磷脂转运蛋白低表达对巨噬细胞炎症因子的表达的影响及分子机制

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圆硕士学位论文IIIIIIIIMIIUIIIWF2809090论文题目：磷脂转运蛋白低表达对巨噬细胞炎症因子的表达的影响及分子机制作者姓名：刘帅学科、专业：病理学与病理生理学学位类型：科学学位研究方向：脂质代谢与动脉粥样硬化指导教师：秦树存教授入学时间：2010年9月论文工作起止时间：2011年7月～2013年2月 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·5符号说明⋯⋯·—1上．—jL-刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··14结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··40讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·42结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·45附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·46参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·53综j苤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··57致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·69原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“ ＼㈣嬲磷脂转运蛋白低表达对巨噬细胞炎症因子表达的影响及分子机制研究生：刘帅专业：病理学与病理生理学导师：秦树存教授中文摘要目的炎症(inflammation)在人类多种重要疾病的发生和发展过程中起着关键的作用。巨噬细胞(macrophage)作为一种免疫细胞，在炎症的多个环节起到重要作用。核转录因子r．B(nucleusfactorkappa-B，NFrB)是巨噬细胞参与的炎症信号通路中最重要的转录因子之一，它的激活能引起多种炎症因子如白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactorQ，TNF一伐)等表达升高。磷脂转运蛋圭t(phospholipidtransferprotein，PLTP)参与炎症发生发展过程，PLTP能结合、转运以及中和脂多糖(1ip．polysaccharide，LPS)，PLTP缺乏dx鼠(PLTP-／一)在致死剂量的内毒素血症时血浆炎症因子表达升高，器官损伤加重，死亡率增加。该过程中高表达的炎症因子均受NFr．B调控，且在巨噬细胞内均有表达，提示上述炎症因子表达升高很可能与巨噬细胞NFr．．B激活相关。本研究拟采用多种巨噬细胞为模型，探讨PLTP低表达或不表达对LPS刺激的影响及可能的分子机制。方法1、小鼠繁育，PLTP敲除杂合子为亲代，繁育出子代经基因型鉴定得到纯合子PLTP．／．及同窝出生野生型小(wildtypemic，WT)。从中选取雄性WT和PLTP-／．各8只。2i小鼠第八周龄时，提取LPS诱导的腹腔巨噬细胞，分离骨髓进行原代培养，并添加含集落刺激因子的Lcell培养基进行诱导。培养十天左右，骨髓源性巨噬细胞(bonemalTOWderivedmacrophage，BMDM)诱导完成。3、培养巨噬细胞模型RAW264．7、人脐静脉上皮细胞(Humanumbilicalveinepithelialcell，HUVEC)，分为三组分别为空白组(标记为blank)、对照组(标记为ControlsiRNA)和实验组(标记为PLTPsiRNA)。 4、将WT和PLTP．／．BMDM两种细胞分别在不同的时间段(分别为0．5h，lh，2h)给予LPS(浓度为200ng／m1)刺激。5、将PLTPsiRNARAW264．7在不同的时间段(分别为O．5h，lh，2h)给予LPS(浓度为200ng／m1)刺激。6、将PLTPsiRNAHUVEC在不同的时间段(分别为O．5h，lh，2h)给予TNF-0【(浓度为20ng／m1)刺激。7、WesternBlot检测与NFr．B信号通路相关蛋白；NFr．_B活性亚单位p65、胞浆内抑制亚单位Iv／3．a、信号转导及转录激活因子3(Signaltransducersandactivatorsoftranscription3，STAT3)及其磷酸化蛋f兰t(pSTAT3)、转录生长因子激酶1(transformgrowthfactoractivatedkinase1，TAKl)及其磷酸化蛋白(pTAKI)，核蛋白内参H3以及胞浆蛋白内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)。8、实时荧光定量PCR(Real．Time．PCR)技术检测细胞中相关炎症因子IL．6、IL一10、TNF．a和干扰素．7(interferon．Y，IFN一7)mRNA的表达。9、酶联免疫吸附法(enzyme．1inkedimmunosorbentassay)检测BNDM培养基中IL．6、IL．10、TNF．a和IFN．Y‘含量。10、免疫荧光染色技术检测核蛋白‘p65转位。结果1、LPS刺激下腹腔巨噬细胞及原代巨噬细胞炎症因子表达的实验结果；(1)PLTP-／．腹腔巨噬细胞炎症因子IL．10、IFN吖、TNF．Q和IL．6的mRNA的表达均较WT显著升高(尸O．05)。(3)PLTP．／．BMDM培养基中炎症因子表达较WT均有所升高：IL．10和TNF—c【升高198．5％(P0．05)。2、LPS刺激下WT和PLTP．／．BMDM及LPS刺激下PLTPkonckdownRAW264．7p65和Ir．_B—a结果；(1)BMDM核内p65含量，PLTP一／一较WT增加30．5％(P<0．05)。(2)BMDM胞浆内Ir．B—a含量，PLTP．／．较WT减少34％(P<0．05)。2 (3)RAW264．7核内p65含量，PLTPsiRNA组较controlsiRNA组增加200％(P<0．05)。(4)RAW264．7胞浆内Ir．B—Gt含量，PLTPsiRNA组较controlsiRNA组减少43％(P<0．02)。3、TNF．Q诱导的HUVECp65和Ir．B．0【结果(1)HUVEC核内p65含量，PLTPsiRNA组较ControlsiRNA组增加54％(P<0．05)。(2)HUVEC胞浆内Ir．_B．a含量，PLTPsiRNA组较ControlsiRNA组减少351．2％P0．05)，nostatisticalsignificance．(3)PLTP-／-BMDMinflammatoryfactorsarehigherthanWT：IL-10andTNF·qarehigherthanWTby198．5％(尸0．05)，nostatistical6 significance．2PLTPdeficiencyenhancednucleartranslocationofNFKBinBMDMandLPSinducedNFKBactivationwasenhancedinPLTPknockdownRAW264．7(1)ThecontentofBMDMnuclearp65，PLTP-／一VSWTincreases30．5％(尸2．0说明提取的RNA有降解。(12)根据所侧得的RNA浓度，将每个样本的RNA均使用DEPC水稀释成相同浓度，以便用于今后的实验。2．2．2QuantcDNA第一链合成试剂盒合成eDNA注意事项；用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能的用DEPC处理，并在高压灭菌后使用，有些试剂不能进行高压灭菌时，首先用经过高压灭菌的器具、水等配置溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理；RNA样品要避免基因组DNA污染；避免反复冻融RNA；试剂盒的各组成分应在．20"(2保存；cDNA产物应在．20℃保存。(1)将模板RNA在冰上解冻，引物、10xRTmix(其中包含RNasin和DTT)、超纯dNTP混合液、RNase—freeddH20在室温(15—25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留管壁上的液体。(2)取29L总RNA用于反应体系，若反应体系为20pL，则加入RNA模板的体积不能超过13pL。(3)按照以下体系混合；成分10×RTmixdNTP混合液Random体积21xL29L 反转录酶1HL模板RNAXlxL加RNAase．free水至总体积为20I_tL(4)按以上反应体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5秒种，简短离心并置于冰上(如下游进行荧光定量PCR实验，使用10I．tL逆转录反应体系)。(5)37。C孵育60min。(6)将逆转录的产物进行后续PCR反应和荧光定量PCR反应。2．2．3实时荧光定量PCR2．2．3．1实时荧光定量PCR反应原理实时荧光定量PCR是目前应用非常广泛的一种实验技术，在PCR反应体系中加入荧光集团，实时荧光定量PCR仪能够利用对荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过标准曲线对未知模板精确定量分析或不同模板间的相对量的比较的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个十分重要的概念就是Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值代表每个反应管体系内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数。它的大小取决于目的模板的数量，每个模板的Ct值与该模板的其实数目的对数存在线性关系，其实越多，Ct值越小，也就是Ct值越小，起始模板数量就越多。．该试剂盒使用的是SYBR荧光染料，在PCR反应体系中，加入SYBY荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，才能发射荧光信号，而不掺入DNA链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加相对应。2．2．3．2引物浓度将引物溶于DEPC水，使其浓度为2I．tmol／L，以使其在后续的实时荧光定量反应体系里引物浓度为200I．tmol／L，能够与试剂盒的要求向符合。2．2．3．3PCR反应(1)反应体系成分10斗L2．5XRealMASterMix／SYBRsolution4．5pL26 上游引物下游引物模板去离子水(2)反应条件1lxL1lxL1“L2．51xL①95℃，预变性5min；②95℃，变性30秒：③68℃，退火20秒；④72℃，延伸20秒：⑤步骤2—4重复40．45个循环；(3)结果计算各组目的基因与内参基因的Ct值由计算机自动生成，计算各组目的基因与内参基因的差值△Ct值，再计算出实验PK组与对照WT组ACt值的差，即为aACt值，求其2的．AACt次方，即为实验PK组目的基因相对于对照WT组目的基因的量的比值，然后用相应的作图软件做成柱形图即可。、2．3蛋白免疫印迹技术(Westernblot)检测蛋白质含量2．3．1蛋白提取(1)按照实验所用试剂盒说明书配制工作液；即RIPA／1ml加入10Mlpmsf。(2)用PBS将细胞洗1．2遍，尽量用枪将PBS吸干净，以免影响裂解液的作用。(3)按照六孔板每孔细胞量加入150．2501aL裂解液，培养瓶(瓶底面积250cm2)加入500．75011L裂解液的标准加入裂解液裂。(4)将六孔板或培养瓶置于冰上，用枪反复吹打数下，使裂解液与细胞充分接触，肉眼观察裂解液变浑浊或镜下观察细胞都滑落下来时停止吹打，转移至1．5ml离心管中冰浴至少30rain。(5)4。C，12000rpm离心30min。(6)取上清至新的1．5mlEP管中，4"C暂时保存，如需放置较长时间应保存．20℃。2．3．2BCA法蛋白浓度测定(1)配制BCA工作液：根据标准品和样品的数量，按照BCA试剂与Cu27 试剂体积比为50：1的比例配制工作液，是他们两个充分混匀(开始肯呢个会有浑浊现象，但充分混匀后浑浊就会消失)，已配好的工作液室温可以放置24小时。(2)稀释标准品：取10斗L标准品BSA用试剂盒中的PBS稀释l0倍，终体积为100“L，BSA终浓度为O．5mg／ml。将稀释后的标准品按0、21．tL、41xL、61．tL‘,81aL、121,tL、161,tL、209L加到96孔板中，再依次向上述孔中加入209L、181．tL、16“L、141,tL、129L、81．tL、4p,L、01．tL的PBS补足至体积为20pL。(3)重复第二步，再做一条标准曲线。(4)稀释样品：根据以往的经验或参考文献，将提取的蛋白稀释一定的倍数(如4倍、8倍、16倍等)。由于吸取的量比较小，为了最大限度的减少误差，先加样品再加稀释液PBS，不要用枪吹打。标准曲线前面的点可能不是很准确，所以极可能的让样品点落在标准曲线后1／2部分。(5)想每个孔中加入2001,tLBCA工作液，37"C孵育25—30min(以标准曲线和样品的颜色变化为依据定时间的长短)。(6)若使用温箱孵育为放置液体蒸发造成测量误差，要用密封膜将实验所用孔密封起来。2．3．3蛋白样品处理(1)调浓度：首先，用酶标仪侧得蛋白在562nm波长下标准品和样品的数值，通过标准曲线计算出蛋白的实际浓度，将蛋白浓度调整一致，并保证在后续的电泳上样中每孔的最大上样量小于等于20pL，蛋白量在l5—30mg。(2)蛋白变性：将调整好浓度的蛋白样品和4×蛋白上样缓冲液按照体积比3：l的比例混合均匀，煮沸变性5．10min。(3)冷却后．20"C短暂保存或．70℃长期保存。2．3．4注意事项(1)在加入裂解液前一定要加入PMSF(RIPA：PFSF=10：1)，也可以加入PI(蛋白酶抑制剂，终浓度100lxmol／L)。(2)提蛋白的整个过程一定要在冰上进行，以防止蛋白的降解。(3)在加入RIPA的混合液时要根据细胞的数量而定，以免造成蛋白浓度过低。(4)不同的玻璃板所容纳的样品的体积不同，为了上样时样品溢出，28 一般上样量在25ul以下。(5)因蛋白酶抑制剂具有毒性，在整个操作的过程中要带手套和口罩。(6)蛋白煮沸变性时EP管盖子有可能压力过大被打开，所以在向EP管中加样品时良不要过多，最多不要超过lml。2．3．5Westernblot实验相关试剂的配置(1)10％过硫酸胺(AP)：用微量电子称称取AP0．19，用去离子水溶解后，4"C保存备用，最大期限为一周。(2)电泳缓冲液：Tris—base39，甘氨酸14．49，SDSlg，加去离子水至1L，磁力棒搅拌器助溶后，室温保存，电泳缓冲液可以重复使用2．3次(注意；SDS分子量小，量轻易扩散，称取时一定要戴手套和口罩)。(3)电转缓冲液：甘氨酸14．49，Tris．base3．99，去离子水800ml溶解后再加入甲醇200ml，至终体积1L，溶解后4"C避光保存(切记不要在甘氨酸和Tris．base未溶解前加入甲醇，会造成这两种物质难以溶解)。(4)TBST溶液；把购买的20xTBS稀释成为1×后，每500ml加入Tween一200．5ml。(5)封闭液：用1xTBST配制10％的脱脂奶粉，用于封闭抗原。(6)分离胶的配制(单位：“L)：试剂8％(5m1)10％(5m1)12％(5m1)去离子水2375202517004×分离胶缓冲液125030％丙烯酰胺混合液132516752000lO％过硫酸胺‘50TEMED4(7)浓缩胶的配制(单位：“L)；试剂5ml10ml去离子水114722944×分离胶缓冲液500100030％丙烯酰胺混合液333666 10％过硫酸胺TEMED2024042．3．6电泳2．3．6．1灌胶(1)将1．0mm厚的带下两个玻璃板对齐后放入玻璃夹中加紧(小玻璃板在内，大玻璃板在外)，垂直向下卡在架子上，两玻璃板的低端对齐，防止漏胶。(2)根据所用胶的浓度按上面的配方配分离胶，TEMED为促凝剂，所以要在最后加，加上快速混匀后立即灌胶。(3)然后用蒸馏水封胶(用枪加水时一定要缓慢，否则会造成分离胶的液面不平，影响电泳)，待分离胶充分凝固后(约30min)将水倒掉，用吸水纸吸干净水。(4)根据所用胶的浓度按上面的配方配浓缩胶，快速混匀后立刻灌胶，插上梳子(注意一定要将梳子垂直慢慢的插入玻璃板内，不要产生气泡)，约30min凝固。2．3．6．2上样电泳(1)将玻璃夹放入电泳槽，拔掉梳子(一定要双手均匀用力垂直向上慢慢拔，否则会最坏浓缩胶)。(2)上样：Marker3p,L，样品每孔201xL(要用109L的枪加样)。(3)电泳：盖好盖子(注意电极千万不能反了⋯红对红，黑对黑)，设置为恒压80V，电泳约20．30min，待样本跑完积层胶后，将电压调至160V，继续电泳(电泳时间以溴酚兰跑到分离胶的底端为止)。2．3．6．3转膜(1)准备物品：提前30min4。C预冷1×电转液、海绵垫和滤纸各两张(均用电转液浸泡)、PVDF膜、玻璃棒、玻璃皿、甲醇、剪刀、尺子等。(2)将玻璃板打开，使大小玻璃板分开，切去多余的分离胶和浓缩胶。对照Marker将目的胶切下，做好标记放到盛有电转液的玻璃皿中，防止干燥。(3)用直尺大体测量目的胶的长和宽，剪取与之大小相等的PVDF膜，在甲醇中浸泡约5秒中活化，接着放到电转液中浸泡10．15min。(4)将电转用夹子打开，黑色的一面在下，依次在上面放上海绵垫、滤纸、30 凝胶、PVDF膜(在滤纸的脚上左上标记，与胶接触的一面为正面)、滤纸、海绵垫各一张。没放一样都要用玻璃棒擀一下气泡，夹住夹子放到电转槽中，黑色的一面对电转槽黑色一面，白色的一面对电转槽红色的一面，在电泳槽的两侧放上冰袋，倒上预冷的电转液，盖上带有电极的盖子。将电转槽放到盛有碎冰的水盆或泡沫盒中，连接电源，打开电转仪，设置转膜条件(电压为恒压100V，时间要根据蛋白分子量饿大小而定，～般参考文献或做预实验摸索条件1。’(5)转膜完成后，将胶和PVDF膜取出(查看胶上是否还有颜色，如有说明转膜时间不够，下一次要增加转膜时间)，将PVDF膜与胶接触的一面朝上放到丽春红染液中染色5．10分钟，用蒸馏水或脱色液冲洗PVDF膜数遍直到PVDF膜无染色液，观察蛋白转膜情况。2．3．6．4封闭将PVDF膜正面朝上(即蛋白面朝上)放入到约30ml，浓度为10％的封闭液中，置于水平摇床上室温摇晃2．3小时。2．3．6．5一抗孵育根据膜的大小，选择适合的自封袋，加入事先配好的3ml左右的封闭液，按照一定的稀释倍数稀释一抗，混匀，将PVDF膜放到自封袋中置于摇床上，室温摇晃3．5小时或4。C摇晃过夜。为防止一抗变性可加入适量10％的叠氮钠2／．tL，4。C保存，可重复使用3．4次。2．3．6．6二抗孵育(1)洗膜：将PVDF膜从一抗中拿出放到小饭盒中，用TBST洗4次，前三次个5min，第四次15min。(2)用同样的方法稀释二抗，将PVDF膜放到二抗中，室温摇床摇晃1．2h。(3)洗膜：步骤同第一步。2．3．6．7ECL显影(1)准备：移液器、剪刀、镊子、枪头、曝光夹、手套、胶片、ECL液、饭盒、大平皿、废液缸等。(2)配ECL液：根据所需ECL液的量，将A、B液等体积混合(注意：在吸完A液后切记要换枪头，否则会交叉污染，使试剂失效)，混匀。(3)将所有物品拿到暗室(手机等发光物体最好不要带到暗室，以免造成31 胶片曝光)，按照PVDF膜的大小和要压片子的数量剪胶片，同样在胶片上做好标记。(4)将PVDF膜正面朝上放到曝光夹上，滴上ECL显色液，将塑料膜盖上压平，把胶片放到PVDF膜上，合上夹子曝光，室温数秒即可(有时也要根据PVDF膜上蛋白量的多少而定，可重复压几次找，找到合适的时间)。(5)曝光完毕后，迅速将胶片放到显影液中，随时观察条带出现的亮度，待调到出清楚来后立即放到定影液中(约5．8分钟)，最后用自来水冲洗干净后晾干。(6)将显影后的底片扫描后分析数据。2．4ELISA检测血浆IL．6、IL．10、IFN．7和TNF．a水平2．4．1检测培养基中IL．6水平2．4．1．1实验准备(1)仪器设备：酶标仪、1009L和1000ItL加样器、200多通道加样器、加样槽等。(2)计算：孔数=(标准曲线(8×2)+样本数x2+对照x2)x重复次数每种试剂总量=孔数x每孔液体量(3)制冰以放置样本：将试剂盒置于室温以平衡试剂温度(加样前打开酶标板包装以减少水汽凝结)。(4)IL．6对照配制：用lml去离子水或蒸馏水溶解对照样品，充分溶解。(5)洗涤液配制：如果使用前浓缩液出现晶体，拿到室温轻轻混匀直到晶体溶解，要准备充分的洗液。去25ml浓缩液加入到600ml去离子水或蒸馏水中配制成洗涤工作液。(6)酶反应液：在使用前15min内将显色剂A和B等体积均匀混合均匀后使用。每孔加入1001．tL。(7)巨噬细胞IL．6标准品的配制：用5ml的标准稀释液RD5T(不能用自己配制或其它稀释液)稀释溶解IL．6标准品，，稀释后标准品的浓度为500pg／ml。在做梯度稀释之前至少轻轻搅拌5min，以确保标准品完全均匀稀释。(8)取2001．tL储存液用校准稀释液RD5T一次做一个2倍的稀释，使其浓度依次为250pg／ml、125pg／ml、62．5pg／ml、31．2pg／ml、15．6pg／ml、7．8pg／ml。32 其中最高浓度为储存液浓度500pg／ml，用校准稀释液RD5T作为最低浓度0pg／ml。2．4．1．2操作步骤(1)在使用前，将所有试剂和样本保持室温。(2)计算一下，取下所用酶标板孔，其余酶标板放回铝箔袋子里。(3)向酶标板的每个孔内50ttLRDl．14稀释液。(4)向加入RDl．14稀释液的孔内加入501．tL标准品、样品和对照，用粘性的封口膜封住每个孔，轻敲1min使其均匀，室温下孵育2h。(5)洗板：将孔内原有的液体倒出(剩下的液体用吸水纸吸干净，尤其是最后一步洗板，最为关键)往每个孔里加400pL的洗涤液，用手指轻轻敲击酶标板的侧壁lmin，使其充分洗涤，重复洗涤5次。(6)向每个孔内加入1009L酶标记抗体，用封口膜封1：3，室温孵育2h。(7)洗板：重复第五步。(8)向每个孔内加1001．tL酶作用底物，轻敲混匀，室温避光孵育30min。(9)向每孔中加入1009L终止液，轻敲混匀，以终止反应。(10)用酶标仪450nm波长侧其吸光度，用540nm或570nm波长矫正。(11)计算；根据吸光度的值，计算巨噬细胞培养基中IL．6的浓度。2．4．1．3注意事项(1)实验前一定要将试剂盒提前30min放于室温，否则影响监测结果。(2)酶作用底物一定要避光，颜色变化为无色一蓝色_黄色。(3)终止液穿透力很强，千万不要弄到皮肤上。(4)整个实验过程中要勤换手套，避免交叉污染。2．4．2检测培养基中IL．10水平2．4．2．1实验准备(1)仪器设备：酶标仪、1009L和10009L加样器、200多通道加样器、加样槽等。(2)计算：孔数=(标准曲线(8x2)+样本数x2+对照x2)x重复次数每种试剂总量=孔数×每孔液体量(3)制冰以放置样本：将试剂盒置于室温以平衡试剂温度(加样前打开酶标板包装以减少水汽凝结)。33 (4)IL．10对照配制：用lml去离子水或蒸馏水溶解对照样品，充分溶解。(5)洗涤液配制：如果使用前浓缩液出现晶体，拿到室温轻轻混匀直到晶体完全溶解，要准备充分的洗液。取25ml浓缩液加入到600ml去离子水或蒸馏水中配制成洗涤工作液。(6)酶反应液：在使用前15min内将显色剂A和B等体积均匀混合均匀后使用。每孑L加入100rLL(注意混合好的液体一定要避光存放)。(7)巨噬细胞IL一10标准品的配制：用5ml的标准稀释液RD5T(不能用自己配制或其它稀释液)稀释溶解IL．10标准品，，稀释后标准品的浓度为1000pg／ml。在做梯度稀释之前要至少轻轻搅拌5min，以确保标准品完全均匀稀释。(8)取2009L储存液用校准稀释液RD5T一次做一个2倍的稀释，使其浓度依次为500pg／ml、250pg／ml、125pg／ml、62．5pg／ml、31．2pg／ml、15．6pg／ml。其中最高浓度为储存液浓度1000pg／ml，用校准稀释液作为最低浓度0pg／ml。2．4．2．2操作步骤(1)在使用前，将所有试剂和样本保持室温。(2)计算一下，取下所用酶标板孔，其余酶标板放回铝箔袋子里。(3)向酶标板的每个孔内501．tLRDl—14稀释液。即使在用之前和用的过程中RDl．14可能会有未溶解的物质。(4)向加入RDl．14稀释液的孔内加入509L标准品、样品和对照，用粘性的封口膜封住每个孔，轻敲1rain使其均匀，室温下孵育2h。(5)洗板：将孑L内原有的液体吸出(剩下的液体用吸水纸吸干净，尤其是最后一步洗板，最为关键)往每个孔里加4001,tL的洗涤液，用手指轻轻敲击酶标板的侧壁lmin，使其充分洗涤，重复洗涤5次。(6)向每个孔内加入100NL酶标记抗体，用封口膜封口，室温孵育2h。(7)洗板：重复第五步。(8)向每个孔内加1009L酶作用底物，轻敲混匀，室温避光孵育30min。(9)向每孔中加入1001．tL终止液，轻敲混匀，以终止反应。(10)用酶标仪450nm波长侧其吸光度，用540nm或570nm波长矫正。2．4．2．3注意事项．34 (1)实验前一定要将试剂盒提前30min放于室温，否则影响监测结果。(2)酶作用底物一定要避光，颜色变化为无色一蓝色_黄色。(3)终止液穿透力很强，千万不要弄到皮肤上。●(4)整个实验过程中要勤换手套，避免交叉污染。2．4．3检测培养基中IFN-丫水平2．4．3．1实验准备(1)仪器设备：酶标仪、100}tL和10009L加样器、200多通道加样器、加样槽等。(2)计算：孔数=(标准曲线(8×2)+样本数x2+对照x2)x重复次数每种试剂总量=孔数×每孔液体量(3)制冰以放置样本及试剂：将试剂盒置于室温以平衡试剂温度(加样前打开酶标板包装以减少水汽凝结)。(4)IFN．^，对照配制：用lml去离子水或蒸馏水溶解对照样品，充分溶解。(5)洗涤液配制：如果使用前浓缩液出现晶体，拿到室温轻轻混匀直到晶体溶解，要准备充分的洗液。去25ml浓缩液加入到600ml去离子水或蒸馏水中配制成洗涤工作液。(6)酶反应液：在使用前15min内将显色剂A和B等体积均匀混合均匀后使用。每孔加入100I．tL。(7)巨噬细胞IFN．丫标准品的配制：用2ml的RD5Y稀释液溶解IFN一丫标准品(不能用其他的稀释剂代替)，溶解后的IFN一丫标准品的浓度为3000pg／ml，溶解后的标准品至少要放置5min才能进行后续的稀释。(8)拿8个新的15ml离心管，取400I-tL的RD5Y稀释液到第一个15ml离心管中，其余的加入200I．tL的RD5Y稀释液，向第一离心管中加入1009L的IFN．丫标准品，此时标准品的浓度为600pg／ml。充分混匀后取2001xL加入到第二个离心管中，以此类推，加到第七个离心管。此时从第一管到第八管的浓度分别为：600pg／ml、300pg／ml、150pg／ml、75pg／ml、37．5pg／ml、18．8pg／ml、9．4pg／ml、0pg／ml。2．4．3．2操作步骤(1)在使用前，将所有试剂和样本保持室温。(2)计算一下，取下所用酶标板孔，其余酶标板放回铝箔袋子里。35 (3)向酶标板的每个孔内50pLRDl—21到每一个孔。(4)向加入RDl—21的孔内加入50l_tL标准品、样品和对照，用粘性的封口膜封住每个孔，轻敲1min使其均匀，室温下孵育2h。做好标记，以区别样品、对照和标准品。(5)将孔内原有的液体倒出(剩下的液体用吸水纸吸干净，尤其是最后一步洗板，最为关键)往每个孔里加400I-tL的洗涤液，用手指轻轻敲击酶标板的侧壁lmin，使其充分洗涤，重复洗涤5次。(6)向每个孔内加入1001．tL酶标记抗体，用封El膜封口，室温孵育2h。(7)洗板：重复第五步。(8)向每个孔内加1001tL酶作用底物，轻敲混匀，室温避光孵育30min。(9)向每孔中加入1001．tL终止液，轻敲混匀，以终止反应。(10)用酶标仪450nm波长侧其吸光度，用540nm或570nm波长矫正。(11)计算；根据吸光度的值，计算巨噬细胞培养基中IL．6的浓度。2．4．3．3注意事项(1)实验前一定要将试剂盒提前30min放于室温，否则影响监测结果。(2)酶作用底物一定要避光，颜色变化为无色一蓝色一黄色。(3)终止液穿透力很强，千万不要弄到皮肤上。(4)整个实验过程中要勤换手套，避免交叉污染。2．4．4检测培养基中TNF．a水平2．4．4．1实验准备(1)仪器设备：酶标仪、1001．tL和10001tL加样器、200多通道加样器、加样槽等。(2)计算：孔数=(标准曲线(8x2)+样本数x2+对照x2)x重复次数每种试剂总量=孔数×每孔液体量(3)制冰以放置样本：将试剂盒置于室温以平衡试剂温度(加样前打开酶标板包装以减少水汽凝结)。．(4)小鼠TNF．a对照配制：用lml去离子水或蒸馏水溶解对照样品，充分溶解。(5)洗涤液配制：如果使用前浓缩液出现晶体，拿到室温轻轻混匀直到晶体溶解，要准备充分的洗液。去25ml浓缩液加入到600ml去离子水或蒸馏36 水中配制成洗涤工作液。(6)酶反应液：在使用前1Stain内将显色剂A和B等体积均匀混合均匀后使用。每孔加入100uL。(7)巨噬细胞TNF．a标准品的配制：用2ml的RD5Z稀释液溶解IFN．丫标准品(不能用其他的稀释剂代替)，溶解后的IFN．丫标准品的浓度为1500pg／ml，溶解后的标准品至少要放置5min才能进行后续的稀释。(8)拿6个新的15ml离心管，取200肛L的RD5Z稀释液到每一个15ml离心管中，向第一离心管中加入200“L的TNF．a标准品，此时标准品的浓度为750pg／ml。充分混匀后取200pL加入到第二个离心管中，以此类推，加到第七个离心管。此时从第一管到第六管的浓度分别为：750p∥ml、375pg／ml、187．5pg／ml、93．8pg／ml、46．9pg／ml、23．4pg／ml。以TNF—a储存液的浓度为最高浓度1500pg／ml，校准液的浓度为最低浓度Opg／ml。2．4．4．2操作步骤(1)计算一下，取下所用酶标板孔，其余酶标板放回铝箔袋子里。(2)向酶标板的每个孔内50肛LRDlW到每一个孔。(3)向加入RDlW的孔内加入50斗L标准品、样品和对照，用粘性的封口膜封住每个孔，轻敲lmin使其均匀，室温下孵育2h。做好标记，以区别样品、对照和标准品。’(4)将孔内原有的液体吸出(剩下的液体用吸水纸吸干净，尤其是最后一步洗板，最为关键)往每个孔里加4009L的洗涤液，用手指轻轻敲击酶标板的侧壁lrain，使其充分洗涤，重复洗涤5次。(5)向每个孔内加入100pL酶标记抗体，用封口膜封口，室温孵育2h。(6)洗板：重复第五步。(7)向每个孔内加1009L酶作用底物，轻敲混匀，室温避光孵育30min。(8)向每孔中加入100pL终止液，轻敲混匀，以终止反应。(9)用酶标仪450rim波长侧其吸光度，用540nm或570nm波长矫正。(1o)计算；根据吸光度的值，计算巨噬细胞培养基中IL．6的浓度。2．4．4．3注意事项一一一三j兰：(1)实验前一定要将试剂盒提前30rain放于室温，否则影响监测结果。(2)酶作用底物一定要避光，颜色变化为无色_÷蓝色叶黄色。37 (3)终止液穿透力很强，千万不要弄到皮肤上。(4)整个实验过程中要勤换手套，避免交叉污染。2．5免疫荧光染色2．5．1实验注意事项(1)实验过程中要戴手套，避免污染。(2)荧光染色后一般在1小时完成，或4℃保存4小时，时间过长使荧光减弱。(3)如果细胞易脱落，可以将所有步骤在静止的桌面上进行，但静止操作时相应的操作时间或次数要延长。(4)在每次洗涤的时候，要尽量吸尽残余的洗涤液，同时要保持6孔板中盖玻片表面湿润，不能干掉。(3)每组实验时，需要设置一下三种对照；①阳性对照：阳性蛋白+荧光标记物②阴性对照：阴性蛋白+荧光标记物③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物2．5．2实验操作步骤(1)样品准备：用镊子将无菌洁净的盖玻片放置到6孔板内，接种并培养wT、PLTP．／_、RAW264．7细胞，待细胞都贴壁生长良好后进行下一步实验。(2)固定：吸出培养液，用高压灭菌PBS洗1．2遍。加1ml免疫染色固定液P0098于6孔板中固定细胞(固定液不要太多，以固定液能覆盖细胞为标准)，置于侧摆摇床固定5．15分钟。(3)洗板：吸出固定液P0098，将固定好的细胞用免疫染色洗涤液P0106洗涤两次，每次5分钟。(4)力11入lml免疫染色封闭液P0102，置于侧摆摇床上封闭60分钟(侧摆摇床速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品)。如果背景较高，可以4"C封闭过夜。(5)一抗孵：将封闭液吸出，立即加入稀释好的NF．r,BP65抗体，室温侧摆摇床l小时。如一抗孵育1小时效果不佳，可以4"C缓慢摇晃孵育过夜(一抗回收4℃保存，可以重复用多次)。(6)洗板：回收一抗，加入免疫染色洗涤液P0106洗3次，每次5分钟。38 如背景颜色较高可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。(7)--抗孵育：吸出洗涤液，立即加入稀释好的lml抗兔Cy3，置于侧摆摇床室温孵育1小时。(8)洗板：回收二抗(4℃保存，可以重复用多次)，方法同第六步。(9)JJH入lml细胞核染色液DAPI，室温条件下染色5分钟。(10)洗板：方法同上。最后一次洗完一定要吸尽洗涤液。(11)蛋白检测：滴加适量的抗荧光猝灭封片液，封好片后直接到荧光显微镜下观察结果并彩图保存。2．6统计学处理应用SPSSl3．0统计学软件对所获得的数据进行分析，实验组与对照组均采用均数士标准差(x±S)表示，实验组与对照组的比较采用单因素方差分析(one．wayANOVA)，采用F统计量。实验组与对照组均数比较采用LSD．t和Dunnett．t检验，以P0．05)无统计学意义，在60rain和120rain时分别增加33．4％和54％(P<0．02)。PLTPsiRNA组较ControlsiRNA组Ir．_B．(It蛋白在30min(P>0．05)和60min(P>0．05)时无统计学意义(尸>O．05)，在120min减少351．2％(尸=0．043)。免疫荧光染色显示如图4．C所示；PLTP．／．BMDM较WT核转位明显增加。5、LPS诱导的PLTPknockdownRAW264．7和TNF．a诱导的PLTPknockdownHUVEC内TAKl磷酸化增强LPS持续刺激PLTPknockdownRAW264．7以及TNF．a持续刺激PLTPknockdownHUVEC2小时，提取其胞浆和细胞核中的蛋白，分别用相应的抗体进行检测。结果如图5所示；在PLTPknockdownRAW264．7细胞中PLTPsiRNA组较ControlsiRNA组在120rain时增加了150％(P<0．02)。在PLTPknockdownHUVEC细胞中，PLTPsiRNA组较ControlsiRNA组TAKl磷酸化在120min时增加了1000％(P=0．05)。6、骨髓源性巨噬细胞中加入格列苯脲后未能增加STAT3磷酸化WT和PLTP．／．骨髓源性巨噬细胞培养两天后，加入ABCAl激动剂格列苯脲30min后加LPS刺激。提取其核蛋白，用相应的抗体进行检测。结果如图所示；在PLTP存在的情况下，pSTAT3的核水平不受格列苯脲的影响，说明在本实验中PLTP未能激活ABCAl．pSTAT3途径。7、巨噬细胞分泌的IL．10不能通过STAT3或SOCS3起到抗炎作用LPS刺激PLTPsiRNA或controlsiRNA转染的RAW264．7细胞24h，，提取其胞浆和细胞核中的蛋白，分别用相应的抗体进行检测。结果如图7所示：pSTAT3和SOCS3均未有明显的变化。41 讨论炎症是机体的一种保护机制，是机体受到外界或体内自身的损伤时的一种正常的生理反应。在此过程中，各种炎症因子及炎细胞共同发挥作用，以消除机体损伤因素。但是炎症并非是只有保护作用。在炎症的整个过程中，某一个环节出现问题，就由可能造成机体更大的损伤，反而成为对机体的不利因素。炎症不仅仅是抗体消灭抗原，机体将进入体内的病原微生物杀死的过程。它涉及到各种组织细胞和内质网、线粒体等各种细胞器【36】；它既是一种适应性免疫反应，也是一种固有的免疫反应，涉及到体内几乎所有免疫细胞、免疫通路和细胞因子；它是一种组织损伤反应，又具有强大的组织再塑和修复作用，几乎涉及到细胞组织的代谢、增殖、迁移、凋亡、自噬、坏死、再生等所有的方面；它既有各种信号分子的特异性；又有各种遗传背景的变异性，涉及到各种信号通路和上百种基因转录、表达、修饰、调控和多态性的变化。是一个多因素、多细胞、多通路、多层次、进行性的复杂的生理和病理的网络性的调节反应。在近年的研究发现，炎症在疾病的发生、发展以及预后中有着不可替代的作用。促炎因子和某些蛋白的表达和分泌是巨噬细胞在急慢性疾病中介导炎症反应的关键特性【”1。细胞外的PLTP在先天性免疫反应的调节已经有文献报道【381，然而细胞内的PLTP在炎症中的作用仍然是不明确的。我们的实验第一次证实了PLTP缺乏引起以下反应：(1)在腹腔巨噬细胞和骨髓源性巨噬细胞中均增强了LPS诱导的炎症因子的表达。(2)在巨噬细胞和人脐静脉上皮细胞中通过TAKl通路增加了NFtcB活性单位P65的核转位。(3)不依赖ABCAl．JAK2．STAT3途径促进了NFxB激活。(4)在本研究中细胞内高水平的IL一10不能减弱TNFa和IL．6的表达。巨噬细胞是人体重要的免疫细胞之一，在全身分布广泛具有高度的吞噬能力和适应能力强。巨噬细胞和其它免疫细胞在炎症反应对于机体的防御和病原微生物的清除是非常关键的。巨噬细胞在参与炎症调节的过程中涉及许多细胞因子和免疫蛋白。同时，它还能产生和分泌多种趋化因子和细胞因子，例如IL．1、IL．6、IL．10、IL．12和TNF．a等。巨噬细胞表面有多种受体存在，如TLR4受体、TNF．0【受体、ABCAl受体以及IL．1受体等，而这些受体被激活后均能引起下游炎症信号通路的激活，从而引起炎症因子的生成和分泌子。在巨噬细胞中还有多种炎症信号通路例如JAK、MAPK、PKC、AKT、IKK、TK、Wnt、Notch42 等等，可以通过AP．1、IRF、NF．KB、HIF等多种转录因子，启动和促进各种炎症基因的表达。其中NF．rd3是一个关键的炎症信号通路，同时由于他还能调节许多与炎症相关联的促炎基因而一直被作为一个促炎因素。然而，在急慢性炎症中，各种各样的血浆蛋白显著增加或被激活并参与炎症过程的调节。近来研究证明炎症中血浆PLTP活性增加暗示了它在先天性免疫反应中起了重要的作用[39-41】。有文献报道细胞外的PLTP能抑制NFxB激活通过ABCAl．JAK2．STAT3途径，然而局部组织PLTP的来源是有限的【33】。此外，在炎症急性期阶段的病人血浆中大量的PLTP减少暗示了细胞外的PLTP在局部炎症中可能起不了重要作用【401。为了弄清楚细胞内PLTP在急性炎症中的作用，我们分析了目前的研究，发现PLTP缺乏能促进促炎因子表达，暗示了在巨噬细胞中内源性的PLTP能抑制NFrB激活。NFrB激活是介导急慢性炎症的主要的转录因子之一，随后的促炎因子的表达会进一步加重局部组织或细胞的损伤。抑制NFxB激活和降低促炎因子的表达是抗炎药物治疗研发的一个至关重要的靶点。我们的研究表明，PLTP可能是～个能够影响NFxB激活的重要蛋白。另外，VuleticS发现PLTP能以激活型形式进入胞浆和细胞核，说明PLTP像一个转录因子一样穿梭核与质的蛋白[42】。然而，各种各样的急性期阶段或先天性免疫蛋白可以与PLTP相互作用，在血浆中形成PLTP蛋白复合体，暗示了磷脂转运蛋白不是一个单纯的脂质转运蛋白。根据以往的研究和我们的研究发现，细胞内的PLTP能与NFxB通路中的某些蛋白相互作用或影响蛋白的功能和重塑例如TAKl磷酸化。PLTP是多功能蛋白，不仅存在于血浆中发挥脂质转运作用，而且存在于细胞高尔基体和内质网内参与脂蛋白的成熟与分泌。生物体所有组织几乎都可以合成PLTP，主要的组织为肝脏和脂肪组织。已有文献报道PLTP能够在脂蛋白间转移磷脂【431，进而对胆固醇逆向转运有一定的影响。另外，PLTP还能转移维生素E和LPS，暗示了在细胞和血浆中的PLTP能够调节这些分子的分布。细胞外PLTP抗炎的作用包括清除LPS和激活ABCAl．JAK2．STAT3信号通路【3l】。在本研究中，我们通过炎症过程中分泌的PLTP排除了LPS和ABCAl的影响，验证了PLTP缺乏是引起NFr,B激活的主要原因。另一方面，有文献证实，堆积的维生素E能增加脂蛋白的抗氧43 化性和抑制内皮细胞功能紊乱【30，4引。暗示了在PLTP存在的情况下，维生素E能更好的发挥其保护作用。在本研究中我们发现，PLTP缺乏促进了巨噬细胞中p65亚单位转录，并增加了胞浆蛋白11(：Ba的降解，p65是Ⅳ^B炎症信号转导通路中最主要的一个转录亚单位，它的核转位的增加说明PLTP缺乏对于NFxB是一个激活作用。在PLTPknockdownRAW264．7和knockdownRAWHUVEC的实验结果进一步证实了上述结论。在低PLTP的情况下IL．10明显的升高。IL．10是由巨噬细胞或T细胞分泌的一种最主要的抗炎细胞因子之一，它的功能是受pSTAT3和抑制p65亚单位转录的SOCS3调控的[45】。通过我们的实验证明升高的IL．10没有通过STAT3激活或SOCS3的表达而发挥抗炎作用【461。研究证明在T细胞中IL．10能通过STATl激活抑制IFN吖表达因此在本实验中LPS诱导的巨噬细胞中IFN．丫表达没有明显变化很可能是被升高的IL．10所抑制。总的来说，通过本研究我们证明了LPS诱导的PLTP缺乏的巨噬细胞炎症因子表达显著升高。对于相关机制研究也说明了，在低内源性PLTP的细胞中NFKB激活是增强的，NFxB激活增强是胞浆蛋白TAKl磷酸化增加的结果。暗示了PLTP能与NFxB激活相关蛋白相互作用。说明了低内源性PLTP也能促进炎症因子的表达。更详细的信号和分子机制还得进一步的研究。 结论(1)PLTP缺乏诱导的PDM和BMDM在LPS刺激下炎症因子表达升高。(2)PLTP缺乏增强了NFr,．B活性亚单位p65核转位水平。(3)RAW264．7和HUVEC中NFr．B活性亚单位p65核转位水平增强可能与TAKl磷酸化作用有关45 APeritonealMacrophageIL-IOIFN-y附图TNFolL-6鹾山蘸山廷山蘸山BBoneMarrowDerivedMacrophageIL·10IFN-yTNFaIL．6WrPm．／．WTPLTP．／-WTPLTP．／-WTPL'IP4-CInflammatoryCytokinesSecretedfromBoneMarrowDerivedMacrophageIL·10IFN·YTNFaIL-6岍Pm-，-岍PLTP．，-岍P帅．／．aMedia口Media+LPSVVTPLlP．，-Figure1pro-InflammatorycytokinesexpressionwasincreasedinPLTPdeficiencymacrophage．A)Peritonealderivedmacrophage(PDM)wasstimulatedwithLPS(200ng／m1)for24h．TotalRNAwasextractedandmRNAofTNF—a，IL一6，IL一10，andIFN-丫wasevaluatedwithreal—timePCR．ExpressionlevelsofmRNAareindicatedasfolddifferencecomparedwithwildtypegroup(WT)．B)Bonemarrowderivedmacrophage(BMDM)wasstimulatedwithLPS(200ng／m1)for24h．TotalRNAwasextractedandmRNAofTNF一0【，IL-6，IL-10，andIFN一丫wasevaluatedwithreal-timePCR．ExpressionlevelsofmRNAareindicatedasfolddifferencecomparedwithwildtypegroup(WT)．C)AfterLPS(200ng／m1)stimulationfor24h，culturemediaofBMDMwasharvestedandconductedforTNF—a，IL-6，IL-10，andIFN一丫quantizationbyELISA．Dataareexpressedasthemean+SD(n=4)．木，P曼c3^J2一qJ辟一《Z芷￡0他∞8642JE、口c significance．ALPS200ng／mL莹Nucleare)ct怕ctCytoplasmicextraCt夏1．41．210．8O．60．40．2Op65PLTP·／0306012003060120(rain)H3●-●-●—●I●●●10／KB·a’-●●-_·_··一●··一·‘GAPDH●———●●_—-●-●●——●I●—●·—●●—-P=O029广——————————]P=0039C161412108O604020P=O026广——————————]P=O0002广——————————]0306012003060120min0306012003060120mlnPUp．1．、^rrPLTP4P65NulcearWTPLlP壬MergeFigure2PLl’PdeficiencyenhancednucleartranslocationofNFKBinprimaryculturedmacrophages．Bonemarrowderivedmacrophages(BMDM)werestimulatedwithLPSfollowingtheindicateddurations，andthenuclearandcytoplasmicextractsweredetectedwithanti．p65andanti．IKBa，respectively．Anti-histone3(H3)andanti—GAPDHantibodieswereemployedasnuclearandcytoplasmicproteinloadingcontrols，respectively．A)NuclearNFKBinwildtypegroup(WT)BMDMVS．PLTPknockout(PLTP．／一)andcytoplasmicIrBainWTVS．PLTP．／．．B、DensitometryanalysisofNuclearNFKBinWTVS．PLTP一／-．C)DensitometryanalysisofcytoplasmicIK：BainWTVS．PLTP-／-．D1ImmunocytochemistryofNFl(B．BMDMwasstimulatedwith200ng／mlLPSforlh(400×)．工D皿《o∞>plo_Io∞兰n工．∞>D一2uI∞一2正 Theseresultsarearepresentativeof3independentexperiments．A蜀ControIsiRNAPLTPsiRNALPS．200ng／mL0306012003060120mInNuclearextractCytoplasmicextractDp65H3。。---_一-I_-_KB’0【●-●●——●·-I-·—-·_·一P=0023广———————————_1P=0020广—————————————1C252望雪15Dm言1呈0．50P=O005厂———————————]0306012003060120min0306012003060120minV订PLTPknockdownWTPLTPknockdownControIsiRNAPLTPsiRNAFigure3PLTPknockdownenhancednucleartranslocationofNFKBinRAW264．7cells．PLTPsiRNAorcontrolsiRNAtransfectedRAW264．7cellswerestimulatedwithLPSfollowingtheindicateddurations，andthenuclearandcytoplasmicextractsweredetectedwithanti—p65andanti-IKBa，respectively．Anti-histone3(H3)andanti-GAPDHantibodieswereemployedasnuclearandcytoplasmicproteinloadingcontrols，respectively．A)NuclearNFrBincontrolsiRNAgroupVS．PLTPsiRNAgroupandcytoplasmicIKBaincontrolsiRNA484321O0O竹工．∞>ploJ竹啦也 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综述磷脂转运蛋白在胆固醇逆向转运中的作用刘帅综述秦树存校正摘要心脑血管疾病的最主要病理学改变之一是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)。胆固醇逆向转运(reversecholesteroltransport，RCT)是由高密度脂蛋白(highdensitylipoproteinHDL)介导的抗AS机制。经典的RCT是指HDL将外周组织堆积的胆固醇通过循环转运至肝脏，在肝内以胆汁的形式经由粪便排出体外。血浆HDL分子及生物学特性在RCT过程中起到关键作用。磷脂转运蛋白(Phospholipidstransportprotein，PLTP)参与HDL代谢，可直接影响血浆HDL胆固醇水平、，HDL亚组分比例以及HDL颗粒上成分。因此，PLTP很可能在多个环节影响RCT。本文就PLTP与RCT相关的研究进展作一综述。AbstractOneoftheuppermostpathologychangesofheartcerebroVasculardiseasesisatherosclerosis(AS)．Theoneofmostimportantanti-atherogenicmechanismsofthegoodcholesterolhighdensitylipoprotein(HDL)ismediatingreversecholesteroltransport(RCT)．TheRCTdescribestheprocesswherebycholesterolinperipheraltissuesistransportedtotheliver(orsmallintestine)whereitisultimatelyexcretedintheformofbile．Thecholesteroltransporters，plasmaproteinsandenzymeswhichinPeripheraltissues、plasma、liversandintestinaltractsallinvolvesRCT．HDLcholesterollevelandbiologicalqualityplayapivotalroleinRCT．Phospholipidtransferprotein(PLTP)isaimportantproteinwhichinvolvesHDLmetabolism，thatcandirectlyimpactsHDLcholesterollevel、proportionofHDLsubgroupsandchangesofHDLcomposition．Therefore，PLTPmayinfluencetheRCTpathwayatmultiplelevels．ThesummaryiswrittenconcerningtherelationshipbetweenPLTPandRCT．关键词胆固醇逆向转运；磷脂转运蛋白；高密度脂蛋白；动脉粥样硬化：胆固醇流出KeywordsReversecholesteroltransport；Phospholipidtransferprotein；Highdensity57 lipoprotein；Atherosclerosis；Cholesterolefflux．饮食结构的丰富和生活方式的改变使得心脑血管疾病发病率急剧升高。AS初始病变是富含胆固醇的脂质侵袭动脉内膜并在内膜下堆积【l】，许多炎症反应相继发生，包括脂蛋白氧化【2。3】、内皮细胞改变、单核细胞迁移聚集、泡沫细胞形成等(见图一)。长期的慢性的炎症反应会促进免疫反应和脂质堆积从而形成AS。胆固醇逆向转运(reversecholesteroltransport，RCT)fl邕将外周组织中多余的胆固醇转运至肝脏，并在肝脏内将其转化成胆酸排出体外，从而抑制AS的形成和发展(见图二)。RCT是由多个重要的步骤组成。首先，胆固醇从外周组织流出所需的转运体例如ATP结合盒转运体A1(ATPbindingcassettetransporterA1，ABCAl)和G1(ATPbindingcassettetransporterG1，ABCGl)[4．5]等，巨噬细胞和外周细胞内多余的胆固醇通过这些转运子被转运到细胞外的胆固醇接受体上，主要是HDL[6。7】。其次，脂质接受体，主要是HDL的各种亚型【8】均可作为RCT的传递者。第三，脂蛋白相关蛋白和酶，例如卵磷脂胆固醇酰基转移酶(1ecithincholesterolacyltransferase，LCAT)pJ、胆固醇酯转运蛋白(cholesterolestertransportprotein，CETP)、磷脂转运蛋白(phospholipidtransferprotein，PLTP)‘10】。第四，肝细胞表面受体，例如LDL受体、B类I型清道夫受体(scavengerreceptorclassB，typeI，SR—BI)，HDL中的胆固醇酯经肝表面的SR．BI受体摄取【11‘121进入肝脏，在肝脏内转化成胆酸。一些证据证实HDL可通过介导动脉内膜下泡沫细胞内胆固醇的流出而发挥它的抗动脉粥样硬化作用的[13-14】。HDL作为RCT过程中的胆固醇接受体，无论是其功能，还是其血浆浓度，对于HDL本身的抗AS生物学活性同样重要[15-16】。因此，参与HDL形成和修饰的数个转运蛋白在巨噬细胞胆固醇流出中必然起到关键的作用。其中PLTP无论在细胞内、质膜还是在循环中都具有转脂活性，人们长期以来也一直研究其在HDL代谢中的作用。 辫嚣}童谤≮图一、泡沫细胞形成富含胆固醇的脂质(主要是LDL)侵袭动脉内膜，使内皮细胞受损，间隙增大，脂质通过损伤的内皮细胞间隙在内膜下堆积。由于细胞因子的趋化性，T淋巴细胞和单核细胞也通过内皮细胞间隙到达内膜下。一系列的炎症反应相继发生一脂蛋白氧化、内皮细胞改变、平滑肌细胞迁移等。单核细胞在内皮下演变为巨噬细胞，吞噬脂质和胆固醇而成为巨噬细胞源性泡沫细胞。内皮细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞均可产生不同细胞因子，刺激中膜平滑肌细胞增生并迁移到内膜下，在内膜下平滑肌细胞通过LDL受体吞噬OX—LDL及胆固醇而最终成为肌源性泡沫细胞。59■■■毋 图二、胆固醇逆向转运RCT能将外周细胞多余的胆固醇转运至肝脏或小肠并最终转化成胆酸排除体外。RCT是由多个重要步骤组成的，首先，巨噬细胞和外周细胞内多余的胆固醇通过细胞膜上的ABCAl被转运到细胞外的胆固醇接受体上。其次，经过LCAT的作用，将胆固醇转化成胆固醇酯。然后，再由CETP将HDL中的胆固醇酯与LDL、VLDL、IDL中的甘油三酯相互交换。最后，VLDL、IDL、LDL通过肝脏或小肠表面的LDL—R受体，将胆固醇酯转运至肝脏。与此同时，HDL继续在LCAT的作用下转变成HDL2，HDL2也可通过CETP与VLDL、IDL、LDL进行胆固醇酯和甘油三酯的交换。最终，HDL2通过肝或小肠表面的SR-BI受体，将胆固醇酯转运到肝脏。大量研究发现，PLTP属于脂多糖结合与脂肪转运蛋白家族，还包括脂多糖结合蛋白(1ipopolysaccharidebindingprotein，LBP)，杀菌渗透性增强蛋白(bactericidal／permeability-increasingprotein，BPI)和胆固醇酯转运蛋白(CETP)t"‘1引。PLTP是多功能蛋白，不仅存在于血浆中发挥脂质转运作用，∞ 而且存在于细胞高尔基体和内质网内参与脂蛋白的成熟与分泌。生物体所有组织几乎都可以合成PLTP，主要的组织为肝脏和脂肪组织，并且在血浆、胎盘、胰腺、脂肪组织、脑和肺中呈高表达【19】。就转运蛋白的特性来讲，PLTP自身特点明确，PLTP在脂蛋白代谢中的主要作用是转移磷脂，即从脂解中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)残粒向HDL转移磷脂，使HDL颗粒增大。循环内PLTP结合于HDL并介导单层囊泡间磷脂的净转运至HDL，也介导脂蛋白间的磷脂交换【201。磷脂净转运至HDL会导致更大的、低密度的HDL亚群产生。血浆PLTP是一种非特异性的脂质转运蛋白，它能转运多数磷脂。除磷脂之外，甘油二酯、维生素E、脑苷脂和脂多糖也能有效的被转运121】。尽管胆固醇脂转运蛋白也能转运磷脂，但在模型鼠中显示PLTP不能代替CETP的功能‘221。一、PLTP与HDL1、PLTP过表达对HDL的影响磷脂转运蛋白对HDL有至关重要的作用，过表达PLTP是否能提升血浆及外周组织中HDL的水平，同时又能增强HDL颗粒抗动脉粥样硬化的特性呢?有人对此也做了研究，通过腺病毒和腺相关病毒转染的方法实现了PLTP在C57BL／6dx鼠体内的过表达，结果显示，前者使血浆PLTP活性增加了10-40倍【23。24】，在增加了血浆prelB．HDL水平的同时降低了a．HDL胆固醇的水平。后者使C57BL／6dx鼠血浆中总胆固醇和HDL胆固醇都有显著地减少【241。通过转基因的方法使人的PLTP基因在小鼠体内过表达，结果显示，与野生型相比，血浆PLTP活性增加了2．5—4．5倍。与此同时，血浆中HDL胆固醇的水平降低了30％．40％t251。Moerland等人通过研究人PLTP和apoAl的转基因鼠发现，PLTP基因呈现高表达状态，并导致HDL颗粒的抗AS的特性丢失【261。由此可见，PLTP过表达时循环中HDL的水平显著降低，减弱了HDL抗AS特性。2、PLTP缺乏对HDL的影响综上，PLTP在小鼠体内过表达对HDL是个不利因素。然而PLTP缺乏时HDL的功能又会怎样?到目前为止，大部分关于PLTP的研究数据都是从PLTP基因敲出的小鼠获得的，数据显示PLTP基因敲除之后，卵磷脂(phosphatidylch01ine，PC)、脑磷脂(phosphatidylethanolamin，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinosito，PI)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)I拘转运活性完全丧61 失，自由胆固醇(freecholesterol，FC)l约转运活性部分丧失【2”。而且，在PLTP基因敲除鼠的在体实验发现，氢3标记的卵磷脂被清除了，在VLDL和LDL中也都没有发现。普通饮食喂养C57BLdx鼠，HDL中磷}]旨(phospholipid，PL)、FC和apoAl都显著的减少，证明了PLTP介导的富含甘油三酯脂蛋白表面成分的转运在维持HDL水平时扮演了重要的角色【271。同时有实验证实PLTP缺乏提高了HDL抗炎症的性能，降低了LDL对于单核细胞趋化的敏感性‘281。此外，来自PLTP基因敲除小鼠的HDL富含蛋白，缺乏磷脂。一HDL和胆固醇酯的更新率(turnoverstudies)研究表明与野生型小鼠(C57BL)相比增加了四倍以上。因此，PLTP缺乏状态也会造成循环中HDL胆固醇和磷脂水平的显著降低，但HDL抗炎症的性能有所增强。二、PLTP与AS1、PLTP过表达对AS影响PLTP在维持内环境的脂质稳态方面，以及AS发展过程中的病理学作用仍然不是十分明了。研究表明在能增加冠心病风险的不同疾病中，像肥胖、胰岛素抵抗、I型II型糖尿病，PLTP的表达是增加的【291。血清PLTP活性与左心室收缩功能紊乱【301和低HDL水平成正相关性【311。快速提高血浆中PLTP的浓度，能加重已存在的ASt321，并且在PLTP转基因鼠[331和过表达PLTP的apoE基因敲除鼠的研究证明，PLTP过表达都有促进AS的作用【241。显然，PLTP与AS的形成关系密切，PLTP过表达对AS是一个促进因素。2、PLTP缺乏对AS影响关于PLTP缺乏对AS的影响的研究，科研工作者也做了大量的工作。有文献报道PLTP敲初小鼠有一个低的血浆胆固醇水平，并能抵抗由饮食诱导而引起的AS[341。Valenta等的研究也证明在全身PLTP缺乏，仅在巨噬细胞表达的PLTP有动脉粥样硬化保护作用f351。这种表现型能通过增强PLTP和ABCAl相互作用得以证实【361，在增强PLTP和ABCAl相互作用的情况下，能使稳定的HDL与ABCAl绑定并增加了胆固醇和磷脂的流出率【371。在人的颈动脉组织截面中，检测到PLTP的免疫反应性【38。39】。而且，在动脉粥样硬化切片中，PLTP与apoA．I、apoE和双糖链蛋白多糖一起堆积在细胞外基质。这些发现提示了PLTP可能会促进HDL和双糖连蛋白多糖的绑定。PLTP通过增强细胞表面的绑定和HDL重塑，提高胆固醇和磷脂从巨噬细胞流出的能力1371。因此，62 以上数据显示全身PLTP缺乏而仅在损伤部位的巨噬细胞中表达能促进RCT，对AS是一种保护作用。三、PLTP与RCT‘I、PLTP过表达对RCT的影响PLTP在RCT中的作用是有争议的。PLTP在巨噬细胞中高表达和调控，暗示了PLTP在巨噬细胞胆固醇和磷脂流出中是有作用的。Oram[361报道说，外源性PLTP能模仿HDL载脂蛋白的功能，通过ABCAl途径将胆固醇和磷脂从细胞内移出。PLTP能通过与ABCAl的相互作用以媒介的形式将过多的脂质转运到脂蛋白上【361。还有文献报道，在血浆中用两种形式的PLTP，一种是高活性的PLTP(HA．PLTP)，一种是低活性I拘PLTP(LA．PLTP)[40‘41】。无论是高活性PLTP，还是低活性I约PLTP都能增强胆固醇流向apoAl[42】。证明，PLTP在不同的胆固醇流出模型中可以扮演促胆固醇流出的作用，对RCT是有促进作用的。‘2、PLTP缺乏对RCT的影响另一方面，研究者也得到了一些相反地结果。有研究发现PLTP缺乏不能显著地改变巨噬细胞胆固醇流出的能力‘431，在巨噬细胞中过表达也是一样的结果【441。Moerlandt261研究也发现从PLTP和apoAl双基因转染小鼠分离获得的HDL比单转染apoAl基因小鼠的HDL效率低。由此看出，PLTP在RCT中没有没明显的作用，甚至有抑SURCT的作用。结论PLTP是否在RCT中起重要作用尚不十分明确。然而，PLTP能影响脂蛋白的重塑和功能，因此，在动脉粥样硬化过程中一定是有显著作用的。就目前已发表的文献资料看，PLTP对RCT是有影响的(促进或抑制)，但是影响并非很强，且不容易解释在其它模型中扮演的角色。PLTP在局部巨噬细胞和组织中表达的特性和功能与其在循环中是不同的。在局部表达的PLTP有较强抗动脉制样硬化的作用，而循环中的PLTP则偏重于促动脉粥样硬化的作用。我们目前的研究是有限的，为了研究清楚PLTP在RCT以及AS中的作用，还需要做大量的工作，尤其应注意选用更为合适的动物模型，同时加强人群样本的研究。大量流行病学的研究也会给我们指导性的见解。最后，人类遗传性PLTP缺乏的病人，对于我们研究转运蛋白在脂蛋白代谢和AS中的作用是非63 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原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：型呈：尘：影学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的成果，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅、检索以圾申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为泰山医学院。论文作⋯：碑⋯名：船