小曲中高活性凝乳酶菌株的筛选、凝乳特性及新型乳制品的研究

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小曲中高活性凝乳酶菌株的筛选、凝乳特性及新型乳制品的研究天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632 研究目的随着营养知识的普及和生活水平的提高，乳制品已逐步成为大众化的营养食品，消费者正渴望种类更多、风味更好的乳制品。奶酪的工业化生产及相关凝乳制品需给予凝乳剂特性的研究。传统的凝乳酶来源于小牛皱胃酶，随着干酪需求量的增加，小牛皱胃已经不能满足干酪生产的需要，凝乳酶已经出现世界性短缺，为此，世界各国近年来相继进行微生物凝乳酶代用品的研究。天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632 研究意义近年来酒酿浸出液凝乳特性的研究为小曲中高凝乳酶产生菌种的筛选提供了基础，小曲中根霉菌成为微生物凝乳酶生产菌种的潜在资源。本研究旨在从高活力凝乳的酒药中分离出产凝乳酶根霉菌，为凝乳酶生产菌种的选育提供资源。同时利用酒酿浸出液的凝乳特性开发新型风味乳品。 实验过程：1、酒曲的收集及酒酿的制作2、各酒酿浸出液凝乳活力的比较3、高凝乳酒曲中根霉菌的分离、纯化4、纯种根霉菌发酵液凝乳特性5、产品调制和感官评定 一、酒曲的收集及酒酿的制作1．酒曲的收集：收集了来自四川、湖北安琪、贵州、上海的四种酒曲。2．酒酿的制作：分别取四份新鲜糯米250g，用清水淘洗2～3次，再用净水浸泡过夜。然后进行常压蒸饭30min左右（以熟为度），淋水冷却到30℃左右，按说明将一定量的酒曲（四川250g用1.1g；湖北250g用1.0g；上海250g用1g；贵州250g用2.5g）碾碎并均匀拌入饭中，将饭放入碗中，搭窝，以塑料膜封口，用牙签在薄膜上扎少量小孔以供给一定氧气。30℃下发酵48h，取浸出液，浸出液经4000r/min离心20min，上清液即为酒酿浸出液，放入4℃冰箱中保存备用。 二、各酒酿浸出液凝乳活力的比较采用Arima的方法。取5ml120g/L的脱脂乳，在36℃下保温5min，加入0.5ml酒酿浸出液，于旋涡混合器上混合，准确记录从加入酶液到乳凝固的时间（s）。40min凝固1ml100g/L的脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位（Soxheltunit），并以相对活性（Ru）表示各因素的影响结果。Su= 以脱脂乳培养基进行液体摇瓶培养，在250m1三角瓶中各加入上述培养基50m1。将名地小曲酒酿浸出液接种后于28℃、120r/min振荡培养36h滤去菌丝体，清液以1500g离心15min上清液测定凝乳活力测定结果以SU/mL表示。天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632 实验得出：四川：36.81SU/mL贵州：27.97SU/mL湖北：20.94SU/mL上海：24.09SU/mL经比较四川小曲凝乳活力最高，因此选用四川的小曲作为根霉菌的分离源。 三、四川酒曲中凝乳菌株的分离、纯化1、酒曲中根霉菌的分离：选用四川的酒曲进行分离1）培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA)、豆芽汁琼脂培养基、察氏培养基、营养肉汤琼脂培养基察氏培养基：NaNO32g；K2HPO41g；KCl0.5g；MgSO40.5g；FeSO40.01g；蔗糖30g；琼脂15～20g；水1000ml；pH自然；121℃灭菌20min。马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200g；蔗糖（或葡萄糖）20g；琼脂15～20g；水1000ml；PH自然马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml，121℃灭菌20min。 豆芽汁蔗糖（或葡萄糖）培养基：黄豆芽100g；蔗糖（或葡萄糖）50g；水1000ml；pH自然；称新鲜的黄豆芽100g，加水1000ml，煮沸30min，用纱布过滤。用水补足原量，再加入蔗糖（或葡萄糖）50g，煮沸溶化。121℃灭菌20min。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；琼脂15～20g；水1000ml；pH7.0～7.2；121℃灭菌20min。 2）菌种的分离：将酒曲在无菌研钵中研细，撒少量于培养基中，然后置于25℃培养箱中培养。结果:豆芽汁琼脂培养基和PDA琼脂培养基培养上，菌株生长都良好，25℃培养2天菌丝生长就很旺盛了，有的已布满整个培养皿，有的已产生孢子囊，3天后所有的菌丝都布满整个培养基，观察到几乎是一种菌，杂菌很少。25℃下察氏培养基生长较前两者微弱，培养2天菌丝生成量很少，3天后有菌丝向外生长，5天后菌丝生长较旺盛。天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632 2、霉菌菌种的纯化根据菌在豆芽汁琼脂培养基上长的更加旺盛，因此选豆芽汁琼脂培养基进行进一步纯化.用接种环挑取生长旺盛的平皿上的少量孢子，以三点接种法点接于培养基上，重复三次，倒置于25℃下培养，观察菌落特征，包括颜色，质地，高度。纯化了两次，保存。天马行空官方博客：http://t.qq.com/tmxk_docin；QQ:1318241189；QQ群：175569632 培养物制片观察：于清洁的载玻片上，滴加乳酸石炭酸溶液，用无菌接种针挑取少量孢子的菌丝置于液体中，然后小心盖上载玻片，以防产生气泡，用火柴棒轻轻敲击盖玻片表面使菌分散，然后置于显微镜下，观察其形态特征。观察结果如下:有假根和匍匐枝，孢囊梗直立，孢子囊为球形. 四、单菌凝乳实验及发酵条件优化1、单菌凝乳实验米浆培养基的制作：称取新鲜糯米50g，清洗三次，浸泡过夜，蒸熟，打浆，加入500ml水，取100ml于三角瓶中，108℃，15min灭菌。将保存于斜面上的霉菌挑取三环接入上述灭好菌的米浆培养基中，于25℃，120r/min摇床培养，36h后取出。将奶粉配成12％的浓度，分装于100ml瓶中，85℃杀菌15min。然后将培养好的菌按5%,7%两个添加量加入杀菌乳中，于45℃水浴下进行凝乳实验。 结果两个接种量在6h后都没凝乳，过夜后都凝乳了。接种量加大到10％和15％，结果接种量为15％的凝乳时间为1h，而接种量为10％的凝乳时间为2h，二者凝乳致密、均匀。 2、发酵产凝乳酶条件优化2.1发酵时间对凝乳活力的影响在36~60h内，随发酵时间延长，凝乳活力增加，发酵60h时凝乳活力达最大值，36~48h之间，活力增加迅速，48~60h之间增加较慢，60h后活力开始呈一定幅度下降。因此，凝乳剂的制备以发酵60h为好。 2.2温度对凝乳活力的影响分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃不同温度下测定凝乳剂活力，结果如图凝乳剂在40~50℃范围内，凝乳活力高，而且观察此范围内所制得的奶酪，奶酪凝块结实、均匀、乳清析出少，45℃时，凝乳剂凝乳活力达最大值，凝乳的各种外观性状也最优。 2.3凝乳剂发酵液pH值对凝乳活力的影响用0.1N的NaOH和0.1N的HCl来调整酒酿浸出液的pH值，静置24h后测定凝乳剂的凝乳活力，结果见图酒酿浸出液pH值3.98时，凝乳活力最好，pH值为2.5-3.98时，随着pH值的增大，凝乳活力迅速增强；pH值在3.98-4.5时，随着pH值的增加大，凝乳活力迅速下降；pH值5.0-7.5时，凝乳活力很低，但此范围内酒酿浸出液凝乳活力随pH值变化不大。结合凝乳的感官品质，认为酒酿浸出液pH值2.5-4.0之间为最适凝乳pH值，此条件下所得凝乳均匀、结实、乳清少。 2.4不同凝乳剂添加量对凝乳活力的影响凝乳剂添加量不同，凝乳活力变化显著，添加量为5%时，活力是10%添加量的63.7%，添加量为2.5%时活力仅为原来的24.47%，添加量少于1%以后，几乎不能形成凝块。添加量越少，活力越低，且所得的凝乳越松散，乳清析出越多。 2.5不同Ca2+浓度对凝乳活力影响在脱脂乳中添加CaCl2，测定不同CaCl2浓度下的凝乳活力。测定结果如图在乳中添加CaCl2，对酒酿浸出液凝乳有促进作用，随着CaCl2浓度的增加，酒酿浸出液的凝乳活力不断增大。CaCl2浓度为0~0.4g/L时，随浓度的增大，凝乳活力上升很快；浓度在0.4~1g/L时，凝乳活力有一定增加，但增加幅度很小，趋于平稳。添加CaCl2后，所得的凝乳凝块硬度增加。 2.6不同金属盐类对凝乳活力的影响在脱脂乳中分别加入各种金属盐类，使其浓度为10mmol/L，测定凝乳剂凝乳活力，对比未添加任何物质的脱脂乳，结果显示：MnSO4对凝乳活力的促进作用最强，其次为FeSO4和CaCl2，MgCl2和Al2（SO4）3表现微弱的促进作用；NaCl、BaCl2、KCl、K2SO4、CuSO4则对凝乳活力表现轻微的抑制作用。 五、产品调制和感官评定1、产品调制将奶粉配制成12％的浓度，分装于四个100ml玻璃瓶中（分别编号为1、2、3、4），85℃杀菌15min。然后将凝乳剂按10%的添加量加入杀菌乳中，向1号瓶和4号瓶中添加8％的蔗糖，向3号瓶和4号瓶中添加0.15％的CaCl2，于45℃水浴下进行凝乳试验。 2、感官评定1）通过2号瓶和3号瓶的比较得出：在奶粉中添加0.15％的CaCl2时有涩味，口感不如不加CaCl2的好。2）通过1号瓶和2号瓶的比较得出：在奶粉中添加8％的蔗糖时甜味太浓，后经过实验得出添加5％蔗糖时甜味适中，为大多数人所接受。3）通过1号瓶和4号瓶的感官评定，1号瓶口感较好。通过调制和感官评定得出在不添加钙离子和5％蔗糖时所得产品口感最佳。 总结：本次实验我们从四川、贵州、湖北、上海搜集到当地的小曲，通过对各地小曲的酒酿浸出液凝乳活力的比较，得出四川的凝乳效果较好。进而对四川小曲中的根霉菌进行了分离纯化，得到一高活力菌株。再用纯化得到的根霉菌进行单菌凝乳实验，并对其发酵产凝乳酶条件进行优化。最后我们进行了产品的调制和感官评定。我们的产品与传统乳制品相比有其独特的酒香味儿，口感滑润。 谢谢大家！