杠板归提取物抗单纯疱疹病毒I型的药理作用研究

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杠板归提取物抗单纯疱疹病毒-I型的药理作用研究作者：张长城,黄鹤飞周志勇，袁丁【摘要】目的研究杠板归提取物体外抗单纯疱疹病毒-1(HSV-1)的作用，探讨杠板归抗疱疹病毒的药理作用与有效部位。方法利用溶剂法和色谱法从杠板归中提取分离出4个部位，MTT法检测杠板归各提取物的病毒抑制效果，以病毒抑制率和治疗指数(TI)为评价指标，比较各部位体外抗病毒的效果。结果杠板归醇提部位与大孔树脂醇洗部位抗病毒作用最强，药物浓度在8μg·ml-1以上时，对HSV的抑制程度可达50%以上，与阳性对照药阿昔洛韦无统计学差异(P>0.05)。结论杠板归提取物体外具有较好的抗HSV-1作用，其有效成分为黄酮类化合物，具有进一步研究开发价值。【关键词】杠板归;单纯疱疹病毒-1;有效部位　杠板归系为蓼科蓼属Polygonaceae植物杠板归Polygonumperfoliatum7 L.的新鲜或干燥全草，又名贯叶蓼，具有清热解毒、祛痰止咳、利湿消肿、散瘀止血等功效，主治痈肿疔疮、丹毒等，始载于《万病回春》。民间习用杠板归鲜品或干品捣烂外敷治疗带状疱疹等疾病，具有良好的效果。现代药理研究表明，杠板归具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等活性[1，2]。目前对杠板归抗病毒活性的研究较少，其药理活性部分与活性成分尚不明确。本文通过研究杠板归各提取部位体外抗HSV-1活性研究，探讨杠板归抗疱疹病毒活性的主要活性部位与可能活性成分。　　1材料与仪器　　1.1药物杠板归鲜品采自湖北宜昌市，经三峡大学医学院中药学教研究室谭复成教授鉴定。阳性对照药物：阿昔洛韦(ACV,上海通用药业股份有限公司)。　　1.2试剂与仪器MTT(4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物)为SIGMA公司产品;RPMI1640培养基为GIBICO公司产品;二甲基亚砜(DMSO)购自上海菲达有限公司;小牛血清购自三利公司;所用化学试剂均为国产分析纯。超净工作台(美国Forma公司);TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DG3022-A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。　　1.3细胞与病毒Hep-2细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供。细胞生长液为RPMI-1640，加10%小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。细胞维持液中加2%新生小牛血清。单纯疱疹病毒Ⅰ7 型(HSV-1)SM44株，武汉大学医学院病毒学研究所提供，经Hep-2细胞活化增殖，CPE达75%以上(+++～++++)收获，测定病毒滴度为TCID5010-5.6/0.1ml，分装后于-80℃冻存备用，实验用病毒浓度为1000TCID50。　　2方法　　2.1供试品的制备取杠板归干燥药材50g，用石油醚脱脂后，用20倍量75%乙醇微沸回流提取2次，每次2h，提取液减压浓缩、干燥，得醇提物(干燥后得醇提部位);醇提物加水溶解，通过D101大孔树脂，水洗后经75%乙醇溶液洗脱，得到水洗部位及醇洗部位;经乙醇提取后的药渣用水回流提取两次，每次2h，减压浓缩、干燥得水提部位。以芦丁(购于中国药品生物制品检定所)为标准对照品，采用硝酸铝络合分光光度法[3]测得经大孔树脂纯化后的母液总黄酮含量达86.08%。过滤除菌分装，实验前用含2%的小牛血清的1640培养基稀释到所需浓度。　　2.2药物对细胞的毒性作用用胰酶将生长良好的Hep-2细胞消化分散成单个细胞悬液，按2×105/ml的浓度每孔100μl接种于96孔板。置37℃，5%CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换成不同浓度的含药维持液，每孔200μl，每种浓度重复4孔。同时设4个组，分别为空白细胞对照、病毒感染对照、ACV阳性对照、受试药物组，继续培养并于倒置显微镜下每日观察记录。采用MTT法[4]检测细胞存活率：上述药物作用的细胞继续培养727 h，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mlMTT的无血清RPMI-1640培养基50μl，置CO2培养箱中继续培养2～3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为1∶1)100μl，振荡5～10min，待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定570nm波长处的光密度OD值，计算细胞存活率。实验重复3次。　　2.3药物抗病毒实验于已长成单层Hep-2细胞96孔板上，每孔接种100μl的1000TCID50/0.1ml的HSV-1病毒液，于37℃吸附2h，弃病毒上清并用PBS洗涤。根据细胞毒性实验的结果，在无细胞毒性浓度范围内，加入不同浓度的含药维持液每孔200μl，每种浓度重复4孔。然后将HSV培养板置37℃、5%CO2培养，逐日观察细胞病变情况。当病毒对照CPE达“+++～++++”时，用MTT检测病毒抑制率。实验重复3次[5，6]。　　2.4统计学方法用统计软件SPSS11.5的Probit回归法计算药物半数毒性浓度TC50和半数抑制浓度IC50，得到药物治疗指数(TreatmentIndex,TI=TC50/IC50)。　　3结果　　3.1药物对细胞的毒性作用药物对Hep-1细胞毒性作用表现为:细胞粘连、变圆、壁厚、破碎脱落,胞质内颗粒增加,折光性增强并且吸光值明显下降。随着药物的浓度增加细胞存活率呈递减趋势。结果见表1。表1各提取物对Hep-2细胞的毒性作用7 　　3.2杠板归各部位抗病毒活性杠板归醇提部位、醇洗部位提取物、杠板归总提物抗HSV-1作用显著，最高抑制率可达78.10%，杠板归水洗部位及水提部位效果均较差，醇提部位、醇洗部位提取物之间没有明显的差异，与阳性对照药物对HSV的抑制作用无统计学差异(P﹥0.05)，结果比较见表2～3。表2各提取物对HSV-1病毒生物合成作用表34个提取部位的药效学指标比较　　4讨论　　临床常用的抗单纯疱疹病毒药物有阿昔洛韦、喷西洛韦等核苷类抗病毒药物，其作用途径主要是抑制病毒复制过程中重要酶的活性，阻止病毒复制和侵染宿主细胞。但核苷类药物都存在一些缺陷，如生物利用度低，溶解度小，并在体内迅速失效及潜在致畸等副作用，长期服用可产生耐药性[7，8]。7 　　杠板归为民间草药，具有一定的抗炎、抑菌作用，民间常用于治疗疱疹病毒感染。本实验初步讨论了杠板归抗HSV-1病毒的有效成分，实验结果表明：杠板归醇提部位与杠板归醇洗脱部位有显著抗HSV-1作用，效果与ACV相当。杠板归经D101大孔树脂75%醇洗脱后母液中黄酮含量达80%以上，提示杠板归中抗HSV-1的主要有效成分为黄酮类化合物。但杠板归提取物如何进入细胞，通过何种机制阻断病毒感染细胞并抑制病毒的复制,尚有待进一步研究。杠板归资源丰富，本实验为杠板归的进一步开发利用提供了实验基础。【参考文献】　[1]章永红.抗癌中药大全[M].南京：江苏科学技术出版社,2000：217.　　[2]黄鹤飞,张长城,袁丁,等.杠板归抗炎抑菌活性部位研究[J].安徽医药,2008,7(12):595.　　[3]国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005：247.　　[4]傅继华.病毒学实用实验技术[M].济南:山东科学技术出版社,2001:271.　　[5]肖春惠,杨占秋,肖红,等.喷昔洛韦体外抗疱疹病毒活性的研究[J].中国病毒学,2002,17(2):102.　　[6]魏金亮，许珍，王璐，等.荔枝核黄酮体外抗单纯疱疹病毒的作用[J].武汉大学学报(医学版)，2009，30(1)：89.7 　　[7]ErardV,WaldA,CoreyL,etal.Useoflong-termsuppressiveacyclovirafterhematopoieticstem-celltransplantation:Impactonherpessimplexvirus(HSV)diseaseanddrug-resistantHSVdisease[J].JournalofInfectiousDisease,2007,196(2):266.　　[8]SuzukiM,OkudaT,ShirakiK.Synergisticantiviralactivityofacyclovirandvidarabineagainstherpessimplexvirustypes1and2andvaricella-zostervirus[J].AntiviralReseach,2006,72(2):157.7