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分类号：密级：UDC：学号：406521812537南昌大学硕士研究生学位论文PTEN干扰促进肺泡巨噬细胞炎症因子的表达PTENinterferencepromotetheexpressionofinflammatoryfactorinalveolarmacrophages邓文刚培养单位（院、系）：南昌大学第一附属医院指导教师姓名、职称：钱克俭教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：急诊医学论文答辩日期：2015年5月答辩委员会主席：评阅人：2015年5月I 一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目姓名学号论文级别博士□硕士□院/系/所专业E_mail备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I 摘要摘要目的：观察转染PTEN干扰RNA（PTENsiRNA）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383）肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）表达的影响，探讨PTEN对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及可能机制。方法：1.体外培养NR8383，将细胞分成两组：对照组转染ControlsiRNA，干扰组转染PTENsiRNA，分别选取10nM、20nM、40nM浓度转染24小时，采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Realtimefluorescentquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-qPCR）检测转染后两组细胞中PTENmRNA表达，采用蛋白质印迹法（westernblot）检测转染后两组细胞内PTEN蛋白表达。优化转染条件，选择20nM为最佳实验转染浓度。2.将NR8383细胞分成两组：对照组转染ControlsiRNA，干扰组转染PTENsiRNA，转染24小时后，两组细胞分别用终浓度1μg/mlLPS刺激细胞6小时，采用RT-qPCR检测两组细胞内TNF-αmRNA表达，采用westernblot检测两组细胞内AKT磷酸化水平，采用酶联免疫吸附实验（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）检测两组细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化。结果：1.与对照组比较，10nM、20nM和40nM干扰组PTENmRNA表达分别下调至（0.33±0.01）倍（P<0.01）、（0.23±0.01）倍（P<0.01）、（0.21±0.01）倍（P<0.01）；PTEN蛋白表达分别下降至（0.30±0.03）倍（P<0.01）、（0.14±0.02）倍（P<0.01）、（0.10±0.02）倍（P<0.01）；在干扰组中，与10nM浓度比较，20nM、40nM浓度PTEN蛋白表达有统计学差异（P<0.01）。20nM与40nM浓度比较，PTEN蛋白表达差异无统计学意义（P=0.08）。2.两组细胞LPS刺激6小时后，与对照组比较，p-AKT/AKT蛋白比值从（0.26±0.02）表达上升至（0.52±0.03）倍（P<0.01），干扰组细胞中TNF-αmRNAII 摘要表达上调至（1.56±0.18）倍（P<0.01）。ControlsiRNA+LPS对照组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1632.56±52.05pg/ml，PTENsiRNA+LPS干扰组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1834.07±57.00pg/ml（P＜0.05）。结论：转染PTENsiRNA入NR8383细胞后，可上调AKT磷酸化水平，促进LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-α的表达。因此，我们推测PTEN可能通过PI3K-AKT通路参与调控LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。关键词：PTEN；干扰RNA；磷酸化AKT；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-αIII AbstractABSTRACTObjective：ToobservethetransfectionofPTENinterferenceRNA(PTENsiRNA)inalveolarmacrophagesofrats(NR8383)inducedtheexpressionoftumornecrosisfactor-α(TNF-α)bylipopolysaccharide(lipopolysaccharide,LPS),toinvestigatethepossibleregulatoryeffectandmechanismofPTENonNR8383inflammatoryreactionand.Methods：1.InvitrocultureofNR8383,cellsweredividedintotwogroups:thecontrolgrouptransfectedwithcontrolsiRNA,interferencegroupweretransfectedwithPTENsiRNA,10nM,20nM,40nMconcentrationwereselected,24hoursaftertransfected,usingreal-timefluorescencequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-qPCR)todetecttheexpressionofPTENmRNAintwogroupsofcellsaftertransfected,usingWesternblottingtodetecttheexpressionofPTENproteinintwogroupsofcellsaftertransfected.Optimizationoftransfectionconditions,choose20nMastheoptimaltransfectconcentration.2.NR8383cellsweredividedintotwogroups:thecontrolgrouptransfectedwithcontrolsiRNA,interferencegroupweretransfectedwithPTENsiRNA,24hoursaftertransfected,cellsintwogroupswerestimulationofLPSwiththefinalconcentrationof1µg/mlafter6h,usingRT-qPCRtodetecttheexpressionofTNF-αmRNAintwogroupsofcells,usingWesternblottingtodetectAKTphosphorylationlevelintwogroupsofcells,theexpressionofTNF-αproteininsupernatantweredetectedintwogroupsofcellsbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).Results：1.Comparedwiththecontrolgroup,in10nM,20nMand40nMinterferencegroupcells,PTENmRNAexpressionwerereducedto(0.33±0.01)fold(P<0.01),(0.23±0.01)fold(P<0.01),(0.21±0.01)fold(P<0.01);theexpressionofPTENIV Abstractproteindecreasedto(0.30±0.03)fold(P<0.01),(0.14±0.02)fold(P<0.01),(0.10±0.02)fold(P<0.01);intheinterferencegroup,comparedwiththeconcentrationof10nM,theexpressionofPTENproteinintheconcentrationof20nMand40nMhadsignificantdifference(P<0.01).TheexpressionofPTENproteinwasnosignificantdifferencebetweentheconcentrationof20nMandtheconcentrationof40nM(P=0.08).2.TwogroupsofcellswerestimulatedbyLPSafter6hours,comparedwiththecontrolgroup,theratioofp-AKT/AKTproteinincreasedfrom(0.26±0.02)to(0.52±0.03)(P<0.01),TNF-αmRNAexpressionininterferencegroupcellswereincreaseto(1.56±0.18)fold(P<0.01).ControlsiRNA+LPSgrouptheexpressionofTNF-αproteininthesupernatantis1632.56±52.05pg/ml,PTENsiRNA+LPSgrouptheexpressionofTNF-αproteininthesupernatantis1834.07±57.00pg/ml(P<0.05).Conclusion：TransfectionofPTENsiRNAintoNR8383cells,canupregulatethephosphorylationlevelofAKT,promotetheexpressionofTNF-αinalveolarmacrophagesbyLPSinduced.Therefore,wehypothesizedthatPTENmaybethroughthePI3K-AKTpathwayregulationthatLPSinducedalveolarmacrophageinflammatoryresponse.KeyWords:PTEN;siRNA;p-AKT;Alveolarmacrophages;Tumornecrosisfactor-αV 目录目录第1章引言...............................................................................................................1第2章材料与方法.....................................................................................................52.1.1细胞株...................................................................................................52.1.2主要试剂...............................................................................................52.1.3主要仪器与设备...................................................................................62.2实验器材、试剂和溶液的准备.....................................................................72.2.1细胞培养用品的处理............................................................................72.2.2去RNA酶处理......................................................................................82.2.3Ham’sF-12K培养基的配制.................................................................82.2.4LPS溶液的配制....................................................................................82.2.5PTENsiRNA及ControlsiRNA相关试剂的配制...............................82.2.6WesternBlot相关试剂的配制..............................................................92.3实验方法.......................................................................................................102.3.1NR8383的复苏、培养、传代和冻存................................................102.3.2细胞处理及分组..................................................................................102.3.3RNA提取、定量和质量检测.............................................................112.3.4SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测PTENmRNA及TNF-αmRNA的表达...............................................................................................132.3.5Westernblot检测PTEN、p-AKT蛋白的表达变化.........................152.3.6ELISA检测上清中TNF-α蛋白的表达..............................................182.3.7统计学处理.........................................................................................21第3章结果...............................................................................................................223.1细胞总RNA质量和浓度测定.....................................................................223.2RT-qPCR扩增的特异性................................................................................223.3BCA蛋白定量...............................................................................................243.4SYBRGreenIReal-TimeqPCR检测转染PTENsiRNA、ControlsiRNA后细VI 目录胞内PTENmRNA表达变化，选择最佳转染浓度............................................243.5Westernblot检测转染PTENsiRNA、ControlsiRNA后细胞内PTEN蛋白表达变化，选择最佳转染浓度..........................................................................253.6下调PTEN对NR8383细胞靶蛋白AKT磷酸化水平的影响..................263.7下调PTEN后对NR8383细胞TNF-αmRNA相对表达的影响..............263.8大鼠TNF-α蛋白标准曲线图.......................................................................273.9下调PTEN后对NR8383细胞上清液中TNF-α蛋白表达的影响............27第4章讨论...............................................................................................................29第5章结论与展望...................................................................................................335.1结论...............................................................................................................335.2进一步工作的方向.......................................................................................33致谢...........................................................................................................................34参考文献.....................................................................................................................35攻读学位期间的研究成果.........................................................................................39综述...........................................................................................................................40VII 中英文缩略词表中英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称SIRSsystemicinflammatoryresponsesyndrome全身炎症反应综合征CCMcriticalcaremedicine重症医学科MODSmultipleorgandysfunctionsyndrome多器官功能障碍综合征EGDTearlygoal-directedtherapy早期目标导向治疗ARDSacuterespiratorydistresssyndrome急性呼吸窘迫综合征ALIacutelunginjury急性肺损伤AMalveolarmacrophage肺泡巨噬细胞TLRsToll-likereceptorsToll样受体PAMPpathogen-associatedmolecularpatterns病原体相关分子模式NF-κBnuclearfactor-KappaB核转录因子KappaBTNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αIL-1βinterleukin1β白细胞介素-1βPTENphosphataseandtensinhmmlogydeleted第十号染色体缺失的磷onten酸酶和张力蛋白同源物基因PIP3phosphatidylinositol3,4,5-triphosphate磷脂酰肌醇三磷酸PI3Kphosphoinositide3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶PKB/AKTproteinkinaseB蛋白激酶BLPSlipopolysaccharide脂多糖PIP2phosphatidylinositol4,5-triphosphate磷脂酰肌醇二磷酸OVAovalbumin卵清蛋白BALFbronchoalveolarlavagefluid支气管肺泡灌洗液ECPeosinophiliccationicprotein嗜酸细胞阳离子蛋白RNAiRNAinterferenceRNA干扰dsRNAdouble-strandedRNA双链RNAPTGSposttranscriptionalgenesilencing转录后基因沉默siRNAsmallinterferenceRNA小干扰RNAVIII 中英文缩略词表DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验FBSfetalbovineserum胎牛血清ODopticaldensity光密度PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液qPCRquantitativepolymerasechainreaction定量聚合酶链式反应TAK1transforminggrowthfactor-betaactivated生长因子-β活化激酶1kinase1TLR4Toll-likereceptors4Toll样受体4Tmmeltingtemperature解链温度ETendotoxin内毒素ECMOextracorporealmembraneoxygenation体外膜肺氧合RISCtheRNA-inducedsilencingcomplex沉默复合体APammoniumpersulfate过硫酸铵IX 第1章引言第1章引言脓毒症（Sepsis）是重症医学科（CriticalCareMedicine，CCM）的常见病、多发病，指合并感染的全身炎症反应综合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS），其中并发多器官功能不全为严重脓毒症（severesepsis），如未得有效控制或治疗可进一步发展为感染性休克（septicshock），是目前导致危重病人死亡的主要原因之一[1]。脓毒症在发生发展过程中合并有多器官功能障碍综合征（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）是导致脓毒症高死亡率的主要原因[2]。最近多中心研究显示早期目标导向治疗（Earlygoal-directedtherapy，EGDT）并不能降低脓毒症休克患者远期死亡率[3,4,5]。流行病学调查显示，在一些国家，严重脓毒症在重症患者的发病率已高达50%~75%，同时每年全球有超过1800万严重脓毒症患者，死亡率居高不下平均为20%~50%[2]。脓毒症并发MODS时，肺脏是最先受累、同时也是最易受累的器官，随着病情的加重可发展为以急性呼吸困难、顽固性低氧血症为特征的急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）[6,7]。因此避免或减轻ALI/ARDS的发生，是降低脓毒症高死亡率的关键。肺组织中肺泡巨噬细胞（alveolarmacrophage，AM）在脓毒症肺损伤的发生发展过程中发挥着关键作用[8]。当病原体入侵时，单核-巨噬细胞通过Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）识别病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP），并通过一系列的信号转导活化核转录因子KappaB（nuclearfactor-KappaB，NF-κB），导致大量炎症介质的转录表达，促使炎症反应的“级联放大”形成SIRS。在此过程中，当AM被过度激活后可导致炎症因子的失控性释放，如肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），这些最具有生物活性的早期炎症因子，形成肺内炎症“瀑布”反应，则可导致ARDS的发生（见图一）[7,9]。然而，目前针对脓毒症肺损伤的治疗方案如机械通气等均未能有效降低其死亡率[10]。理论上清除炎症介质被认为是治疗脓毒症合并ARDS的另一重要途径，过去有通过静脉注射单一的介质抗体或使用高容量血液滤过等方法，这些治疗方法虽能明显减少循环中的炎症介质，达到抑制SIRS的作用，但对肺部的炎症反应控制却不理想，对脓毒症ARDS的保护作用有限[11,12,13]。既然对症支持效果有限，因此，我1 第1章引言们有必要从病因出发，研究一种新的治疗手段，能够有效阻断AM的过度激活，减少肺部炎症介质的产生，抑制或减弱肺部炎症“级联放大”反应，改善脓毒症预后。图一：肺内巨噬细胞被过度激活导致肺内过度炎症反应是脓毒症发生肺损伤的根本原因图片摘自NEnglJMed,2000,342(18):1334-1349第十号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphataseandtensinhmmlogydeletedonten，PTEN）是人类发现的第一个具有磷酸化酶功能的抑癌基因[14]，在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面都起着重要的调控作用[15]。当单核/巨噬细胞受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后，膜上磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol4,5-triphosphate，PIP2）在细胞内的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）催化下生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol3,4,5-triphosphate，PIP3），PIP3能与蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB/AKT）结合而使PI3K-AKT信号通路激活[16]。PTEN其主要功能是使PIP3（PI3K-AKT信号通路的关键环节）的D3位点去磷酸化，从而降低细胞内PIP3水平。而PIP3的减少可减弱PI3K激活引起的AKT磷酸化，从而阻断PI3K-AKT信号通路[17,18]。因此，PTEN是PI3K-AKT信号通路中的一个重要的分子开关。近年来，国内外陆续展开了PTEN与炎症关系的研究报道[19,20]。有研究显示，PI3K-AKT信号通路的激活可以引起NF-κB的活化来促进炎症反应2 第1章引言[21]。见图二图二：PTEN/PI3K/AKT信号通路近年来采用基因敲除、基因沉默技术，通过反向遗传学分析发现可通过PI3K-AKT信号通路调控炎症反应[22]。近年发展起来的RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一门新兴的基因阻断技术，是一种双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）分子在信使核糖核酸（messengerribonucleicacid，mRNA）水平上关闭相应序列基因的表达并使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）[23]。它通过21～23nt的RNA片段，即小干扰RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）与特异性mRNA结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达的下调[24]。Kuroda等[25]以特异性敲除巨噬细胞PTEN基因小鼠为模型，研究PTEN对巨噬细胞吞噬功能的影响，巨噬细胞PTEN基因敲除小鼠较之正常野生型小鼠对利什曼原虫更具易感性，且敲除PTEN基因的巨噬细胞杀伤病原体的能力亦有所下降，因此PTEN对于巨噬细胞有效清除胞内寄生菌是必要的。Li等[26]研究显示，特异性敲除小鼠髓系来源细胞的PTEN基因后，当发生肺炎时，中性粒细胞趋化作用明显增强，凋亡效应有所延迟、细菌杀伤能力增强，进一步证实了PTEN可通过使PIP3去磷酸化调控中性粒细胞功能。综上所述，在脓毒症肺损伤发病过程中，肺泡巨噬细胞起着至关重要的作用。目前PTEN在炎症反应中的研究多见于哮喘、克罗恩病等动物模型。然而3 第1章引言PTEN在脓毒症肺损伤中究竟起到什么作用鲜见报道。本实验在体外环境下通过脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应来模拟脓毒症肺损伤，通过转染PTENsiRNA入肺泡巨噬细胞，抑制PTEN蛋白的表达，观察能否活化巨噬细胞内PI3K-AKT信号通路，进而影响脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。通过构建脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应来模拟脓毒症肺损伤，本研究初步了解PTENsiRNA与炎症介质TNF-α的关系，进而推测PTEN在脓毒症肺损伤中可能的作用及其机制。为脓毒症肺损伤的治疗扩宽思路，为药物治疗寻找新的靶点。4 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞株大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383：购自中国科学院（ChineseAcademyofSciences，CAS）上海细胞库。细胞来源于正常大鼠肺灌洗时的AM，具有AM的生物学特性，可运用于体外AM的相关研究。2.1.2主要试剂Ham’sF-12K培养基美国Sigma-Aldrich（N3520）胎牛血清（FBS）美国Gibco（10099-141）L-glutamine美国Sigma-Aldrich（G7513）LPS美国Sigma-Aldrich（L2880）PowerFectTMsiRNA＆DNATransfection上海明睿（SL100569）ReagentPTENsiRNA(r)美国Santa-Cruz（sc-61873）ControlsiRNA-A美国Santa-Cruz（sc-37007）焦碳酸二乙酯（DEPC）美国Amresco（E174-10）TransZol北京全式金（ET101-01）RNase-freeWater北京全式金（GI201-01）溴化乙锭EB北京Solarbio（0492-100）琼脂糖美国invitrogen（75510-019）6×DNALoadingBuffer、北京全式金（GH101-01）TransDNAMarkerI北京全式金（BM401-01）PrimeScript®RTreagentKit(PerfectRealTime)日本TaKaRa（DRR037s）SYBR®PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)日本TaKaRa（DRR820s）RIPA裂解液南京诺唯赞（E311-02）PhosphataseInhibitorCocktail3（磷酸酶抑制美国Sigma-Aldrich（P0044）剂）5 第2章材料与方法BCA蛋白浓度测定试剂盒江苏碧云天（P0012S）EasyProteinLoadingBuffer北京全式金（DL101-01）凝胶制备试剂盒武汉博士德（AR0138）BluePlusIIProteinMarker(14-100kDa)北京全式金（DM101-01）Trisbase北京Solarbio（T8060）甘氨酸北京Solarbio（G8200）十二烷基硫酸钠（SDS）北京Solarbio（S8010）PVDF膜美国millipore（NC00010-0.22）AlbuminBovineV北京Solarbio（A8020-5g）脱脂奶粉中国完达山β-ActinMouseMonoclonalAntibody美国anbobio（E0012-25µg）PTEN(D4.3)xp®RabbitmAb美国CellSignalingTechnology（9188P）Phospho-Akt(Ser473)(D9E)xp®RabbitmAb美国CellSignalingTechnology（4060S）Akt(pan)(C67E7)RabbitmAb美国CellSignalingTechnology（4691P）aMoIgG/HRP北京中杉金桥（ZB-2305）aRbIgG/HRP北京中杉金桥（ZB-2301）EasySeeWesternBlotkit北京全式金（DW101-01）胶片美国柯达（JPKD-5x7）大鼠TNF-αELISA试剂盒武汉博士德（EK0526）二甲基亚砜（DMSO）美国Amresco（0231）β-actin、PTEN和TNF-α的PCR扩增引物由广州锐博生物工程有限公司合成，氯仿（chloroform）、甲醇（methanol）、异丙醇（isopropylalcohol）、无水乙醇（Anhydrousethanol）等均为国产分析纯，一次性耗材：25cm2细胞培养瓶、0.22µm一次性针头滤器、六孔细胞培养板、Tip头（枪头）、EP管（离心管）、八连排透明荧光定量PCR薄壁管、一次性冻存管等。2.1.3主要仪器与设备立式压力蒸汽灭菌器上海博讯电热恒温干燥箱上海精宏实验液氮罐四川亚西机器超净工作台苏州净化设备厂6 第2章材料与方法移液枪德国Eppendorf倒置显微镜日本Olympus二氧化碳培养箱美国Thermo普通低速离心机上海安亭（飞鸽）（TDL-50B）普通高速离心机上海安亭（飞鸽）（TGL-16B）电子天平上海天平仪器厂WD800型微波炉中国GalanzDNA电泳设备北京市六一仪器厂高速冷冻离心机上海安亭（飞鸽）（TGL-16G）紫外分光光度计日本HITACHI4℃冰箱中国Haier-20℃冰箱中国Haier-80℃冰箱日本ThermoAppliedBiosystems7500Real-TimePCRsystem美国ABI电磁炉中国MideaWestern-blot仪上海TanonX胶片曝光盒日本FUJIFILM酶标分析仪美国Thermo2.2实验器材、试剂和溶液的准备2.2.1细胞培养用品的处理细胞培养条件要求严格，无杂质干扰。在培养过程中需要使用的玻璃器皿需经过严格清洗及消毒。过程：①玻璃器皿首先需要洗衣粉水充分浸泡约8h。②软化污渍后洗刷干净，流水反复冲洗12遍以上，至洗衣粉水冲洗干净，再于烘箱中烘干过夜。③烘干后浸没于强酸内浸泡约8h。④穿好防护衣，戴口罩及防护手套小心捞出玻璃器皿，用流水反复冲洗15遍以上。⑤待强酸冲洗干净，再用一蒸水漂洗5遍。7 第2章材料与方法⑥用饭盒包装好后，121℃高压消毒灭菌30min。⑦消毒结束后放入烘箱内烘干备用。注：清洁液配方：浓硫酸600ml、重铬酸360g、一蒸水3000ml。2.2.2去RNA酶处理RNA在提取纯化过程中容易受RNA酶的污染降解，且RNA酶广泛存在，为防止影响后续实验，因此提取RNA过程中所需器械都需去RNA酶处理。使用到的器械有EP管、Tip头等塑料耗材可用0.1%的DEPC水溶液完全浸泡8h以上。无核酶水：三蒸水和DEPC溶液按比例配成0.1%的DEPC水溶液，配制好后进行高压灭菌消毒备用。2.2.3Ham’sF-12K培养基的配制准备好1个1L的容量瓶及6个250ml规格的广口瓶，清洗、去污、消毒、烘干后，将Ham’sF-12K干粉型培养基（1L装）及1.5g碳酸氢钠（Sodiumbicarbonate,NaHCO3）倒入容量瓶中，加入约900ml三蒸水，磁力搅拌器充分拌匀溶解待无明显固体沉淀，用三蒸水定容至1L，用75%酒精溶液消毒广口瓶口后，转移至超净台，采用50ml规格一次性无菌注射器及0.22µm规格的一次性滤器过滤除菌，即配制成基础培养基（5瓶170ml及1瓶150ml）。胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）使用时需56℃水浴30min灭活处理，按每170ml基础培养基中加入30mlFBS，配制成终浓度15%含FBS的Ham’sF-12K完全培养基，消毒封口后，于4℃冰箱保存。2.2.4LPS溶液的配制于无菌操作台中操作，将粉剂脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（1mg装）完全溶于1ml的无菌磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）中，配制成母液（1mg/ml），分装后于-20℃冰箱保存。使用时用无菌PBS溶液按比例稀释10倍，配成100μg/ml工作液。2.2.5PTENsiRNA及ControlsiRNA相关试剂的配制RNAsiRNA容易受内源性RNA酶的降解，操作中应带口罩及手套，用去RNA酶处理的试剂、EP管、Tip头等。PTENsiRNA粉末（10µM），配置前瞬时高速离心，使粉末都沉积在管底部，加入330µl无核酶水充分混匀溶解，配制8 第2章材料与方法成10µM浓度工作液，分装后保存于-20℃冰箱备用，避免反复冻融。ControlsiRNA-A粉末（10µM），配置前瞬时高速离心，使粉末都沉积在管底部，加入66µl无核酶水充分混匀溶解，配制成浓度10µM工作液。分装后保存于-20℃冰箱，为保证产品的稳定性，应尽量避免反复冻融。2.2.6WesternBlot相关试剂的配制（1）10%SDS：10gSDS溶入80ml一蒸水，水浴加热，待完全溶解后调整pH至7.2，总体积定容至100ml。（2）10%AP：0.1g过硫酸铵（ammoniumpersulfate,AP）完全溶解于1ml一蒸水，4℃避光保存。（3）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris15.1g、甘氨酸94g、10%SDS50ml溶解于900ml一蒸水中，待完全溶解后定容至1000ml，常温保存。（4）1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液与一蒸水按1：4的比例配制。（5）1×Tris-甘氨酸转移缓冲液：Tris3.03g、甘氨酸14.4g溶于600ml一蒸水中，待完全溶解再加入甲醇200ml，待混匀后缓慢加入一蒸水至总体积为1000ml，常温保存。（6）1.0mol/LTris-HCl（pH7.5）：Tris30.29g溶于200ml一蒸水中，待充分溶解后加入浓盐酸调整pH至7.5，总体积用一蒸水定容至250ml，高温灭菌后常温保存。（7）10×TBS缓冲液：1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml、NaCl8.8g混匀后加一蒸水定容至100ml。（8）1×TBS缓冲液：将10×TBS缓冲液与一蒸水按1:9比例配制。（9）20%Tween-20溶液：Tween-2020ml加入一蒸水60ml充分溶解，总体积定容至100ml后混匀，4℃冰箱保存。（10）TBST缓冲液：1×TBS70ml、20%Tween-20165µl混匀后使用，现配现用。（11）WesternBlot封闭液（5%脱脂奶粉TBST缓冲液）：脱脂奶粉1.0g加入20mlTBST缓冲液，充分混匀溶解后4℃冰箱保存。（12）凝胶制备试剂盒中包括已配制好的30%丙烯酰胺/亚甲双丙烯酰胺液100ml、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）100ml、0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）15ml、9 第2章材料与方法10%SDS5ml、AP0.5g、TEMED1ml。2.3实验方法2.3.1NR8383的复苏、培养、传代和冻存2.3.1.1复苏：穿好防护衣及防冻手套，从液氮灌中取出目的冻存管，马上放入37℃水浴晃动，冻存管盖不可浸入水浴中，尽量使其在2min内融化，尽量保护细胞不受理化损害。将冻存管消毒转移至超净台，使用移液管将解冻的细胞悬液小心转移至离心管，同时加入Ham’sF-12K完全培养基数毫升（根据复苏冻存管的数量而定），1000×g离心5min，小心弃掉上清液后加入Ham’sF-12K完全培养基数毫升（根据接种所需培养瓶的数量而定），反复吹打至细胞悬液，接种至无菌培养瓶中，拧松瓶口后放入培养箱培养。2.3.1.2培养：NR8383生长状态为混合型：部分贴壁+部分悬浮。细胞培养基用含15%FBS、1.5g/LNaHCO3、2mML-谷氨酰胺（L-glutamine）的Ham’sF-12K完全培养基，置于一个标准大气压下，37℃，含5%浓度的CO2温湿细胞培养箱中培养，2-3天更换培养液。2.3.1.3传代：选择对数期生长的细胞，可用移液管小心将贴壁细胞吹打下来，收集细胞悬液至离心管，1000×g离心5min，小心弃掉上清液，加入Ham’sF-12K完全培养基反复吹打至细胞悬液，按2-5×105/ml接种细胞于无菌培养瓶中，拧松瓶口后细胞培养箱内培养。2.3.1.4冻存：选择对数期生长的细胞进行冻存，待细胞生长融合至约90%时，可用移液管小心将贴壁细胞吹打下来，收集细胞悬液至离心管，1000×g离心5min，小心弃掉上清液，加入细胞冻存液反复吹打混至细胞悬液，分装于1.5ml规格的冻存管中，消毒后封口膜封口，详细标记后保存。冷冻过程：4℃30min—-20℃30min—-80℃过夜—液氮长期保存。细胞冻存液为按比例配制的含5%DMSO的完全细胞培养基。2.3.2细胞处理及分组2.3.2.1取对数期NR8383，待细胞密度生长至约90%时，吹打、收集并重悬细胞，细胞计数，按细胞数约2×106/孔接种至6孔板，每孔加入Ham’sF-12K完全培养基至2ml，放入培养箱中培养。10 第2章材料与方法2.3.2.2细胞接种培养90min，分为以下两组：①转染controlsiRNA对照组：培养板中细胞分别转染10nM、20nM、40nM浓度的controlsiRNA培养24h；②转染PTENsiRNA干扰组：培养板中细胞分别转染10nM、20nM、40nM浓度的PTENsiRNA培养24h。离心收集两组细胞沉淀，保存于-80℃冰箱备用，进行下一步实验。2.3.2.3优化转染条件，选择20nM为最佳PTENsiRNA干扰浓度。细胞接种于六孔板中培养90min，分为两组进行下一步实验：①转染controlsiRNA+LPS对照组：转染controlsiRNA入细胞24h后，培养板中加入终浓度为1μg/ml的LPS溶液培养6h；②转染PTENsiRNA+LPS干扰组：转染PTENsiRNA入细胞24h后，培养板中加入终浓度为1μg/ml的LPS溶液培养6h。离心收集两组细胞沉淀和细胞上清液，保存于-80℃冰箱备用，进行下一步实验。2.3.2.4分别运用RT-qPCR检测细胞中PTENmRNA、TNF-αmRNA表达变化，运用WesternBlot检测细胞中PTEN蛋白相对表达量及p-AKT蛋白水平，ELISA检测两组细胞上清液中TNF-α表达水平。2.3.3RNA提取、定量和质量检测2.3.3.1准备工作：①主要试剂：TransZol、氯仿、异丙醇、去RNA酶水。②0.1%DEPC溶液处理过的无菌EP管和Tip头。③佩戴口罩、帽子、手套。2.3.3.2细胞总RNA提取步骤：（1）将之前收集的细胞沉淀，加入1mlTransZol，用移液枪反复吹打直至TransZol裂解液中无明显沉淀，室温静置5min。（2）按每1mlTransZol加0.2ml氯仿，剧烈上下摇动15s后室温放置3min。（3）10000×g4℃离心15min。（4）离心后可见液体分成3层：无色水相（上层）、中间层、粉红色有机相（下层），RNA主要在无色水相中，无色水相体积约为所用TransZol裂解液的60%（注：为保证实验的有效性及结果的可靠性，拿取时应轻拿轻放，吸取无色水相）。（5）小心吸取无色水相入去RNA酶的EP管中，按每1mlTransZol加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。11 第2章材料与方法（6）10000×g4℃离心10min。（7）小心弃掉上清，这是可见在EP管管侧和管底有微量胶状沉淀。（8）加1ml75%乙醇（DEPC处理过的无RNA酶水配制的）洗涤RNA沉淀，剧烈上下摇动（每使用1mlTransZol至少加1ml75%乙醇）。（9）7500×g4℃离心5min。（10）将上清液小心弃干净，常温晾干沉淀（5min左右）。（11）沉淀中加入约50µl去RNA酶水溶解，用移液枪小心清洗EP管壁，立即-80℃冰箱保存。2.3.3.3操作注意事项：①为了更好地保证RNA纯度，应尽量除净乙醇。②使用RNA提取专用操作台。③操作全程应在冰上进行。④操作时务必佩戴手套、口罩及医用帽。⑤操作全程应尽量避免交谈，防止唾液污染等。2.3.3.4细胞总RNA质量和浓度测定：（1）琼脂糖凝胶电泳检测（1.0%琼脂糖凝胶）：①将0.2g琼脂糖（agarose）溶解于20mll×TAE溶液中，配成1.0%琼脂糖凝胶溶液。②用微波炉反复加热振荡后充分溶解，待冷却至50℃左右时，加入10μgEB溶液（终浓度为0.5μg/ml），混匀后倒入清洁干燥后的制胶板，插入上样梳。③待冷却凝固后拔出上样梳，置于电泳槽中，每孔上样4μl样本RNA和0.8μl6×DNA上样缓冲液（LoadingBuffer）。④120伏特（volt,V）电泳约15min，用凝胶成像系统观察并拍摄电泳条带。注：完整RNA电泳条带分为三条：28S、18S和5S。其中28S和18S较明亮（其中28S是18S亮度的2倍左右），5S较暗。三条条带应整齐，无杂带。（2）紫外分光光度计检测：用200μl去RNA酶水调零作参照，取2μl总RNA样品用去RNA酶水稀释至200μl，加入比色杯，按照机器说明依次测定样品A260值及A280值。总RNA所测的A260/A280比值应该在1.8-2.0范围以内：比值小于1.8提示样品总RNA可能存在蛋白质污染，比值大于2.0提示样品总RNA可能存在降解。总RNA浓度（μg/ml）＝A260值×40×稀释倍数（100）。12 第2章材料与方法2.3.4SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测PTENmRNA及TNF-αmRNA的表达2.3.4.1检测原理：SYBRGreenI实时荧光定量PCR是最常用及最常见的一种RT-qPCR检测方法。SYBRGreenI是具有绿色激发波长的染料，只结合于双链DNA。在RT-qPCR反应过程中，只与双链DNA结合发出绿色荧光，PCR仪收集反应过程中荧光信号强度。RT-qPCR可以对基因进行准确定量，也可以在PCR结束后测定各自DNA片段所对应的融解温度。参考所有基因的融解曲线分析PCR产物的特异性。具体原理见图2.1。图2.1SYBRGreenI实时荧光定量PCR原理图图片摘自宝生物SYBR®PremixExTaqII说明书2.3.4.2准备工作：①试剂：逆转录试剂盒PrimeScript®RTreagentKit、PCR试剂盒SYBR®PremixExTaq™II、PCR引物、无核酶水。②0.1%DEPC水溶液浸泡过的无菌EP管和Tip头。③佩戴帽子、口罩、手套。2.3.4.3总RNA的逆转录反应体系：反应体系ReagentAmountTotalRNA100ng15×PrimeScriptBuffer（forRealTime）2μl2PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl3OligodTPrimer（50μM）0.5μl4Random6mers（100μM）0.5μl5RNase-FreedH2Oupto10μl13 第2章材料与方法2.3.4.4注意事项：1.可先配制总反应体系混合液：①+②+③+④+⑤。混匀后再平均分装至各个EP管中，最大化的减少实验操作误差。各管中再加入等量总RNA（100ng）。2.以上操作均在冰上完成。3.反应条件：37℃15min、85℃5s、4℃forever，产物cDNA保存于-20℃冰箱备用。2.3.4.5目的基因PCR扩增：RT-qPCR引物序列及RT-qPCR扩增产物片段长度GeneSequence(5'->3')productlengthForwardPrimer:TACTGCCCTGGCTCCTAGCAβ-actin[27]101bpReversePrimer:TGGACAGTGAGGCCAGGATAGForwardPrimer:ACCAGGACCAGAGGAAACCTPTEN[28]126bpReversePrimer:TTTGTCAGGGTGAGCACAAGForwardPrimer:GGCAGCCTTGTCCCTTGAAGAGTNF-α[29]172bpReversePrimer:GTAGCCCACGTCGTAGCAAACC注：本实验选取β-actin作为内参2.3.4.6RT-qPCR的反应体系：反应体系ReagentAmount①SYBR®PremixExTaqII（2×）10μl②PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl③PCRReversePrimer（10μM）0.8μl④ROXReferenceDye（50×）0.4μl⑤RTreactionsolution（cDNAsolution）⑥dH2O（灭菌无核酶水）upto20μl注：因反应体系中含有ROXReferenceDye，配制时应避免强光。配制好后放入AppliedBiosystems7500定量PCR仪进行40次扩增，60℃延伸时可自动收集荧光，扩增完成后PCR仪可自动分析产物融解温度（Tm）。反应条件：95℃30sec14 第2章材料与方法95℃5sec40cycle60℃34sec2.3.4.7琼脂糖凝胶电泳（2.0%琼脂糖凝胶）：①取0.4g琼脂糖溶解于l×TAE溶液40ml中，配成2.0%琼脂糖凝胶溶液。②用微波炉加热沸腾2遍，充分溶解后待冷却至50℃左右时，加入10μgEB溶液（终浓度0.5μg/ml），混匀后倒入清洁干燥后的制胶板，插入上样梳。③待冷却凝固后拔出上样梳，置于电泳槽中，每孔上样4μlRT-qPCR扩增产物和0.8μl6×DNALoadingBuffer，另取孔加5μlTransDNAMarkerI。④120V电泳约30min，用凝胶成像系统观察拍摄并分析电泳结果。2.3.4.8数据分析：选取β-actin作为内参基因，组间PTENmRNA、TNF-αmRNA相对表达量采用2-ΔΔCt[30]计算。Ct值：RT-qPCR扩增反应过程中扩增产物荧光信号达到设定阈值时所对应的扩增循环次数。ΔΔCt计算公式：ΔΔCt=(Cttarget-Ctcontrol)干扰组-(Cttarget-Ctcontrol)对照组，其中target表示为目的基因，control表示为内参基因。2.3.4.9条件优化SYBRGreenIRT-qPCR反应条件的优化：RT-qPCR扩增后的Ct值范围应在15-30之间，不在这个范围都会导致结果不准确。2.3.5Westernblot检测PTEN、p-AKT蛋白的表达变化2.3.5.1细胞总蛋白质的提取（1）收集细胞悬液至无菌离心管中，1000×g离心5min，小心倒掉上清液，加入5ml4℃预冷的PBS缓冲液漂洗NR8383，离心去掉废液，再次漂洗同时将细胞悬液转移至新EP管中，最后并用滤纸吸干剩余液体。（2）将EP管移至冰上，根据RIPA细胞裂解液操作说明书进行下一步操作：①按每106细胞中加入预冷的1mlRIPA细胞裂解液和1μlPhosphataseInhibitorCocktail，使用1ml枪头反复吹打，促进细胞裂解，约每5min重复一次。②裂解约30min后，RIPA裂解液中无明显细胞沉淀后，将蛋白样品于4℃12000×g离心10min。③细胞总蛋白溶解于上清液中，迅速将上清液移至新的干净离心管中，-80℃冰箱保存备用。15 第2章材料与方法2.3.5.2BCA法测定蛋白浓度购买的BCA蛋白浓度测定试剂套装中有：BCA试剂A40ml、BCA试剂B1.2ml、蛋白标准（BSA）20mg、蛋白标准配制液1ml。（1）取0.8ml蛋白标准配制液加入BSA中，溶解完全后配制为蛋白标准溶液（终浓度25mg/ml）。-20℃冰箱可长期保存。（2）取适量25mg/ml蛋白标准（根据检测蛋白样品数及标准品孔数而定），加入适量PBS缓冲液稀释成终浓度为0.5mg/ml蛋白标准。例如：10μl25mg/ml蛋白标准混合490μlPBS缓冲液即可稀释至终浓度为0.5mg/ml蛋白标准。-20℃冰箱长期保存。（3）根据样品数量，配制BCA工作液：取BCA试剂A50份加入BCA试剂B1份（50：1）配制适量BCA工作液（根据检测蛋白样品数及标准品孔数而定），充分混匀后使用。BCA工作液现配现用。（4）制作蛋白标准品曲线：将0.5mg/ml蛋白标准按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl及20μl加到96孔板标准品孔中，并分别加入20μl、19μl、18μl、16μl、12μl、8μl、4μl及0μlPBS缓冲液至每孔溶液总体积为20μl。（5）加4μl样品到96孔板的样品孔中，加16μlPBS缓冲液至每孔总体积为20μl。（6）每孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30min。（7）测定各孔A562。（8）根据蛋白标准品各孔所测OD值，制作出蛋白标准曲线；根据各样品所测OD值及标准曲线计算出样品蛋白浓度。2.3.5.3蛋白质变性蛋白定量后，根据蛋白样本的体积加入1/5份体积的6×蛋白上样缓冲液（ProteinLoadingBuffer），反复吹打混匀，置于沸水中水浴变性5min，稍混匀备用。2.3.5.4WesternBlot（1）清洗制胶架、玻片，晾干，安装好制胶架。（2）SDS-PAGE凝胶的配制：10ml10%分离胶6ml5%浓缩胶一蒸水4ml4ml30%丙烯酰胺溶液3.3ml1ml16 第2章材料与方法1.5MTrisHCl（pH8.8）2.5ml—0.5MTrisHCl（pH6.8）—1ml10%SDS100μl80μl10%AP100μl60μlTEMED4μl8μl依据上述配方依次配制SDS-PAGE分离胶（先）及浓缩胶（后）。配制SDS-PAGE凝胶注意：①配制完分离胶后小心倒掉及用滤纸洗净压缩液，不可破坏液面。②配制过程中应缓慢轻柔注液，避免胶块产生气泡、泳道应整齐。③安装制胶架需保持密闭性，避免漏胶。（3）将配制好的SDS-PAGE凝胶小心安装于电泳槽中，注意保持内槽的紧密性，防止漏液。内槽中加满新鲜配制的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，平行拔出加样梳，用200µl移液枪反复冲洗泳道去除气泡及杂质。（4）上样：每孔上样蛋白总量保持于20-50μg范围（0.75mm规格10孔上样梳）。取孔加BluePlusIIProteinMarker4μl，剩余孔加入等量样品。上样注意事项：①10孔上样梳（0.75mm）每孔最大上样量为25μl；15孔上样梳（0.75mm）每孔最大上样量为10μl。②上样量较大时应避免样品溢出上样孔。（5）电泳：浓缩胶电压80V，待溴酚蓝进入分离胶时调整电压至100V。密切观察溴酚蓝电泳位置，如将至凝胶底部停止电泳。（6）电转：待电泳结束后小心取出凝胶浸泡于1×Tris-甘氨酸转移缓冲液中。根据ProteinMarker说明书，判断目的蛋白条带的位置并小心切胶。剪取比凝胶稍大的PVDF膜，按阴极（—）至阳极（+）：黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板的顺序组装“三明治”，于1×Tris-甘氨酸转移缓冲液中排净气泡后放入电转槽中，加满1×Tris-甘氨酸转移缓冲液，低温环境下90V恒压电转90min，将蛋白转移至PVDF膜上。电转注意事项：①在安装切胶及安装“三明治”过程中应全程于电转液中进行。②PVDF膜需用甲醇激活。③电转时需将电转槽放置于冰水中。17 第2章材料与方法④需根据目的蛋白分子量大小适当调整电转时间。（7）封闭：电转结束后小心取出PVDF膜，蛋白面朝上，加入含5%脱脂奶粉TBST溶液，于4℃下摇床上封闭2h。（8）一抗孵育：封闭结束后小心弃掉5%脱脂奶粉TBST溶液，加入1×TBST缓冲液，于室温下放置摇床上缓慢摇动漂洗5min×3次。一抗孵育：用1×TBST缓冲液稀释一抗，兔抗PTEN（1:1000）/兔抗p-Akt（1:2000）/兔抗Akt（1:1000）/鼠抗β-actin（1:5000）。混匀后将含有蛋白的PVDF膜浸泡于对应的一抗液中，蛋白面朝上，4℃冰箱孵育过夜。（9）洗膜：取出PVDF膜浸没于10ml1×TBST缓冲液中，于室温下放置摇床上缓慢摇动漂洗10min×3次。（10）孵育二抗：用1×TBST缓冲液稀释二抗，aMoIgG/HRP（1:5000）、aMoIgG/HRP（1:5000）。混匀后将含有蛋白的PVDF膜浸泡于对应的二抗液中，蛋白面朝上，室温孵育2h。（11）洗膜：取出PVDF膜浸没于10ml1×TBST缓冲液中，于室温下放置摇床上缓慢摇动漂洗10min×3次。（12）曝光、显影及定影：EasySeeWesternBlotkit包括溶液A50ml、溶液B50ml及溶液C150µl。暗室内，各取500µl溶液A、B及1µl溶液C混匀后滴于膜上，孵育约1min后，剪取对应稍大柯达胶片进行曝光、显影并定影。（13）将胶片进行扫描，通过QuantityOne软件进行数据分析。以β-actin蛋白作为内参，各组目的蛋白条带灰度与对应的内参蛋白条带灰度进行比值。2.3.6ELISA检测上清中TNF-α蛋白的表达2.3.6.1检测原理：博士德所提供的TNF-αELISAKit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（EnzymeLinked-Immuno-SorbentAssay,ELISA）。预先包被的抗体为抗RatTNF-α抗体。待检测样品和生物素标记的RatTNF-α抗体前后加入酶标板孔中反应，待反应结束后PBS缓冲液洗涤。随后加入亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）反应。酶标板经过PBS缓冲液的多次洗涤后用底物TMB显色。TMB在酶的催化下变成蓝色，加终止液后变成黄色。于酶标仪中测各孔的OD450值。OD450与样品中的TNF-α呈正相关。2.3.6.2准备工作：①酶标仪。18 第2章材料与方法②ELISA测定试剂盒。③移液器及吸头。④试剂盒复温至常温。⑤配制标准品。⑥配制ABC工作液。⑦佩戴手套及口罩。2.3.6.3酶联免疫吸附测定试剂盒包括：①重组RatTNF-α冻干标准品，10ng/管×2管。②预包被抗RatTNF-α抗体的酶标板。③样品稀释液，30ml。④生物素标记抗RatTNF-α，130μl，效价1：100。⑤抗体稀释液，12ml。⑥ABC，130μl，效价1：100。⑦ABC稀释液，12ml。⑧TMB显色液，10ml。⑨TMB终止液，10ml。2.3.6.3操作步骤：（1）标准品配置：a.10,000pg/ml标准品：将标准品溶于1ml样品稀释液中，孵育大于10min，然后反复颠倒待完全溶解。b.配制1000pg/ml标准品：取0.1ml10,000pg/ml浓度的标准品于一新EP管中，加入0.9ml样品稀释液，反复颠倒。做上标记。c.配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品：准备6只Ep管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml。取0.3ml1000pg/ml浓度的标准品溶液，加入标记有500pg/ml的EP管中，反复颠倒混匀后同样取出0.3ml，加入标记有250pg/ml的EP管中。余同此类推，直到最后一只样品管。d.生物素标记抗RatTNF-α工作液：在使用前2小时内准备。根据每孔需要0.1ml计算总用量。按生物素标记抗RatTNF-α：抗体稀释液=1：99的比例配制工作液。轻轻混匀。e.ABC工作液的准备：在使用前1小时内准备。根据每孔需要0.1ml计算19 第2章材料与方法总用量。按ABC：ABC稀释液=1：99μ的比例配制工作液。轻轻混匀。（2）将配制好的ABC和TMB显色液应先在37℃中孵育30min以后。孵育后才可加入酶标板孔中进行下一步实验。（3）根据所需检测样本数及标准孔数量，确定酶标板孔数目，并预留1孔作为TMB空白显色孔。其余重包装好放如冰箱中。（4）将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中。其中1孔加稀释液作为零孔。酶标板胶封，37℃孵育90min。（5）轻柔甩去板中的液体，再次对着滤纸轻微拍数下。（6）将生物素抗RatTNF-α工作液依次加入各孔中：每孔0.1ml，TMB空白显色孔除外。37℃反应60min。（7）洗涤：0.01MPBS缓冲液×3次，每次浸泡约1min，每孔0.01MPBS缓冲液大于300ul。（8）将ABC工作液依次加入各孔中：每孔0.1ml，TMB空白显色孔除外。37℃反应30min。（9）再次洗涤：0.01MPBS缓冲液×5次，每次浸泡约2min，每孔0.01MPBS缓冲液大于300ul。（10）显色：TMB显色液已在37℃孵育30min。每孔依次加入90μl已孵育的TMB显色液，37℃避光孵育约25min。（11）终止显色：每孔依次加入TMB终止液0.1ml。注意：此时液体由蓝色变成黄色。（12）用酶标仪在450nm测定O.D.值。（13）根据标准品TNF-α浓度和测定的对应的O.D.值绘制标准曲线。（14）由标本O.D.值计算出相应TNF-α浓度。2.3.6.4注意事项：（1）在实验前，应将各种试剂管高速瞬时离心（时间根据管壁上有无固体/液体附着物而定），使试剂集中到管底。（2）避免96孔酶标板干燥。否则酶标板上生物成份活性会减弱。（3）为避免交叉污染，都需使用一次性无菌的Tip头和EP管。（4）禁止使用不同批次的试剂。（5）通常情况下，酶标板在恒温箱中孵育时，位于边缘的孔总是反应快/20 第2章材料与方法强一些。为尽量避免由于孵育时温度的不匀所带来的不良实验结果，故必须将已配制好的ABC和TMB显色液预热至37℃，时间一般大于3min。2.3.7统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差（xs）表示，采用单因素方差分析进行多样本均数比较，采用LSD-t检验进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。21 第3章结果第3章结果3.1细胞总RNA质量和浓度测定收集各组细胞沉淀后，按照TransZol试剂说明书提取细胞总RNA。本实验检测细胞总RNA的完整性及纯度采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测两组细胞总RNA的完整性。从图中可见三条RNA电泳条带：28S、18S和5S。其中28S和18S较明亮（目测：28S亮度大约是18S亮度的2倍），5S较暗（见图3.1）。三条带清晰边缘整齐。取2µl细胞总RNA加入去RNA酶水198µl，稀释100倍后于紫外分光光度计测定A26及A280值。两组细胞总RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0范围以内。图3.1细胞总RNA的完整性1、2泳道分别代表controlsiRNA对照组、PTENsiRNA干扰组3.2RT-qPCR扩增的特异性RT-qPCR特异性扩增可保证实验结果的可靠性。本实验运用融解曲线+琼脂糖凝胶电泳分析RT-qPCR产物的特异性。由融解曲线图可见：内参基因β-actin与目的基因PTEN、TNF-α三者融解曲线均呈锐利单峰，无杂峰。内参基因β-actinTm=84.16℃，目的基因PTENTm=80.88℃、TNF-αTm=88.01℃，说明PCR产物单一无非特异性。见图3.222 第3章结果2.0%琼脂糖凝胶电泳图：根据TransDNAMarkerI，RT-qPCR产物可观察目的基因的特异性。β-actin扩增目的DNA片段长度为101bp，PTEN扩增目的DNA片段长度为126bp，TNF-α扩增目的DNA片段长度为172bp。三条带清晰无杂带。结果显示RT-qPCR扩增为特异性扩增。见图3.2图3.2PCR扩增的特异性：内参基因β-actin和目的基因PTEN、TNF-α的琼脂糖凝胶电泳图及融解曲线图；琼脂糖凝胶电泳图：1、2泳道分别代表controlsiRNA对照组、PTENsiRNA干扰组，M：TransDNAMarkerI。23 第3章结果3.3BCA蛋白定量根据已知的标准样品（BSA）蛋白质浓度及所测出的相应的OD562值，制作蛋白标准曲线图。可知：y=3.1841x-0.3064，R²=0.9983，根据公式及所测的各样品OD562值可计算出样本蛋白的浓度。见图3.3图3.3左图：所测各孔OD562值及相对应的BSA蛋白质浓度；右图：BCA蛋白定量标准曲线3.4SYBRGreenIReal-TimeqPCR检测转染PTENsiRNA、ControlsiRNA后细胞内PTENmRNA表达变化，选择最佳转染浓度按说明书建议，分别选取10nM、20nM、40nM浓度的PTENsiRNA及controlsiRNA转染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，与对照组比较，干扰组PTENmRNA表达分别下调至（0.33±0.01）倍（*P<0.01）、（0.23±0.01）倍（*P<0.01）、（0.21±0.01）倍（*P<0.01）。见图3.424 第3章结果图3.43种不同浓度PTENsiRNA转染NR8383细胞后PTENmRNA相对表达变化。与对应的controlsiRNA相比较*P<0.01，n=3。3.5Westernblot检测转染PTENsiRNA、ControlsiRNA后细胞内PTEN蛋白表达变化，选择最佳转染浓度按说明书建议，分别选取10nM、20nM、40nM浓度的PTENsiRNA及controlsiRNA转染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，与相应的对照组比较，干扰组PTEN蛋白表达分别下调至（0.30±0.03）倍（*P<0.01）、（0.14±0.02）倍（*P<0.01）、（0.10±0.02）倍（*P<0.01）；在干扰组中，与10nM浓度比较，20nM、40nM浓度干扰后的NR8383细胞PTEN蛋白表达有统计学差异（#P<0.01）。20nM与40nM浓度比较，PTEN蛋白表达无统计学意义（P=0.08）（见图3.5）。综合RT-qPCR和westernblot结果，选取20nM为实验转染浓度。图3.53种不同浓度PTENsiRNA转染NR8383细胞后PTEN蛋白相对表达变化。与对应的controlsiRNA相比较*P<0.01；与10nM干扰组相比较#P<0.01；20nM与40nMPTENsiRNA干扰组比较无统计学差异P=0.08。n=3。25 第3章结果3.6下调PTEN对NR8383细胞靶蛋白AKT磷酸化水平的影响相对于controlsiRNA+LPS对照组p-AKT/AKT蛋白比值为（0.26±0.02），PTENsiRNA+LPS处理组表达量升高至（0.52±0.03）倍（*P<0.01），结果说明经过预先干扰处理后的NR8383细胞，LPS诱导后AKT磷酸化的表达上调。见图3.6图3.6PTENsiRNA转染NR8383细胞后对LPS诱导的AKT蛋白磷酸化水平的影响，*P<0.01，n=3。3.7下调PTEN后对NR8383细胞TNF-αmRNA相对表达的影响相对于controlsiRNA+LPS对照组TNF-αmRNA相对表达量，PTENsiRNA+LPS处理组表达量升高（1.56±0.18）倍（*P＜0.01），结果说明经过预先干扰后的NR8383细胞，LPS诱导后，较对照组而言TNF-αmRNA的相对表达量增高。见图3.7图3.7PTENsiRNA转染NR8383细胞后对LPS诱导的TNF-α转录水平的影响，*P<0.01，n=3。26 第3章结果3.8大鼠TNF-α蛋白标准曲线图ELISA法检测各标准孔OD450值与相对应的TNF-α蛋白浓度间存在一定的线性关系。本实验发现空白孔OD450值大于15.6pg/mlTNF-α蛋白浓度OD450值，表明空白孔与OD450值之间不存在线性关系。依据其它孔TNF-α蛋白浓度与相对应的OD450值制作TNF-α蛋白标准曲线图。可知：y=1034.5x-66.956，R²=0.9982。根据公式及其他样本孔所测的OD450值可得出TNF-α蛋白浓度。见图3.8图3.8左图：所测各孔OD450值及相对应的TNF-α蛋白浓度；右图：大鼠TNF-α蛋白标准曲线图3.9下调PTEN后对NR8383细胞上清液中TNF-α蛋白表达的影响根据各样品孔所测的OD450值及已计算出的大鼠TNF-α蛋白标准曲线图，得出：controlsiRNA+LPS对照组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1632.56±52.05pg/ml，PTENsiRNA+LPS干扰组细胞上清液TNF-α蛋白表达量为1834.07±57.00pg/ml（*P＜0.05），结果说明经过PTENsiRNA预先干扰后的NR8383细胞，LPS诱导后，TNF-α蛋白表达量升高。见图3.927 第3章结果图3.9PTENsiRNA转染NR8383细胞后对LPS诱导的TNF-α蛋白表达的影响，*P<0.05，n=3。28 第4章讨论第4章讨论脓毒症是一种全身性及有害的宿主对感染的免疫反应，可发展至严重脓毒症（合并有急性器官功能不全），如未及时得到有效的干预可进一步发展为感染性休克（严重脓毒症合并有经过液体复苏仍无法纠正的低血压伴组织低灌注）[31]。脓毒症患者往往是在严重的原发病（创伤、烧伤、急性重症胰腺炎等）基础上合并感染导致。尽管随着治疗手段及技术的进步，但脓毒症的病死率仍无法让人满意。据统计，美国每年约75万脓毒症患者，其中约21.5万患者死于脓毒症并发MODS[32]，而在我国每年大约有300万脓毒症患者，其中死亡的患者有100万左右[33]，脓毒症已成为良性疾病的主要死因。脓毒症并发急性肺损伤是导致脓毒症高死亡率的主要原因[34]，如果发生脓毒症时避免或减轻肺损伤的发生，将有助于提高脓毒症患者的成功救治率。ALI/ARDS是指由各种非心源性原因导致的肺毛细血管内皮和肺泡上皮损伤，血管通透性增高的临床综合征[35]。而在脓毒症肺损伤的发生发展过程中，肺组织中最多的非实质性细胞—肺泡巨噬细胞发挥着关键作用。在创伤、休克或内毒素等致病因素作用下AM首先被激活，数量亦迅速增加。当AM受到病原体或不同炎症介质的刺激时，通过识别PAMP来活化TLRs/NF-κB等炎症信号通路，导致大量炎症基因的转录活化—级联放大反应，失控性释放大量炎症因子，形成肺部炎症“瀑布”反应[36]。活化的AM在肺泡上皮细胞附近产生和释放TNF、氧自由基和一氧化氮等，对肺泡上皮产生损伤作用，因此，AM启动了肺组织原位的炎症反应过程，从而导致脓毒症肺损伤的发生。本实验所用的大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383来源于正常大鼠肺灌洗时的AM，具有AM的生物学特性，可运用于体外AM的相关研究。LPS为内毒素（endotoxin，ET）的主要成分，而ET是革兰氏阴性细菌的主要致病源。LPS分子包含三个基本亚单位：①O-多糖（或O-特异侧链）；②R-核心（或核心多糖）；③脂质部分。LPS的脂质部分可被酸性水解分离，A段是脂溶性部分，称为脂质A（lipidA）。而脂质A也是LPS主要的具有生物活性的成分。LPS能够激活单核/巨噬细胞，增强宿主多种炎症因子的合成与释放，是SIRS、脓毒症、ALI/ARDS等的主要病因之一。故本实验采用LPS诱导NR8383炎症反应来模拟脓毒症肺损伤模型。29 第4章讨论TNF-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急相反应的众多细胞因子中的一员。主要由巨噬细胞分泌，不过有一些其它类型的细胞也能产生。TNF-α的主要作用是调节免疫细胞的功能。作为一种内源性致热原，它能够促使发热，引起细胞凋亡，（通过诱使产生IL-1和IL-6）引发败血症，引起恶病体质，引发炎症，阻止肿瘤发生和病毒复制。研究表明，TNF-α是脓毒性休克时最早释放且起关键作用的介质，它启动脓毒症的炎症反应，并在发展过程中起放大作用，即所谓的免疫炎症的瀑布反应[37]。本人导师上一国家课题研究已证实LPS诱导的NR8383细胞炎症反应及大鼠脓毒症肺损伤的模型中，炎症因子TNF-α表达明显上调[38]，同时大鼠肺部病理图片显示呈ALI/ARDS改变。故本实验检测上清液中TNF-α蛋白的表达量，代表炎症反应的严重程度。目前脓毒症肺损伤的治疗方法主要是对症支持治疗：通过静脉注射单一的介质抗体或通过高容量血液滤过等手段，降低循环中的炎症介质，减轻SIRS[12,13,39]；采用保护性肺通气、肺复张、体外膜肺氧合（extracorporealmembraneoxygenation，ECMO）等方法以保证足够的肺通气和组织氧合，同时避免或减轻再次肺损伤；使用糖皮质激素、β2受体激动剂、呋塞米等药物来改善肺通气功能[40]。然而，由于脓毒症肺损伤早期明确诊断困难，实际中这些治疗方案对肺部的炎症反应抑制却不明显，对脓毒症肺损伤的保护作用有限。因此，探索新的脓毒症肺损伤的救治手段迫在眉睫。PTEN是于1997年Li等[14]首次发现的具有磷脂酶活性及抑癌作用的基因。近些年PTEN的研究主要集中在肿瘤领域，发现其可通过诱导细胞凋亡、抑制细胞周期、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、抑制肿瘤血管形成、维持免疫系统的稳定性等发挥其抑癌作用[41]。PTEN可通过磷脂酶活性使PIP3脱磷酸形成PIP2，抑制PI3K-AKT信号通路。当PTEN活性增强时，PI3K-AKT通路减弱；而当PTEN活性减弱时，PI3K-AKT通路则增强[42]。本研究也已证实，在LPS诱导的NR8383炎症反应中下调PTEN，细胞内AKT的磷酸化水平表达上调了（2.07±0.24）倍。因此，PTEN是PI3K-AKT信号通路中的一个重要的分子开关。近些年来，国内外陆续开展了有关PTEN与炎症关系的研究。在哮喘小鼠模型的研究中发现，PTEN可通过使脂质信号分子PIP3去磷酸化以抑制PI3K活性[43]。有研究表明，PI3K抑制剂能抑制微生物产物、炎性产物和多种趋化剂诱导的白细胞趋化[44,45]。同时，Kwak等[46]研究发现，PTEN蛋白的表达和活性在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）-诱导的哮喘豚鼠模型肺组织中降低，而支气管内应用携带30 第4章讨论PTENcDNA的腺病毒（AdPTEN）后，哮喘鼠支气管肺泡灌洗液（BronchoalveolarLavageFluid，BALF）液中IL4、IL-5和嗜酸细胞阳离子蛋白（eosinophiliccationicprotein，ECP）水平下调，气道炎症减轻。因此作为PI3K主要的负调控分子，PTEN具有一定的抗炎作用并有望成为治疗哮喘的有效靶分子[47]。PI3K-AKT信号转导通路激活后，活化的AKT（p-AKT）通过增强NF-κB抑制蛋白IκB激活主要是IκBα的磷酸化、降解，继而导致NF-κB的活化[48]。近些年来，随着分子生物学及其他相关学科的不断发展，PTEN在炎症及免疫系统方面的研究越来越深入，PTEN不仅可通过抑制嗜酸性粒细胞趋化和炎症介质释放在支气管哮喘中发挥着重要作用，亦可抑制中性粒细胞活性在其他炎症性疾病中起到抗炎作用，并可维持免疫系统稳定。RNAi是指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默。含21～23个碱基的单链或双链RNA即siRNA，可以通过RNA干扰高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。siRNA通过与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、螺旋酶）结合形成沉默复合体(theRNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC在siRNA的反义链介导下，特异性的识别和降解目标mRNA。SiRNA与目标mRNA靶位点的结合是一个遵循Waston-Crick碱基互补配对原理的高度序列特异的过程。一旦结合，目标mRNA将会在siRNA与目标mRNA结合处的中点裂解，从而诱导特异序列的转录后沉默。SiRNA不仅可用于研究基因功能，而且还可作为一种高效、特异、靶向性治疗手段应用于阻断致病基因[49]。本研究已证实不同浓度的PTENsiRNA转染入NR8383细胞都可以有效下调PTENmRNA及PTEN蛋白的表达。10nM、20nM、40nM三种干扰浓度，细胞中PTENmRNA表达分别下调至（0.34±0.01）倍、（0.23±0.01）倍、（0.21±0.01）倍，细胞中PTEN蛋白表达分别下调至（0.30±0.03）倍、（0.14±0.02）倍、（0.10±0.02）倍，干扰有效可以进行下一步实验。综合本实验结果：在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中，PTENsiRNA能够促进炎症因子TNF-α的产生，并上调AKT磷酸化水平的表达；并依据文献报道：TNF-α的释放主要是依赖NF-κB的活化，并且PTENsiRNA通过促进PIP2向PIP3转化靶向调控PI3K-AKT信号通路，进一步能够促进NF-κB的活化，增强TNF-α的产生。由此推测PTENsiRNA可能通过PI3K-AKT信号通路来促进肺泡巨噬细胞炎症因子的释放。以此我们可以通过上调PTEN的表达是否降低31 第4章讨论脂多糖诱导肺泡巨噬细胞炎症因子的释放，抑制肺内炎症反应，减轻肺损伤，实现对脓毒症肺损伤的保护作用有待进一步实验研究。32 第5章结论与展望第5章结论与展望5.1结论PTENsiRNA转染NR8383细胞后，通过上调细胞中AKT蛋白磷酸化水平，促进LPS诱导的NR8383细胞炎症反应，增强细胞释放炎症因子TNF-α。因此，在NR8383细胞炎症反应中，PTENsiRNA可能通过上调PI3K-AKT信号通路，来促进LPS诱导的炎症因子的产生。我们推测PTEN参与调控了LPS诱导的NR8383炎症反应。5.2进一步工作的方向本实验研究检测到在脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞NR8383细胞炎症反应模型中，用PTENsiRNA转染细胞后，可上调AKT磷酸化水平，能增强炎症因子的释放。但PTENsiRNA在体内实验-脓毒症肺损伤模型中是否有致炎作用，以及是否依赖于p-AKT的表达上调还未明确。PTENsiRNA在肺泡巨噬细胞炎症反应中的致炎作用是否只依赖于p-AKT的表达上调，还是有其他炎症信号通路还有待进一步研究。由于时间有限，未能研究上调PTEN蛋白可否会减弱脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。本实验研究只是部分体外实验，具有一定局限性，待条件及时间允许可进一步完善体内及体外试验。33 致谢致谢值此论文完成之际，谨向所有给予我关心、帮助和指导的老师、同学、朋友及家人表示最诚挚的谢意。首先由衷地感谢我尊敬的导师——钱克俭教授，无论是在科研、临床还是生活上，导师都给予了我耐心细致的指导和无微不至的关怀，尤其在课题的设计、实施和论文撰写过程上都凝聚着导师的心血。导师渊博的知识、严谨的科学态度、求实的治学作风、忘我的工作精神，精湛的医术和崇高的医德都将是我一生学习的楷模。三年来导师对我的谆谆教诲和精心培养，将使我受益终生！再次衷心地感谢尊敬的老师曾振国副教授，多年来他对我的成长倾注了无尽的心血，不仅在科研及临床方面给予我悉心的指导与帮助，更是在做人方面给予我教育与启迪！感谢南昌大学生化教研室揭克敏教授、罗达亚教授、黄春洪教授、朱伟峰老师、颜念龙老师、涂硕老师及其他老师对课题的指导和实验上的帮助。感谢南昌大学第一附属医院重症医学科刘芬老师、聂成老师及其他老师和同事，他们敏捷的科研思路，丰富的实验经验，严谨的工作作风，忘我的工作热情使我受益匪浅。在这个优秀的集体中，我时刻都能感受到集体的团结与温暖。感谢南昌大学基础医学院公共科研平台，及感谢熊睿老师对我实验的指导及帮助。感谢南昌大学第一附属医院烧伤研究所郭菲老师对实验技术上的帮助。感谢南昌大学第一附属医院泌外研究所娄远蕾老师对实验相关指标检测上的帮助。感谢师兄丁成志、邵强、卿城，师姐黄彩雪，师弟胡志国、彭菲，师妹赵宁、王燕。感谢我的同学卢洪飞、赵浩、王蒙蒙和乐贞，还有我的室友及其他同学，感谢你们给予我无私的帮助，感谢你们在我最无助仿徨的时候给我鼓励，这种纯真的友谊我将永记在心!本研究经费由国家自然科学基金（81160233）资助，在此特别表示感谢！邓文刚2015年5月34 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参考文献[49]RaoDD,VorhiesJS,SenzerN,etal.siRNAvs.shRNA:similaritiesanddifferences[J].AdvDrugDelivRev,2009,61(9):746-759.38 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果1、已发表的论文：[1]曾振国,钱克俭,刘芬,李勇,黄彩雪,邓文刚.胞浆内线粒体DNA在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞炎症反应时的变化[J].南昌大学学报(医学版),2014,54(1):4-6,26.[2]聂成,刘芬,曾振国,詹以安,邓文刚,卿城,邵强,丁成志,揭克敏,钱克俭.转染miR-146a对肺泡巨噬细胞中核因子-κB表达的影响[J].广东医学,2014,35(18):2814-2816.2、参加的科研项目：国家自然科学基金项目（No.81160233）：miR-21调控PTEN基因对脓毒症小鼠肺保护作用的实验研究。39 综述综述PTEN与肺部疾病的研究进展邓文刚综述钱克俭审校第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphataseandtensinhmmlogydeletedonten，PTEN）是人类发现的第一个具有磷酸化酶功能的抑癌基因，在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面都起着重要的调控作用。本文就PTEN的发现、结构、功能及其与在肺部疾病的作用等作一综述。1.PTEN的发现1997年，Li等[1]采用代表性差别分析法在2个浸润性乳腺癌移植瘤中发现了10q23染色体特定区域的纯合性缺失，并分离出一种新的基因，开放阅读框架（openreadingframe，ORF）序列分析揭示了它可能编码蛋白质酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase，PTP），且与张力蛋白、辅助蛋白有大片同源区，因此将其命名为与细胞骨架蛋白tensin同源在10号染色体有缺失的磷酸酯酶。同年，美国另外两个研究小组亦克隆到亚定位于10q23.3，多种进展期癌均有突变的基因称之为MMAC1（mutatedinmultipleadvancedcancer1）和受TGF2β（transforminggrowthfactor2β）调节、上皮细胞富含的磷酸酶基因TEP1（TGF2βregulatedandepithelialcell2enrichedphosphatase），在比较三者cDNA及编码的蛋白质后将其归为同一基因[2,3]。2.PTEN的结构及功能PTEN定位于10q23.3，由9个外显子、8个内含子组成，全长200kb，信使RNA（mRNA）长度为5500bp。PTEN基因是迄今发现的惟一具有蛋白脂酶和磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN编码的蛋白产物由403个氨基酸组成，相对分子质量4.7×104，具有双特异性磷酸酶活性，包括一个N端磷酸酶区域，一个与脂质结合的C2区域和一个由50个氨基酸组成的C端区域。PTEN的N端有一段与细胞张力蛋白、辅助蛋白同源的序列，含175个氨基酸，为主要结构功能区。40 综述不仅可使蛋白质分子中的酪氨酸或丝苏氨酸残基脱磷酸，而且还能作用于磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸肌醇环上的D3位点，使之脱磷酸，在多种信号通路和细胞周期中发挥作用。C端由50个氨基酸组成，也是易突变区域，缺失会降低PTEN的稳定性，使PTEN失去磷酸酶活性。C2结构域与细胞膜相互作用，PTEN借此连接到磷酸质膜上，从而介导许多重要的细胞内过程，包括膜运输、产生纸质第2信使、活化GTPase、调控蛋白质磷酸化等[4]。PTEN编码双重底物特异性磷酸酶，具有脂质磷酸酶活性，并可通过其脂质磷酸酶活性催化磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol4,5-triphosphate，PIP2）与磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PIP3）脱磷酸化，从而拮抗磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）活性，降低细胞内PIP3浓度，进一步抑制蛋白激酶B（proteinkinaseB,PKB,又名AKT）激活[5]，PI3K/PIP3/AKT信号途径与PTEN的动态平衡的紊乱可导致肿瘤的发生[6]；同时PTEN也可通过蛋白磷酸酶活性调节细胞的转移与粘连[7]。PTEN还具有蛋白磷酸酶活性。PTEN能使它自身、聚集黏附激酶（focaladhesionkinase，FAK）、SHC和由生长因子受体衍生的血小板脱磷酸。FAK与细胞持续性的定向迁移有关，SHC与细胞的随机迁移有关。此外，PTEN尚可通过抑制FAK、MAPK信号通路[8]，影响p53/MDM2、NF-κB信号通路[9]；拮抗PRAP/mTOR信号通路[10]等调控细胞增殖、分化、生存、迁移并抑制凋亡。当然，PTEN亦受到多种其他因子的调控，包括NEDD4-1通过泛素化蛋白体降解途径调节PTEN[11]，BMP通过RAS/ERK信号通路抑制PTEN表达[12]，IGF-1可以通过抑制PTEN磷酸化，激活PI3K/AKT，在肿瘤发生中发挥着重要作用[13]。3.PTEN与肺部疾病3.1PTEN与肺癌大量研究发现，PTEN蛋白低水平表达与NSCLC（non-smallcelllungcancer）的分化、临床分期、淋巴结转移、及预后密切相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型、及吸烟指数无关。李艳等[14]研究发现PTEN在正常组织、癌前病变、原发性肺癌、淋巴结转移性肺癌中的阳性率分别为90.0％、66.7％、44.9％和25.0％，呈逐渐降低趋势，原发性肺癌中PTEN阳性率显著低于正常组（P<0.05）。说明PTEN在肺癌发展过程中的表达缺失率呈1种逐渐升高的进行41 综述性变化趋势，逐渐丧失其抑癌功能。目前，许多研究显示PTEN基因突变、缺失或表达产物的失活，影响肺癌的发生、发展。Hosoya等[15]对30例进展期肺癌患者的原发部位、转移部位及正常组织中的PTEN变异进行了研究，该研究发现，总的等位基因的缺失率达33.3％（7/21），在每例患者中，原发部位和转移部位等位基因的缺失是完全一致的，而且等位缺失发生在肿瘤转移之前。近来的研究发现PTEN表达水平的高低与肿瘤病人的病理分级及预后有关，病人预后越差、恶性程度越高，其PTEN表达水平越低。3.2PTEN与肺部慢性炎症疾病PTEN在炎症中的作用研究多集中在其对呼吸道慢性炎症-支气管哮喘致病过程中所起的保护作用上[16,17,18]。支气管哮喘的主要特征是呼吸道嗜酸性粒细胞增加，杯状细胞增生，粘液分泌增加，对吸入性抗原及非特异性刺激的高敏感性。嗜酸性粒细胞聚集及支气管组织的活化在支气管哮喘的病理生理过程中发挥了重要作用。研究显示，多种炎症介质通过PI3K信号通路募集及活化嗜酸性粒细胞。在哮喘小鼠被抗原激活的呼吸道上皮细胞，PTEN的标书减少。注入PI3K激酶抑制剂或携带PTEN的腺病毒（AdPTEN）显著减轻了嗜酸性粒细胞的水平及炎症的发生。其可能通过阻止PI3K的活性，抑制嗜酸性粒细胞脱颗粒剂白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5在呼吸道的聚集，从而减少变应原刺激引起的炎症及呼吸道高敏性。研究显示，血管内皮生长因子也在支气管哮喘中发挥了重要作用，PI3K参与血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）介导的信号通路。体内试验发现，变应原诱导的呼吸道炎症导致小鼠肺组织PI3K活性增高，呼吸道炎症细胞数量增加，呼吸道高反应性，IL-4、IL-5、IL-13、细胞间粘附分子、VEGF等水平升高。注射PI3K抑制剂或携带有PTEN的腺病毒可减少哮喘症状，减少渗出和肺组织VEGF的表达。提示，PTEN可减少VEGF的表达，从而减弱变应原诱导的呼吸道炎症[19,20,21]。Lee等报道过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ，PPARγ）可增强PTEN的表达，从而参与炎性细胞中PI3K通路的调节。注入PPARγ促进剂及携带PPARγcDNA的腺病毒，可是哮喘小鼠肺部PTEN表达增高，与Akt活性减弱相关，说明PPARγ可通过上调PTEN表达在哮喘的病理过程中起到保护性作用[22]。国内动物实验研究发现，气道上皮细胞是PTEN主要表达细胞，哮喘大鼠42 综述PTEN蛋白表达明显减少，PTEN可减少Th2细胞因子的表达，从而影响Thl/Th2细胞因子的平衡状态[23]；研究发现地塞米松可通过上调PTEN的表达而控制哮喘发作，这可能为地塞米松抑制哮喘气道炎症形成的重要作用机制[24,25]。多项体外实验发现，上调PTEN表达能有效抑制人气道平滑肌细胞的增殖，可能主要是通过抑制P13K-AKT信号转导途径而起作用的[26]。综上所述，PTEN可能在控制过敏性炎症的发生中起着重要作用。3.3PTEN与肺部急性炎症疾病PTEN在肺部急性炎症反应中的具体作用还未明确。有研究证实，PTEN可通过影响NF-κB来调节炎症反应[27]。在内毒素刺激的情况下内皮细胞中的PTEN基因表达上调，通过对PI3K的拮抗作用下调了AKT基因的表达，由于AKT基因可以负向调节NF-κB的表达，因此下调AKT基因的表达会导致NF-κB基因表达的上调。NF-κB是重要的炎症调节基因，它表达的上调增加了内皮细胞中炎症因子的表达，从而加重和放大了炎症反应的过程。由于内皮细胞受损、内皮细胞屏障功能障碍，导致肺组织充血、水肿，导致急性肺损伤的发生。不同种类的细胞在内毒素刺激下，PTEN表达差异较大。在成纤维细胞系PTEN呈剂量时间依赖性增高，而在单核巨噬细胞系PTEN表达却无明显变化[28]。另一方面，Li等[29]研究显示，特异性敲除小鼠髓系来源细胞的PTEN基因后，当发生肺炎时，中性粒细胞趋化作用明显增强，凋亡效应有所延迟、细菌杀伤能力增强，进一步证实了PTEN可通过使PIP3去磷酸化调控中性粒细胞功能。Vasudevan等[30]发现NF-κB能通过p65抑制共转录激活因子CBP（CREBbindingprotein）/p300来下调PTEN的表达，从而抑制由TNF（Tumornecrosisfactor）引起的细胞凋亡。PTEN在肺部急性炎症反应甚至在其他部位的作用还需进一步的实验来完善及证实。4.小结长期以来，PTEN因其在抑制恶性肿瘤方面的重要作用成为研究的热点。近几年，PTEN在肺部组织及相关肺部疾病的作用也逐渐被人们所重视。人们发现，在许多肿瘤中都存在着PTEN的缺失和突变。而且PTEN在不同肿瘤中的突变率，突变方式不同，在同种肿瘤的不同分化型，不同分化程度中也不同，PTEN蛋白表达水平的高低与病人的病理分级及预后有关。PTEN通过不同的途径调节43 综述细胞的生长、分化、凋亡、转移及浸润。此外，随着分子生物学及其他相关学科的不断发展，PTEN在炎症及免疫系统方面的研究越来越深入，PTEN不仅可通过抑制嗜酸性粒细胞趋化和炎症介质释放在支气管哮喘中发挥着重要作用，亦可抑制中性粒细胞活性在其他炎症性疾病中起到抗炎作用，并可维持免疫系统稳定。总之，PTEN作为一个可能的靶点，将为医学者们治疗肺癌及肺部炎症性疾病提供一个新的思路。参考文献：[1]LiJ,YenC,LiawD,etal.PTEN,aputativeproteintyrosinephosphatasegenemutatedinhumanbrain,breast,andprostatecancer[J].Science,1997,275(5308):1943-1947.[2]SteckPA,PershouseMA,JasserSA,etal.Identificationofacandidatetumoursuppressorgene,MMAC1,atchromosome10q23.3thatismutatedinmultipleadvancedcancers[J].NatGenet,1997,15(4):356-362.[3]LiDM,SunH.TEP1,encodedbyacandidatetumorsuppressorlocus,isanovelproteintyrosinephosphataseregulatedbytransforminggrowthfactorbeta[J].CancerRes,1997,57(11):2124-2129.[4]MyersMP,PassI,BattyIH,etal.ThelipidphosphataseactivityofPTENiscriticalforitstumorsupressorfunction[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(23):13513-13518.[5]CantleyLC,NeelBG.Newinsightsintotumorsuppression:PTENsuppressestumorformationbyrestrainingthephosphoinositide3-kinase/AKTpathway[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(8):4240-4245.[6]ZhangLL,MuGG,DingQS,etal.PTENrepressescoloncancerprogressionthroughinhibitingpaxillintranscriptionviaPI3K/AKT/NF-kBpathway[J].JBiolChem,2015Apr14.[7]TamuraM,GuJ,MatsumotoK,etal.Inhibitionofcellmigration,spreading,andfocaladhesionsbytumorsuppressorPTEN[J].Science,1998,280(5369):1614-1617.[8]TamuraM,GuJ,DanenEH,etal.PTENinteractionswithfocaladhesionkinaseandsuppressionoftheextracellularmatrix-dependentphosphatidylinositol3-kinase/Aktcellsurvivalpathway[J].JBiolChem,1999,274(29):20693-20703.[9]FreemanDJ,LiAG,WeiG,etal.PTENtumorsuppressorregulatesp53proteinlevelsandactivitythroughphosphatase-dependentand-independentmechanisms[J].CancerCell,2003,3(2):117-130.[10]HanX,JiY,ZhaoJ,XuX,etal.ExpressionofPTENandmTORinpancreaticneuroendocrinetumors[J].TumourBiol,2013,34(5):2871-2879.44 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