stability,deliveryandfunctionsofhumanspermRNAsatfertilization[J].NucleicAcidsResearch,2013,41(7):4104.[122]NolascoS,BellidoJ,GonçalvesJ,etal.TheExpressionofTubulinCofactorA(TBCA)IsRegulatedbyaNoncodingAntisense,Tbca,RNAduringTestisMaturation[J].PlosOne,2012,7(8):e42536.[123]FukudaN,FukudaT,SinnamonJ,etal.ThetransactingfactorCBF-A/HnrnpabbindstotheA2RE/RTSelementofprotamine2mRNAandcontributestoits182 新疆医科大学博士学位论文translationalregulationduringmousespermatogenesis.[J].PlosGenetics,2013,9(10):e1003858.[124]GarcíajiménezC,GarcíamartínezJM,ChocarrocalvoA,etal.Anewlinkbetweendiabetesandcancer:enhancedWNT/β-cateninsignalingbyhighglucose.[J].JournalofMolecularEndocrinology,2013,52(1):R51.[125]AkhadeVS,DigheSN,KatarukaS.MechanismofWntsignalinginduceddownregulationofmrhllongnon-codingRNAinmousespermatogonialcells[J].NucleicAcidsResearch,2016,44(1):387.[126]ParkHW,KimYC,YuB,etal.AlternativeWntSignalingActivatesYAP/TAZ[J].Cell,2015,162(4):780.[127]VigneriP,FrascaF,SciaccaL,etal.Diabetesandcancer[J].EndocrineRelatedCancer,2009,16(4):1103-1123.[128]GallagherEJ,LeroithD.Diabetes,cancer,andmetformin:connectionsofmetabolismandcellproliferation[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2011,1243(1):54.[129]Jan-WilhelmK,BrüningJC.Regulationofmetabolismbylong,non-codingRNAs[J].FrontiersinGenetics,2014,5:57.[130]GoffLA,RinnJL.LinkingRNAbiologytolncRNAs[J].GenomeResearch,2015,25(10):1456-1465.[131]JohnssonP,LipovichL,GrandérD,etal.Evolutionaryconservationoflongnon-codingRNAs;sequence,structure,function.[J].BiochimBiophysActa.2014,1840(3):1063-1071.[132]UlitskyI,ShkumatavaA,JanCH,etal.ConservedFunctionoflincRNAsinVertebrateEmbryonicDevelopmentDespiteRapidSequenceEvolution[J].Cell,2011,147(7):1537.[133]PaulP,ChakrabortyA,SarkarD,etal.InterplaybetweenmiRNAsandHumanDiseases:AReview.[J].JournalofCellularPhysiology,2017.[134]ErikssonJG,LaineMK.Insulintherapyintheelderlywithtype2diabetes[J].MinervaEndocrinologica,2015,40(4):283.[135]LeeJH,GaoC,PengG,etal.AnalysisoftranscriptomecomplexitythroughRNAsequencinginnormalandfailingmurinehearts.[J].CirculationResearch,2011,109(12):1332.[136]GutschnerT,DiederichsS.Thehallmarksofcancer:Alongnon-codingRNApointofview[J].RnaBiology,2012,9(6):703.183 新疆医科大学博士学位论文[137]WangY,MoY,GongZ,etal.CircularRNAsinhumancancer[J].MolecularCancer,2017,16(1):25.[138]CarterG,MiladinovicB,PatelAA,etal.CirculatinglongnoncodingRNAGAS5levelsarecorrelatedtoprevalenceoftype2diabetesmellitus[J].BbaClinical,2015,4(C):102-107.[139]DaviesM,BrophyS,WilliamsR,etal.ThePrevalence,Severity,andImpactofPainfulDiabeticPeripheralNeuropathyinType2Diabetes[J].DiabetesCare,2006,29(7):1518-1522.[140]Y.Zhou,X.Zhang,A.Klibanski,MEG3non-codingRNA:atumorsuppressor,J.Mol.Endocrinol.48(2012)R45eR53.[141]T.Mondal,S.Subhash,R.Vaid,S.Enroth,S.Uday,B.Reinius,S.Mitra,A.Mohammed,A.R.James,E.Hoberg,MEG3longnon-codingRNAregulatestheTGF-[beta]pathwaygenesthroughformationofRNA-DNAtriplexstructures,Nat.Commun.6(2015).[142]KameswaranV,BramswigNC,MckennaLB,etal.EpigeneticregulationoftheMEG3-DLK1microRNAclusterinhumanType2diabeticislets[J].CellMetabolism.2014,19(1):135-145.[143]WallaceC,SmythDJ,Maisuria-ArmerM,WalkerNM,ToddJAandClaytonDG.TheimprintedDLK1-MEG3generegiononchromosome14q32.2alterssusceptibilitytotype1diabetes.NatGenet2010;42:68-71.[144]QiuGZ,TianW,FuHT,etal.LongnoncodingRNA-MEG3isinvolvedindiabetesmellitus-relatedmicrovasculardysfunction[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications.2016,471(1):135-141.[145]YouL,WangN,YinD,etal.DownregulationofLongNoncodingRNAMeg3AffectsInsulinSynthesisandSecretioninMousePancreaticBetaCells.[J].JournalofCellularPhysiology.2016(4).[146]ZhuX,WuYB,ZhouJ,etal.UpregulationoflncRNAMEG3promoteshepaticinsulinresistanceviaincreasingFoxO1expression.[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications.2016,469(2):319-325.[147]MercerTR,DingerME,MattickJS.Longnon-codingRNAs:insightsintofunctions[J].NatureReviewsGenetics,2009,10(3):155.[148]RinnJL,ChangHY.GenomeRegulationbyLongNoncodingRNAs[J].AnnualReviewofBiochemistry,2012,81(1):145.[149]YanB,TaoZF,LiXM,etal.AberrantexpressionoflongnoncodingRNAsinearly184 新疆医科大学博士学位论文diabeticretinopathy[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2014,55(2):941.[150]ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs.[J].Cell,2009,136(4):629.[151]QureshiIA,MehlerMF.Emergingrolesofnon-codingRNAsinbrainevolution,development,plasticityanddisease.[J].NatureReviewsNeuroscience,2012,13(8):528-41.[152]HarriesLW.Longnon-codingRNAsandhumandisease.[J].BiochemicalSocietyTransactions,2012,40(4):902.[153]WingenderE,ChenX,HehlR,etal.TRANSFAC:anintegratedsystemforgeneexpressionregulation[J].NucleicAcidsResearch,2000,28(1):316-319.[154]FowlerMJ.MicrovascularandMacrovascularComplicationsofDiabetes[J].ClinicalDiabetes,2008,26(26):77-82.[155]BaumSJ.Retinopathyprogressionintype2diabetes.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2010,363(22):2173-4.[156]HammesHP,FengY,PfisterF,etal.DiabeticRetinopathy:TargetingVasoregression[J].Diabetes,2011,60(1):9.[157]NguyenTT,WangJJ,WongTY.Retinalvascularchangesinpre-diabetesandprehypertension:newfindingsandtheirresearchandclinicalimplications.[J].DiabetesCare,2007,30(10):2708-2715.[158]BarberAJ,GardnerTW,AbcouwerSF.TheSignificanceofVascularandNeuralApoptosistothePathologyofDiabeticRetinopathy[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2011,52(2):1156.[159]LeungA,TracC,JinW,etal.NovelLongNon-CodingRNAsAreRegulatedbyAngiotensinIIinVascularSmoothMuscleCells[J].CirculationResearch,2013,113(3):266.[160]MichalikKM,YouX,ManavskiY,etal.LongnoncodingRNAMALAT1regulatesendothelialcellfunctionandvesselgrowth[J].CirculationResearch,2014,114(9):1389.[161]AdaCongrains,KeiKamide,TomohiroKatsuya,etal.CVD-associatednon-codingRNA,ANRIL,modulatesexpressionofatherogenicpathwaysinVSMC[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2012,419(4):612-616.[162]LorenzenJ,KumarswamyR,DangwalS,etal.MicroRNAsindiabetesanddiabetes-associatedcomplications[J].RnaBiology,2012,9(6):820-827.185 新疆医科大学博士学位论文[163]YangHu,YingChen,LexiDing,etal.Pathogenicroleofdiabetes-inducedPPAR-alphadown-regulationinmicrovasculardysfunction[J].2013.[164]GutschnerT,HämmerleM,DiederichsS.MALAT1-aparadigmforlongnoncodingRNAfunctionincancer[J].JournalofMolecularMedicine,2013,91(7):791-801.[165]QiuMT,HuJW,YinR,etal.LongnoncodingRNA:anemergingparadigmofcancerresearch[J].TumourBiologytheJournaloftheInternationalSocietyforOncodevelopmentalBiology&Medicine,2013,34(2):613-620.[166]CuadradoA,NebredaAR.Mechanismsandfunctionsofp38MAPKsignalling[J].BiochemicalJournal,2010,429(3):403.[167]KyriakisJM,AvruchJ.MammalianMAPKsignaltransductionpathwaysactivatedbystressandinflammation:a10-yearupdate.[J].PhysiologicalReviews,2012,92(2):689.[168]PuthanveetilP,ChenS,FengB,etal.Longnon‐codingRNAMALAT1regulateshyperglycaemiainducedinflammatoryprocessintheendothelialcells[J].JournalofCellular&MolecularMedicine,2015,19(6):1418.[169]FalcãopiresI,LeitemoreiraAF.Diabeticcardiomyopathy:understandingthemolecularandcellularbasistoprogressindiagnosisandtreatment.[J].HeartFailureReviews,2012,17(3):325.[170]MoranVA,PereraRJ,KhalilAM.Emergingfunctionalandmechanisticparadigmsofmammalianlongnon-codingRNAs[J].NucleicAcidsResearch,2012,40(14):6391.[171]CarlaA.Klattenhoff,JohannaC.Scheuermann,LaurenE.Surface,etal.Braveheart,aLongNoncodingRNARequiredforCardiovascularLineageCommitment[J].Cell,2013,152(3):570-83.[172]GroteP,WittlerL,HendrixD,etal.TheTissue-SpecificlncRNAIsanEssentialRegulatorofHeartandBodyWallDevelopmentintheMouse[J].DevelopmentalCell,2013,24(2):206-14.[173]LeungA,TracC,JinW,etal.NovelLongNon-CodingRNAsAreRegulatedbyAngiotensinIIinVascularSmoothMuscleCells[J].CirculationResearch,2013,113(3):266.[174]HammesHP,FengY,PfisterF,etal.DiabeticRetinopathy:TargetingVasoregression[J].Diabetes,2011,60(1):9.[175]DurhamJT,HermanIM.Microvascularmodificationsindiabeticretinopathy.[J].186 新疆医科大学博士学位论文CurrentDiabetesReports,2011,11(4):253-64.[176]FrancescoP,BeckmanJA,CreagerMA,etal.Diabetesandvasculardisease:pathophysiology,clinicalconsequences,andmedicaltherapy:partI[J].EuropeanHeartJournal,2013,34(31):2436.[177]ZhangJ,ChenM,ChenJ,etal.Longnon-codingRNAMIATactsasabiomarkerindiabeticretinopathybyabsorbingmiR-29bandregulatingcellapoptosis:[J].BioscienceReports,2017,37(2):BSR20170036.[178]BichuP,NistalaR,KhanA,etal.Angiotensinreceptorblockersforthereductionofproteinuriaindiabeticpatientswithovertnephropathy:resultsfromtheAMADEOstudy[J].VascularHealth&RiskManagement,2009,5(1):129-40.[179]MogensenCE,ChristensenCK,VittinghusE.TheStagesinDiabeticRenalDisease:WithEmphasisontheStageofIncipientDiabeticNephropathy[J].Diabetes,1983,32Suppl2(supplement2):64.[180]KanwarYS,SunL,XieP,etal.AGlimpseofVariousPathogeneticMechanismsofDiabeticNephropathy[J].AnnualReviewofPathology,2011,6(1):395.[181]NelsonRG,KunzelmanCL,PettittDJ,etal.Albuminuriaintype2(non-insulin-dependent)diabetesmellitusandimpairedglucosetoleranceinPimaIndians.[J].Diabetologia,1989,32(12):870-876.[182]GallMA,RossingP,SkøttP,etal.Prevalenceofmicro-andmacroalbuminuria,arterialhypertension,retinopathyandlargevesseldiseaseinEuropeanType2(non-insulin-dependent)diabeticpatients[J].Diabetologia,1991,34(9):655-661.[183]PughJA,MedinaR,RamirezM.Comparisonofthecoursetoend-stagerenaldiseaseoftype1(insulin-dependent)andtype2(non-insulin-dependent)diabeticnephropathy[J].Diabetologia,1993,36(10):1094-1098.[184]RavidM,BroshD,Ravid-SafranD,etal.MainRiskFactorsforNephropathyinType2DiabetesMellitusArePlasmaCholesterolLevels,MeanBloodPressure,andHyperglycemia[J].ArchivesofInternalMedicine,1998,158(9):998.[185]NelsonRG,KnowlerWC,PettittDJ,etal.IncidenceanddeterminantsofelevatedurinaryalbuminexcretioninPimaIndianswithNIDDM[J].DiabetesCare,1995,18(2):182.[186]RosenqvistU.Theeffectofintensivetreatmentofdiabetesonthedevelopmentandprogressionoflong-termcomplicationsininsulin-dependentdiabetesmellitus.TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup.[J].NewEnglandJournalofMedicine,1993,329(3):977-986.187 新疆医科大学博士学位论文[187]LewisEJ,HunsickerLG,BainRP,etal.Theeffectofangiotensin-converting-enzymeinhibitionondiabeticnephropathy.[J].NewEnglandJournalofMedicine,1993,330(13):937;authorreply938.[188]GaedePH,JepsenPV,ParvingHH,etal.Intensifiedmultifactorialinterventioninpatientswithtype2diabetesmellitusandmicroalbuminuria:theSteno-2study[J].UgeskriftforLaeger,1999,161(30):4277.[189]NelsonRG,KnowlerWC,PettittDJ,etal.Assessmentofriskofovertnephropathyindiabeticpatientsfromalbuminexcretioninuntimedurinespecimens.[J].ArchivesofInternalMedicine,1991,151(9):1761.[190]PettittDJ,SaadMF,BennettPH,etal.FamilialpredispositiontorenaldiseaseintwogenerationsofPimaIndianswithtype2(non-insulin-dependent)diabetesmellitus[J].Diabetologia,1990,33(7):438-443.[191]QuinnM,AngelicoMC,WarramJH,etal.FamilialfactorsdeterminethedevelopmentofdiabeticnephropathyinpatientswithIDDM[J].Diabetologia,1996,39(8):940-945.[192]SeaquistER,GoetzFC,RichS,etal.Familialclusteringofdiabetickidneydisease.Evidenceforgeneticsusceptibilitytodiabeticnephropathy.[J].NewEnglandJournalofMedicine,1989,320(18):1161.[193]DistefanoJK.Identificationofnovelgeneticmarkersandimprovedtreatmentoptionsfordiabetickidneydisease[J].BiomarkersinMedicine,2010,4(5):739.[194]ThomasMC,GroopPH,TryggvasonK.Towardsunderstandingtheinheritedsusceptibilityfornephropathyindiabetes.[J].CurrOpinNephrolHypertens,2012,21(2):195-202.[195]GuanY,KuoWL,StilwellJL,etal.AmplificationofPVT1ContributestothePathophysiologyofOvarianandBreastCancer[J].ClinicalCancerResearchAnOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,2007,13(19):5745.[196]GrahamM,AdamsJM.Chromosome8breakpointfar3′ofthec‐myconcogeneinaBurkitt'slymphoma2;8varianttranslocationisequivalenttothemurinepvt‐1locus.[J].EmboJournal,1986,5(11):2845-51.[197]MenglegawL,RabbittsTH.Ahumanchromosome8regionwithabnormalitiesinBcell,HTLV-I+Tcellandc-mycamplifiedtumours.[J].EmboJournal,1987,6(7):1959.[198]HansonRL,CraigDW,MillisMP,etal.IdentificationofPVT1asacandidate188 新疆医科大学博士学位论文geneforend-stagerenaldiseaseintype2diabetesusingapooling-basedgenome-widesinglenucleotidepolymorphismassociationstudy.[J].Diabetes,2007,56(4):975.[199]AlvarezML,DistefanoJK.FunctionalCharacterizationofthePlasmacytomaVariantTranslocation1Gene(PVT1)inDiabeticNephropathy[J].PlosOne,2011,6(4):e18671.[200]AlvarezML,KhosroheidariM,EddyE,etal.RoleofmicroRNA1207-5Panditshostgene,thelongnon-codingRNAPvt1,asmediatorsofextracellularmatrixaccumulationinthekidney:implicationsfordiabeticnephropathy.[J].PlosOne,2013,8(10):e77468.[201]ReddyMA,NatarajanR.Epigeneticsindiabetickidneydisease.[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyJasn,2011,22(12):2182.[202]KatoM,ParkJT,NatarajanR.MicroRNAsandtheglomerulus.[J].ExperimentalCellResearch,2012,318(9):993.[203]AlvarezML,DistefanoJK.Theroleofnon-codingRNAsindiabeticnephropathy:Potentialapplicationsasbiomarkersfordiseasedevelopmentandprogression[J].DiabetesResearch&ClinicalPractice,2013,99(1):1-11.[204]AlirezaS,SaghaeianJM,SamaeiNM,etal.Longnon-codingRNASOX2OT:expressionsignature,splicingpatterns,andemergingrolesinpluripotencyandtumorigenesis[J].FrontiersinGenetics,2015,6:196.[205]AmaralPP,NeytC,WilkinsSJ,etal.ComplexarchitectureandregulatedexpressionoftheSox2otlocusduringvertebratedevelopment[J].Rna-aPublicationoftheRnaSociety,2009,15(11):2013.[206]MercerTR,DingerME,SunkinSM,etal.SpecificexpressionoflongnoncodingRNAsinthemousebrain.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2008,105(2):716-21.[207]TobyA,NikolasM,FrancisC,etal.IdentificationandReplicationofThreeNovelMyopiaCommonSusceptibilityGeneLocionChromosome3q26usingLinkageandLinkageDisequilibriumMapping[J].PlosGenetics,2008,4(10):e1000220.[208]LiCP,WangSH,WangWQ,etal.LongNoncodingRNA-Sox2OTKnockdownAlleviatesDiabetesMellitus-InducedRetinalGanglionCell(RGC)injury[J].Cellular&MolecularNeurobiology,2017,37(2):1-9.[209]ShanK,JiangQ,WangXQ,etal.Roleoflongnon-codingRNA-RNCR3inatherosclerosis-relatedvasculardysfunction[J].CellDeath&Disease,2016,189 新疆医科大学博士学位论文7(6):e2248.[210]SanukiR,OnishiA,KoikeC,etal.miR-124aisrequiredforhippocampalaxogenesisandretinalconesurvivalthroughLhx2suppression.[J].NatureNeuroscience,2011,14(9):1125-34.[211]MelaniM,WeinsteinBM.CommonFactorsRegulatingPatterningoftheNervousandVascularSystems[J].AnnuRevCellDevBiol,2010,26(26):639-665.[212]LiuC,LiCP,WangJJ,etal.RNCR3knockdowninhibitsdiabetesmellitus-inducedretinalreactivegliosis.[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,479(2):198.[213]AwataT,YamashitaH,KuriharaS,etal.AGenome-WideAssociationStudyforDiabeticRetinopathyinaJapanesePopulation:PotentialAssociationwithaLongIntergenicNon-CodingRNA[J].PlosOne,2014,9(11):e111715.[214]AmaralPP,ClarkMB,GascoigneDK,etal.lncRNAdb:areferencedatabaseforlongnoncodingRNAs[J].NucleicAcidsResearch,2011,39(Databaseissue):D146.[215]BudcziesJ,KlauschenF,SinnBV,etal.CutoffFinder:AComprehensiveandStraightforwardWebApplicationEnablingRapidBiomarkerCutoffOptimization[J].PlosOne,2012,7(12):e51862.[216]TaneeraJ,FadistaJ,AhlqvistE,etal.Identificationofnovelgenesforglucosemetabolismbaseduponexpressionpatterninhumanisletsandeffectoninsulinsecretionandglycemia.[J].HumanMolecularGenetics,2015,24(7):1945-55.[217]ReddyMA,ChenZ,ParkJT,etal.Regulationofinflammatoryphenotypeinmacrophagesbyadiabetes-inducedlongnoncodingRNA.[J].Diabetes,2014,63(12):4249-61.[218]EizirikDL,ColliML,OrtisF.Theroleofinflammationininsulitisandbeta-celllossintype1diabetes.[J].NatureReviewsEndocrinology,2009,5(4):219.[219]DonathMY,StørlingJ,BerchtoldLA,etal.Cytokinesandbeta-cellbiology:fromconcepttoclinicaltranslation.[J].EndocrineReviews,2008,29(3):334.[220]PipeleersD,HoorensA,Marichal-PipeleersM,etal.Roleofpancreaticbeta-cellsintheprocessofbeta-celldeath[J].Diabetes,2001,50Suppl1(2):S52.[221]KaminitzA,SteinJ,YanivI,etal.Theviciouscycleofapoptoticbeta-celldeathintype1diabetes.[J].Immunology&CellBiology,2007,85(8):582-589.[222]KutluB;CardozoAK;DarvilleMI;KruhøfferM;MagnussonN;ØrntoftT;EizirikDL.Discoveryofgenenetworksregulatingcytokine-induceddysfunctionandapoptosisininsulin-producingINS-1cells.[J].Diabetes,2003,52(11):2701.190 新疆医科大学博士学位论文[223]EizirikDL,SammethM,BouckenoogheT,etal.TheHumanPancreaticIsletTranscriptome:ExpressionofCandidateGenesforType1DiabetesandtheImpactofPro-InflammatoryCytokines[J].PlosGenetics,2012,8(3):e1002552.[224]GuayC,JacovettiC,NescaV,etal.Emergingrolesofnon-codingRNAsinpancreaticβ-cellfunctionanddysfunction[J].DiabetesObesity&Metabolism,2012,14(s3):12-21.[225]RoggliE,BritanA,GattescoS,etal.InvolvementofMicroRNAsintheCytotoxicEffectsExertedbyProinflammatoryCytokinesonPancreaticβ-Cells[J].Diabetes,2010,59(4):978.[226]RoggliE,GattescoS,CailleD,etal.ChangesinmicroRNAexpressioncontributetopancreaticβ-celldysfunctioninprediabeticNODmice.[J].Diabetes,2012,61(7):1742-51.[227]CarninciP,KasukawaT,KatayamaS,etal.Thetranscriptionallandscapeofthemammaliangenome[J].Science,2005,309(5740):1559-1563.[228]MattickJS.ThegeneticsignaturesofnoncodingRNAs[J].PlosGenetics,2009,5(4):e1000459.[229]ConsortiumEP.AnintegratedencyclopediaofDNAelementsinthehumangenome.[J].Nature,2012,489(7414):57-74.[230]WangKC,ChangHY.MolecularmechanismsoflongnoncodingRNAs[J].MolecularCell,2011,43(6):904.[231]GuttmanM,DonagheyJ,CareyBW,etal.lincRNAsactinthecircuitrycontrollingpluripotencyanddifferentiation[J].Nature,2011,477(7364):295.[232]KhaitanD,DingerME,MazarJ,etal.TheMelanoma‐UpregulatedLongNoncodingRNASPRY4-IT1ModulatesApoptosisandInvasion[J].CancerResearch,2011,71(11):3852.[233]GingerMR,ShoreAN,ContrerasA,etal.AnoncodingRNAisapotentialmarkerofcellfateduringmammaryglanddevelopment.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2006,103(15):5781-5786.[234]ParalkarVR,WeissMJ.Anew'Linc'betweennoncodingRNAsandblooddevelopment.[J].Genes&Development,2011,25(24):2555-8.[235]TripathiV,EllisJD,ShenZ,etal.TheNuclear-RetainedNoncodingRNAMALAT1RegulatesAlternativeSplicingbyModulatingSRSplicingFactorPhosphorylation[J].MolecularCell,2010,39(6):925-938.[236]BatistaPJ,ChangHY.LongnoncodingRNAs:cellularaddresscodesin191 新疆医科大学博士学位论文developmentanddisease.[J].Cell,2013,152(6):1298.[237]StablesCL,GlasserRL,FeldmanEL.Diabeticcardiacautonomicneuropathy:insightsfromanimalmodels[J].AutonomicNeuroscienceBasic&Clinical,2013,177(2):74-80.[238]VinikAI,DanZ.DiabeticCardiovascularAutonomicNeuropathy[J].Circulation,2007,115(3):387.[239]StandlE,SchnellO.Anewlookattheheartindiabetesmellitus:fromailingtofailing.[J].Diabetologia,2000,43(12):1455.[240]ArmourJA.Potentialclinicalrelevanceofthe'littlebrain'onthemammalianheart[J].ExperimentalPhysiology,2008,93(2):165-176.[241]WhiteMF.IRSproteinsandthecommonpathtodiabetes[J].AjpEndocrinology&Metabolism,2002,283(3):E413-22.[242]WernerED,LeeJ,HansenL,etal.Insulinresistanceduetophosphorylationofinsulinreceptorsubstrate-1atserine302[J].JournalofBiologicalChemistry,2004,279(34):35298-305.[243]XuH,XiongC,HeL,etal.Trans-resveratrolattenuateshighfattyacid-inducedP2X7receptorexpressionandIL-6releaseinPC12cells:possibleroleofP38MAPKpathway[J].Inflammation,2015,38(1):327.[244]YamakawaI,KojimaH,TerashimaT,etal.InactivationofTNF-αamelioratesdiabeticneuropathyinmice.[J].AjpEndocrinology&Metabolism,2011,301(301):E844-52.[245]FurchgottRF,ZawadzkiJV.Theobligatoryroleofendothelialcellsintherelaxationofarterialsmoothmusclebyacetylcholine[J].Nature,1980,288(5789):373-376.[246]VanhouttePM,ZhaoY,XuA,etal.ThirtyYearsofSayingNO:Sources,Fate,Actions,andMisfortunesoftheEndothelium-DerivedVasodilatorMediator.[J].CirculationResearch,2016,119(2):375-396.[247]VanhouttePM,ShimokawaH,FeletouM,etal.Endothelialdysfunctionandvasculardisease–a30thanniversaryupdate[J].ActaPhysiologica,2016,219(1):22-96.[248]VanhouttePM.HowWeLearnedtoSayNO[J].ArteriosclerosisThrombosis&VascularBiology,2009,29(8):1156.[249]JohnstoneMT,CreagerSJ,ScalesKM,etal.Impairedendothelium-dependentvasodilationinpatientswithinsulin-dependentdiabetesmellitus.[J].Circulation,192 新疆医科大学博士学位论文1993,88(6):2510.[250]SzaboC.Roleofnitrosativestressinthepathogenesisofdiabeticvasculardysfunction[J].BritishJournalofPharmacology,2009,156(5):713.[251]VedanthamS,ThiagarajanD,AnanthakrishnanR,etal.AldoseReductaseDrivesHyperacetylationofEgr-1inHyperglycemiaandConsequentUpregulationofProinflammatoryandProthromboticSignals[J].Diabetes,2014,63(2):761-774.[252]SuganyaN,BhakkiyalakshmiE,SaradaDV,etal.Reversibilityofendothelialdysfunctionindiabetes:roleofpolyphenols.[J].BritishJournalofNutrition,2016,116(2):223.[253]DurpesMC,MorinC,PaquinveilletJ,etal.PKCbetaactivationinhibitsinterleukin-18bindingproteincausingendothelialdysfunctionanddiabeticatherosclerosis.[J].CardiovascularResearch,2015,106(2):303-313.[254]WuG,HaynesTE,YanW,etal.Presenceofglutamine:fructose-6-phosphateamidotransferaseforglucosamine-6-phosphatesynthesisinendothelialcells:effectsofhyperglycaemiaandglutamine.[J].Diabetologia,2001,44(2):196-202.[255]HsuehWA,LyonCJ,QuiñonesMJ.Insulinresistanceandendothelium[J].AmericanJournalofMedicine,2004,117(2):109-117.[256]AvogaroA,deKreutzenbergSV,FadiniG.Endothelialdysfunction:causesandconsequencesinpatientswithdiabetesmellitus.[J].DiabetesResClinPract,2008,82(82Suppl2):S94-S101.[257]SoldatosG,CooperME,Jandeleit-DahmKA.Advanced-glycationendproductsininsulin-resistantstates[J].CurrentHypertensionReports,2005,7(2):96-102.[258]KaiserN,SassonS,FeenerEP,etal.Differentialregulationofglucosetransportandtransportersbyglucoseinvascularendothelialandsmoothmusclecells[J].Diabetes,1993,42(1):80-9.[259]LiuJY,YaoJ,LiXM,etal.PathogenicroleoflncRNA-MALAT1inendothelialcelldysfunctionindiabetesmellitus[J].CellDeath&Disease,2014,5(10):e1506.[260]YanB,YaoJ,LiuJY,etal.lncRNA-MIATregulatesmicrovasculardysfunctionbyfunctioningasacompetingendogenousRNA[J].CirculationResearch,2015,116(7):1143.[261]FaveroG,PaganelliC,BuffoliB,etal.EndotheliumandItsAlterationsinCardiovascularDiseases:LifeStyleIntervention[J].BiomedResearchInternational,2014,2014(2):801896.[262]ChistiakovDA,OrekhovAN,BobryshevYV.Effectsofshearstressonendothelial193 新疆医科大学博士学位论文cells:gowiththeflow[J].ActaPhysiologica,2017,219(2):382.[263]AltaanyZ,MocciaF,MunaronL,etal.Hydrogensulfideandendothelialdysfunction:relationshipwithnitricoxide[J].CurrentMedicinalChemistry,2014,21(32)[264]KaragkiozakiV,LogothetidisS,PappaAM.NanomedicineforAtherosclerosis:MolecularImagingandTreatment.[J].JournalofBiomedicalNanotechnology,2015,11(2):191.[265]GilbertRE.Endotheliallossandrepairinthevascularcomplicationsofdiabetes:pathogeneticmechanismsandtherapeuticimplications.[J].CirculationJournalOfficialJournaloftheJapaneseCirculationSociety,2013,77(4):849-56.[266]LiaoJK.Linkingendothelialdysfunctionwithendothelialcellactivation[J].JournalofClinicalInvestigation,2013,123(2):540.[267]ElasrarAMA,MohammadG,NawazMI,etal.TheChemokinePlateletFactor-4Variant(PF-4var)/CXCL4L1InhibitsDiabetes-InducedBlood–RetinalBarrierBreakdown[J].InvestOphthalmolVisSci,2015,56(3):1956-64.[268]PatelL,ThakerA.TheeffectsofadenosineA2B,receptorinhibitiononVEGFandnitricoxideaxis-mediatedrenalfunctionindiabeticnephropathy[J].RenalFailure,2014,36(6):916-24.[269]OmaeT,NagaokaT,TananoI,etal.Adiponectin-induceddilationofisolatedporcineretinalarteriolesviaproductionofnitricoxidefromendothelialcells.[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2013,54(7):4586-94.[270]KowluruRA,KowluruA,VeluthakalR,etal.TIAM1-RAC1signallingaxis-mediatedactivationofNADPHoxidase-2initiatesmitochondrialdamageinthedevelopmentofdiabeticretinopathy[J].Diabetologia,2014,57(5):1047-1056.[271]LeguinaruzziA,PereiraJ,PereirafloresK,etal.IncreasedRhoA/Rho-KinaseActivityandMarkersofEndothelialDysfunctioninYoungAdultSubjectswithMetabolicSyndrome.[J].MetabolicSyndrome&RelatedDisorders,2015,13(9):373.[272]PortilloJAC,SchwartzI,ZariniS,etal.ProinflammatoryResponsesInducedbyCD40inRetinalEndothelialandMüllerCellsareInhibitedbyBlockingCD40-Traf2,3orCD40-Traf6Signaling[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2014,55(12):8590-8597.[273]UtkanT,YazirY,KarsonA,etal.EtanerceptimprovescognitiveperformanceandincreaseseNOSandBDNFexpressionduringexperimentalvasculardementiain194 新疆医科大学博士学位论文streptozotocin-induceddiabetes[J].CurrentNeurovascularResearch,2015,12(2):135.[274]LiX,WuTT,ChenJ,etal.Elevatedexpressionlevelsofseruminsulin-likegrowthfactor-1,tumornecrosisfactor-αandvascularendothelialgrowthfactor165mightexacerbatetype2diabeticnephropathy[J].JournalofDiabetesInvestigation,2017,8(1):108-114.[275]YeonDJ,YoungKeunC,HyunK,etal.Retinalhypoxiainducesvascularendothelialgrowthfactorthroughinductionofestrogen-relatedreceptorγ[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2015,460(2):457-463.[276]TakedaK,DuanLJ,TakedaH,etal.Improvedvascularsurvivalandgrowthinthemousemodelofhindlimbischemiabyaremotesignalingmechanism[J].AmericanJournalofPathology,2014,184(3):686.[277]FengB,CaoY,ChenS,etal.miR-200bMediatesEndothelial-to-MesenchymalTransitioninDiabeticCardiomyopathy[J].Diabetes,2016,65(3):768.[278]AdvaniA,ConnellyKA,AdvaniSL,etal.RoleoftheeNOS-NOsysteminregulatingtheantiproteinuriceffectsofVEGFreceptor2inhibitionindiabetes.[J].BiomedResearchInternational,2013,37(10):201475.[279]VandZR,MuroharaT,LuoZ,etal.Vascularendothelialgrowthfactor/vascularpermeabilityfactoraugmentsnitricoxidereleasefromquiescentrabbitandhumanvascularendothelium.[J].Circulation,1997,95(4):1030-7.[280]ZicheM,MorbidelliL,ChoudhuriR,etal.Nitricoxidesynthaseliesdownstreamfromvascularendothelialgrowthfactor-inducedbutnotbasicfibroblastgrowthfactor-inducedangiogenesis.[J].JournalofClinicalInvestigation,1997,99(11):2625-34.[281]UlkerE,ParkerWH,RajA,etal.AscorbicacidpreventsVEGF-inducedincreasesinendothelialbarrierpermeability[J].Molecular&CellularBiochemistry,2015,412(1-2):73-79.[282]YuCG,ZhangN,YuanSS,etal.EndothelialProgenitorCellsinDiabeticMicrovascularComplications:FriendsorFoes?[J].StemCellsInternational,2016,(2016-5-29),2016,2016(23):1-10.[283]CoutinhoM,GersteinHC,WangY,etal.Therelationshipbetweenglucoseandincidentcardiovascularevents.Ametaregressionanalysisofpublisheddatafrom20studiesof95,783individualsfollowedfor12.4years.[J].DiabetesCare,1999,22(2):233-240.195 新疆医科大学博士学位论文[284]LimAKH,TeschGH.InflammationinDiabeticNephropathy[J].MediatorsofInflammation,2012,(2012-8-21),2012,2012(5):146154.[285]PackhamDK,AlvesTP,DwyerJP,etal.RelativeIncidenceofESRDVersusCardiovascularMortalityinProteinuricType2DiabetesandNephropathy:ResultsFromtheDIAMETRIC(DiabetesMellitusTreatmentforRenalInsufficiencyConsortium)Database[J].AmericanJournalofKidneyDiseases,2012,59(1):75-83.[286]AzabB,DaoudJ,NaeemFB,etal.Neutrophil-to-LymphocyteRatioasaPredictorofWorseningRenalFunctioninDiabeticPatients(3-YearFollow-UpStudy)[J].RenFail,2012,34(5):571-576.[287]PitsavosC,TampourlouM,PanagiotakosDB,etal.AssociationBetweenLow-GradeSystemicInflammationandType2DiabetesMellitusAmongMenandWomenfromtheATTICAStudy.[J].ReviewofDiabeticStudiesRds,2007,4(2):98.[288]SenaCM,PereiraAM,SeiçaR.Endothelialdysfunction-amajormediatorofdiabeticvasculardisease.[J].BiochimicaEtBiophysicaActa,2013,1832(12):2216-31.[289]ChickWL,LikeAA.Studiesinthediabeticmutantmouse.3.Physiologicalfactorsassociatedwithalterationsinbetacellproliferation.[J].Diabetologia,1970,6(3):243-51.[290]MaedlerK,SpinasG,LehmannR,etal.Glucoseinducesbeta-cellapoptosisviaupregulationoftheFasreceptorinhumanislets.[J].Diabetes,2001,50(8):1683-90.[291]MaedlerK,OberholzerJ,BucherP,etal.Monounsaturatedfattyacidspreventthedeleteriouseffectsofpalmitateandhighglucoseonhumanpancreaticbeta-cellturnoverandfunction[J].Diabetes,2003,52(3):726.[292]BarbierM,CherbutC,AubéAC,etal.Elevatedplasmaleptinconcentrationsinearlystagesofexperimentalintestinalinflammationinrats[J].Gut,1998,43(6):783.[293]HullRL,WestermarkGT,WestermarkP,etal.Isletamyloid:acriticalentityinthepathogenesisoftype2diabetes[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2004,89(8):3629.[294]ArnushM,HeitmeierMR,ScarimAL,etal.IL-1producedandreleasedendogenouslywithinhumanisletsinhibitsbetacellfunction.[J].JournalofClinicalInvestigation,1998,102(3):516-26.[295]MaedlerK,SchumannDM,SauterN,etal.Lowconcentrationofinterleukin-1betainducesFLICE-inhibitoryprotein-mediatedbeta-cellproliferationinhuman196 新疆医科大学博士学位论文pancreaticislets.[J].Diabetes,2006,55(10):2713.[296]SchumannDM,MaedlerK,FranklinI,etal.TheFaspathwayisinvolvedinpancreaticbetacellsecretoryfunction.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2007,104(8):2861-6.[297]MassaguéJ.HowcellsreadTGF-betasignals.[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2000,1(3):169-78.[298]FengXH,DerynckR.Specificityandversatilityintgf-betasignalingthroughsmads[J].AnnualReviewofCell&DevelopmentalBiology,2005,21(1):659.[299]NagarajNS,DattaPK.Targetingthetransforminggrowthfactor-betasignalingpathwayinhumancancer.[J].ExpertOpiniononInvestigationalDrugs,2010,19(1):77-91.[300]DerynckR,ZhangYE.Smad-dependentandSmad-independentpathwaysinTGF-betafamilysignalling.[J].Nature,2003,425(6958):577.[301]TrutyMJ,UrrutiaR.BasicsofTGF-betaandpancreaticcancer[J].Pancreatology.2007,7(5-6):423-435.[302]LinHM,LeeJH,YadavH,etal.Transforminggrowthfactor-beta/Smad3signalingregulatesinsulingenetranscriptionandpancreaticisletbeta-cellfunction[J].JournalofBiologicalChemistry,2009,284(18):12246-12257.[303]SjöholmA,HellerströmC.TGF-betastimulatesinsulinsecretionandblocksmitogenicresponseofpancreaticbeta-cellstoglucose.[J].AmericanJournalofPhysiology,1991,260(1):1046-51.[304]XiaoX,WierschJ,ElGoharyY,etal.TGFβreceptorsignalingisessentialforinflammation-inducedbutnotβ-cellworkload-inducedβ-cellproliferation.[J].Diabetes,2013,62(4):1217-26.[305]XiaoX,FischbachS,SongZ,etal.TransientSuppressionofTGFβReceptorSignalingFacilitatesHumanIsletTransplantation[J].Endocrinology,2016,157(4):1348.[306]Toren-HaritanG,EfratS.TGFβPathwayInhibitionRedifferentiatesHumanPancreaticIsletβCellsExpandedInVitro[J].PlosOne,2015,10(9):e0139168.[307]ElgoharyY,TulachanS,GuoP,etal.Smadsignalingpathwaysregulatepancreaticendocrinedevelopment[J].DevelopmentalBiology,2013,378(2):83-93.[308]MiyazawaK,ShinozakiM,HaraT,etal.TwomajorSmadpathwaysinTGF-betasuperfamilysignalling.[J].GenestoCells,2002,7(12):1191-1204.[309]SmartNG,ÅsaAApelqvist,GuX,etal.ConditionalExpressionofSmad7in197 新疆医科大学博士学位论文PancreaticβCellsDisruptsTGF-βSignalingandInducesReversibleDiabetesMellitus[J].PlosBiology,2006,4(2):200-209.[310]BoernerBP,GeorgeNM,TargyNM,etal.TGF-βSuperfamilyMemberNodalStimulatesHumanβ-CellProliferationWhileMaintainingCellularViability[J].Endocrinology,2013,154(11):4099.[311]OgawaK,AbeK,KurosawaN,etal.Expressionofα,βAandβBsubunitsofinhibinoractivinandfollistatininratpancreaticislets[J].FebsLetters,1993,319(3):217-20.[312]CaoY,FengB,ChenS,etal.Mechanismsofendothelialtomesenchymaltransitionintheretinaindiabetes[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2014,55(11):7321.[313]MreichE,ChenXM,ZakyA,etal.TheroleofKLF4inTGFβinducedinflammatoryandfibroticresponsesinhumanproximaltubulecells[J].Clinical&ExperimentalPharmacology&Physiology,2015,42(6).[314]MondalT,SubhashS,VaidR,etal.MEG3longnoncodingRNAregulatestheTGF-βpathwaygenesthroughformationofRNA-DNAtriplexstructures.[J].NatureCommunications,2015,6:7743.[315]InahH,Eun-YoungS,HunjooH.Wnt/beta-cateninsignaling:anoveltargetfortherapeuticinterventionoffibrotickidneydisease.[J].ArchivesofPharmacalResearch.2009,32(12):1653-1662.[316]GlinkaA,WuW,DeliusH,etal.Dickkopf-1isamemberofanewfamilyofsecretedproteinsandfunctionsinheadinduction.[J].Nature.1998,391(6665):357-362.[317]RattnerA,HsiehJC,SmallwoodPM,etal.Afamilyofsecretedproteinscontainshomologytothecysteine-richligand-bindingdomainoffrizzledreceptors.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.1997,94(7):2859-2863.[318]ChiangYT,IpW,JinT.TheroleoftheWntsignalingpathwayinincretinhormoneproductionandfunction.[J].FrontiersinPhysiology.2011,3:273.[319]LuH,WardMG,AdeolaO,etal.Regulationofadipocytedifferentiationandgeneexpression-crosstalkbetweenTGFβandwntsignalingpathways.[J].MolecularBiologyReports.2013,40(9):5237-5245.[320]KimMH,HongSH,LeeMK.Insulinreceptor-overexpressingβ-cellsamelioratehyperglycemiaindiabeticratsthroughWntsignalingactivation[J].PlosOne,2013,8(7):e67802.198 新疆医科大学博士学位论文[321]KaurK,VigS,SrivastavaR,etal.ElevatedHepaticmiR-22-3pExpressionImpairsGluconeogenesisbySilencingtheWnt-ResponsiveTranscriptionFactorTcf7[J].Diabetes,2015,64(11):3659-69.[322]MaschioDA,OliveiraRB,SantosMR,etal.ActivationoftheWnt/β-cateninpathwayinpancreaticbetacellsduringthecompensatoryislethyperplasiainprediabeticmice[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,478(4):1534.[323]LiuX,ChenD,WuZ,etal.Ghrelininhibitshighglucose-induced16HBEcellsapoptosisbyregulatingWnt/β-cateninpathway.[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,477(4):902-907.[324]WangX,LeiXG,WangJ.Malondialdehyderegulatesglucose-stimulatedinsulinsecretioninmurineisletsviaTCF7L2-dependentWntsignalingpathway.[J].Molecular&CellularEndocrinology,2014,382(1):8.[325]XiXH,WangY,LiJ,etal.ActivationofWnt/β-catenin/GSK3βsignalingduringthedevelopmentofdiabeticcardiomyopathy.[J].CardiovascularPathologytheOfficialJournaloftheSocietyforCardiovascularPathology,2015,24(3):179.[326]ChaoQ,ZhuC,YuW,etal.Bonemorphogeneticprotein2promotesosteogenesisofbonemarrowstromalcellsintype2diabeticratsviatheWntsignalingpathway[J].InternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,2016,80:143-153.[327]KorinekV,BarkerN,MoererP,etal.Depletionofepithelialstem-cellcompartmentsinthesmallintestineofmicelackingTcf-4[J].NatureGenetics,1998,19(4):379-383.[328]MorinPJ,SparksAB,KorinekV,etal.Activationofbeta-catenin-Tcfsignalingincoloncancerbymutationsinbeta-cateninorAPC.[J].Science,1997,275(5307):1787.[329]JinT,FantusIG,SunJ.WntandbeyondWnt:Multiplemechanismscontrolthetranscriptionalpropertyofβ-catenin[J].CellularSignalling,2008,20(10):1697-1704.[330]JinT,LiuL.Minireview:TheWntSignalingPathwayEffectorTCF7L2andType2DiabetesMellitus[J].MolecularEndocrinology,2008,22(11):2383-92.[331]SunJ,KhalidS,RozakisadcockM,etal.P-21-activatedproteinkinase-1functionsasalinkerbetweeninsulinandWntsignalingpathwaysintheintestine.[J].Oncogene,2009,28(35):3132.199 新疆医科大学博士学位论文[332]LockeJM,DaSXG,RutterGA,etal.AnalternativepolyadenylationsignalinTCF7L2generatesisoformsthatinhibitTcellfactor/lymphoid-enhancerfactor(TCF/LEF)-dependenttargetgenes[J].Diabetologia,2011,54(12):3078.[333]NiZ,AniniY,FangX,etal.Transcriptionalactivationoftheproglucagongenebylithiumandbeta-catenininintestinalendocrineLcells.[J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278(2):1380-1387.[334]NortonL,FourcaudotM,AbdulghaniMA,etal.Chromatinoccupancyoftranscriptionfactor7-like2(TCF7L2)anditsroleinhepaticglucosemetabolism[J].Diabetologia,2011,54(12):3132.[335]FenghuaYi,PatriciaL.Brubaker,TianruJin.TCF-4MediatesCellType-specificRegulationofProglucagonGeneExpressionbyβ-CateninandGlycogenSynthaseKinase-3β[J].JournalofBiologicalChemistry,2005,280(2):1457.[336]GrantSF,HakonarsonH,SchwartzS.Canthegeneticsoftype1andtype2diabetesshedlightonthegeneticsoflatentautoimmunediabetesinadults?[J].EndocrineReviews,2010,31(2):183.[337]GrantSF,ThorleifssonG,ReynisdottirI,etal.Variantoftranscriptionfactor7-like2(TCF7L2)geneconfersriskoftype2diabetes.[J].NatureGenetics,2006,38(3):320.[338]LehmanDM,HuntKJ,LeachRJ,etal.Haplotypesoftranscriptionfactor7-like2(TCF7L2)geneanditsupstreamregionareassociatedwithtype2diabetesandageofonsetinMexicanAmericans.[J].Diabetes,2007,56(2):389.[339]SaleMM,SmithSG,MychaleckyjJC,etal.Variantsofthetranscriptionfactor7-like2(TCF7L2)geneareassociatedwithtype2diabetesinanAfrican-Americanpopulationenrichedfornephropathy.[J].Diabetes,2007,56(10):2638.[340]HayashiT,IwamotoY,KakuK,etal.ReplicationstudyfortheassociationofTCF7L2,withsusceptibilitytotype2diabetesinaJapanesepopulation[J].Diabetologia,2007,50(5):980-984.[341]DaSXG,LoderMK,AngelaMD,etal.TCF7L2RegulatesLateEventsinInsulinSecretionFromPancreaticIsletβ-Cells[J].Diabetes,2009,58(4):894.[342]ShuL,MatveyenkoAV,KerrconteJ,etal.DecreasedTCF7L2proteinlevelsintype2diabetesmellituscorrelatewithdownregulationofGIP-andGLP-1receptorsandimpairedbeta-cellfunction[J].HumanMolecularGenetics,2009,18(13):2388.[343]ShuL,SauterNS,SchulthessFT,etal.TranscriptionFactor7-Like2Regulatesβ-CellSurvivalandFunctioninHumanPancreaticIslets.Diabetes200 新疆医科大学博士学位论文2008;57:645-653.[J].Diabetes,2014,57(3):645.[344]LyssenkoV,LupiR,MarchettiP,etal.MechanismsbywhichcommonvariantsintheTCF7L2geneincreaseriskoftype2diabetes[J].JournalofClinicalInvestigation,2007,117(8):2155.[345]DanielSavic,HonggangYe,IvyAneas,Soo-YoungPark,GraemeI.Bell,MarceloA.Nobrega.AlterationsinTCF7L2expressiondefineitsroleasakeyregulatorofglucosemetabolism.[J].GenomeResearch,2011,21(9):1417-1425.[346]PilgaardK;JensenCB;SchouJH;LyssenkoV;WegnerL;BrønsC;HansenT;MadsbadS;HolstJJ;VølundA;PoulsenP;GroopL;PedersenO;VaagAA.TheTalleleofrs7903146TCF7L2isassociatedwithimpairedinsulinotropicactionofincretinhormones,reduced24hprofilesofplasmainsulinandglucagon,andincreasedhepaticglucoseproductioninyounghealthymen.[J].Diabetologia,2009,52(7):1298-1307.[347]WegnerL,HussainMS,PilgaardK,etal.ImpactofTCF7L2rs7903146oninsulinsecretionandactioninyoungandelderlyDanishtwins.[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2008,93(10):4013.[348]LiuH,FergussonMM,WuJJ,etal.METABOLISMWntSignalingRegulatesHepaticMetabolism[J].ScienceSignaling,2011,4(158):ra6.[349]IpW,ShaoW,ChiangYT,etal.TheWntsignalingpathwayeffectorTCF7L2isupregulatedbyinsulinandrepresseshepaticgluconeogenesis[J].AmericanJournalofPhysiologyEndocrinology&Metabolism,2012,303(9):E1166.[350]GaoY,LuX.DecreasedexpressionofMEG3contributestoretinoblastomaprogressionandaffectsretinoblastomacellgrowthbyregulatingtheactivityofWnt/β-cateninpathway[J].TumourBiologytheJournaloftheInternationalSocietyforOncodevelopmentalBiology&Medicine,2016,37(2):1461-1469.[351]ThornberryNA,LazebnikY.Caspases:EnemiesWithin[J].Science,1998,281(5381):1312.[352]KroemerG.Theproto-oncogeneBcl-2anditsroleinregulatingapoptosis[J].NatureMedicine,1997,3(6):614.[353]GreenDR,KroemerG.Thepathophysiologyofmitochondrialcelldeath.[J].Science,2004,305(5684):626-629.[354]GreenDR,EvanGI.Amatteroflifeanddeath.[J].NewScientist,2002,1(1):19-30.[355]WangWK,LuQH,WangX,etal.Ulinastatinattenuatesdiabetes-inducedcardiac201 新疆医科大学博士学位论文dysfunctionbytheinhibitionofinflammationandapoptosis[J].Experimental&TherapeuticMedicine,2017,14(3):2497-2504.[356]ZhangH,XiongZ,WangJ,etal.Glucagon-likepeptide-1protectscardiomyocytesfromadvancedoxidationproteinproduct-inducedapoptosisviathePI3K/Akt/Badsignalingpathway[J].MolecularMedicineReports,2015,13(2):1593.[357]LiuS,DuF,LiX,etal.Effectsandunderlyingmechanismsofirisinontheproliferationandapoptosisofpancreaticβcells.[J].PlosOne,2017,12(4):e0175498.[358]TunçdemirM,ÖztürkM.RegulationoftheKu70andapoptosis-relatedproteinsinexperimentaldiabeticnephropathy[J].MetabolismClinical&Experimental,2016,65(10):1466.[359]LevineAJ,OrenM.Thefirst30yearsofp53:growingevermorecomplex[J].NatureReviewsCancer,2009,9(10):749-58.[360]DanilovaN,SakamotoKM,LinS.p53familyindevelopment.[J].MechanismsofDevelopment,2008,125(11):919-931.[361]PoyurovskyMV,PrivesC.P53andaging:Afreshlookatanoldparadigm.[J].Aging,2010,2(7):380.[362]LevineAJ,TomasiniR,MckeonFD,etal.Thep53family:guardiansofmaternalreproduction[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2011,12(4):259-65.[363]ChangJR,GhafouriM,MukerjeeR,etal.Roleofp53inneurodegenerativediseases[J].Neuro-degenerativediseases,2012,9(2):68.[364]MenendezD,ShatzM,ResnickMA.Interactionsbetweenthetumorsuppressorp53andimmuneresponses[J].CurrentOpinioninOncology,2013,25(1):85-92.[365]SanoM,MinaminoT,TokoH,etal.p53-inducedinhibitionofHif-1causescardiacdysfunctionduringpressureoverload[J].Nature,2007,446(7134):444-8.[366]VousdenKH,PrivesC.BlindedbytheLight:TheGrowingComplexityofp53[J].Cell,2009,137(3):413.[367]BerkersCR,MaddocksOD,CheungEC,etal.Metabolicregulationbyp53familymembers.[J].CellMetabolism,2013,18(5):617.[368]MinaminoT,OrimoM,ShimizuI,etal.Acrucialroleforadiposetissuep53intheregulationofinsulinresistance.[J].NatureMedicine,2009,15(9):1082-1087.[369]TavanaO,Puebla-OsorioN,SangM,etal.Absenceofp53-dependentapoptosiscombinedwithnonhomologousend-joiningdeficiencyleadstoaseverediabeticphenotypeinmice[J].Diabetes,2010,59(1):135.202 新疆医科大学博士学位论文[370]CnopM,WelshN,JonasJC,etal.Mechanismsofpancreaticbeta-celldeathintype1andtype2diabetes:manydifferences,fewsimilarities.[J].Diabetes,2005,54Suppl2(Suppl):S97.[371]WredeCE,DicksonLM,LingohrMK,etal.ProteinkinaseB/Aktpreventsfattyacid-inducedapoptosisinpancreaticbeta-cells(INS-1)[J].JournalofBiologicalChemistry,2002,277(51):49676-49684.[372]MayoLD,DonnerDB.Aphosphatidylinositol3-kinase/AktpathwaypromotestranslocationofMdm2fromthecytoplasmtothenucleus.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(20):11598.[373]ZhouBP,LiaoY,XiaW,etal.HER-2/neuinducesp53ubiquitinationviaAkt-mediatedMDM2phosphorylation[J].NatureCellBiology,2001,3(11):973.[374]LovisP,RoggliE,LaybuttDR,etal.AlterationsinMicroRNAExpressionContributetoFattyAcid–InducedPancreaticβ-CellDysfunction[J].Diabetes,2008,57(10):2728.[375]KimWH,LeeJW,GaoB,etal.SynergisticactivationofJNK/SAPKinducedbyTNF-alphaandIFN-gamma:apoptosisofpancreaticbeta-cellsviathep53andROSpathway.[J].CellularSignalling,2005,17(12):1516.[376]KoshkinV,WangX,SchererPE,etal.Mitochondrialfunctionalstateinclonalpancreaticbeta-cellsexposedtofreefattyacids.[J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278(22):19709.[377]YuanH,ZhangX,HuangX,etal.NADPHOxidase2-DerivedReactiveOxygenSpeciesMediateFFAs-InducedDysfunctionandApoptosisofβ-CellsviaJNK,p38MAPKandp53Pathways[J].PlosOne,2010,5(12):e15726.[378]KonN,ZhongJ,QiangL,etal.Inactivationofarf-bp1inducesp53activationanddiabeticphenotypesinmice[J].JournalofBiologicalChemistry,2012,287(7):5102-11.[379]HinaultC,KawamoriD,LiewCW,etal.Delta40Isoformofp53controlsβ-cellproliferationandglucosehomeostasisinmice[J].Diabetes,2011,60(4):1210.[380]BourdonJC,FernandesK,Murray-ZmijewskiF,etal.p53isoformscanregulatep53transcriptionalactivity[J].Genes&Development,2005,19(18):2122-37.[381]ZhouY,ZhangE,BerggreenC,etal.SurvivalofpancreaticbetacellsispartlycontrolledbyaTCF7L2-p53-p53INP1-dependentpathway.[J].HumanMolecularGenetics,2012,21(1):196.[382]BelgardtBF,AhmedK,SprangerM,etal.ThemicroRNA-200familyregulates203 新疆医科大学博士学位论文pancreaticbetacellsurvivalintype2diabetes.[J].NatureMedicine,2015,21(6):619-27.[383]ShangX,VasudevanSA,YuY,etal.Dual-specificityphosphatase26isanovelp53phosphataseandinhibitsp53tumorsuppressorfunctionsinhumanneuroblastoma.[J].Oncogene,2010,29(35):4938-4946.[384]HeY,WuYT,HuangC,etal.InhibitoryeffectsoflongnoncodingRNAMEG3onhepaticstellatecellsactivationandliverfibrogenesis[J].BiochimicaEtBiophysicaActa,2014,1842(11):2204-2215.[385]JensenHA,MehtaJL.Endothelialcelldysfunctionasanoveltherapeutictargetinatherosclerosis[J].ExpertReviewofCardiovascularTherapy,2016,14(9):1021-1033.[386]BuschA,EkenSM,MaegdefesselL.Prospectiveandtherapeuticscreeningvalueofnon-codingRNAasbiomarkersincardiovasculardisease[J].AnnalsofTranslationalMedicine,2016,4(12):236.[387]RuhleF,StollM.Longnon-codingRNADatabasesinCardiovascularResearch[J].GenomicsProteomicsBioinformatics,2016,14(4):191-199.[388]BoonRA,JaéN,HoldtL,etal.LongNoncodingRNAs:FromClinicalGeneticstoTherapeuticTargets?[J].JournaloftheAmericanCollegeofCardiology,2016,67(10):1214.204 新疆医科大学博士学位论文综述长链非编码RNA(lncRNA)在糖尿病及其并发症中的研究进展王志强综述姚华校审随着人类基因组项目(HGP)的完成，开始进入后基因组时期，在许多领域对非编[1]码RNA(ncRNA)进行了大量的关注。自从2006年发现了小干扰RNA后，非编码RNA包括长链非编码RNAs(lncRNAs)逐渐在生物医学领域具有重要的位置。在过去三十年，在人类基因组发现了成千上万种lncRNAs，表明lncRNAs在细胞的功能中具有不可替代的作用。虽然lncRNAs不能编码功能性蛋白，但lncRNAs参与许多生[2,3]理过程，对保持细胞增殖和分化具有重要作用。越来越多的证据表明，lncRNAs通过调节基因在表观遗传学的表达参与生理和病理过程。而且，lncRNAs的异常表[4][5][6][7]达与许多人类疾病有关，包括银屑病，冠心病、糖尿病、肿瘤等。可是，在人类疾病中lncRNAs广泛的生物功能和分子机制还不清楚。因此，需要更多的努力探究lncRNAs世界。糖尿病是由于胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗的发生导致高糖血症位特征的一类[8]代谢性疾病，糖尿病的发生是由于遗传或者是环境因素。糖尿病的慢性高糖血症与多种器官系统的长期损伤、功能障碍和衰竭密切相关，特别是肾脏、眼睛、血管、8心脏和神经。在糖尿病迅速成为全球的公共卫生问题影响超过了4×10的人群，事实上糖尿病成为了全球第三大流行的非传染性疾病(NCD)，仅次于心血管疾病和癌症[9][10]。预期全球糖尿病的患病率从1995年的4%会增长至2025年的5.4%，糖尿病患8者在2040年将会达到6.42×10。当前，糖尿病患者最多的国家为印度、中国和美国。有趣的是，通过定期的筛查、早期的发现和对慢性并发症恰当的治疗能够减少糖尿病引起的发病率和死亡率。因此，对于糖尿病及其并发症的预防和治疗迫在眉睫。由于新技术的广泛应用，一些lncRNAs被证明在糖尿病的分子生物学中作为全新的调节物，对于糖尿病的预防、早期诊断和治疗提供全新的策略。在本综述中，我们将概述lncRNAs的起源和功能，强调lncRNAs在糖尿病中的作用，概括lncRNAs在糖尿病中的分子机制。进一步讨论应用lncRNAs作为糖尿病预防、早期诊断和治疗的生物标记物。1LncRNAs的定义和现状[11]人类基因组项目揭示出蛋白编码的基因占总基因组序列的比例小于2%，剩下205 新疆医科大学博士学位论文大量的DNA序列并不能编码蛋白，由于进化的过程而累积被认为是“垃圾DNAs”[12]。此外，大部分的“垃圾DNAs”是动物内含子区域内的DNAs，被认为非编码的DNAs(ncDNAs)。一般根据转录本的长度把ncRNAs分为两类，短链ncRNAs(小于200个核苷酸)和长链ncRNAs(大于200个核苷酸)。随着全基因组的重测序技术的进[13]步，最近的GENCODE发布揭示了人类75%-90%的基因组能够转录产生lncRNAs。依据以前的研究，对于lncRNAs的广泛定义包括：lncRNAs是一类在真核细胞发现的RNAs，转录本长度为200-100000nt；它们缺少完整功能性的开放阅读框(ORF)，[14]不常编码功能性短肽，坐落在细胞核或细胞质。同时，大部分lncRNAs的结构特点像poly(A)尾巴、5’帽子和启动子结构，因此与mRNAs相似。LncRNAs通过RNA[15]聚合酶Ⅱ转录，选择性剪接成为最终的多聚腺苷酸化。有趣的是，lncRNAs序列是高度保守的，在人体中它们具有组织和细胞特异性的表达模式。随着RNA测序应用新一代的测序技术，大量的lncRNAs被发现和定义。大量的功能性lncRNAs在184[16]种人类疾病被识别(http://lncrnadb.org/)；尽管如此，与生物信息软件分析预测的总lncRNAs数量相比，这仅仅是冰山一角。通过阐明lncRNAs与疾病的关系，我们能够进一步理解人类调节系统的复杂性和多层次，运用lncRNAs作为分子标记物和潜在的药物靶点提供全新的治疗策略。2LncRNAs的分类和功能[17]随着测序技术的进步，特别是新一代RNA测序技术，发现了大量的lncRNAs。LncRNAs展现出的特点能够描述为“三多”，即多类型、多模式和多数量。虽然许多lncRNAs被发现，然而对于lncRNAs的起源还不是完全清楚。可能的起源包括基因[18]突变、连续重复事件、染色体重排、反转录转座和插入转位因子。根据LncRNAs与邻近转录本基因组的相似性分为五种类型：⑴正义链合成，坐落在注释转录单元的正义链；⑵反义链合成，坐落在注释转录单元的反义链；⑶内含子的合成，来源于注释基因的内含子；⑷双向合成，产生于转录起始区域的正义和反义两个方向；⑸基因间的合成(也称之为lincRNAs)，其lncRNAs的转录本来源于注释基因的内含[19]子。越来越多的证据表明lncRNA是人类基因组重要的调节分子。LncRNAs的长核苷酸链能够形成复杂的空间结构和与蛋白因子相互作用，或者提供大段区域供许多分子结合，从而参与表观遗传修饰、X染色体沉默、基因组印记、转录激活和干[20]预、mRNA间接和降解等。虽然目前对lncRNAs的了解还很少，但是lncRNAs在[21]调节各种生物过程中展示出重要作用，例如细胞增殖、分化、凋亡、衰老和死亡。最近lncRNA在表观遗传学、转录和转录后水平的分子功能被广泛接受，lncRNA的功能可分为：⑴招募蛋白与蛋白相互作用：在Th17细胞中lncRNARMRP作为支架[22]与DEAD-盒解旋酶5(DDX5)和RORγ相互作用控制转录程序；⑵作为共调节或共抑制物：反义LncRNA坐落在HIV启动子的5’LTR，通过招募EZH2、HDAC1和206 新疆医科大学博士学位论文Dnmt3a形成转录抑制复合物，抑制病毒基因的转录；⑶作为诱饵分子：在NF-κB信[23]号分子中，PACER作为诱饵分子促进COX2的转录；⑷作为miRNA的宿主基因：lncRNAH19作为miR-675-3p和miR-675-5p的宿主基因，在骨骼肌分化的过程中被诱导[24]；⑸与miRNA相互作用：Linc-MD1作为竞争内源性lncRNA(ceRNA)与[25]miR-133相互作用调节骨骼肌肌肉细胞的分化。3糖尿病相关的lncRNAs随着人口的增加、老龄化、城市化、肥胖的流行和缺乏体力活动，最近几年糖尿病成为全球的公共卫生问题。糖尿病的发生和进展是一个复杂的过程，其中有众多的因素和步骤参与。糖尿病的发生和进展与环境因素、遗传因素、微生物感染和由其他疾病导致的免疫系统下降紧密相关。目前，治疗糖尿病包括5个方面：糖尿病的教育、血糖的自我监督、饮食治疗、锻炼和药物治疗。只有这5个方面携手并进才能有效的控制血糖，缓解糖尿病的进展。依据发病机制，糖尿病分为四种类型包括，1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特定类型的糖尿病。在这些当[26]中，2型糖尿病是最常见的类型，超过90%的糖尿病都为2型糖尿病。糖尿病的发展伴随有一系列的并发症包括糖尿病肾脏病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病心肌病和糖尿病神经痛。LncRNAs是一种多功能的分子，最近受到了广泛的关注。大量[27]的数据表明糖尿病易感性位点与lncRNAs的异常表达密切相关，部分这些[28-32]lncRNAs在糖尿病及其并发症的进展中具有重要作用，参与β胰岛细胞的功能紊乱、胰岛素抵抗和表观遗传学的调节等。然而，我们对于lncRNAs及其在糖尿病中作用的理解还不够。4LncRNAs和胰腺β细胞胰岛包括一类激素释放细胞，大约70%的胰腺细胞是β细胞。胰腺β细胞在通[33]过胰岛素分泌保持血糖稳态中起重要作用。相应的，胰岛素能够控制人体碳水化合物和脂肪代谢。因此，由于β细胞和/或损失，减少了胰岛素分泌，导致不同类型[34]的糖尿病形成。最近的研究表明在胰腺β细胞成熟的过程中lncRNAs表达发生了改变。异常表达和功能障碍的lncRNAs，伴随有胰腺β细胞的功能障碍，从而影响着细胞存活、增殖、分化、功能(胰岛素分泌)和凋亡。例如，运用全基因组转录组图谱，发现一系列胰岛lncRNAs(HI-LNC25、HILNC75、HI-LNC12和HI-LNC78)被动态调节，这些lncRNAs在人体胚胎胰腺祖细胞中没有被激活，但在成熟的胰腺细胞中却被激活，因此，这些lncRNAs是β细胞分化和成熟程序的重要组成部分。其他的研究表明β细胞特异性表达的HI-LNC25能够下调GLIS家族锌指3(GLIS3)mRNA，[35]GLIS3是胰岛重要的转录因子，通过基因调节功能影响胰腺β细胞的程序。而且，[36]Zou等研究表明在人羊膜上皮干细胞中，过表达LincRNA-ROR后，Sox2和其他干细胞标志物(Oct4和Nanog)表达下调。同时，通过荧光素酶报告基因实验表明207 新疆医科大学博士学位论文miR-145对LncRNA-ROR和Sox2的表达产生重要影响。此外，LincRNA-ROR通过竞争性结合miR-145保持β胰岛类似细胞的分化效率，从而能够保持Sox2基因的表[37]达。在胰腺β胰岛增殖的过程中，Mutskov等人表明β细胞在高浓度的血糖的刺激下，IGF2-AS的表达上调，因此，潜在调节β细胞的增殖。炎症微环境是一种重[38[39]要的因子导致β细胞的凋亡]。Motterle等人表明小鼠胰岛LncRNA-1的上调能够促进NF-κB的表达，相应的诱导敏感β细胞的凋亡。总之，miRNAs的功能障碍会通过调节β细胞的生物和功能导致糖尿病的发生。5LncRNAs和胰岛素抵抗胰岛素抵抗是损害了细胞对胰岛素的反应，缺乏对胰岛素生理水平的调节从而获得血糖稳态的能力。在目标组织和细胞中减少胰岛素敏感性和反应性的生理状态时2型糖尿病的标志。胰岛素抵抗的过程与胰岛素受体的胰岛素信号通路下游[40][41](INSR)，胰岛素受体底物1/2(IRS-1/2)，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸[42][43]激酶(AKT)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)。最近，大量的研究表明lncRNAs能够将胰岛素信号通路和胰岛素抵抗联系起来。LncRNAs可以作为基因表达的关键调节[44][45]物，调节在胰岛素目标组织的功能中发挥重要的作用。Zhu等人证明MEG3在高质饮食和ob/ob小鼠的肝脏中表达上调。因此，MEG3通过增加FoxO1基因的表达增加胰岛素抵抗，同时，MEG3能够在糖异生过程中调节G6pc和Pepck的表达，[46][44]因此，MEG3是肝糖原和脂代谢过程中重要的调节物。而且，Yan等人研究表明在ob/ob小鼠的肝脏中肺腺癌转移相关基因转录本1(MALAT1)表达增加，通过增加稳定性核固醇调节元件结合转录因子1c(SREBP-1c)促进肝脏胰岛素抵抗。因此，抑制肝脏胰岛素抵抗相关的lncRNAs可能是治疗2型糖尿病相关高糖血症的潜在策略。6LncRNAs和糖尿病的表观遗传学修饰表观遗传学通过不影响DNA序列本身可遗传的改变基因的表达。重复的研究证明表观遗传学的改变在出生体重和整个生命过程中健康恶化关系中的分子机制有关[47]。表观遗传修饰能够通过激活或者抑制转录，调节糖尿病相关基因的表达，从而影响血糖的稳态、β细胞的功能、胰岛素分泌和血管病变。同时，lncRNAs坐落在细[48]胞核，通过形成染色质重构复合物参与lncRNAs依赖的核小体重组。越来越多的证据表明lncRNAs不仅能够在表观遗传学水平调节基因的表达，同时lncRNAs在表[49]观遗传修饰中进行调节。表观遗传学修饰是通过两种最广泛的机制，即DNA甲基[50]化和组蛋白的修饰，对于控制基因的表达至关重要。DNA甲基化经常发生在CpG二核苷酸的序列丰度，或者发生在坐落在启动子的近侧区和在未被充分表达的剩余基因组中的CpG岛中。CpG岛的甲基化与基因沉默相关，然而低甲基化与基因表达的过度激活相关。研究表明父源等位基因表达的lncRNAsMYMAI，当异常表达时，208 新疆医科大学博士学位论文与新生儿一过性糖尿病密切相关(TNDM)，TNDM经常与DNA甲基化缺陷共同发生。宫内高血糖会引起胰岛素样生长因子2(IGF2)/H19基因位点的甲基化，同时IGF2/H19[51]基因位点的甲基化是联系出生体重和胎儿代谢程序的基石。此外，MEG3异常的[52]DNA甲基化与1型糖尿病和2型糖尿病密切相关。然而，lncRNAs能够调节DNA[53]甲基化。例如，Dhawan等证明MALAT1能够调节methyl-CpG结合蛋白(MeCP2)的水平，对于调节Arx具有重要作用，因此，能够使血糖达到动态平衡。组蛋白修饰是指组蛋白亚基氨基末端的转录后改变。一些组蛋白修饰，例如乙酰化作用，不[54]稳定与基因的激活有关，而甲基化作用稳定会导致基因的失活。Long等研究表明Tug1在糖尿病足细胞中表达下降。然而，由于Tug1能够通过表观遗传学增加PGC-1α启动子的活性，从而调节PGC-1α的表达，Tug1还能影响慢性肾脏疾病的发展。其[55]中Zhuo等证明了在糖尿病大鼠中H19过表达会抑制自噬相关基因(LC3-II、ATG7b和BECN1)的表达。与此同时，在RNA结合蛋白免疫共沉淀实验发现H19能够直接结合到EZH2，在心肌细胞中染色质免疫沉淀发现H19/EZH2复合物能够通过表观遗传学沉默DIRAS3抑制自噬。然而，目前lncRNAs和糖尿病表观遗传学修饰关系的机制还处于探索的阶段，具体的机制需要更深入的研究。7LncRNAs和糖尿病肾脏病变(DN)在糖尿病中，糖尿病肾脏病变是引起终末期肾脏疾病(ESRD)的主要原因发生率[56,57]为20%-40%，是导致糖尿病死亡和残疾的主要原因。糖尿病肾脏疾病是以进行性肾脏间质纤维化为特征导致的一系列病理改变，包括细胞外基质(ECM)的大量沉[58]积、系膜扩张、肾小球和肾小管基底膜增厚。最近的研究表明lncRNAs在糖尿病肾脏病变的进展中具有重要作用，调节细胞外基质的沉积。研究显示由于1型糖尿[59][60]病和2型糖尿病，PVT1基因位点与终末期肾脏疾病显著相关。Alvarez等发现PVT1会在高糖处理的人系膜细胞中表达增加。上调的PVT1会促进主要的细胞外基质蛋白(FN1和COL4A1)和两种重要的细胞外基质蛋白调节物(TGFβ1和PAI-1)表达增加。同时，PVT1作为宿主基因能够决定miR-1207-5p的产量。miR-1207-5p能够直接影响葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、前列腺跨膜蛋白、雄激素诱导1(PMEPA1)、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1)和SMAD家族成员7(SMAD7)，增加FN1、TGFβ1和PAI-1的表达调节糖尿病肾病的发病机制。此外，使用miRNA微阵列分析[61]和荧光素酶报告基因分析，Duan等证明了db/db糖尿病小鼠中miRNA-377显著上调，Tug1是miRNA-377的靶基因。Tug1也作为miRNA-377的内源性海绵分子能够下调miRNA-377基因的表达，同时在系膜细胞中抑制目标基因PPARγ的表达，缓解PAI-1和TGF-β1的累积。在db/db糖尿病肾病小鼠中，LincRNA-Gm4419能够参与[62][63]NF-κB/NLRP3炎性体介导的炎症反应。此外，Zhou等证明了在高糖诱导的肾小管上皮损伤模型和急性肾损伤病理过程中，心肌梗死相关转录本(MIAT)-Nrf2轴可209 新疆医科大学博士学位论文以作为重要的信号通路。8LncRNAs和糖尿病视网膜病变(DR)糖尿病视网膜病变是最常见的糖尿病并发症，是引起发达国家视力损失的主要[64]原因。糖尿病视网膜病变导致的视觉恶化常伴有炎症、视网膜缺血、新生血管形[65,66]成，血管通透性增加和血管细胞功能障碍。因此，视网膜微血管的结构或功能[67,68]异常是糖尿病视网膜病变的重要特点。依据视网膜新生血管的增殖状态，糖尿病视网膜病变分为两类：非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜[69,70]病变(PDR)。由于复杂的发病机制和危险因素，确定生物标记物预测糖尿病视网[71,72]膜病变和确定治疗是非常重要的。最近，越来越多的证据表明lncRNAs在糖尿病视网膜病变的进展中具有重要作用，特别是视网膜微血管的功能障碍。重要的是，[73]MALAT1是最早发现的在糖尿病视网膜病变中异常表达的lncRNAs。同时，在体[74]内MALAT1是最早发现的对内皮细胞血管生成和血管化有重要作用的基因。随后，[75][76,77][78]大量的lncRNAs被报道与糖尿病视网膜病变相关，例如RNCR3、MIAT和[79]MEG3等。有趣的是，调节机制是以lncRNA-miRNA-mRNA的方式参与。Shan等[76,77]揭示了RNCR3在糖尿病小鼠和高糖诱导的RF/6A细胞中表达上调。当运用荧光素酶报告基因实验和基因敲除技术敲除RNCR3后，发现RNCR3与miR-185-5p可以作为ceRNA调节目标基因KLF2的表达。RNCR3/miR-185-5p/KLF2复合物参与动脉粥样硬化和糖尿病诱导的视网膜微血管异常。除此之外，在体内外发现MIAT与糖尿病诱导的视网膜微血管功能障碍密切相关，可能是通过与miR-150-5p和miR-29b相互作用。而且，lncRNA也参与调节糖尿病视网膜病变另一种重要的病理[80][81]特征，即视网膜神经节细胞(RGC)的损伤。Li等证明了在高糖的诱导下SOX2重叠转录本敲除能够保护视网膜神经节细胞，在糖尿病相关的神经退行性疾病中发挥神经保护作用。其中，研究表明RNCR3通过减少胶质细胞反应性相关基因(GFAP和vimentin)的表达缓解糖尿病诱导的视网膜神经退行性疾病。这些研究表明lncRNA具有潜力成为糖尿病视网膜病变的治疗靶点。9LncRNAs和糖尿病心肌病(DCM)糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管并发症之一，糖尿病心肌病携带有大量的[82]危险因素，随后会发展成为心衰和死亡率的增加。在没有患有冠心病、高血压或[83,84]瓣膜性心脏病时，糖尿病心肌病是糖尿病患者发生的心肌功能障碍。炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、钙处理的损伤、肾素-血管紧张素系统激活和心肌细胞凋[85]亡参与糖尿病心肌病的发病机制。最近，越来越多的证据表明lncRNA在调节心[86][87]肌时具有重要作用，例如生长停滞特异性5(GAS5)，心脏中胚层增强子相关非[88][89]编码RNA(CARMEN)、尿路上皮癌相关1(UCA1)。然而，当前有两种lncRNA[90,91][92]与糖尿病心肌病密切相关，即MALAT1和H19。在患有心肌梗死患者中和糖210 新疆医科大学博士学位论文[91]尿病大鼠的心脏组织中MALAT1表达上调。Zhang等研究表明在糖尿病大鼠中MALAT1敲除能够减少糖尿病诱导的心肌炎症和心肌细胞凋亡，随后改善左心室的功能。相比于MALAT1，H19在糖尿病心肌病中的调节机制更为复杂。H19编码2.6kb[93]的非编码RNA主要是在细胞质、小部分在细胞核。然而，H19在急性高胰岛素血症时表达下调。H19通过在DIRAS3的启动子结合和招募组蛋白甲基转移酶EZH2在细胞核发挥生物功能。EZH2招募反过来会导致DIRAS3的表观遗传学的沉默，从而在高糖环境下抑制DIRAS3诱导的自噬，保护心肌细胞。还有一种机制是，细胞[94,95]质H19能够作为miRNA海绵隔离miR-106a和miR-let7家族成员。而且，H19可以作为miR-675的前身在转录后水平调节大量目标基因的表达，参与细胞增殖和[96][92]分化。Zhang等证明了在心肌细胞转染了H19siRNA后miR-675表达下降。通过荧光素酶报告基因实验发现，miR-675能够直接以电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)基因为靶点，从而形成H19/miR-675/VDAC1轴抑制高糖诱导的凋亡。这些发现对于治疗糖尿病心肌病提供了全新的策略。10LncRNAs和糖尿病神经性疼痛(DNP)糖尿病神经性疼痛(DNP)是最常见的2型糖尿病慢性并发症，百分之五十的糖尿[97]病患者患有糖尿病神经性疼痛。典型的糖尿病神经性疼痛的症状包括病理性神经疼痛、包括自发性疼痛、痛觉过敏(对伤害性刺激的疼痛感知增加)和异常性疼痛。患有糖尿病神经性疼痛的患者主要以像“手套和袜子”分布的感觉症状、具有燃烧/刺(刺[98]伤)感觉、有刺痛感(发麻或感觉异常)、或射击感(电休克)。糖尿病神经性疼痛是顽固性疼痛治疗领域的主要问题，伴有糖尿病患者生活质量的减少。最近，一些研究表明lncRNAs在糖尿病神经性疼痛的进展中具有重要作用。血糖调控分子NONRATT021972与糖尿病神经性疼痛密切相关。在一方面，NONRATT021972与糖[99]尿病自主神经病变(DAN)相关，NONRATT021972能够诱导颈上神经节(SCG)肿瘤坏死因子(TNF-α)和胰岛素受体丝氨酸磷酸化底物1(IRS1)表达增加介导糖尿病大鼠打心率变化。而且，NONRATT021972与背根神经节(DRG)功能异常有关，背根神经[100]节(DRG)功能异常是糖尿病神经性疼痛的临床特征。Liu等研究表明在2型糖尿病大鼠中NONRATT021972siRNA处理能够减少嘌呤受体P2X7和炎症因子TNF-α的表达水平，抑制背根神经节的兴奋性，减少机械性痛过敏和热痛过敏。而且，Peng等[]证明了在大鼠的背根神经节中NONRATT021972是潜在的诱导因子通过P2X3受体的表达促进糖尿病神经性疼痛的进展。有研究报道lncRNAuc.48+能够介导P2X3[101]受体的表达，促进背根神经节的兴奋性传递。总之，这些的研究提供了治疗糖尿病神经性疼痛的全新见解。11LncRNAs和其他糖尿病并发症[102]LncRNAs在其它糖尿病中具有重要作用。Reddy等报道E330013P06在db/db211 新疆医科大学博士学位论文小鼠和2型糖尿病患者的巨噬细胞中表达上调，诱导了一些基因的表达增加炎症反[103]应。此外，Puthanveetil等证明了人脐静脉内皮细胞在血糖的刺激下能够增加MALAT1和血清淀粉样蛋白A3(SAA3)的表达。MALAT1、SAA3和炎症介质IL-6、TNF-α在MALAT1特异性siRNA转染后表达增加，最终会促进糖尿病诱导的小血管和大血管的并发症。而且，在糖尿病并发脑梗死的大鼠中ANRIL的反义非编码RNA能够上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达和通过激活NF-κB炎症信号通路促进血管[104][105]生成。在糖尿病相关的认知损伤方面，Li等证明了PVT1能够介导自噬保护海马神经元的突触可塑性的损坏和凋亡，随后缓解链脲佐菌素诱导的小鼠认知损伤。糖尿病相关的的免疫异常，在1型糖尿病中lncRNAs展现出潜在的调节功能。1型糖尿病是以慢性和进行性胰腺β细胞凋亡为特点的器官特异性自身免疫性疾病。最近的研究表明lncRNAs能够调节敏感的β细胞凋亡，可以作为全新诊断的生物标记物和作为治疗1型糖尿病的治疗靶点。12结论目前，确定了越来越多的lncRNAs，然而大部分lncRNAs的功能和作用机制还不清楚。LncRNAs在糖尿病领域的研究还处于初期。最近的研究清楚的表明lncRNAs在脂肪细胞、β细胞功能和胰岛素抵抗的发展中而具有重要作用。这些进展表明lncRNAs可以作为糖尿病及其并发症有希望的全新诊断标记物和治疗靶点。参考文献[1]PaulsonH,GonzalezalegreP.RNAigetsitsprize.[J].LancetNeurology,2006,5(12):997-999.[2]HiranoT,YoshikawaR,HaradaH,etal.LongnoncodingRNA,CCDC26,controlsmyeloidleukemiacellgrowththroughregulationofKITexpression[J].MolecularCancer,2015,14(1):90.[3]YinY,YanP,LuJ,etal.OpposingRolesforthelncRNAHauntandItsGenomicLocusinRegulatingHOXAGeneActivationduringEmbryonicStemCellDifferentiation[J].CellStemCell,2015,16(5):504.[4]MártaS,JuditD,ZsuzsannaBC,etal.PRINS,aprimate-specificlongnon-codingRNA,playsaroleinthekeratinocytestressresponseandpsoriasispathogenesis:[J].PflugersArchivEuropeanJournalofPhysiology,2016,468(6):935-943.[5]YangY,CaiY,WuG,etal.Plasmalongnon-codingRNA,CoroMarker,anovelbiomarkerfordiagnosisofcoronaryarterydisease[J].ClinicalScience,2015,212 新疆医科大学博士学位论文129(8):675.[6]WangM,WangS,YaoD,etal.Anovellongnon-codingRNACYP4B1-PS1-001regulatesproliferationandfibrosisindiabeticnephropathy[J].Molecular&CellularEndocrinology,2016,426(C):136-145.[7]JinY,CuiZ,LiX,etal.Upregulationoflongnon-codingRNAPlncRNA-1promotesproliferationandinducesepithelial-mesenchymaltransitioninprostatecancer:[J].Oncotarget,2017,8(16):26090-26099.[8]AlegredíazJ,HerringtonW,LópezcervantesM,etal.DiabetesandCause-SpecificMortalityinMexicoCity.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2016,375(20).[9]WangL,KongL,WuF,etal.PreventingchronicdiseasesinChina.[J].Lancet,2005,366(9499):1821.[10]KingH,AubertRE,HermanWH.Globalburdenofdiabetes,1995-2025:prevalence,numericalestimates,andprojections[J].DiabetesCare,1998,21(9):1414.[11]LanderES.Initialimpactofthesequencingofthehumangenome.[J].Nature,2011,470(7333):187-97.[12]WrightMW,BrufordEA.Naming'junk':Humannon-proteincodingRNA(ncRNA)genenomenclature[J].HumanGenomics,2011,5(2):90-8.[13]HarrowJ,FrankishA,GonzalezJM,etal.GENCODE:thereferencehumangenomeannotationforTheENCODEProject.[J].GenomeResearch,2012,22(9):1760.[14]GuttmanM,RinnJL.Modularregulatoryprinciplesoflargenon-codingRNAs.[J].Nature,2012,482(7385):339-46.[15]KapranovP,ChengJ,DikeS,etal.RNAmapsrevealnewRNAclassesandapossiblefunctionforpervasivetranscription.[J].Science,2007,316(5830):1484-1488.[16]IlottNE,PontingCP.Predictinglongnon-codingRNAsusingRNAsequencing.[J].Methods,2013,63(1):50.[17]GuenzlPM,BarlowDP.MacrolncRNAs:anewlayerofcis-regulatoryinformationinthemammaliangenome.[J].RnaBiology,2012,9(6):731-41.[18]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629.[19]GutschnerT,DiederichsS.Thehallmarksofcancer:Alongnon-codingRNApointofview[J].RnaBiology,2012,9(6):703.[20]HeY,MengXM,HuangC,etal.LongnoncodingRNAs:Novelinsightsintohepatocelluarcarcinoma[J].CancerLetters,2014,344(1):20-7.213 新疆医科大学博士学位论文[21]DerrienT,GuigóR.Longnon-codingRNAswithenhancer-likefunctioninhumancells[J].Cell,2010,143(1):46-58.[22]HuangW,ThomasB,FlynnRA,etal.DDX5anditsassociatedlncRNARmrpmodulateTh17celleffectorfunctions[J].Nature,2015,528(7583):517.[23]KrawczykM,EmersonBM.p50-associatedCOX-2extragenicRNA(PACER)activatesCOX-2geneexpressionbyoccludingrepressiveNF-κBcomplexes[J].Elife,2014,3(3):e01776.[24]DeyBK,PfeiferK,DuttaA.TheH19longnoncodingRNAgivesrisetomicroRNAsmiR-675-3pandmiR-675-5ptopromoteskeletalmuscledifferentiationandregeneration[J].GenesDev,2014,28(5):491-501.[25]CesanaM,CacchiarelliD,LegniniI,etal.ALongNoncodingRNAControlsMuscleDifferentiationbyFunctioningasaCompetingEndogenousRNA[J].Cell,2011,147(2):358.[26]MaRCW,ChanJCN.Type2diabetesinEastAsians:similaritiesanddifferenceswithpopulationsinEuropeandtheUnitedStates[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2013,1281(1):64.[27]CunningtonMS,KorefMS,MayosiBM,etal.Chromosome9p21SNPsAssociatedwithMultipleDiseasePhenotypesCorrelatewith,ANRIL,Expression[J].PlosGenetics,2010,6(4):e1000899.[28]JangWI,KimMS,KangSH,etal.Associationbetweenmetforminuseandmortalityinpatientswithtype2diabetesmellitusandlocalizedresectablepancreaticcancer:anationwidepopulation-basedstudyinkorea[J].Oncotarget,2017,8(6).[29]XueL,LiZ,CaoC,etal.LongnoncodingRNAMALAT1regulatesrenaltubularepithelialpyroptosisbymodulatedmiR-23ctargetingofELAVL1indiabeticnephropathy[J].ExperimentalCellResearch,2017,350(2):327-335.[30]LiuC,LiCP,WangJJ,etal.RNCR3knockdowninhibitsdiabetesmellitus-inducedretinalreactivegliosis.[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,479(2):198-203.[31]AkermanI,TuZ,BeucherA,etal.HumanPancreaticβCelllncRNAsControlCell-SpecificRegulatoryNetworks.[J].CellMetabolism,2016,25(2):400.[32]YanB,YaoJ,LiuJY,etal.lncRNA-MIATregulatesmicrovasculardysfunctionbyfunctioningasacompetingendogenousRNA[J].CirculationResearch,2015,116(7):1143.[33]HorakM,NovakJ,Bienertova-VaskuJ.Muscle-specificmicroRNAsinskeletal214 新疆医科大学博士学位论文muscledevelopment[J].DevelopmentalBiology,2016,410(1):1.[34]GuayC,JacovettiC,NescaV,etal.Emergingrolesofnon-codingRNAsinpancreaticβ-cellfunctionanddysfunction[J].DiabetesObesity&Metabolism,2012,14(s3):12-21.[35]SenéeV,ChelalaC,DuchateletS,etal.MutationsinGLIS3areresponsibleforararesyndromewithneonataldiabetesmellitusandcongenitalhypothyroidism[J].NatureGenetics,2006,38(6):682-687.[36]GangZ,LiuT,GuoL,etal.miR-145modulateslncRNA-RORandSox2expressiontomaintainhumanamnioticepithelialstemcellpluripotencyandβislet-likecelldifferentiationefficiency[J].Gene,2016,591(1):48-57.[37]MutskovV,FelsenfeldG.Thehumaninsulingeneispartofalargeopenchromatindomainspecificforhumanislets.[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(41):17419-17424.[38]OrtisF.Theroleofinflammationininsulitisandbeta-celllossintype1diabetes.[J].NatureReviewsEndocrinology,2009,5(4):219.[39]MotterleA,GattescoS,CailleD,etal.Involvementoflongnon-codingRNAsinbetacellfailureattheonsetoftype1diabetesinNODmice[J].Diabetologia,2015,58(8):1827-35.[40]StumvollM,GoldsteinBJ,vanHaeftenTW.Type2diabetes:principlesofpathogenesisandtherapy.[J].Lancet,2005,365(9467):1333.[41]FernandeztwinnDS,AlfaradhiMZ,MartingronertMS,etal.DownregulationofIRS-1inadiposetissueofoffspringofobesemiceisprogrammedcell-autonomouslythroughpost-transcriptionalmechanisms.[J].MolecularMetabolism,2014,3(3):325-333.[42]XuG,JiC,SongG,etal.MiR-26bmodulatesinsulinsensitivityinadipocytesbyinterruptingthePTEN/PI3K/AKTpathway[J].InternationalJournalofObesity,2015,39(10):1523.[43]ChenYH,HeneidiS,LeeJM,etal.miRNA-93inhibitsGLUT4andisoverexpressedinadiposetissueofpolycysticovarysyndromepatientsandwomenwithinsulinresistance.[J].Diabetes,2013,62(7):2278-86.[44]YanC,ChenJ,ChenN.LongnoncodingRNAMALAT1promoteshepaticsteatosisandinsulinresistancebyincreasingnuclearSREBP-1cproteinstability:[J].ScientificReports,2016,6:22640.[45]ZhuX,WuYB,ZhouJ,etal.UpregulationoflncRNAMEG3promoteshepatic215 新疆医科大学博士学位论文insulinresistanceviaincreasingFoxO1expression.[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,469(2):319-25.[46]HaeuslerRA,KaestnerKH,AcciliD.FoxOsFunctionSynergisticallytoPromoteGlucoseProduction[J].JournalofBiologicalChemistry,2010,285(46):35245.[47]SmithAC,ChoufaniS,FerreiraJC,etal.GrowthRegulation,ImprintedGenes,andChromosome11p15.5[J].PediatricResearch,2007,61(2):43R-47R.[48]IpJY,NakagawaS.Longnon‐codingRNAsinnuclearbodies[J].DevelopmentGrowth&Differentiation,2012,54(1):44–54.[49]WuSC,KallinEM,ZhangY.RoleofH3K27methylationintheregulationoflncRNAexpression[J].CellResearch,2010,20(10):1109-16.[50]ChuangJC,JonesPA.EpigeneticsandMicroRNAs[J].PediatricResearch,2007,61(5Pt2):17R.[51]St-PierreJ,HivertMF,PerronP,etal.IGF2DNAmethylationisamodulatorofnewborn'sfetalgrowthanddevelopment[J].EpigeneticsOfficialJournaloftheDnaMethylationSociety,2012,7(10):1125.[52]BriggsTA,Lokulo-SodipeK,ChandlerKE,etal.Templesyndromeasaresultofisolatedhypomethylationofthe14q32imprintedDLK1/MEG3region[J].AmericanJournalofMedicalGeneticsPartA,2016,170A(1):170.[53]DhawanS,GeorgiaS,TschenS,etal.PancreaticβcellidentityismaintainedbyDNAmethylation-mediatedrepressionofArx.[J].DevelopmentalCell,2011,20(4):419-29.[54]LongJ,BadalSS,YeZ,etal.LongnoncodingRNATug1regulatesmitochondrialbioenergeticsindiabeticnephropathy[J].JournalofClinicalInvestigation,2016,126(11):4205.[55]ZhuoC,JiangR,LinX,etal.LncRNAH19inhibitsautophagybyepigeneticallysilencingofDIRAS3indiabeticcardiomyopathy[J].Oncotarget,2016,8(1):1429.[56]SchernthanerG,MogensenCE,SchernthanerGH.TheeffectsofGLP-1analogues,DPP-4inhibitorsandSGLT2inhibitorsontherenalsystem[J].Diabetes&VascularDiseaseResearchOfficialJournaloftheInternationalSocietyofDiabetes&VascularDisease,2014,11(5):306-23.[57]ZhangMH,FengL,ZhuMM,etal.Theanti-inflammationeffectofMoutanCortexonadvancedglycationendproducts-inducedratmesangialcellsdysfunctionandHigh-glucose-fatdietandstreptozotocin-induceddiabeticnephropathyrats.[J].JournalofEthnopharmacology,2014,151(1):591-600.216 新疆医科大学博士学位论文[58]KanwarYS,WadaJ,SunL,etal.Diabeticnephropathy:mechanismsofrenaldiseaseprogression[J].ExperimentalBiology&Medicine,2008,233(1):4-11.[59]MillisMP,BowenD,KingsleyC,etal.Variantsintheplasmacytomavarianttranslocationgene(PVT1)areassociatedwithend-stagerenaldiseaseattributedtotype1diabetes.[J].Diabetes,2007,56(12):3027.[60]AlvarezML,KhosroheidariM,EddyE,etal.RoleofMicroRNA1207-5PandItsHostGene,theLongNon-CodingRNAPvt1,asMediatorsofExtracellularMatrixAccumulationintheKidney:ImplicationsforDiabeticNephropathy[J].PlosOne,2013,8(10):e77468.[61]DuanLJ,DingM,HouLJ,etal.LongnoncodingRNATUG1alleviatesextracellularmatrixaccumulationviamediatingmicroRNA-377targetingofPPARγindiabeticnephropathy[J].BiochemBiophysResCommun,2017,484(3):598.[62]YiH,PengR,ZhangLY,etal.LincRNA-Gm4419knockdownamelioratesNF-κB/NLRP3inflammasome-mediatedinflammationindiabeticnephropathy.[J].CellDeath&Disease,2017,8(2):e2583.[63]ZhouL,XuDY,ShaWG,etal.Longnon-codingMIATmediateshighglucose-inducedrenaltubularepithelialinjury[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2015,468(4):726-732.[64]YauJW,RogersSL,KawasakiR,etal.Globalprevalenceandmajorriskfactorsofdiabeticretinopathy[J].DiabetesCare,2012,35(3):556-564.[65]CampochiaroPA.OcularNeovascularization[J].JMolMed,2013,91:311-321.[66]BrownleeM.Biochemistryandmolecularcellbiologyofdiabeticcomplications.[J].Nature,2001,414(6865):813-820.[67]SchalkwijkC,StehouwerC.Vascularcomplicationsindiabetesmellitus:theroleofendothelialdysfunction.[J].NederlandsTijdschriftVoorGeneeskunde,1996,140(16):870.[68]MichalikKM,YouX,ManavskiY,etal.LongnoncodingRNAMALAT1regulatesendothelialcellfunctionandvesselgrowth.[J].CirculationResearch,2014,114(9):1389.[69]CurtisTM,GardinerTA,StittAW.Microvascularlesionsofdiabeticretinopathy:cluestowardsunderstandingpathogenesis|[quest]|[J].Eye,2009,23(7):1496.[70]WuL,FernandezloaizaP,SaumaJ,etal.Classificationofdiabeticretinopathyanddiabeticmacularedema.[J].WorldJournalofDiabetes,2013,4(6):290.[71]TingDSW,TanKA,PhuaV,etal.BiomarkersofDiabeticRetinopathy[J].Current217 新疆医科大学博士学位论文DiabetesReports,2016,16(12):125.[72]DhootDS,AveryRL.VascularEndothelialGrowthFactorInhibitorsforDiabeticRetinopathy.[J].CurrentDiabetesReports,2016,16(12):122.[73]YanB,TaoZF,LiXM,etal.AberrantexpressionoflongnoncodingRNAsinearlydiabeticretinopathy.[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,2014,55(2):941.[74]LiuJY,YaoJ,LiXM,etal.PathogenicroleoflncRNA-MALAT1inendothelialcelldysfunctionindiabetesmellitus[J].CellDeath&Disease,2014,5(10):e1506.[75]JaeN,DimmelerS.LongNoncodingRNAsinDiabeticRetinopathy.[J].CirculationResearch,2015,116(7):1104-6.[76]ShanK,LiCP,LiuC,etal.RNCR3:Aregulatorofdiabetesmellitus-relatedretinalmicrovasculardysfunction[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,482(4):777.[77]ShanK,JiangQ,WangXQ,etal.Roleoflongnon-codingRNA-RNCR3inatherosclerosis-relatedvasculardysfunction[J].CellDeath&Disease,2016,7(6):e2248.[78]ZhangJ,ChenM,ChenJ,etal.Longnon-codingRNAMIATactsasabiomarkerindiabeticretinopathybyabsorbingmiR-29bandregulatingcellapoptosis[J].BioscienceReports,2017,37(2):BSR20170036.[79]QiuGZ,TianW,FuHT,etal.LongnoncodingRNA-MEG3isinvolvedindiabetesmellitus-relatedmicrovasculardysfunction[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2016,471(1):135.[80]KernTS,BarberAJ.Retinalganglioncellsindiabetes.[J].JournalofPhysiology,2008,586(18):4401-8.[81]LiCP,WangSH,WangWQ,etal.LongNoncodingRNA-Sox2OTKnockdownAlleviatesDiabetesMellitus-InducedRetinalGanglionCell(RGC)injury[J].Cellular&MolecularNeurobiology,2016,37(2):1-9.[82]BahtiyarG,GuttermanD,LebovitzH.HeartFailure:aMajorCardiovascularComplicationofDiabetesMellitus[J].CurrentDiabetesReports,2016,16(11):116.[83]AnejaA,TangWH,BansilalS,etal.Diabeticcardiomyopathy:insightsintopathogenesis,diagnosticchallenges,andtherapeuticoptions[J].AmericanJournalofMedicine,2008,121(9):748.[84]FalcãopiresI,LeitemoreiraAF.Diabeticcardiomyopathy:understandingthemolecularandcellularbasistoprogressindiagnosisandtreatment[J].HeartFailure218 新疆医科大学博士学位论文Reviews,2012,17(3):325-344.[85]BuggerH,AbelED.Molecularmechanismsofdiabeticcardiomyopathy.[J].Diabetologia,2014,57(4):660-671.[86]PangL,HuJ,ZhangG,etal.Dysregulatedlongintergenicnon-codingRNAmodulescontributetoheartfailure[J].Oncotarget,2016,7(37):59676.[87]WangYN,ShanK,YaoMD,etal.LongNoncodingRNA-GAS5:ANovelRegulatorofHypertension-InducedVascularRemodeling[J].Hypertension,2016,68(3):736.[88]OunzainS,MichelettiR,ArnanC,etal.CARMEN,ahumansuperenhancer-associatedlongnoncodingRNAcontrollingcardiacspecification,differentiationandhomeostasis[J].JournalofMolecular&CellularCardiology,2015,89(PtA):98-112.[89]LiuY,ZhouD,LiG,etal.LongNonCodingRNA-UCA1ContributestoCardiomyocyteApoptosisbySuppressionofp27Expression.[J].CellularPhysiology&Biochemistry,2015,35(5):1986-1998.[90]ZhangM,GuH,ChenJ,etal.InvolvementoflongnoncodingRNAMALAT1inthepathogenesisofdiabeticcardiomyopathy.[J].InternationalJournalofCardiology,2015,202:753.[91]ZhangM,GuH,XuW,etal.Down-regulationoflncRNAMALAT1reducescardiomyocyteapoptosisandimprovesleftventricularfunctionindiabeticrats.[J].InternationalJournalofCardiology,2016,203:214.[92]LiX,WangH,YaoB,etal.lncRNAH19/miR-675axisregulatescardiomyocyteapoptosisbytargetingVDAC1indiabeticcardiomyopathy[J].SciRep,2016,6:36340.[93]GaboryA,JammesH,DandoloL.TheH19locus:roleofanimprintednon-codingRNAingrowthanddevelopment.[J].BioessaysNews&ReviewsinMolecularCellular&DevelopmentalBiology,2010,32(6):473–480.[94]ImigJ,BrunschweigerA,BrümmerA,etal.miR-CLIPcaptureofamiRNAtargetomeuncoversalincRNAH19-miR-106ainteraction.[J].NatureChemicalBiology,2015,11(2):107.[95]KallenAN,ZhouXB,XuJ,etal.TheImprintedH19LncRNAAntagonizesLet-7MicroRNAs[J].MolecularCell,2013,52(1):101.[96]KeniryA,OxleyD,MonnierP,etal.TheH19lincRNAisadevelopmentalreservoirofmiR-675whichsuppressesgrowthandIgf1r[J].NatureCellBiology,2012,219 新疆医科大学博士学位论文14(7):659.[97]CallaghanBC,ChengHT,StablesCL,etal.Diabeticneuropathy:clinicalmanifestationsandcurrenttreatments[J].LancetNeurology,2012,11(6):521.[98]DaviesM,BrophyS,WilliamsR,etal.ThePrevalence,Severity,andImpactofPainfulDiabeticPeripheralNeuropathyinType2Diabetes[J].DiabetesCare,2006,29(7):1518-1522.[99]LiG,ShengX,XuY,etal.Co‐expressionchangesoflncRNAsandmRNAsinthecervicalsympatheticgangliaindiabeticcardiacautonomicneuropathicrats[J].JournalofNeuroscienceResearch,2016.[100]LiuS,ZouL,XieJ,etal.LncRNANONRATT021972siRNAregulatesneuropathicpainbehaviorsintype2diabeticratsthroughtheP2X7,receptorindorsalrootganglia[J].MolecularBrain,2016,9(1):44.[101]BingW,ZhangC,ZouL,etal.LncRNAuc.48+siRNAimproveddiabeticsympatheticneuropathyintype2diabeticratsmediatedbyP2X7,receptorinSCG[J].AutonNeurosci,2016,197:14-18.[102]ReddyMA,ChenZ,ParkJT,etal.RegulationofInflammatoryPhenotypeinMacrophagesbyaDiabetes-InducedLongNoncodingRNA[J].Diabetes,2014,63(12):4249-4261.[103]PuthanveetilP,ChenS,FengB,etal.Longnon-codingRNAMALAT1regulateshyperglycaemiainducedinflammatoryprocessintheendothelialcells.[J].JournalofCellular&MolecularMedicine,2015,19(6):1418.[104]ZhangB,WangD,JiTF,etal.OverexpressionoflncRNAANRILup-regulatesVEGFexpressionandpromotesangiogenesisofdiabetesmellituscombinedwithcerebralinfarctionbyactivatingNF-κBsignalingpathwayinaratmodel.[J].Oncotarget,2017,8(10):17347.[105]LiZ,HaoS,YinH,etal.AutophagyamelioratescognitiveimpairmentthroughactivationofPVT1andapoptosisindiabetesmice[J].BehaviouralBrainResearch,2016,305:265.220 新疆医科大学博士学位论文攻读博士学位期间获得的学术成果1论著[1]YaoH,WangZ,WangT,etal.AssociationofTCF7L2GeneticPolymorphismswithType2DiabetesMellitusintheUygurPopulationofChina[J].InternationalJournalofEnvironmentalResearch&PublicHealth,2015,12(9):11797-814.**[2]WangZ,LiuL,ChenZ,etal.Associationofrs3814570andrs7094463polymorphismsinTCF7L2genewithsusceptibilitytotype2diabetesmellitusinaChineseUygurpopulation[J].InternationalJournalofClinicalandExperimentalPathology,2016,9(9):9508-9519.**[3]WangZ,LiY,SuY,etal.Associationofrs7903146andrs7085532polymorphismsinTCF7L2genewithtype2diabetesmellitusinaChineseUygurpopulation[J].InternationalJournalofClinicalandExperimentalPathology,2017,10(5):5939-5947.**[4]WangZ,DingL,ZhuJ,etal.Longnon-codingRNAMEG3mediateshighglucose-inducedendothelialcelldysfunction[J].InternationalJournalofClinicalandExperimentalPathology,2018,11(1).[5]王志强,马琦,王婷婷,等.转录因子7类似物2基因多态性与新疆维吾尔族人群2型糖尿病遗传易感性的关系[J].基础医学与临床,2015,35(9):1162-1166.[6]王志强,刘莉娜,朱筠,等.TCF7L2基因rs3814570多态性与新疆维吾尔族人群T2DM的相关性研究[J].重庆医学,2017,46(18):2449-2452.[7]王志强,李豫凯,朱筠,等.转录因子7类似物2基因的rs7903146位点多态性与新疆维吾尔族人群2型糖尿病的相关性研究[J].中国病理生理杂志,2017,33(8).[8]苏银霞,王志强,姚华,等.锌转运蛋白-8基因单核苷酸多态性和基因-吸烟的交互作用及与维吾尔族人群2型糖尿病的关联研究[J].中华流行病学杂志,2015,36(10):1167-1171.2项目[1]新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目，2016D01C296，LncRNA调控GCKR基因表达对2型糖尿病的影响，2017/01-2019/12，7万元，在研，参加[2]新疆维吾尔自治区自然科学基金项目，2016D01C335，ABCG2基因在新疆不同民族高尿酸血症发病异质性中的作用及其分子机制研究，2017/01-2019/12，5万元，在研，参加[3]新疆维吾尔自治区重点研发计划项目，2016B03048，新疆医院—社区一体化糖尿病管理模式的研究与应用，2016/01-2018/12，45万元，在研，参加221 新疆医科大学博士学位论文个人简历王志强，男，回族，1987年8月生，中共党员，2012年毕业于石河子大学医学院，预防医学学士学位。2015年毕业于新疆医科大学公共卫生学院，公共卫生硕士学位。2015年至今在新疆医科大学公共卫生学院在读劳动卫生与环境卫生学专业。教育经历[1]2007.09-2012.06石河子大学预防医学系预防医学专业，预防医学学士[2]2012.09-2015.06新疆医科大学公共卫生学院公共卫生专业，公共卫生硕士[3]2015.09-至今新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学专业，在读博士222 新疆医科大学博士学位论文新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名王志强学号１０７６０１１５０８１１所在学院公共卫生学院导师姓名姚华专业劳动卫生与环境卫生学研究方向环境－基因－疾病论文题目２型糖尿病ＬｎｃＲＮＡｓ差异表达谱的筛选及功能研究学术评语：论文题目《２型糖尿病ＬｎｃＲＮＡｓ差异表达谱的筛选及功能研究》利用基因芯片ＩｎｃＲＮ及生物信息学技术，初步探索差异表达的Ａｓ在２型糖尿病中的分子机制。探讨ＭＥＧ３、ＭＡＬＡＴ１和ＭＩＡＴ基因在２型糖尿病诊断中潜在的意义６深度了解内皮细胞的ＩｎｃＲＮＡｓ，对于糖尿病并发症可能提供了全新的生物标记物和治疗靶点。理．解糖尿病诱导的内皮细胞功能障碍和确定全新的治疗靶点对于预防和减少糖尿病并发症非常重要。该生在进行本研究前阅读了大量的国内外文献，研究设计合理可行，思路清晰，。论数据分析阶段严谨认真，能够熟练准确的应用统计分析方法和软件进行分析文，逻辑性强重点突出，结构合理，统计方法运用准确，结果客观可靠，图表制作规范。该生对专业知识学习认真，各门课程成绩均达到了优良的水平。课题期间已发表了多篇学术论文，并参与多项自治区自然科学基金项目，体现了较好的学术水平。和良的术作风好学生论文同意该提交学位文，进行论答辩ｌＡ签：指导教师字ｔｑ月年咐尸２２２３
此文档下载收益归作者所有
