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中国农业大学博士学位论文禽副粘病毒-2的基因组序列测定与分析姓名：杨爱梅申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：赵继勋2002.6.1 英文缩写英文全称AmpbpBSAcDNACPEELISAHNkDaNDVntNTNTR0．D．ORFPJVPMV一2RIPArpmRT-PCRRACESDSSDS—PAGESPF缩略词表ampicilinbasepairBovineserumAlbumincomplementaryDNAcel1pathologyeffectenzyme—linkedimmunosorbentassayhema991utinin—neuraminidasekilodotonNewcast]ediseasevirusnucleotidenutralizationtestNontranslationalregionOpticaldensityopenreadingregionparainfluenzavirusParamyxovirus一2Radioimmunopreciptionassayroundsperminuterevrerse—transcriDtase—polymerasechairlrapidamplificationofCDNAendSodiumdodecylSUIfateSDS—polyacrylamidegelelectroDhoresiSspecifiCpathogenfree中文全称氨苄青霉素碱基对牛血清白蛋白互补DNA细胞病变酶联免疫吸附试验血凝素一神经氨酸酶千道而顿新城疫病毒核苷酸中和试验非翻译区光密度值开放阅读框架副流感病毒副粘病毒2型放射性免疫沉淀分析转／分钟反转录一聚合酶链式反应互补朱端的快速扩增十_二烷基磺酸钠SDS一聚内稀酰胺凝胶电泳无特定瘸原体 摘要在本实验室已对PMV．2的流行病学、致病性、诊断方法、单抗制备等做了大量研究的基础上，本研究将进行PMV．2基因组的部分基因序列测定与分析，从分子水平上对该病毒做进一步的研究。本实验主要完成了下列工作：，(1)收获四株PMV．2jf标准毒株Yucaipa株，进口七彩文鸟F4株、F6株和北京分离株F8株的接毒鸡胚的尿囊液，经差速、超速离心后，利用蔗糖密度梯度离心纯化。分别制备免疫电镜样品、透射电镜样品和病毒蛋白的SDS．PAGE的上样样品。经电镜观察，各毒株形态结构无明显差别，与发表的文献一致，病毒的SDS-PAGE图谱也与报道基本一致，进～步确证了病毒为PMV-2。为以后PMV．2的分子生物学的研究奠定了基础。／，’。(2)提取4株病毒的RNA，经RT-PCR，获得4株毒株的HN基因，同时首次测得F基因与HN基因之间的序列。f序列分析结果表明，HN基因的ORF全长为1743nt，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白。4株毒株的HN基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为99．89％和99．69％。分析F基因与HN基因间序列发现基因间序列与副粘病毒科其他病毒的基因间序列相似，含有基因起始信号和终止信号。但不含3个碱基的连接序列。通过序列分析，进一步证实所测毒株为PMV．2病毒，并在分子水平上进一步证实赵继勋等分离于同一批进I：l七彩文鸟的F4、F6株是抗原性存在差异的两个毒株。毒株间的血清学关系与分子水平的核苷酸序列、氨基酸序列的比较关系一致。夕‘1(3)我们的研究还从分子水平上进一步论证了分离自猕猴的Murayama病毒与Yucaipa病毒有着非常密切的血清学关系，Mumyama病毒可能是Yucaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猕猴后的适应株。(4)在HN基因5’端设计步移引物进行反转录。将反转录产物构建质粒文库，通过点杂交及Southern杂交，筛选阳性克隆。测序产物做BLAST比较，并与本科病毒的L基因的核苷酸序列、氨基酸序列进行了比较。进一步证实我们在国际上首次完成了PMV-2标准毒株的L基因3’端的序列测定。(5)用Pfu保真酶扩增HN基因，连接入PTYB．2表达载体，成功进行了原核表达，为制备针对HN蛋白的单抗工作奠定了一定的基础。关键词l禽副粘病毒．2：电镜观察胎SDS．PAGE图谱：基因测序与骨靖；质粒文库；原核表达J1 AbstractOnthebaseofalotofworkwehaddone，wewillsequencethegenomeofPMV一2initiallyintheworldtostudythisvirusonthemolecularlevel．Theworkwehaddoneareasfollows：(1)Yueaipavirus，whichisthestandardstrainofPMV-2，andotherthreeisolatedstrainsinChinawerepropagatedintheallantoiccavityofSPFchickenseggsandpurifiedbydiscontinuoussucrosedensitygradientcentrifugation．Negatively-stainedtransmissionmicrographandimmuneelectronmicrographrevealpleomorphicpopulationsofroughlysphericalparticles．SDS-PAGEofYucaipavirusisidenticaltothepublisheddocumentsinmain．(2)ExtracttheRNAofthefourstrainvirus．WegettheHNgeneofthevirusesbyRT-PCRandalsowegettheintergeniegenebetweenHNgeneandFgeneofPMV-2initiallyintheworld．AnalysisofsequencesrevealedthateachORFofHNwascomposedof1743nucleotidas，whichencodedaproteinwith580aminoacids．Comparisonofsequencesshowedthattheyhave99．89％and99．69％homologyinnucleotideandaminoacidsequencerespectively．Theintergenicgenehasthehighlyconservedgnnestartandgenestopsignals，whichisthecommonsigninparamyxoviridan，butitdocsn’thavetheminimaltrinucleofidesintergenicjunctions．Bysequencescomparativeanalysis。itisalsoprovedonthemolecularlevelthatthefourstrainvirusarePMV-2andZhaoJixunetai．hadisolatedtwodifferentPMV-2isolatesfromthesamegroupofimportedmannikin．TherelationshipsamongthisfourstrainofPMV-2isidenticaltoitsmolecularlevelcomparation．(3)itisdemonstratethatMurayamavirusmaybeanagentthatadaptedtomonkeysafterinfectionwithYucaipavirusorYucmpalikevirusonmolecularlevelulteriorly(4)Wedesignedonewalkingprimeratthe5’terminiofHNgeneandconstructedplasmidlibraryofeDNA．Choosingthepositiveclonebydot-blollingandsouthern-blotting，WegetintergenicgenebetweenofHNgeneandLgeneandthe3’terminiofLgeneofstandstrainofPMV-2initiallyintheworld，whichWasfurtherconfirmedbyBLASTandthehomologyanalysisofthenucleotidesandaminoacidssequencesofLgeneofParamyxovirinaeviruses．(5)TheexpressionofHNgeneofYucaipavirusestablishthebaseofpreparationofmonocloneantibodyagasintHNprotein．2 Keywords：Avianparamyxovirus-2，ElectronmicrographandSDS-PAGE，Sequencingandanalysis，Plasmidlibrary，Prokaryoticexpression3 Yucaipa病毒于1956年首次分离于美国加利福尼亚州的Yucaipa镇(Bankowski．1956)，1964年Dinter等人证实该病毒为一种新的副粘病毒，1979年此病毒被定型为禽副粘病毒2型(PMV．2／Chicken／Califunia／Yucaipa／56)(Alexander’1980)。单纯感染禽副粘病毒2型病毒(AvianParamyxovirus-2，PMV-2)的家禽只表现轻微的呼吸道症状。自然情况下PMV-2常与其它病原微生物协同感染，造成比其它病原微生物单独感染更为严重的临床症状和病理变化，从而影响了养禽业的生产。研究还表明Yueaipa病毒能够在法氏囊、胸腺等免疫器官繁殖，具有一定的抑制免疫功能的作用．雏鸡感染PMV一2后对新城疫疫苗的免疫应答有明显抑制作用(王宏卫、赵继勋等，1998)。ShigeruKusagawa(1993)等认为Murayama病毒是Yueaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猕猴的适应株。s．Ramachandm等人(1986)还认为Yucaipa病毒在进化关系上优于仙台病毒。而Starke等(1977)则认为PMV-2可能是副粘病毒在自然界中传播的中间类型。由于PMV．2在鸡群中的感染普遍存在，同时可以实验性的感染鼠、豚鼠、猴子等哺乳动物，并引起豚鼠的支气管炎，PMV-2在实验动物检测中具有相当重要的地位，1987年WHO又将PMV．2列为SPF鸡监测的必检项目之一。PMV-2呈世界性分布，我国及周边国家和地区均有病毒分离鉴定报告，野鸟和进口观赏鸟是主要传播源，全世界已有几十个分离株，分成数个血清型。1998年，赵继勋等从一批有呼吸道和拉稀症状的进口七彩文鸟的泄殖腔内分离到两株与Yucaipa病毒有血清学关系的禽副粘病毒：F4株和F6株，紧接着又于1999年从北京地区肉鸡体内分离到一株PMV-2：F8株。赖志、赵继勋等(2000)使用自己制备的针对Yucaipa病毒的单抗L9H2对这四株病毒进行了抗原性差异分析，结果表明：该单抗只与F6株和Yucaipa毒株特异性结合，不与F4、F8两株分离株结合。HI交叉反应实验表明F4、F6、F8与标准毒株Yueaipa存在不同水平的交叉。国内外对PMV．2的报道都很少。研究报道的内容主要是关于PMV-2的流行病学和病原学，对PMV．2病毒的致病性及病理学特征的研究报道很少，对其分子生物学方面的研究，到目前为之，还未查见任何正式的书面报道。在本实验室对PMV．2的流行病学、致病性、诊断方法、单抗制各等做了人量研究的基础上。本研究将对病毒的基因组序列进行测定，从分子水平上对PMV一2做进一步的深入研究，为免疫抑制的机理研究开辟另一个突破口，为解决重大疫病NDV的预防及生物4言目前 技术的应用提供有价值的信息，也为进出口检疫和SPF鸡质量监测提供可靠的保障。对HN蛋白进行原核表达，期望能用表达、纯化的蛋白制备针对HN的单抗，为以后的研究1i作奠定基础。 文献综述副粘病毒的生物学特性1病原学Yucaipa病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridac)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)腮腺病毒属(Rubulavirus)，为PMV一2的标准毒株(Rimaetal．1995)。国际病毒分类委员会(ICTV)编写的第六次病毒分类报告将禽副粘病毒科的分类和命名重新作了修改，整个副粘病毒科分为2个亚科、4个属。包括副粘病毒亚科和肺病毒亚科。副粘病毒亚科包括副粘病毒属、麻疹病毒属和腮腺炎病毒属；肺病毒亚科包括肺病毒属。新的腮腺炎病毒属包括禽副粘病毒1．9型(PMV1-9)、腮腺炎病毒和猴副流感病毒(SV．5)。PMV．2在电镜下为多型性，一般呈球型，有脂质囊膜，囊膜脆弱易破裂，囊膜表面有长约8rim的纤突蛋白，也有报道为13—15rim(Langeta1．1975；Collingseta1．，1975)。毒粒直径为40．330nm，囊膜内的核衣壳为螺旋对称，其螺旋直径为160，螺距为55，中心孔径为50。病毒颗粒的电镜照片见图1。啊“喇帖囊毒粒子的负鞭鼍射电子量tt■片(}I自SCIENCE．ORGNETPAGE)Figurel：Negatively-stainedtransmissionelectronmicrugraphofpurumyxovirusparticlesPMV．2属于RNA病毒(Dintecta1．．1964)，Fleury等(1979)曾报道其分子量为5．6×106道尔顿。副粘病毒科病毒一般具有6-9个多肽，毒粒中含有转录酶、多聚A转移酶、mRNA甲基转移酶、神经氨酸酶等。PMV-2具有血凝性、神经氨酸酶活性和溶血活6 性，能凝集鸡、豚鼠、牛和人的“O”型红细胞，不能凝集马的红细胞。不同毒株间的神经氨酸酶活性稍有差别(Dintereta1．，1964，Lipkindeta1．，1979)。由于止粘病毒没有溶血活性，可利用这一性质来初步区分副粘病毒和正粘病毒。Dinter等人证实PMV．2对乙醚敏感，而对酸性环境及羟胺、胰酶等试剂不敏感。副粘病毒复制不受放线菌素D的影响。副粘病毒科病毒的蔗糖浮密度是1．18．1．209／cm3。Yucaipa病毒的结构蛋白多肽随着电泳条件的不同而不同。当分离胶浓度为7．5％时样品中加入2％的DTT．为还原状态时，为7条条带，由于有两条条带的分子量大小一样，电泳样品经氨基黑染色可见6条条带：在非还原状态下，为9条条带(Alexandereta1．，1974)。Nerome等(1984)用Tl寡核苷酸指纹图谱分析PMV-2毒株的核酸相关性，结果表明图谱相似，但分离株与原型株之间有细微的差别。PMV一2可在lO日龄鸡胚尿囊腔中繁殖，但鸡胚没有典型病变。PMV．2能在鸡胚成纤维细胞、鸡肾细胞、鸡胚肾细胞、猴肾细胞，以及牛、羊、猪的肾细胞，VERO细胞、HELA细胞和BHK等细胞上繁殖∞ankowkicta1．，1968)。在牛肾和猪肾细胞和HELA细胞中产生细胞病变(Bankowkieta1．，1960)，在鸡肾细胞中的CPE包括空泡形成，合胞体形成和胞浆内包涵体，在鸡胚成纤维细胞的CPE不明显，病毒增殖情况只能用血球吸附实验证明。感染PMV-2病毒的猴肾细胞培养物经HE染色，可见嗜伊红的胞浆内包涵体，间接荧光抗体染色时。荧光也局限于胞浆中。2流行病学20世纪70年代，美国家禽血清学普查结果表明，此病毒分布广泛．尤其在火鸡、雀形目鸟中分布更广(AlexanderD．J．eta1．，1985)。随后在世界各地：加拿大(Langeta1．，1975)、英I蚕(Collongseta1．，1975)、德国(Mymadawaeta1．，1977)、捷克(TumovaB．eta1．，1779)、意大利(FranciosiandPetek,personalcommunication)、以色列(LipkInd，1982)等都先后从鸡、火鸡、非洲灰鹦鹉等鸟类中分离到了Yucaipa病毒。我国及周边国家和地区，包括香港、朝鲜、日本(Asaharaeta1．，1973；Goodmaneta1．1988)、前苏联(1sachenkoeta1．，1975)、东南亚(AlexanderD．J．，1985)等均有分离鉴定毒株的报道。分离到PMV-2的鸟类多无明显病症，因此在未曾进行调查的国家中不能断言没有PMV．2(AlexanderD．J．，1980)。从1992年6月到1995年12月，有400多万只鸟从世界各地运送到新加坡，其中有1100多只在兽医中心实验室进行了病毒检查。总共分离到了28例新城疫、9例禽流感病毒、29例PMV．2和l例禽痘病毒(Koheta1．．1996)。7 1998年，赵继勋等从一批有呼吸道和拉稀症状的进口七彩文鸟的泄殖腔内分离到两株与Yucaipa病毒有血清学关系的禽副粘病毒：F4株和F6株，紧接着又于1999年从北京地区肉鸡体内分离到一株PMV．2：F8株。赵继勋(1994)等利用自制的Hl诊断试剂，还对来自北京、山东、河北、宁夏的许多蛋鸡和肉鸡场的2000多份姐清的检测结果表明，PMV．2在鸡群中的感染率普遍存在，普通肉鸡阳性率11．6％以上，蛋鸡阳性率19％以上。曹永长等(1996)利用同样的试剂对广东11个禽场20个禽群进行PMV．2的血清学调查结果表明，20个禽群均有阳性样本检出，阳性率最高为100％，最低为16．7％。1987年，WHO明确规定PMV-2为制备人用生物制品所用SPF鸡的必检项目，中国的SPF鸡群经多次检查，均未查出HI抗体阳性鸡。3致病性Yucaipa病毒晟初是从患有传染性喉气管炎的病鸡分离到的。单纯感染PMV．2的病鸡只表现轻微的呼吸道症状，食欲下降。火鸡感染症状比鸡严重，引起产蛋率、孵化率和出雏率下降(AlexderD．J．，1982)。自然情况下PMV-2常与其它病原微生物共同感染，造成比其它病原微生物单独感染更为严重的I临床症状和病理变化，从而影响了养禽业的生产(Helereta1．，1984；YeganaY．eta1．，1985；王宏卫等，1998)。Yucaipa病毒经肌肉感染37日龄鸡未能引起任何临床症状。经气管感染可引起湿罗音，但很温和。经气管接种成年火鸡末见呼吸道症状，其1VPI和ICPI指数均为O．00。A．V．Rukavishnikov等(1998)进行的病毒学及血清学的检测表明，在前苏联的大部分地区广泛流行Yucaipa病毒，51个分离毒中有23个鉴定为PMV-2，有9株已被检测过，这些分离株对鸡胚有致病性，其脑致病数ICPI可达0．00．0．66。接种30日龄鸡不表现临床症状，但可导致鸡只体重减轻及抗体产生。文献还证明Yucaipa病毒对呼吸道及肠道细胞有明显的亲嗜性。Nishikawa等(1977)从有轻微呼吸道症状的猕猴分离到Murayama病毒t而Murayama病毒与Yucaipa病毒存在着非常密切的血清学关系，有可能是Yucmpa病毒或类Yucaipa病毒感染猴后的适应株。此外，Yucaipa病毒可以实验性的感染鼠、豚鼠、猴子等哺乳动物，并引起豚鼠的支气管炎(Fleury，1983)。千宏甲、赵继勋等(1998)州SPF鸡为实验材料，进行Yucaipa病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)年¨鸡毒支原体(MG)三种病原微生物的单独感染和协同感染的实验，结果表明，7日龄SPF鸡经滴鼻点眼感染Yucaipa病毒(攻毒剂量为0．5ml含毒尿囊液／只)，8 感染病毒后第三天，表现精神沉郁，并有轻微的呼吸道症状，Yucaipa病毒与IBV或MG混合感染比单独感染这三种病原的任何一种均呈现更严重的呼吸道症状。其中以同时混合感染Yucaipa病毒和IBV或big组中的鸡的症状最严重，表现为精神沉郁和湿罗音加重，气管中粘液量增多。上述实验说明Yucaipa病毒具有协同致病作用。王宏卫等(1998)用Yueaipa病毒感染SPF鸡三天后，攻毒组和对照组均免疫接种鸡新城疫克隆30疫苗，免疫后的5．30天，每隔5天采血，检测血清中ND的HI抗效价，结果表明Yueaipa病毒感染组比对照组的HI效价平均低21092，说明Yueaipa病毒感染SPF雏鸡，可能会引起机体免疫功能抑制，导致鸡对新城疫疫苗的免疫应答有明显抑制作用。Shihmanter等(1997)在研究副粘病毒混合感染时也指出当发生两种副粘病毒混合感染时，其中一种可能会干扰另一种副粘病毒的免疫效果。王宏卫、赵继勋等的实验还证明PMV-2可在胸腺、法氏囊中增殖，在感染鸡的法氏囊中含量很多，法氏囊可作为PMV·2的分离器官。4血清学关系禽副粘病毒的血清学分型主要依据血凝抑制(HI)实验的关系．神经氨酸酶抑制(NI)实验的结果在血清学分型上与HI实验的结果基本一致。血清中和实验、补体结合实验、免疫荧光实验及放射状溶血实验等也能用来验证这些血清型与其他禽或哺乳动物副粘病毒在抗原性上的区别．PMV-2各毒株间存在着广泛的抗原变异性，往往两株血清学关系相差较大的毒株却与第三者存在较密切的相关，同时也有一些分离株存在不对称的血清学交叉关系。文献报道存在不对称血清学交叉关系的毒株有Bangor株，Robin株以及小型鸟(troglodyt8s)中分离到的两株PMV．2。为解决PMV．2各毒株间血清学交叉反应较为复杂的问题，Ozdemir(1990)等制备了针对PMV一2的三株单抗，此三株单抗可将经多抗血清认定的53个PMV．2分离株划分成四个组；结果表明，各单抗的HI反应能力的强弱不同，这也说明即使数量有限的单抗也有利于鉴定和研究PMV-2的流行情况。Starke(1977)、Dinter(1964)等认为PMV．2和人副流感2型和牛副流感3型有抗原相关性。s．Ramachandm(1988)等还认为Yueaipa病毒在进化关系上优于仙台病毒，并据此推断仙台病毒为禽类病毒适应鼠类病毒宿主后的变异株。ShigeruKusagawa(1993)ff'J研究发现分离自有临床症状的猴子的Murayama病毒(MrV)与哺乳动物的副粘病毒不存在血清学关系，但与Yueaipa病毒(YuV)存在着单向血清学关系。即抗Mrv的抗血清不与YuV反9 应．但抗YuV的抗血清却可抑制MrV的血凝性和感染能力。通过HI、NT、RIPA、ELISA实验及使用多克隆抗体、单克隆抗体进行病毒特异性多聚位点分析他们还进一步证明了MrV属于PMV一2，并推断MrV可能是YuV或类YuV感染猴后的适应株。ShigeruKusagawa等人还推测YuV可能会感染人，而Fleury等人(1983)贝U在塞内加尔的人的血清中查到了YuV的HI抗体。Starke等(1977)提出假设认为PMV一2可能是副粘病毒在自然界中传播的中间类型。因此，PMV．2在副粘病毒的系统进化地位需要进一步重视。PMV．2在实验动物检测中也具有相当重要的地位，已被世界卫生组织规定为制备人用生物制品所用SPF鸡的必检项目之一。5诊断方法由于该病无特征性病变，所以血清学反应是该病的主要检测方法。PMV．2常用的标准诊断方法是HI方法(Bankowkiela1．，1968；Senneetal，1983；Maldonado，1983，1992，1994)。赵继勋等(1994)对PMV．2血凝性进行了研究，并在此基础上成功地制备了Hl诊断试剂，己广泛用于我国鸡群流行病学普查和SPF鸡是否感染PMV-2的检测。由于PMV．2分离株较多，且各毒株之间有一定的非对称交叉反应，为确保诊断准确，选择HI滴度／>23为阳性判定标准。赵继勋等为弥补HI实验灵敏度不足的缺点，建立了免疫荧光诊断法和ELISA诊断方法。李春富等(1996)成功地建立了用DOT．ELISA检测PMV-2抗原的方法。检测36份鸡血清、9份孔雀血清，结果IFA方法阳性检出率为48．9％，HI方法阳性检出率为28．9％，说明IFA方法的敏感度高于HI方法。通过对31份鸡血清的检测，显示ELISA阳性检出率为77．4％，明显高于HI方法64．5％的阳性检出率。通过对100份待检血清的检测，显示DOT-ELISA阳性血清检出率大大提高，DOT-ELISA阳性检出率为39％．HI方法阳性检出率为21州李春富，1996；陈亮，1999)。二、副粘病毒的分子生物学特性由丁．国内外对PMV．2的分子生物学研究较少，因此本文将着重介绍本科病毒及新城疫病毒的分子生物学特性。10 1副粘病毒基因组结构各种副粘病毒都有一个螺旋对称的核衣壳。RNA是负链单股RNA，约含有15×10’--20X103个碱基，含一组串联的6个或更多的基因。有时毒粒中也含有少量的转录的正链RNA，所以提纯的病毒RNA可以部分自我退火。基因组本身不能做为mRNA，不带译制病毒蛋白质的信息，因此必须通过病毒自己的RNA聚合酶转录互补链做为mRNA。腮腺炎病毒属基因组的利用效率很高，超过95％的RNA编码蛋白质，病毒在P基因内通过阅读框的选择和RNA的剪接来提高基因组的编码容量(David，1991)。副粘病毒基因组结构的共同特征是只有1个启动子位于3’端，紧随启动子的是编码核心蛋白的基因，而后是编码囊膜蛋白的基因，编码聚合酶的基因离启动子最远，但其编码蛋白的能力几乎占据整个基因组的一半，如图2所示。在副流感病毒3型的各基因之间有一3’GAA保守序列，每一基因末端含有转录终止序列和mRNA互补的聚(A)序列，有12个末端核苷酸是半保守的：3’UUUAUU／AUUC／UUUUU5’。在基因的起始端有10个核苷酸是半保守的：3’UCCUA／CA／GUUUC，见图2。各基因翻译起始与起始端保守序列的距离各不相同。vR■^GeneendiGenustert田2剐流蓐病毒3基因组组成示意圈(引自Microbiology＆ImmunologyBS335NETPage)Figure2Schematicrepresentationofthegenomestructureofparainfluenzavirus。3新城疫病毒基因组全长为15156个核苻酸，分子攘在5．2x106至5．6x106道尔顿之间，主要包括六个基因，编码相应的六种结构蛋白和由P基因编码的非结构蛋白W和v。六种主要信使l附'qA由病毒相关RNA聚合酶顺序转录，其顺序为3’NP—P-M—F—HN·Lll 5’，然后由病毒蛋白使之甲基化、帽化和polyA化。与其他副粘病毒一样，NDV的单股基因组含有一个位于3’端的启动子，在六种mRNA之间均有一个保守的起始信号，序列为3’-UGCCCAUCUU-5’(只有L基因的起始信号不一样，为3’UUCAUUGUUA．5’)，终JL时有都有～个保守的polyA信号，序列为3’．AUUCUUUUUU．5’。mRNA起始信号和polyA终止信号之间的距离不等，通常在1．47个核苷酸之间。此外在HN基因和L基因的起始端还分别有一个41和50个核苷酸的小开放阅读框。序列分析表明NDV六种结构蛋白的基因编码区长度分别为NP为1467nt、P为1185nt、M为1092nt、F为1659nt、HN为1713nt(或173Int，HN01848nt)和L为6700nt。2副粘病毒毒粒结构和蛋白功能(以新城疫病毒为例)禽副粘病毒各科成员结构多肽有一个相似点，即都具有6-9个多肽，并且其中两种是糖苷多肽。尽管同一血清型的禽副粘病毒结构多肽非常相似，但他们在构象上与别的血清型病毒不同。同一血清型中抗原性非常近似的病毒间多肽的构象也有差异。NDV基因组编码两种囊膜糖蛋白：血凝素．神经氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)：四种结构蛋白：基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)和高分子量的RNA依赖性RNA聚合酶(L)。此外，还编码两种非结构蛋白(36kDa和33kDa蛋白)(Millereta1．，1986)。其中，NP、P和L蛋白共同参与病毒RNA的转录和复制；HN和F位于囊膜外面，分别形成大、小纤突：M蛋白构成表面的支撑物。副粘病毒糖蛋白功能与流感病毒表面糖蛋白的功能相似(ward1981)。病毒粒子结构示意图见图3。P⋯^田3副粘瘸毒粒子的结构示意田Figure3Schematicrepresentationofthevlronstructureofparamyxoviruspaticle12 HN蛋白(Hemagglugtinin-neuraminidase,HN)l麻疹病毒属的此蛋白不具有神经氨酸酶活性。称为H蛋白：肺病毒属的此蛋白无血凝素和神经氨酸酶的活性，称为G蛋白；腮腺炎病毒的此蛋白则具有血凝性和神经氨酸酶两种活性，称为HN蛋白。HN蛋白既可与宿主细胞受体结合还可与之解离(Scheideta1．，1974)。在病毒侵染过程中起着识别受体和介导病毒粘附细胞膜的作用(Giufferela1．，1982)。此外，Morrison(1991)、Ebita(1991)曹殿军(1996)等人发现并证实HN蛋白还具有促进F蛋白融合作用的融合启动功能，且该功能具有种属特异性。NDV的HN糖蛋白的主要功能区结构示意图见图4。TransmcmbraneSialicacidbjnding鲢协DimerlinkageCOOH5711577／581／616圈4NDV的ItN糖蛋白的主要功麓区培杓示●圈Fig．4AschematicdiagramofimportantdomainsandfeaturesoftheNDVHNglycoprotein横线代表不同长度的HN蛋白，U(糖基化位点)和·(潜在的糖基化位点)位于横线上方rc代表半胱氨酸残基，黑色箭头代表分子间的二硫键．数字代表氨基酸在洲蛋白中的位置·NDV的HN蛋白根据多肽长度可分为三个亚型。分别为HN0616、HN577和HN571。其中HN0616是无活性的前体蛋白，另外两个亚型是活化型蛋白。成熟的HN蛋白是由两个二聚体通过二硫键连接而成的四聚体。FIN蛋白以氨基端(N端)插入病毒脂质膜内，27—48氨基酸区域高度疏水，为跨膜区。羧基端(c端)露于囊膜表面，HN蛋白的N端具有很强的疏水性，这一区域使其固定在病毒囊膜的双层脂质}～膜内，C端露于囊膜表面。HN基因的氨基端为高变区，尤其是N端1—75位氨基酸，不同毒株间变异可达44％，羧基端则为高变区与保守区交替出现。羧基端位于病毒囊膜外t是发挥生物学功能的主要区域，故虽然HN蛋白变异率较高．但其主要功能区相对保守。一般说来，HN13 蛋白有六个潜在的Asn一桥联的糖基化位点(Asn．X．Ser／Thr)，分别位于119，341，481，508和538位。其中有5个位点为副粘病毒科病毒的共有特征(Crennelleta1．，2000；Pitteta1．，2000)。第341和48l处的两个潜在的糖基化位点通过点突变和x射线分析，被证实为糖基化位点。此外，这些潜在的糖基化位点也是由蛋白质分子间的是否有二硫键决定。HN蛋白的糖基化与否对于蛋白转移到细胞表面是非必需的，但对于维持HN蛋白的NA活性是必需的。研究发现PIV一2的HN蛋白有19个Cys残基，其中有17个Cys残基在SV5的HN蛋白是保守的，有l0个Cys残基在SV5、NDV、PIV一3的HN蛋白内是保守的．这些高度保守的Cys残基表明它们对于HN蛋白结构起着重要的作用。Jorgensen等(1987)通过对4株NDV的HN序列分析发现了预期的唾液酸结合位点(234一Asn-Arg-Lys-Ser-Cys·Ser-239)的存在，其序列与流感病毒NA的唾液酸结合位点序列一致。Kawano等(1990)对其他副粘病毒的的HN基因的氨基酸序列进行分析，也发现了这一保守区域的存在，因此怀疑这一区域与NA活性有关。Millar(1986)等在NDV、SV5距离氨基端大约400个氨基酸处还发现了另一保守区域：Gly．Ala-Glu-Gly-Arg-(Leu，lle)，与流感病毒HA基因的唾液酸结合位点序列相似。这两个保守区域也存在于PIV一2的HN蛋白，分别位于228—233和393—398．说明这两个区域对于HN蛋白的特殊功能起了非常重要的作用。目前有许多证据支持HA与NA活性位点分开的假说。即HA活性位点靠近HN蛋白的羧基端(c端)。神经氨酸酶活性位点位于I-IN蛋白的中心。单抗结合实验也表明HN蛋白的血凝素和神经氨酸酶有各自的抗原位点(Nishikawaetal。1983)。但Sheehan等(1992)对位于距氨基端(N端)约250个氨基酸的唾液酸结合位点区域进行突变，发现病毒不仅丧失了NA活性，同时HA活性也被抑制，因此怀疑HN蛋白的HA活性与NA活性在同一位点或两者位点较为接近。还有研究发现在HN分子的一级结构中心第193和201位氨基酸残基同时参与了这两种功能，所以这两个活性位点可能有某种程度的重叠(10rioeta1．，1984，1986)．然而最近对HN蛋白的晶体结构研究发现HN蛋白在分子水平上只有一个结合位点，意味着HN蛋白的HA活性和NA活性在同一位点，可能由环境因素决定这两种活性的转换(Crennelleta1．，2000)。F蛋白(Fusionprotein)F蛋白可将病毒囊膜与宿主细胞表面的脂蛋白膜融合。从而将核衣壳释放到宿主细胞浆内．F蛋白首先以无活性的F0(68KD)存在，被水解为由二硫键连接的F1(55．0KD)14 +F2(12．5KD)后，才具有感染力，说明F蛋白与NDV的致病性密切相关。两个亚单位都在N位点糖基化，进一步增加其稳定性。氨基酸序列分析表明Fl、F2片段的顺序为Nit2一F2-phe-T1．COOH，这是副粘病毒的共同特征(Collinseta1．，1994,，1996)。NDV的F蛋白的成熟结构为二聚体。F0蛋白的水解位点在距N端大约100个氨基酸处，该位点的氨基端存在一个由精氨酸和赖氨酸组成的短序列，在羧基端存在有约为30个氨基酸的疏水性长序列。不同种属的副粘病毒，甚至同种内的不同毒株，在Fo蛋白水解位点的氨基端的精、赖氨酸的数量和距离都各不相同，两氨基酸成对则标志着易于水解，致病性增强(Bankowskieta1．，1960)。M蛋白(Matrixprotein)M蛋白位于病毒囊膜的内层，在病毒粒子装配过程中参与囊膜的形成，介导核衣壳与囊膜之间的识别以维持病毒粒子结构的完整性。有资料表明M蛋白和F蛋白的相互作用对于形成具有感染性的病毒粒子至关重要。在NDV感染的过程中，大量M蛋白集中于细胞核分泌区内，且感染过程中始终在细胞核和核仁中浓集，而其他蛋白则存在于细胞浆中。NP蛋白(Nueleoeapsidprotein)核衣壳结构蛋白(NP)：副粘病毒属的核衣壳结构蛋白是核衣壳蛋白(N)的主要成分，其结构单位有两个主要区域。一是氨基端区域。约占整个结构单位的三分之二，它与RNA直接结合：另一个是羧基端区域，裸露于装配后的核衣壳表面，胰蛋白酶处理后可以由核衣壳上解离下来，表明在两区域的结合部位存在有对蛋白酶敏感的结合点。如上所述，在感染副链RNA病毒的细胞中，仅是那些没有被核衣壳蛋白包裹的病毒RNA具有病毒mRNA作用。另外，无核衣壳的RNA，在无细胞系统中是RNA合成的模板。这些结果说明，核衣壳结构单位与负链RNA病毒基因组模板活性有着密切的关系。然而副粘病毒的核衣壳蛋白中的NP和N蛋白必须与操纵RNA合成的辅助蛋白相互作用。才能完成RNA的合成。特异性抗辅助蛋白结构单位的抗体对RNA合成的抑制，也充分证明了这一点。辅助核衣壳蛋白：L蛋白(Largeprotein)和P蛋白(Phosphateprotein)是与RNA复制和转录酶促反应过程相关的主要辅助性蛋白质，包括L蛋白质和较小的P蛋白，这些辅助蛋白相互协同才能发挥作用。NP蛋白、P蛋白和L蛋白与病毒基冈15 组RNA合在一起构成了病毒的核衣壳。在RNA复制过程中辅助核衣壳蛋白的作用是在某一病毒基因的3’末端加上多聚(A)和在5’末端的转录后的修饰。研究表明，L蛋白起很重要的作用，可能在病毒转录和复制过程中起RNA聚合酶的作用。ND的L蛋白基因具有高度保守性，C端的保守性相对较小，与病毒特异性有关。至于P蛋白的功能尚不十分明确。大多数副粘病毒的P蛋白mRNA同时编码P蛋白和非结构蛋白v和w，在mRNA的第484个位置，多出1至2个鸟嘌呤碱基，则mRNA会相应编码非结构蛋白v和W(Stewardeta1．，1993；Lockeetal．，2000)。部分NDV的P蛋白序列分析表明不同毒株间P蛋白的保守性较小，故可能在病毒中起特异性作用，P蛋白的C端有两个与NP接合的部位(SatoH．eta1．，1987)。3病毒的转录和复制副粘病毒的复制与弹状病毒类似，RNA的转录也发生在核心颗粒内，50个核苷酸的先导序列可能对病毒的转录是必需的。在感染过程中，副粘病毒的每一个基因均有其相对应的不同mRNA，这些分开的mRNA是由整个基因组的多拷贝转录后加工获得，还是各基因分别转录后的产物，机理仍未完全清楚．如副粘病毒3型有6个转录物，这6个RNA均戴帽。甲基化和聚(A)加尾。整个基因组只有一个启动子。负链RNA一方面转录mRNA，合成相应的病毒蛋白质成分，另一方面转录成其互补链，再合成病毒RNA链，参与病毒包装．转录复制过程见图5．vil'iOI培啊S瘸毒转曩童■示t圈Figure5Schematicrepresentationofthetanscriptionandreplicationofp-r-myxOVirus6 4致病性的分子机理目前多项研究表明F蛋白和HN蛋白是NDV的致病性分子基础。通过}IN蛋白识别、吸附细胞表面受体而参与病毒粒子感染。而F蛋白则通过释放融合多肽，穿入细胞膜而发挥致病作用。当病毒粒子与宿主细胞接触时，HN蛋白识别细胞上的受体位点并与之结合，使自身构象发生变化，进而触发F蛋白构象发生变化，这种触发机制可能是HN蛋白对F蛋白的直接作用，也可能是细胞蛋白参与的跨膜信号传递而引发的。还有报道M蛋白也可通过抑制宿主细胞蛋白的合成而协同F、HN蛋白的致病作用。(MrissonT．G．．1988)。三、微生物基因组序列测定及其意义随着微生物的深入研究，需要人们从更高层次上把握病原微生物的致病机制及其规律，而微生物全基因测序为此提供了必要的基础。早年的核酸序列测定主要是针对一些病毒和噬菌体。FredSanger等于1977年第一个完成噬菌体OXl74的基因组序列(5836nt)的测定，随之Sanger等(1982)Y．完成^AR噬菌体(48502nt)的全基因组序列测定。80年代末和90年代初，229KB的巨细胞病毒、192KB牛痘病毒等序列也相继完成测定(ScottjG，eta1．，1990；KenjiO．，eta1．，1992)。一段时间内相对比较复杂的细菌的基因组测序发展缓慢。1995年RobertD．F．等采用随机测序法完成1．8兆碱基对的流感嗜血杆菌全基因组序列，为微生物基因组研究揭开了历史性的一页。90年代的中后期成为基因组的年代。近年来，病原微生物的基因组计划在欧美已提上议事日程。并已大规模展开。1基因组序列测定的意义首先，可以更好地了解病原微生物的致病机制以及它们与宿主的相互关系。由于细菌的致病基因往往有特殊的核苷酸序列，因此在全基因测定的基础上。用计算机分析可找到致病基因热点区，再对多种病原菌的致病基因热点区做分析比较。就可以了解病原菌共性及特异的致病基因。此外，全基因的测定还为发展研究病原菌生物学及生理学的新技术提供了基础。如在研究基因功能方面，近年来发展的“签名标签诱变”(SignatureTaggedMutagenesis，STM)技术(MichaelH．eta1．。1995)u-J"同时敲掉100多个基因，产生基因敲除突变库，从而根本上改变目前单基因研究的局限性。第三。可以寻找更灵敏及特异的病原分17 子标记，作为诊断、分型等依据。利用PCR技术、核酸探针技术和DNA芯片技术等，结合特异性DNA序列用于诊断、分型：结合特异性毒力基因可判断疾病进展；结合抗性基因甚至还可预测临床治疗效果。微生物全基因序列测定将会使分子诊断技术发生革命性的变化。第四，基因组序列测定还为临床筛选有效药物及发展疫苗提供参考。全基因测定一方面能揭示细菌耐药的确切机制；另一方面细菌优先表达的必要生存因子，选择这些因子作为药物的靶位点。此外，可通过计算机预测病原的保护性抗原(通常位于表面且具有很高的免役原性)，制备传统疫苗或基因疫苗。第五，可提高对人类相关基因功能的认识，为探讨人类遗传性疾病机制提供参考。2全基因组序列测定的方法和策略最初，人们只能通过测定RNA的序列来推测DNA的序列。这种方法既费时又不准确，测定10-20几个核苷酸往往需要花费l-2年的时间。1977年，Sanger的酶法以其快速和准确性取而代之了Maxam和Gilbert的化学法。1986年，Smith用四色荧光标记的测序物，单一泳道电泳，激光诱导荧光法(LIF)进行测序，使测序方法由手工进入自动化操作：Prober则采用荧光标记双脱氧核苷酸良终止法进行测序，这两种方法分别被Perkin—Elmer和Dupont公司商品化为测序仪。从而引发了大规模测序的开始，不仅效率高，而且测序质量也比手工操作高得多。由于DNA多聚酶的不断修饰和荧光底物的不断更新，直到如今，荧光测序仍保持其主导地位．毛细管电泳也有可能在不久的将来取代现在的平板电泳。近年来．人们研制的DNA芯片技术也会极大的提高测序速度和效率。基因组序列测定需要很多反应才能完成，因此除了基本技术和仪器外，测序的策略也很重要，是关系到整个工作效率的大问题。目前，常用的两种策略为：鸟枪法(shotgun)和引物步移法(primerwalking)。2．1鸟枪法鸟枪克隆策略是DNA片段经超声切断，随机亚克隆到载体上，构建基因文库．而后进行DNA序列测定．经计算机进行数据分析。排出完整的DNA序列。该策略的成功实施是建立在高度自动化的DNA序列测定技术上的．尤其是荧光自动化测序仪以及计算机序列分析软件方面的成果。应用这一技术首先完成了流感嗜血杆菌全序列测定，目前这一技术几乎成为微生物基因组测序的标准方法。其步骤是：先将细菌染色体DNA机械性随机切割成一定范围的片段，分别构建小片段和大片段两套文库。小片段文库选择1．6．18 20kb的切割产物，经末端修补处理后克隆至pucl8质粒载体的Smal位点中，其目的是尽量减少单个插入片段中存在完整基因的可能．因为某些基因表达的毒性产物可致死宿主菌，从而使该片段丢失。导致测序过程中缺口(gap)总数增多。构建大片段文库，以克隆15-20kb的随机切割DNA片段。两种文库构建完成，随之对其插入片段进行大规模的PCR循环测序。一般每条测序长度在500nt左右，其精确性在97％以上。在流感嗜血杆菌中．用于组装的24304个序列片段(comig)，其总长度为11．6Mb，为原基因组的6倍序列。根据泊松分布。未测碱基的概率为Po=e“(m是序列覆盖率)。在流感嗜血杆菌测序中，其测序总长度为原基因组的6倍，未测碱基概率为Po=e-618000rpm离心1rain。4)取出离心柱，倒掉液体，将离心柱重新放入离心管中，加入500pIC液(用前用无水乙醇l：l稀释)于离心柱中，≥8000rpm离心lmin。5)重复步骤4。6)≥15，000rpm离心Imin，以甩干剩余液体。7)将离心柱置于新的离心管中，加入≥50℃预热的D液15山，保温静置2min。8)≥15，000rpm离心Imin，管底即为所需DNA。9)重复步骤7和8，再次回收剩余的DNA。10)分别取第一次回收的产物l山、第二次回收产物3山与Marker一起电泳，估测回收产物的浓度。4．6感受态细胞的制各1)将大肠杆菌DH5d从甘油冻存管中取出，在LB固体平板上划线，37℃倒置培养过夜。2)挑取1个单菌落分别接种于3mlLB液体培养基中，2,00rpm／min，37℃振摇培养t2-16h，取lml培养物分别加入到100mlLB液体培养基中，37"0振摇培养2．5h，使培养物OD600达到0．4．0．6。3)将培养物冰浴10min，4"C4,000rpm离心10min，弃上清。4)将沉淀重悬于10ml预冷的0．1mol／LCaCl2内，冰浴1h。5)4"C4,000rpm离心lOmin，弃上清。6)沉淀用2ml预冷的含15％甘油的0．1mol／LCaCl2重悬．冰浴数分钟后，200pl，管分装，．80℃冻存。4．7PCR产物与质粒载体的连接所用克隆载体为Promega公司的pGEM-Teasyvector。插入片段与载体的比为3：1。 在O．5ml微量离心管中分别加入4株毒株的PCR回收产物，并依次加入下列成分2xBuffer：10plT-easy载体(50ng)：lp．IPCR回收产物：89l(根据回收产物的浓度)T4DNA连接酶OU／／．t1)．-lpl总体积为15m，14"C连接16h。4．8质粒的转化1)从．80"12冰箱取出4管感受态细胞，迅速冰浴化开．2)将10pl连接产物分别加入到感受态细胞内．轻轻混匀，冰浴30min。3)42℃水浴90s整。不要摇动离心管。4)迅速冰浴5min。5)分别加入800plSOC培养基，37"C，150rpm振摇培养1．5h。6)取100pl振摇培养物涂布在预先涂布了IPTG和X—Gal(终浓度均为800ug／平mr)含Amp的LB平板上，37"C放置至液体被吸收。7)倒置平皿，于37℃培养20h。8)于4℃将平板放置数小时。使兰色充分显现。4．9阳性克隆的初步筛I盎-细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查1)用无菌牙签挑取单菌落的一小部分，在含抗生素的琼脂母板上划线。所有的菌落均照此影印妥当之后，将平板于37"C培养若干小时，然后保存于4"C。2)将原始平板上1个兰斑和其余白斑的剩余部分分别转移到不同微量离心管中，管中放有30pl1xCracking溶液。剧烈振荡30s。3)用1％琼脂糖电泳检查。4．10阳性克隆鉴定t定。重组质粒鉴定的方法有多种，本试验选用了限制性内切酶酶切的方法来对阳性克隆鉴 4．10．1碱裂解法提取质粒I)挑取1个兰斑和4株毒株的数个初步鉴定为阳性的菌落，分别接种于1．5ml含Amp的LB液体培养基中的Eppendorf管中，3TC振摇培养16h。2)4，000rpm离心5min，弃上清。3)用0．5mlSTE冲洗沉淀，离心弃上清。4)加入100p1预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全溶解，冰浴5min。5)加入2001-tl新配溶液II，迅速轻轻颠倒几次Eppendorf管(勿振荡)，冰浴5rain。6)加入1501al溶液Ⅲ，轻轻振摇lOs，混匀，冰浴5min。7)12，000rpm离心5min，将上清小心转移至另一离心管，切勿吸到下层液体。(必要时，可用苯酚：氯仿：异戊醇抽提一次。)8)上清中加入2倍体积的无水乙醇，室温放置10min或．2032放置2h。9)12，000rpm离心5min，弃净上清。10)加入lml70％乙醇洗涤沉淀，12，000rpm离心5rain，弃净上清。11)置无菌台内风干30min，直至完全干燥。12)沉淀溶于201．tlTE(含50ng／mlRNase)中，3TC作用30min。13)．20℃冻存。4．10．2It组质粒酶切鉴定根据已知序列的酶切位点图谱，选用EcoRI对4株毒株的所提质粒DNA进行酶切鉴定，所加样品如下：DNA溶液：5p．1EcoRI(15U／p．I)：lp,l10×Buffer：2ul去离子水：121al离心，混匀，3TC作用4h，65℃灭活20min。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，观察结果。4．1l质粒大抽提1)分别接种4株毒株的阳性单菌落于8ml含Amp的LB液体培养基中。37℃振摇培养12．16h。37 2)按1：100的比例接种培养物于500ml含Amp的LB中，37"(2振摇培养12．16h。3)4"C，4．000rpm离心10min收集菌体。4)沉淀用15mlSTE悬浮，4℃，4，000rpm10rain再次离心收集菌体。5)沉淀重重悬于18ml溶液I中。6)加2ml新配溶菌酶溶液。7)加40ml新配制的溶液II，盖紧盖，缓缓填倒数次，充分混匀内容物，室温放置10min。8)加入20ral预冷溶液m，轻摇混匀，冰浴10min。9)4℃，4,000rpm离心15min，自然停转。10)将上清转移至另一瓶中，加入0．6倍体积的异丙醇。充分混匀，于室温放置10min或-20℃放置2h。11)4"C，1，5000rpm离心15min，弃净上清。12)沉淀以70％乙醇洗涤沉淀洗涤一次，风干沉淀13)溶于3mlTE(含RNase)中，分装保存于．20"C。4．12测序：测序引物为通用引物T7、SP6，用ABl3700全自动DNA序列分析仪测序。由上海联合基因公司合成中间测序引物并完成测序。4．13序列同源性比较应用Omiga2．0，DNAMAN，DNASTAR4．5，DNASIS、GENIX)c等软件对所测序列进行比较。5．结果5．1RT-PCRl用TRIZOL法提取病毒RNA，用特异性引物进行RT-PCR。产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在大约2．0kb处有一条目的条带。结果见图2．1：38 圈2．14株PMV-2的RT-PCR啊球靖果1．^DNAEcoRI+HindrllMarhr2．Yuciipa■毒的RT--PCR产物3．F4分膏株的RT-PCR产物4．“分膏株的RT-PCR产啊S．F8分膏株的RT-PCR产物Figure2．1RT-PCRoffourstrainsofPMV-21．^DNAEcoRI+HindmMnrkcr2．RT-PCRofYucaipavirus3．RT-PCRofF4strain4．I玎-PCRofF6strain5．RT．PCRof鹋strains．2阳性克隆的酶切鉴定分别提取4株毒株的阳性克隆及兰斑克隆的质粒，用EcoRI进行酶切鉴定，电泳结果可见兰斑质粒酶切产物为一条约3．0kb的载体条带，4株PMV-2的阳性克隆的酶切产物均可见一条约3．Okb的载体条带及约2．0kb的目的条带。结果见图2．2：嗣2．24株PMV-2的重组曩牧●切奠定l_^DNAEcoRl+HindmM-rker2．Yueaipx囊毒的的一牧一切锖果3．F4分膏椿的质粒蠢切蛄果4．F6分膏株的曩牧■切培粟5．髓分膏槔昀■粒一切培果6．兰斑质粒的一切始果 Figure2．2EnzymedigestionoftherecombinantplasmidsoffourstrainsofPMV-21．^DNAEcoRl+HindlIRMarker2．Yucoipa／EcoRI3．F4／EcoRI4．F6／EcoRI5．F8／EcoRI6．Negativeclone／EcoRI5．3序列测定与分析测序峰图见附图Ⅳ：Pagell6--Pagel25。通过序列分析，发现4个分离株的HN基因同源性较高，每个基因均含有一个完整的ORF，含有1743个碱基，编码580个氨基酸，推测其分子量约为63kDa。序列测定结果已输入GENEBANK，ACESSIONNUMBER分别为AF515836，AF515837，AF515838，AF515839。用DNAMAN软件对所测的四株PMV-2与D14030的序列进行核苷酸与氨基酸的序列同源性比较，5个PMV．2的核苷酸序列同源性为99．89％，氨基酸序列同源性为99．69％。根据核苷酸序列同源性比较，使用DNASIS2．5绘制的基因遗传距离图见图2．3。五病毒的核苷酸序列比较见附图2．1。其中HNYUCA．1为GENBANK中所查序列(D14030)。HNY为我们实验室所保存的PMV-2的标准毒株的HN序列。HNY88，HNY69，HNY42分别为F8、F6和F4株的HN的核苷酸序列。HI,／Y11．SE0Iti口Y88．SEOHNY69．SEOHNY42．SEO卸5rrUCA-1．SEO6讨论圈2JPMV．2的鼍传魇膏圈Fig．2．3ThegeneticdistanceofPMV-299．5每6．1五个PMV．2的核苷酸序列同源性比较由圈2．3、附图2．1可见五个PMV．2的HN基因的核苷酸同源性很高，从分子水平上进一步证实儿株分离株均为PMV．2。核苷酸序列同源性比较差异不人，相比较而言，国内从鸡体内分离株F8株与我们所保存的标准毒株的同源性最高。本实验室保存的4株毒株的同源性高于GENBANK中所查序列．值得关注的是尽管F4与F6株分离于同一批进口40 七彩文鸟，F6株与实验室保存的标准株及从国内鸡场分离的F8株的同源性却高于与F4株的同源性。6．2HN蛋白的氨基酸序列分析对所测的4株病毒及报道的Yucaipa病毒的HN蛋白的氨基酸序列进行分析。同时分析了几株与Yucaipa病毒有一定血清学关系的病毒的I-IN蛋白的氨基酸序列。所选取的病毒的详细情况可据表1中的GENEBANKNUMBER中获得。(1)Cys残基分析t利用突变技术研究发现突变半胱氨酸残基(Cys残基)中的任何一个，都会影响biN抗原位点的形成。通过对所测的4株氨基酸序列分析发现PMV-2的氨基酸序列含有15个cys残基。作者发现尽管Murayama病毒与Yucaipa病毒的氨基酸序列的同源性只有73．23％，但是这15个eys残基却全部保守。这其中还有9个cys残基在NDV(F48E9和LASOTA株)、HPI-2和BIV-3也是保守的。这些高度保守的eys残基表明它们对HN蛋白的结构起着重要的作用。Sendai病毒与PMV．2也有9个cys残基保守，只是这几个保守的cys残基的位置与前边所提到的9个保守的cys残基位置不同。(2)神经氨酸曹活性位点分析I通过对所测的氨基酸序列分析发现在235-240位存在六个氨基酸的保守序列：235-Asn-Arg-Lys．Ser-Cys-Ser-240。与流感病毒的神经氨酸酶的唾液酸结合位点序列一致，这与Jorgensen(1987)、Kawano(1990)的报道一致。他们怀疑这一区域与FIN蛋白的神经氨酸酶活性有关．作者对副粘病毒科的18株病毒的HN蛋白的氨基酸序列进行了分析，发现这些病毒中所有属于腮腺炎病毒属和副粘病毒属的病毒的FIN蛋白在大约250位氨基酸左右都有这一保守序列。同时，作者发现麻疹病毒属及肺病毒属的病毒的这一蛋白都不具有这一保守序列，由于麻疹病毒属及肺病毒属的病毒的这一蛋白都不具有神经氨酸酶活性，因此从反面进一步论证了这一区域确实与FIN蛋白的神经氨酸酶活性有关。(3)糖基化位点分析1分析发现，PMV．2及Murayama病毒均含有5个潜在的Asn桥联的糖基化位点，分别位于118、278、346、391、488位。4l 6．3PMV-2与有抗原相关性的其他病毒的HN蛋白的分析比较作者选取了几株报道与PMV一2有一定血清学关系的毒株一起进行HN蛋白分析(所选取的病毒的详细情况根据表1中的所列的GENEBANKNUMBER中获得)。其氨基酸序列同源性比较分析见附图2．2。6．3．1蛋白质亲水性分析对PMV-2及Murayama病毒、Sendal病毒的HN蛋白进行亲水性分析，结果见附图2．4。由图可见，与所报道的其他副粘病毒一样，在PMV．2的HN蛋白氨基端大约27-48的区域表现为高度疏水，为跨膜区，FIN蛋白以其氨基端插入病毒的囊膜。Murayama病毒的HN蛋白的亲水性图谱与PMV．2极为近似。而Sendai病毒的HN蛋白的亲水性图谱与其他病毒的差异比较明显，其跨膜疏水区的位置也略微靠后，大约在N端30-60个氨基酸处。(其中Yu代表本室保存的标准毒株，Yueaipa代表D14030所测的标准毒株，以下同。16．3．2表面抗原分析作者选取报道与PMV-2有一定抗原相关性的毒株：Murayama病毒、Sendai病毒、牛PIV·3和人PIV-2与所测毒株一起进行分析。同时作者还选取了NDV强毒株F48E9、NDV弱毒株Lasota毒株一起进行表面抗原分析。表面的可能性结构分析见附图2．5，抗原指数分析见附图2．6。由附图2．5可见，几株PMV．2的表面可能性结构图谱近似，F4与F6未见明显差别．Murayama的表面可能性结构图谱与PMV．2的最为近似。而Sendai病毒的表面可能性结构则与PMV-2及Murayama病毒的相差甚远。作者还同时比较了NDV的强毒株F48E9和弱毒株LASOTA的表面可能性结构图谱。发现两者在第70位、325位、440位、500．520位、570位氨基酸附近的图谱分析差异明显。比较PMV-2的这几处的表面可能性结构图谱，发现PMV一2与弱毒株LASOTA的更为近似。分析几株病毒的抗原指数图谱发现，它们的抗原指数图谱近似，F6在第560位氨基酸附近与F4的存在差异，但与本室保存的Yu的表现相同；而F4的这一区域的抗原指数的变化与F8的变化相同。这一现象与赖志、赵继勋等使用单抗L9H2能将4株PMV一2分为两组的结果一致。他们发现L9H2能与F6和Yu特异性结合。而不能与F4、F8特异性结合。仍然是Murayama的抗原指数图谱与PMV．2的最为近似，Sendal病毒的抗原指数图谱与PMV-2及Murayama病毒的存在一定差异。比较F48E9和LASOTA的抗原指数图谱．发现两者在第55位一70位、125位一14042 位、260．275位、425．440位、500．520位、565位氨基酸附近的图谱分析差异明显，这些位置与两者的表面可能性结构图谱存在差异的位置部分重合，不知这几处是否与其毒力差异也有一定的关系。比较PMV．2的这几处的表面可能性结构图谱。依旧是PMV-2与弱毒株LASOTA的更为近似。作者将LASOTA毒株、F48E9毒株分别与Yucaipa毒株的氨基酸序列和核苷酸序列进行了同源性比较，发现LASOTA毒株与Yucaipa毒株的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性较F48E9毒株与Yucaipa毒株这两者的同源性均高。这一现象与PMV一2的致病性不强是否存在一定的关系，仍需进一步探讨。通过与副粘病毒科的人的呼吸道合胞体病毒(GENEBANKNUMBER：NC_001781)的表面可能性结构图谱及抗原指数图谱(见附图2．7)的对比，可以发现这几株副粘病毒的表面可能性结构图谱及抗原指数图谱基本走势相同，存在一定的相关性。6．4Murayama病毒、Sendai病毒与PMV-2的关系推断S．Ramachandm等(1988)推断仙台病毒为禽类病毒适应鼠类病毒宿主后的变异株。ShigeruKusagawa(1993)则推断Murayama病毒可能是Yueaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猕猴后的适应株。通过对三者的HN蛋白的核苷酸序列同源性比较、氨基酸序列同源性比较以及HN蛋白的cyS残基分析、糖基化位点分析、神经氨酸酶位点分析以及HN蛋白的亲水性分析、表面可能性结构分析、抗原指数分析，可以看出Murayama病毒与Yucaipa病毒有着非常密切的血清学关系，而且从基因进化树上我们也可以看到Murayama病毒与Yueaipa病毒的亲缘关系较NDV、PMV-4、PMV-6都要近。因此，我们在国际上首次从分子水平上进一步论证了Mumyama病毒可能是Yueaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猴后的适应株。同时我们可以看到Sendal病毒与PMV-2在上述分析中存在的差异较大，不能充分证明s．Ramaehandm关于二者关系的推断。从表2．1中也可以看到Sendal病毒的FIN蛋白的氨基酸序列的同源性低于核苷酸序列的同源性(由于存在同意突变·通常情况下是氨基酸序列的同源性高于核苷酸序列的同源性)，作者认为这一现象的产生可能是由于核苷酸在翻译成氨基酸时存在的种属偏好性造成的。三者比较情况详见表2．I。 2．IMurayama瘸毒、Sendai瘸毒与Yucaipa瘸毒的部分特征的比较与YucaipaCys残基糖基化位点神经氨亲水性病毒HN基病毒I-IN蛋酸酶位分析、表因的核苷酸白的氨基酸点分析面可能序列同源性性结构比较分析、抗原指数分析Yucaipa病100％15个5个235．240一致毒位Murayama67．18％73．23％15个，且分7个．且有5235-240近似病毒布位置与个分布位置位Yucaipa病与Yueaipa毒～致病毒基本一致Sendai病39．4l％24．53％17个，其中4个，分布254．259存在一毒有9个cys位置与前两位定差异残基分布与者很不一致Yucaipa病毒～致6．5根据本科病毒HN基因的氨基酸序列比较建立基因迸化树选取PMV-2及本科病毒各种属的代表毒株。进行I-IN基因的氨基酸序列同源性比较并建立基因进化树，从分子水平上对本科病毒的分类做一论证．所选序列详情可根据表l的GENEBANKNUMBER查询。结果见附图2．3．由图可见一有趣现象，即肺炎病毒属(人呼吸道合胞体病毒G蛋白：AaHGhrv和牛呼吸道合胞体病毒G蛋白：Aahgcrv)的G蛋白与副粘病毒属和腮腺炎病毒属的HN蛋白的遗传距离较麻疹病毒属的H蛋白(牛瘟病毒H蛋白：aahncdv和麻疹病毒H蛋白：Aahnmeasles)与副粘病毒属和腮腺炎病毒属的HN蛋白的遗传距离的要近。而我们知道副粘病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属同属于副粘病毒亚科，肺病毒属则属于肺病毒亚科。作者仔细观察了氨基酸序列的同源性比较图谱(图谱未给出)，发现尽管G蛋白只有大约300个氨基酸，最大同源性比较中常出现大段的空白。但是较H蛋白(大约617个氨基酸)而言，确实是存在更多的氨基酸与HN蛋白(大约580个氨基酸)同源。这一现象与副粘病毒科病毒的分类与进化的关系有待于进一步探讨。 6．6关于F4与F6的关系尽管F4与F6株分离于同一批进口七彩文鸟，但二者却存在一定的差异。赖志、赵继勋等(2000)对四株毒株进行的HI交叉反应实验结果发现分离株F4与Yucaipa毒株的HI效价相差最大，有4倍的差值。通过对所测的4株PMV-2的序列进行比较，发现F6株与从国内鸡场分离的F8株及本实验室保存标准毒株的同源性高于与F4株的同源性。分析由4株毒株的HN基因氨基酸序列推断的抗原指数图谱也发现，在第560位氨基酸附近F6与Yu的变化一致，F4与F8的变化相同。这一现象与赖志、赵继勋等使用单抗L9H2能将4株PMV-2分为两组的结果一致。他们发现L9H2能与F6和Yu特异性结合，而不能与F4、F8特异性结合。四株毒株的血清学关系与核苷酸序、氨基酸序列比较结果一致。通过上述分析，我们从分子水平上进一步证明分离自同一群七彩文鸟的F4株与F6株为两株不同的PMV．2。究竟是两株PMV．2同时感染了一群七彩文鸟，还是这群七彩文鸟为一混合群，亦或是还存在其他的原因。需要我们进一步探讨。45 附田2．1五株PMV-2的棱苷奠序列同并性比较ExtraFig2．IThehomologyanalysisoftheneucleotidesoffivestrainsofPMV-2virush祖W‘，Xqr叫tl■T‘lHⅢC^I，^h咀1l■Y‘，H目UC^I舰mruh社W‘，HⅣI，C^I孙h社HwMMl叫l■邓，H瞰茸^IlAh神1W“c口““c_钾，-眦Ⅻt弘"々"q啭掣七|‰弘nc扯●‘咄‘●嚏H“口kcct■kⅢ‘■i‘乞‘n，‘c鸸口毗c●'m弘，‘f铀，王cct-tc々n俨q坤，-¨k-％-c‘弘“，“川nc““社，’弗‘峨口f々，-“■‘nc‘““叼州％m“‘口I蝴托哺f-■f嚏肿心叼哺¨‘"tIc々．-矗ng¨洲们托‘ft弘·，‘邺扯“-钾·●婶I乞呻·●fnu·‘％‘‘^fctn哺‘慵‘^n^p^‘nccaag㈨—‘cct■-kc々扯札n—●ct·-的■：啼dm，，·htc螂n々‘‘n．々●9弘‘d|々c“m'争，饰●c々c●c●々●-cn￡It々f_‘t-g，吡—fc‘g■nf●1fc-咄c‘一n'‘n-々【々c々【々-■’睁，c々，⋯■“●¨¨¨¨¨ⅢⅢⅢⅢⅢ虻nn”牡¨¨¨¨¨●●●●●●‘t‘‘‘‘I‘； hwnh忸HmC^I，^h枇m¨H-郏C^l融l呲HmC^IHh忸h“m¨HIM^IP^l●枇l■弭，h枇h祖cx≈cgcag&cEgg一‘fc々nc协c协，c¨c■fc-f“f饥砷钳岫n“c_k心钾“咖nf●，cI々c舭fn⋯n扯肿乖，n—x【鼬f‘—砖蜘qm●“扯-，--nf稍衅址-"kt●砖【‘弗t々-‰脚々“n-cc呻咖-巾肼曲‘一-弘髑钉岬‘弘cf_№c¨扣nn钉啊9‘一f‘c-舭扯t，‘●扯c々●如n钾神，协-¨●竹鲈‘^n心fu鼻|叼n●n州●f·’“471．¨1●¨U舢1●‘●1●¨】1l●U¨】1t●1l●●1l¨1t¨1￡¨1t●●1“Olj¨1¨●mⅢⅢⅢⅢ川川ⅢⅢⅢⅢⅢⅢⅢⅢ h忡h¨m●Ih忸目Ml*I，I—帅c^I■Ah枇1日”埘nl矗露‘，HbmC^I轴h祖W¨l-Ⅳ"g-c¨扯协址口f，-§西f—口‘fg‘竹【E“·c_‘nfcc々9c々簪c々一一C々ccgg，-坼玮c-，-‘m‘’f‘●n¨一扯q洲儿n·扯-#·扯-怫巾相霸％■哗·’ht慵q“fn“々_哺cc^钾⋯c¨“岬稍伸fuct‘●舭'-铲们u‘t‘-c‘“c“f々■晦“脚弘_∞弘驰弘●'—‘ctc^扯c-¨-c矗●‘协‘‘钾‘扯Ⅱc-“‘9帕扯“●f矗曲咐‘相岫●弘铲-‘●哪嘲相々‘●舭帅q●^‘■呶似q—蝴pp讳邺“‘‘扯‘"‘“nn●-乒481$401‘‘．1“●14t01I¨1‘le】J¨lIlo1‘t●】J●●U●●■¨●1¨e1‘I●1‘¨Usei‘I●1‘¨上，‘L11‘L17411’札1’‘L 附圈2．2有一定血清学相关性的喇粘病毒的HN蛋白氨基奠序列的同黑性比较ExtraFig2．2ThehomologyanalysisoftheaminoacidsofHNproteinofserum-relatedp_r_myxovirin_evirus ^0删f4BAalasota^删Y从F8唧^j丁qf珊^▲r6HN^^YUC▲Ip^H^^坷灿uravakahnavl6QYYTPGDKmAahnsvSAehnhpi2^删S聃D^IAehnMIv361i 附圈2．316株副粘瘸毒科瘸毒的HN氯基t序列绘制的系麓发育进化树Extra]Fig2．3ThehomologytreeoftheaminoacidsofHNproteinofP●r_myxoVirid_eviruses 附图2．4PMV-2与Murayama病毒、Sendni瘸毒的HN蛋白的索水性分析ExtraFig．2．5ThehydrophilicityananlysisofHNproteinofPMV-2，MurayamaandSendalVirusYUCAIPAYUF4MURAYAMA”'0，)1O017，15O”5}D0}}5750，，5j0Oj?5jSO3，54D0I?5I5D¨5S0D575D57SENDA 附圈2．5几株剐粘瘸毒科瘸毒的HN蚤白的表面可能性姑构圈誊ExtraFig．2．5ThesurfaceprobabilityplotofHNproteinofsomeparamyxoviridoevirusesYu广_F百]—百两1万F而习可五百而1五F五可万F百丽1再F面砑k一，唧k也切姆时渤，，曰叁冒b耐_k‰^。～IL霄。^^L，4F4]。，二!。；!。2：』i。二。二二2二』：e二二二：i：I二。二之i．1二二：。：!U二C]F6I矗圈^唧抽啊小忉耐咖^j-▲即州以扣^—洲ku即叼：山F，以咆啊姆，尊。，．一，h，一1．M-I__纠，l|—1J‘．_．．可。iJ4J咖_JMurayamab露墨：Jk啜k，1bk．t如。夺。鼎．凡雷酋曙L．露曲。直I。可，。一，厶。；凡哪．F^。k划7，’oJ51oD?s15o1¨}oo?}57，o?75】boj2535D375Io口I75I5oI，55oD575{5o5iSendai F48E9lI墨了．口k也帅舸忉，^督且J。：上。A址蝻钾u如。k』舢j，对fLASoTA1．：基曩霸弋A—d内。；响．～，．，～，IU-I．．．▲-山～．钿^山啼-lk囊-J，；叼JHPIV．2BIV．352，5D75O0171B”5}0O”?0”3032535O37‘D0I2Sl5D47O0”jDb‰“止，耐山¨_耐n．I上．▲-一^u～。一^LJ冉一“^一 附圈2．6几株剐粘瘸毒科瘸毒的HN蛋白的抗愿指数圈■ExtraFig·2．6TheantigenicindexofHNproteinofsomeporamyxoviridaeviruesYucaipaYuF4F6Murayama]I|l—^／．一J-IIll^，I汕^---．．．山U^一～-I▲1-_IM--II_一7，，0510D”，501，52On}，525O?，5j0Dj，5j50j75l0Ol?5I5Dl5，D057s"D’jSendai HPI．21：]J-．I山--．▲“，．MM土Ⅲ从d．-I一-U．W{，01，F48E9LASOTA 附图2．7人呼吸道合胞体病毒的G蛋白的抗原指教圈谱与表面可能性结构图谱ExtraFig．2．7TheantigenicindexandsurfaceprobabilityplotoftheGproteinofhumanrespiratorysyncytialvirus 1材料第三部分L基因的3’端测序I．I病毒tYucapia标准毒株，由本实验室保存。1．2SPF鸡胚t山东家禽研究所提供。1．3菌种lE．coliDHlob由生物学院曹云鹤博士惠赠。1．4质粒lpGEM-7ZF(+)vector，购于华美公司。1．5试剂盒IRNA提取试剂：TRIZOL试剂购于Gibicol公司；DNA纯化回收试剂盒购于鼎国公司；RiboClonecDNA合成试剂盒购于Promega公司。随机引物标记试剂盒购于宝生物公司。1．6工具酶及化学试剂IRNasin、限制性内切酶购于宝生物公司；1"4DNAligasc购于Promega公司：DEPC、IPTG、X-gal购于上海生工；EcoRl+HindIllMarker购于原平皓公司；胰蛋白胨为Sigma公司产品：酵母提取物为OXOID公司产品；PolyA聚合酶为G1BCO公司产品。a．”P-dCTP购于北京亚辉生物工程公司。1．7步移引钧P$s5’-CGAATACTGAGGGAGGGT-3’，位于HN基因终止密码子上游164个碱基处．由jE京赛百盛生物工程公司合成。由北京六合通技术发展有限公司完成测序。2试剂配制一所有配制的溶液除经特殊说明外，均经15磅／平方英寸高压蒸汽灭菌20rain，而后贮藏于4"C。凡用于RNA实验的双蒸水、试剂(含"Iris的试剂除外)、容器均用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理并高压。(I)0．5mol／LEDTA(pH8．O)I在160ml水中加入37．279EDTA-Na·2H20，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10NNaOH溶液(约15m1)调节pH值至8．0，然后定容至200ml。(2)Imol／LTris·CI(pH8．0)I在160ml水中加入24．229Tris碱，加入浓HCI调节pH值至8．0，定容至200ml。(3)TEBuffer(pH8．0)IlmlImol／L的Tris·CI(pH8．o)和0．2ml0．5mol／LEDTA(pH8．0)混合，定容至100ml。60 (4)50XTAE：1219Tris碱，28．55ml冰乙酸，50ml0．5mol／LEDTA(pH8．0)混合，定容至500ml。(s)6x凝胶加样曩冲蒗·0．0259澳酚兰，0．0259二甲苯青FF，3ml甘油加入一定量水中溶解混匀，定容至10ml，分装，4℃保存。(6)1％琼脂糖凝胶ll×TAE100ml加入19琼脂糖，加热融化后加入5ulEB(10mg／m1)，混匀，室温放置。(7)20mg／ml氨苄青霉素贮存液t100mg氨苄青霉素溶于5ml灭菌水中，过滤除菌，分装冻存。(8)10％甘油l倒取10ml甘油，定容至100ml。(9)LB培养基。950ml去离子水中加入胰化蛋白胨109，酵母提取物59，NaCI109。溶解后。用5NNaOH调节pH值至7．0，加水定容至1L，分装10磅高压灭菌，贮存于4"12。Oo)舍氨苄青霉素LB平扳·500mlLB培养基中加入7．59琼脂粉，融化后高压灭菌t待冷却至约50"C左右，加入氨苄青霉素至终浓度为lOOpg／ml，倾倒平板。(11)SOB培养基l在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨209，酵母提取物59，NaCl0．59。完全溶解后，加入250mmoFLKCl溶液100ml，用5mol／LNaOH溶液调pH值至7．0，加去离子水定容至lL，高压灭菌20min，使用前加入经过滤除菌的2MM矿+(IMMgCl2，1MMgS04)．(12)SOC培养基lSOB培养基lL经高压灭菌，冷却后，加入10ml经0．22pm滤膜除菌的3M葡萄糖溶液。(13)3MNaAc∞H5．2)l在80ral双蒸水中溶解40．819NaAc·3H20，用冰醋酸调pH值至5．2，加水定容至100ml。(14)RNA奠溶液l将胰RNA酶溶于10mMTris·CI(pH7．5)，15mMNaCI中，配成10mg／ml的浓度，于ioo'chl热15min，灭活DNA酶，缓慢冷却至室温，分装成小份，冻存于．20℃。(1s)10％SDS：在90ml双蒸水中溶解109电泳级SDS。加热至68"c左右助溶，Jj口／X．)L滴浓盐酸调pH至7．2．加水定容至100ml。无需灭菌即可置室温备用。(16)10mol／LNaOH：409NaOH加80ml水溶解，定容至100ml，室温保存。(17)IPTGl250mgIPTG溶于1．25ml双蒸水中，过滤除菌，分装冻存备用。(18)X—Gall20mgX．Gal溶于lml二甲基甲酰氨中，以锡箔纸包裹容器··20"(2冻存备用。6l (19)2XCracking涪液：0．IMNaOH，0．01MEDTA(pH8．0)，l％SDS，0．05％溴甲酚绿，10％甘油。(20)制鲁提取质粒DNA的试剂‘STE：1．179NaCl，2mllmol／L"Iris。HCI(pH8．0)和0．4mlO．5ml／LEDTA(pH8．O)，加160ml双蒸水溶解混匀，定容至200ml。·溶液Il0．999葡萄糖，2．5mllmol／LTris·HCI(pH8．o)和2ml0．5mol／L的EDTA(pH8．0)，加80ml双蒸水溶解混匀，定容至100ml，10b／ins高压灭菌。·溶液ⅡlO．2mol／LNaOH，I％SDS，现用现配。·溶液Ⅲl60ml5molfLKAC，l1．5ml冰乙酸，双蒸水28．5ml。总体积为100ml。(此溶液无需灭菌)。·苯酚l氯仿l异戊醇tTris饱和酚静置分层后吸取下层溶液25ml，氯仿24ml，异戊醇lml，混匀，上层覆盖0．1moFLTris·HCI(pn8．0)，装于棕色瓶内，4℃保存。(21)杂交试剂一·20×SSC,3MNaCI，O．3MC6H3Na30，，用101,4NaOH调节pH值至7．0，定容至lL。·变性液l0．5NNaOH，I．SMNaCl。·中和液lO．5MTris·Cl(pH8．o)。1．5MNaCl。·瀑洗液l2×SSC0．2MTris·O(pH7．5)。·预杂交液：29BSA，1raMEDTA，7％SDS，0．25MNaHP04(pH7．2)。定容至200ml。3主要仪器·超速冷冻离心机lBeckmanLT-65Ultracentrifuge·水浴箱t星球电子恒温水浴锅·MUUQ超纯水仪·杂交仪IHYBAID公司产品·电击仪IBio—RAOGenePulse·高速冷冻离心机：日立18PR·52·台式高速冷冻膏心机·Hettich公司产品·稳压稳流电泳仅及电泳檀：北京博思拜公司产品·紫外检舅仪：2卜3上海长兴仪器厂62 ·紫外分光仪；PE公司tUV／VISSpectrometerLambdaBi02．0·成像仪：Alphalmager2000。AlphalnnotechCorporation·空气浴摇床l哈尔滨东明仪器厂4方法4．1病毒繁殖及纯化将病毒接种于10龄SPF鸡胚，连续传代5代，使HA效价稳定大于27之后进行扩毒。收获接毒鸡胚的尿囊液，于4"C，7，000rpm高速离心45分钟，取上清，再以35，0009离心3．5小时，沉淀溶于原尿囊液l％体积的pH7．2的PBS中。将样品加于30％和55％的不连续蔗糖梯度(w／w)界面上，180，0009离心5小时，收获两蔗糖梯度之间的明显乳白带。溶于pH7．2的PBS中，35，0009离心3．5小时去蔗糖，沉淀溶于pH7．2的PBS中，一30℃保存备用。4．2步移物的设计与合成使用PrimerPremier5．0从HN基因的5’端设计一步移引物P3：5’-CGAATACTGAGGGAGGGT一3，位于HN基因终止密码子上游164个碱基处。由北京赛百胜公司合成，PAGE纯化。用DEPC处理过的灭菌双蒸水将引物配制成100ⅢM溶液，分装，．80℃冻存。4．3TRIZOL法提取病毒RNA(1)取两管250plYucaipa病毒浓缩液，分别加入750111TRIZOL液，剧烈振荡15s，直至液体变粘稠。(2)室温放置5min。(3)分别加入200Ⅱl氯仿，充分混匀后，振荡15s，室温放置5min。(4)混合液4"12。12，000rpm离心15min，取上层水相于另一离心管中。(5)分别加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min。(6)12,000rpm离心18min，沉淀RNA。(7)小心弃尽上清，用冰冷的75％乙醇lml洗涤沉淀．混悬后12，000rpm离一Ii,10min。小心弃净上清。(8)超净台内风干RNA沉淀，约15min。63 (9)分别用DEPC处理的灭菌双蒸水141．tl溶解沉淀，并加入lp．1RNasin。一管RNA用于合成双链eDNA，另一管RNA用于标记探针。．80"C冻存。4．4双链eDNA的合成及质粒文库的构建4．4．1第一链的合成：取一管病毒的RNA，并依次加入下列成分：RNA溶液151．tl步移引物(100uM)II．tl离心混匀，70℃作用8min，迅速冰浴5min，离心后加入RNasin(40U／I．t1)llal预热的BufferI5Ⅲ离心混匀，42℃预热5rain，依次加入：预热的SodiumPyrophosphate2．5／alAMV(20u／po1．5u1共25ul，瞬时离心混匀，42℃作用2h。4．4．2第二链的合成：将合成的第一链产物瞬时离心，置于冰上，并依次加入BufferII：400,IBSA(1mg／m1)：50'1DNApolymeraseI(9．2uml)：30,1RNaseH(2U／山)：10,1去离子水：260,1共100lJl，离心混匀，14"C作用4h。70"C×8min，迅速冰浴5min，离心。4．4．3双链eDNA的末端补平：向离心管中依次加入：T4DNApolymerase：dNTP(10mM)：5U10,1 37。C10min，迅速加入10ulO．2MEDTA，以终止反应。4．4．4抽提反应产物l向反应液中加H20至300ttl，加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇，混匀放置5min，12，000rpm×15min，取上清入新的离心管中，并加入1／10体积的3MNaAC(pH5．2)，2．5倍体积的无水乙醇。混匀，．70"C放置40min，12，000rpm×15min，去上清，加入lml70％冰乙醇洗涤沉淀。去上清，风干，加入10ul去离子水，溶解沉淀。-20"C冻存。4．4．5pGEM-7ZF的奠切：向离心管中依次加入：pGEM·7ZF：2ulBSA(Img／m1)：21xl10×Buffer：21xlSmal(10U／p,1)：lulH20：13Itl共20111，离心混匀，25℃过夜，补水至300p．I，用Tris饱和酚：氯仿：异戊醇抽提产物，并用乙醇沉淀、洗涤酶切产物，溶于20pl去离子水中，取1ul酶切产物跑电泳，看是否酶切完全并估测酶切产物的含量。4．4．6电击感受态细臆的制备：1)将大肠杆菌DHIOb从甘油冻存管中取出，在LB固体平板上划线，37℃倒置培养过夜。2)挑取1个单菌落分别接种于3mlLB液体培养基中，2．00rpm／min，37‘C振摇培养12·16h，取2ml培养物分别加入到200mlLB液体培养基中，37℃振摇培养3h，使培养物OD6eo达到0．6。3)将培养物冰浴10min，4"C4，000rpm离心10min，弃上清。4)将沉淀重悬于60ml预冷的10％的甘油内。5)4"C4，000rpm离心10min，弃上清。6)沉淀用5ml预冷的lo％IB甘油重悬，4"C4，000rpm离心10min，弃上清。7)用200111预冷的10％的甘油重悬沉淀，40p．I／管分装，-80"C冻存。 4．4．7平端连接：离心管中依次加入：补平的双链eDNA：101』1pGEM一7ZF的酶切产物：lⅢ10×buffer：2p．1BSA(Img／m1)：211lH20：4／alT4DNAligase(3U／p．1)：11．tl共20．I，离心混匀，15"12x16h。补水到300．i，用Tris饱和酚：氯仿：异戊醇抽提产物，并用乙醇沉淀、洗涤连接产物，溶于10pl去离子水中，转化感受态细胞。4．4．8电击转化1)从-80"(2冰箱取出1管感受态细胞，冰上慢慢融化。2)将10pl抽提洗涤的连接产物加入到感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴lmin。3)迅速加入冰冷的电击杯杯底，迅速敲打使之铺平于杯底。4)电击。电击时间控制在5．13秒左右。5)迅速加入lmlSOC培养基，37℃，150rpm振摇培养1．5h。6)取100u1振摇培养物涂布在预先涂布了IPTG和X-Gal(终浓度均为800I．tg／平la)含Amp的LB平板上，37℃放置至液体被吸收。7)倒置平皿，于37℃培养20h。8)将平板于4℃放置数小时。使兰色充分显现。4．5阳性克隆的初步筛选-细菌苗落的快速裂解及质粒大小的检查1)用无菌牙签挑取单菌落的-4,部分，在含抗生素的琼脂母板上划线。所有的菌落均照此影印妥当之后，将平板于37"C培养若干小时，然后保存于4"C。2)将原始平板上1个兰斑和其余白斑的剩余部分分别转移到不同微量离心管中，管中放有30pl1xCraeking溶液，剧烈振荡30s。3)用1％琼脂糖电泳检查。初步筛选阳性克隆。 4．6阳性克隆筛选：采用了点杂交的方法筛选阳性克隆并用限制性内切酶酶切的方法来对估测插入片段的大小。4．6．1碱裂解法提取质粒(1)挑取1个兰斑和数个初步鉴定为阳性的插入片段较大的细菌菌落，分别接种于3ml含Amp的LB液体培养基中的试管中，37"(2振摇培养16h。(2)4，000rpm离心5min，弃上清。(3)用O．5mlSTE冲洗沉淀。离心弃上清。(4)加入100pl预冷的溶液l，剧烈振荡使沉淀完全溶解，冰浴5min。(5)加入200“1新配溶液II，迅速轻轻颠倒几次Eppendoff(勿振荡)，冰浴5min。(6)加入150pl溶液Ⅲ，轻轻振摇10s，混匀，冰浴5min。(7)12，000rpm离心5min，将上清小心转移至另一离心管，切勿吸到下层液体。(必要时，可用苯酚：氯仿：异戊醇抽提～次。)(8)上清中加入2倍体积的无水乙醇，室温放置10min或-20"C放置2h。(9)12，000rpm离心5min，弃净上清。(10)加入lml70％7-,醇洗涤沉淀，12，000rpm离心5min，弃净上清。(11)置无菌台内风干30rain，直至完全干燥。(12)沉淀溶于20plTE(含50ng／mlRNase)中，37"C作用30rain。(13)．20℃冻存。4．6．2点杂交(1)点膜。先用打点针在尼龙膜上打出方针孔，每孔间距约为Icm，将提取的质粒溶液(含兰斑)稀释25倍后，各取lpJ慢慢点到打好的孔内，注意点样时速度要慢，使的所点的样品面积尽量的小。剪掉尼龙膜的右下角，并标记好点样面。(2)固定l将点样的尼龙膜用去离子水润湿，夹入打湿的吸水纸内，放入微波炉内，中火烤约3分30秒至吸水纸干燥。(3)预杂交；杂交管内放入预热的3×SSC，将固定好的尼龙膜放入杂交管，注意将未点样的一面贴壁。65"(2，70rpm／min×10min，倒出液体，加入7ml预热的预杂交液，70rpm／minxlorain后45rpm／min×6h。(4)随机探针的标记(操作过程中穿铅衣，并在有机玻璃屏蔽后操作)67 向离心管中依次加入：RNA11。5ul随机引物2ul离心混匀，70"C×10min，迅速冰浴5min，依次加入：RNase(40U／I．tnO．5BI10×buffer2．5111dNTP(10mM／each)2．51．tlM-MLV(200U4d)lktl离心混匀，在防护措施下加入a．”p-dCTP，混匀，37"(2作用I小时。65"(3x5min，加入1／100体积的10NNaOH变性5min。(5)过柱l标记好的探针过G50柱，以去除未标记上的a．”p-dcrP。每次用200ul的水冲洗，收集第3-8管。(6)杂交；将探针加入杂交管内，55"C杂交过夜。(7)洗膜：①于保护措施下，回收杂交探针液。②先用约70ml的2×SSC室温冲洗杂交膜两次，荐于55"12。50rpm／minX10rain，冲洗两次。每次的冲洗液都倒入指定的废液缸内。③使用约50ml0．2×SSC．55℃×15min冲洗两次。④再用约50ml0．1xSSC。65"Cx15rain冲洗两次。⑤使用约250mlO．1xSSC，65"C的水浴摇床内冲洗20min。(8)压板t将洗好的杂交膜包入保鲜膜内，去净气泡，压入磷板．点样面靠近磷板。(9)扫描l72h后扫描结果。4．7重组质粒的Sourthern杂交鉴定4．7．1重组质粒酶切根据扫描结果，筛选杂交阳性的克隆，并取插入片段最长的克隆(定名为PLl01)的质粒，选用EcoRI、HidllI进行双酶切．所加样品如下：DNA溶液：EcoRI(15Uml)5pl1Ul HidllI(15U／lal)：lttl10×BufferM：2pl去离子水：11Ixl离心，混匀，37"C作用4h。65"C灭活20min。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，观察结果。4．7．2Sourthern杂交(1)转印l①将跑好的胶切取适当大小，并切掉右下角，以做标记。②将切好的胶放入变性液内，变性30rain。③将平台置于装有0．4NNaOH的大平皿内。④先在平台上铺3层用NaOH打湿的滤纸，滤纸的周边浸入平皿里的液体内·注意滤纸上不能有气泡。⑤铺3层与胶一样形状的滤纸，周边比胶稍大lmm，去尽气泡。⑥在这3层滤纸的边缘铺para膜。⑦将变性的凝胶铺在上面，去气泡，用0．4NNaOH润湿凝胶。⑧铺加同样大小形状的尼龙膜，标记尼龙膜的触胶面。⑨再铺加3层同样大小的滤纸，去气泡。⑩铺加5cm厚的吸水纸，并于其上压一重物，转印，过夜。期间．更换湿透的吸水纸·(2)取胶于紫外灯下观察目的条带是否全部转印完毕。(3)固定l将尼龙膜用去离子水润湿，夹入吸水纸内，打湿吸水纸，放入微波炉内，中火烤约3分30至吸水纸干燥。(4)预杂交。杂交管内放入预热的3×SSC，将固定好的尼龙膜放入杂交管，注意将未点样的一面贴壁。65"C，70rpm／min×10min，倒出液体，加入7ml预热的预杂交液，70rpm／min×10min后45rpm／min×6h。(5)杂交。将做点杂交时回收的探针煮沸15min，迅速冰浴5min，变性厉加入杂交管内。低速转动15min后，55rpm／min×65"C杂交过夜。(6)洗膜：①于保护措施下。回收杂交探针液。 ②先用约70ml的2×SSC室温冲洗杂交膜两次，再于55"C，50rpm／minx10min冲洗两次。每次的冲洗液都倒入指定的废液缸内。③使用约50ml0．2xSSC，55"Cx15min冲洗两次。④再用约50mlO．1×SSC，65"Cx15min冲洗两次。⑤使用约250ml0．1xSSC，65℃的水浴摇床内冲洗20min。(7)压板。将洗好的杂交膜包入保鲜膜内，压入磷板，点样面靠近磷板。(8)扫描l72h后扫描结果。4．8阳性克隆测序用步移引物对PLl01进行测序，用ABl377全自动DNA序列分析仪测序，由六合通公司完成。5结果5．1Yucaipa病毒的RNA提取用TRIZOL法提取病毒RNA，将电泳槽、梳子等用O．3％的H202处理，电极缓冲液高压灭菌，将所提RNA经1％琼脂糖凝胶电泳，可见目的条带。结果见图3．1：圈3．1Yueaipa瘸毒的RNA照片1．RNA2．^DNA／EcoRl+HiudlllMarkerFig．3．1PhotogruphofRNAofYucaipavirusI．RNA2．^DNA／EcoRI+HindlllMarker(注·此处所用的Marker为DNAMarker．对RNA的分子量大小不具有标示性) 5，2阳性克隆的点杂交筛选根据副粘病毒科推测的PMV-2的病毒基因组图谱，从HN基因的5’端设计步移引物P3，以所提的病毒RNA为模板。合成双链RNA，平端化后连入PpGEM．7ZF(+)I拘ISmal位点，构建质粒文库。克隆策略见附图3．4．经Amp和兰、白斑筛选，共挑出156个白斑进行cracking筛选。挑选14个插入片段比较大的重组质粒提取质粒DNA，适量稀释后，进行点膜、变性、杂交，共得到7个阳性克隆。点杂交结果见图3．2。圈3．2点杂交眦(D3为阳性对照IHN基因片段．D4为阴性对愚I兰斑质粒)Fig3．2Dothybridization∽l-een(D3isthepositivecontrol，D4isthenegativecontr01)5．3Southern杂交鉴定5．3．1质粒酶切根据pGEM．7zF(+)的质粒图谱发现。在Smal酶切位点的两旁各有一个EcoRI和HindHI酶切位点。将根据点杂交结果筛选到的插入片段最大的阳性克隆B3(PLl01)的质粒用EcoRl和HindHl进行双酶切，发现除载体基因外，插入片段被酶切为三个片段，其片段长度分别约为1．1kb、O．9kb和0．3kb。这与用DNAMAN软件对PLl01的EcoRl和HindlII双酶切预测结果：323bp、907bp、1080bp一致。电泳结果见图3．3。7l 田3．3PLIOI的EcoRI和Hind]]l陬．■切精果1．^DNA／EcoRI+HindlIiMarker2．PLIOI●切●自果3．兰斑斑一切结果Fig3．3TheresultofPLl0IbyEcoRIandHindTndigestien1．^DNAJEeoRI+HindIIIMarker2．PLIOI／EceRI+Hindlll3．pGEMTZl7(+)／EceRI+Hindm5．3．2Southern杂交PLl01经EcoRl和HindllI双酶切，跑胶照相后进行转印，并进行Southern杂交。磷板扫描结果见图3．4。田3．4Southern杂交l_^DNA／EcoRI+HindlIIMarker2．PLl01一切螬果3．兰囊一切结粟Fig3．4Southernblotting1．^DNA／EcoRI+HindlIIMarker2．PLl01／EcoRI+HindⅢ3．pGEMTZF(+)／EeoRI+HindⅢ 5．4测序用步移引物对PLIOI进行测序，中间测序引物由六合通公司合成并完成测序。核苷酸序列及所推导的氨基酸序列见附图3．1。测序峰图见附图Ⅳ：Pagel26--Pagel28。6讨论6．1Southern杂交鉴定对所测片段使用EeoRl和HindlIl进行双酶切，发现除了载体基因外，插入片段被酶切为三个片段，其片段长度分别约为1．1kb、0．9kb和O．3kb。由于考虑到所测基因与HN基因有大约0．2kb的重复，为防止点杂交结果仅为该部分作用结果，作者又采取Southem杂交的方法进行鉴定。杂交结果见图3．4。由图可见，插入片段均表现出阳性信号，进一步验证了所测序列为PMV．2的序列的可信性。6．2所测基因的性质推测将所测序列进行BLAST比较，发现所输入序列与猴副流感病5(AF052755)的L基因的部分核苷酸序列的同源性为93％，与其他几株SV4、SV5的L蛋白的核萤酸部分序列的同源性也都大于90％。利用DNAMAN软件，作者将所测序列的氨基酸序列与NDV的LASOTA株和F48E9、SV5等副粘病毒科病毒的L基因的氨基酸序列进行了I司源性比较。几者的氨基酸同源率为46．96％，根据氨基酸序列比较建立的遗传距离图见图3．5·同时根据副粘病毒基因组结构特点，可以断定步移所测序列为PMV．2的L基因的3’端序列。圈3．5以几株捌粘■毒L蛋白3’■氯基■序列比较t立的遗传甩鼻圈Fig3．5Geneticdistanceofthe3’terminielLproteinofsomep-r●myxoVirid-evirus73 6．3基因间序列通过对所测序列的F与HN基因问序列以及HN基因与L基因的基因间序列分析发现，F基因、HN基因和L基因的mRNA的3’端都有一保守的polyA终止信号，序列为3’-AUUCUUUUUU-5’，这一保守序列与副粘病毒科的其他病毒的终止信号序列基本一致。各基因的mRNA的5’端也都有一保守的起始信号序列，序列为3’．CCCCCGCU一5’，这一保守序列仅与Murayama病毒的起始信号序列一致，与作者所选取的表l中报道的其他病毒的的基因起始信号不同。同时，对于所测序列，作者未曾发现许多报道所提到的在副粘病毒基因之间存在的3个碱基的连接保守序列：3’-GAA．5’。通过对表1所列的所有序列及BIV-3、Nipah和Hendra等十几株副粘病毒的M基因与F基因的基因间序列、F基因与HN基因的基因问序列和FIN基因与L基因的基因间序列及ZJl的所有基因间序列分析发现：不同种属各基因的mRNA的3’端终止信号序列高度保守；起始信号序列则各不相同。真正具有“3’终止信号-GAA-起始信号5⋯结构的病毒有麻疹病毒、人副流感病毒．I、牛的副流感病毒一HI、Nipah病毒。其他病毒的终止信号序列与起始信号序列之间往往存在一定距离，中间也不一定存在“3’．GAA．5⋯连接序列。而PMV-1(主要是NDV：LASOTA、BI、ZAl)、PMV02及PMV-6中，除了PMV-2的HN基因与L基因间存在上述典型结构外。其他的基因问序列均未发现有存在“3’-GAA．5’”连接序列。而许多关于NDV的基因组结构特点的报道都提到了：各基因问存在“3’．GAA-5’”的3个碱基的连接序列。作者选取几个有代表性的病毒的F与HN基因间序列以及HN基因与L基因的基因间序列分析列于附图3．3。6．4L蛋白3’端测序与分析NDV病毒的L蛋白全长约为8600多个核苷酸，编码2800多个氨基酸，PLl01的插入片段全长约为2293bp，其中与HN基因大约有225个碱基的重复；测得HN与L蛋白的基因间序列长为14个碱基：L蛋白的3’序列长为2063nt,编码框长为2042nt，编码680个氨基酸，分子量约为76742道尔顿。测序结果及编码的氨基酸序列见附图3．1。由所测序列推导的氨基酸序列进行L蛋白的3’端的亲水性、抗原指数和表面可能结构图分析，由图可以看出L蛋白的3’端高度亲水。74 圈3．6Yucaipa瘸毒的L蛋白3’靖部分性质分析Fig3．6Somepropertyofthe3’terminioftheLproteinofYucsipavirusLYucaipa6．5Yucaipa病毒已完成测序部分的棱苷酸序列Yucaipa病毒的整个基因组大约为15kb长，通过RT-PCR的方法及构建质粒文库进行引物步移的方法，目前我们实验室已完成了Yucaipa病毒的F基因、I-IN基因和L基因3’端共5681个核苷酸序列的测定，完成了多于l，3的基因组测序。测序结果见附图3．2。测序结果已输入GENBANK，其序列号分别为：AF422844、AF515835、AF515836、A1'5】5837、AF5】5838、AF515839。6．6关于第二次步移测序作者曾设计引物，进行了第二次步移，虽然经过几次尝试。但一直未成功，分析原因如下：(1)所提病毒的RNA量较少，陈丽君等人(1997)在构建NDV的cDNA文库时，所提取的病毒的基因组RNA的含量为42ng／ttl，而我们所提的病毒基因组KNA的含最为8—16ng，¨l，可能是NDV较Yucaipa病毒更易在鸡胚中大量繁殖。这也是作者在进行第一次步移时，所构建的质粒文库质量不高的原因。根据Clarke的统计学方法对文库进行质量检验：N=In(1．Pyln(1．X／Y)。其中，P是从建成的基因文库中可能筛选到任一基因的概率；x是该基因文库中每一克隆所含有外源片段的平均长度：Y是生物基因组的大 小：N是该基因组文库所包含的克隆数目。假设从某一文库中筛选到任一基因的概率是99％，一般插入片段为1．3kb，当基因组大小为15kb时，则得到该基因组应包含的克隆数目至少是50个，这样所建立的cDNA文库才会覆盖整个基因组。陈丽君等人所建立的文库含有52个阳性克隆，而作者第一次步移所构建的质粒文库只含有十儿个阳性克隆。比较幸运的是一般从质粒cDNA文库筛选的片段多为lkb大小。而作者所筛选到的PLl01长约2．3kb。(2)后期病毒存放时间过长，也影响了提取病毒的RNA含量。当作者意识到可能是RNA含量影响建库质量后，曾加大提取RNA的病毒含量，可能是由于病毒存放时间过长。提取效果仍不能达到满意效果，提取的RNA进行电泳，也不如前期所提的RNA跑的条带清楚(见图3．1)。(3)第二次建库不成功，也有可能是由第二次步移引物设计的位置不够理想，恰好处于RNA二极结构较复杂的位置。目前，作者已设计了较为巧妙的二次反向筛选方法，以解决上述问题，详见总结部分。 附图3．1L基因3’靖涮序结果(附氨基馥序列)Fi93．1Theresultofthesequencingof3’terminiofLgene(aminoacidsequenceisattached)Totalaminoacidnumber：680，MWffi76742MaxORF．1-2040，680AA．MW=76742IATGGATCAAACTCAAGCTGACACTATAATACAACCTGAAGTCCATCTGAA'lq'CACCACTT1MDQTQADTIQPEVHLNSPLGTTCGCGCAAAATTGGTTCTTCTATGGAAA'ITGACTGGGTTACCTTTGCCGTCTGATTTGVRAKLVLWKLTGLPLPSDLAGATCATITGTACTAACTACACATGCAGCTGATGACCAAATCGCAAAAAATGAGACTAGGRSFVLTHADQIAKNETRATCAAGGCCAAAATTAATTCCCTAATCGATAACTrAATCAAACACTGCAAGGCAAGGCAAIKAKINSLIDNLIKHCKARQGTGGCACTTTCAGGGTI'GACACCTGTCGTACATCCAACAACTCTACAGTGGTTGCTATCCVALSGLTPVHPTLQWLSATCACATGTGAACGAGCAGACCACCTTGCAAAAGTACGCGAGAAATCAGTrAAGCAAGCAITCERADHLAKVREKSVKQAATGTCAGAGAAGCAACACGGGTrTAGACATCTCITI'TCGC记AGTAAGTCATCAGTI'AGTI"MSEKQHGFRHLFSAVSHQLVGGAAACGCCACACTGTrCTGTGCACAAGACTCTAGCACCGTGAATGTCGACTCTCCTI'GCGNATLFCAQDSTVNVDSPCTCATCAGGTI'GTGAGA嘲GATAATAGACTCTATI'GGAGCCTTACAAACACGATGGACASGCERLIDSIGALQTRWTAGATGTAGGT删GGCTrCACATTAAACAGGTAATGAGATACCAGGTGCTI'CAGAGTRCRWAWLH1KQvMRYQvLQSCGCCTACACGCrCATGCCAATfCTGTTAGCACATGGTCTGAGGCGTGGGGGTTCATTGGGRLHAHANSVSTWSEAWGFIGATCACACCAGATATAGTCCTTATI'GTAGACTATAAGAGCAAAATGlTI'ACTATCCTGACCITPDIVLIVDYKSKMFTILTTTCGAAATGATGCTGATGTATI'CAGATGTCATAGAGGGTCGTGATAATGTGGTAGCTGTAFEMLMYSDVIEGRDNVAVGGAAGTATGTCACCAAACCTACAGCCTGTGGTGGAGAGGATTGAGGTGCTGTTTGATGTAGSMSPNLQPvER1EVLFDVGTGGACACCTTGGCGAGGAGGATTCATGATCCTATTTATGATCTGGTTGCTGCCTTAGAAVDTLARIHDPIYDLVALEAGCATGGCATACGCTGCCGTCCAATI'GCACGATGCTAGTGAGACACACGCAGGGGAATTCSMAYAVQLHDASETHAGEFTTTTCGTI'CAATITGACAGAAATAGAGTCCACTCTTGCCCCCTTGCTGGATCCTGGCCAAFSFNLTEIESTLAPLDPGQ引引他“埔矾N引如m拍他驼H诣坫”惦∞加的弛佗M馏；号¨擂帅如％让 15652116254116856l174l58l180l60l186l62I192l64lGTCCTATCGGTGATGAGGACTATCAGTTATTGTTACAGTGGGCTATCGCCTGACCAAGCTVLSVMRT1SYCYSGLSPDOAGCAGAGTTGCTCTGTGTGATGCGCTTATTTGGACACCCTCTGCTCTCCGCACAACAAGCAAELCVMRLFGHPLSAQAGCCAAAAAAGTCCGGGAGTCTATGTGTGCCCCTAAACTGTTAGAGCATGATGCAATACTGAKVRESMCAPKLEHDAlLCAAACTCTATC'ITI'CTTCAAGGGAATCATAATCAATCKICXACAGGAAAAGTCATTCTGGAOTLSFKGI1NGYRKSHSGGTATGGCCTGCAATrGACCCAGATI'CTATAGTGGACGATGACCTTAGACAGCTGTATI'ACVWPAIDPDS1VDLRQLYGAGTCGGCAGAAAr兀℃ACATGCTITCATGC'ITAAGAAATATCGGTACCTrAGTATGATTESAEISHAFMLKYRYLSMlGAGlTCCGCAAGAGCATAGAGl'n’GACTTAAATGATGACCTGAC．cCACATTCCTTAAAGACEFRKSIEFDLNDLSTFLKD从AGC从TCTOCAGoCCAAAAGATC¨TGGOCACGCA丁I卫TCCGGAAATCArr(y丌CCCTKAICRPKDQWAR1FRKSLFP1lGCAA从CG从CC兀’GGCACTAGTATAGATGrr^AAAGTAATcGACTGTrGATAGA兀TrCKTNLGTSIDVKSNRLIDF11IGGAGTCACATGAClTcAATCCTGAGGAAGAAATGAAGTA|r(玎GACTACGCTAGCATACLESHDFNPEMKYVTLAYCTGGCAGATAATCAATTCTCAGCATCKt}矾c^姐QAAGGAGAAAGAG缸e氏}n心§￡、LADNQFSASYSLKEKEIKTQGCCGGATCTTCGCCKk}∞Q}￡c黼Kkh帆嫩铀翟飞讯ck黼№mGQ}∞c^GRIFAKMTRKMRSCQVILESCTATTGTCCAGTCAC咖C^^^rrcTrr^^GGAGA^CGGr(、1_{GTCAATGGAACAACTGLSHVCKFKENGVSMEQLTCr丌GACAAAGAGCTFGCTTGCAATGTCACAGTFAGCACCCAGGATATCITCAGTFCGCSLTKSLAMSQLAPRISVRCAGGCGACAGCACGTAGACAGGACCCAGGACI℃AGCCACTCTAArGGTrGTAATCACATTQATARQDPGLSHSNGCNHIG下AGGAGAC兀-AGGCCCACACCAGCAGGACAGACCGGCCCGGAAGAGTGTAGTCGCAACCVGDLGPHQDRPARKSVAT1981TTCCl’rACAACAGATCITCAAAAATAl’rGCTTGAArrGGCGATATGGGAGTATCAAGCTT661FLTDLQKYCLNWRYGSIKL耋|川眦Ⅲ⋯Ⅲm蚓嘶蚴墨；川m蚓Ⅲ埘啪跏 附图3．2、ucaipa病毒已完成的澍序部分ExlraFig3．2ThesequencedpartofthegenomeofYucaipavirus。lj起始信号序列、终止信号序列和连接序列用方框{任起．井加黑：2j起始密码于和终止密码子和三个碱基的连接密玛于用方框椎起，1，佛加燃期加肼影：i3jF基闻和HN基因的上游引物用职下划线标出，并加黑；t4)F基因和HN基因的下游引物用渡亍良线标出，并加黑；t5，步移引物用荦下划粗线标出I叵面亘圃CGTCCAGACTAAGTGGG—TGGCTAAlq,CT—CTGACTGATAAGGAAl画A]61C．&A．GCACTCGTGA丌兀GTTGGTAH肌CCAGCTCGGCGTTGCCHAGA1'AAC【_C^GIa12【TT(3GCqCCAATAGGAGTAGCTAGCGCACAGGAGTGGCAACrGGCGGCAFAI'ACAACGAC(18ICTCtCAGGGACCATCGCAGTGAGATlTATCCCGGTCCTGCCTGGGAACCTAT(AACA]《汀241OC^CAGGAG^CGCTGCAGGAA1~A1jAATAGAACTGTGACTAATATCFTAGGCC(、(jI'IGAGA301GAGAACTTGGAI'GCTCTCCTATCTQAC'ITCGATAAACCIGCATCGAGGTICG2GGG(、GCC36IAICATFGGGTCGGTGGCCTTGGGGGTAGCAACAGCFGCACAAATCACAGCCGCC(Il“(，CT421CfCAAlCAAGCACAAGAGAATGCCCGGAATATA]GGCGTC1CAAGGAAICGA1AAA(，、．¨柏】ACCAAl’GAGGCTG丁G1vr0GAATTG从GGATGGAC"ITGCAACGACTGCTA]AG(”r兀GGAC541AAAGTGCAAAAGVITATCAATGATGATATTATACCACAGA"ITAAGGACArTGAClGCCAG60IGIAGTTGCAAATAAATTAGGCGTCTACCTCTCCTTATACTTAACAGAGC，rTACAAC]GTA66I1耵GGTI"CTCAGATCACT从TCCTGCAllATCAACGCl℃TCTrACCAGGCGC’IGIACA(,C721TTATGTGGAGGGGATATGGGA从GCTAACTGAGCTGATCGGTGTCAATGCAAAGGAT‘．JI'G781GGAlCCCTCTACGAGGCTAATCTCA7：40CCGGCCAAN[CGTTGGA[ATGA(((1Iri^一(TA84ICAGA]、AATCCl℃A1、ACAAGTATCTTACCCAAGTGlGTCqGAAGTGACAGGAGFCCGGGCl'90IACTGAGTTAGTCACTGTCAGTGTCACTACACCAAAAGGAGAAGGGCAGGCAArf'GFFCC(}961AG．^,TATGIGGCACAGAGTAGAGI'GCTGACAGAGGAGTlGGArGTCTCGACTl0IAGGITI102lAnfAAAAC从CTC几1A1’FGTAGGTCGAllCTCACACGGCCCCTACCA^CTII(JAIL【rC(1081AGCTGCCqGrCAGGGAAGTACGACGATIGTCAGTACACAACAGAGAqAGGAtI(GCl、】L【141TC(}AGAVICATCACA．G]CAATGGTGGAGTCCTTGC从ACfGCAOAGCAAI(【；【t，】“IA^(一120I1GjGl￡1TCACCCC{GC^TAJA^TACCACA^AACGACAI'TGGCqCCGFAAC^tr1【A1ItjA(26I【CAAGlAIATGCAAGGAAGTTO]CTTAGAGAGrGTGCAGC兀AGGTIAGAA／i(iA&A{；f¨】1321TCAlCCCAATACTFCTCCAACGTGACAA'H’GACCTYFCCCAAATCACAACGI'CAGGGI【’G39lCTGGA丁ATAAGCAGTGAAATTGGTAGCATTAACAACACAGTTAATCGGGr{'GACGAGTIA7q 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附圈3．3一些喇粘瘸毒科瘸毒的F-HN(G成H)基因问，HN(G戚H)与L基因问序列分析Extra3．3The_nalysisoftheintergenicgenebetweenFandHNlGorH)’mq(GorH)betweenLofSomep_r_myxovirid_eviruses(1)所选的序列为前一基因的终止密码子与后一基因的起始密码子之间的序列(2)每一病毒后附有相应序列的GENEBANK序列号MEASLES(NC．001498)(F-H)tcctctacaactcttgaaacacagatttcc7141cacaagtctcctcttcgtcatcaagcaaccaccgcatccagcatc“gc。ca附ga棚201tg‰c鹳c撕ctct髂ccg舰c蛐tc睁辐面蜒面五五函7261atcatccaca(H-L)ggc培cca垂gⅢcg彻c姆t蚰cccagacatcaggcatacccactagt9181gtgaaatagacatcagaa蛔困cgt医匠园gtggtttcccgttMUMUPS(NC-002200)(SH．HN)gaaagatctccagttgggacaagtcccaatccatcattcg6481agaacaagccgcatttaaatgatg。。班。aatcatgagac垣五画亘眍函五玉caagcttaggatcacaatacaacacagaaccccagctgctatcataactgtt咖6601ggccgctcgaaag(删．L)鲫tagtgcatg啦鹊唧ccta锻鹏cc840ltcaa眦atcga逋五巫画互面虱HPI．1(NC-003461)(F-HN)aaaatcagatcaagtacattgtagc6781atacatacaacaatcaaatctatccacaacttcaccaatcag哥g嗡。“c∞垣画西t哂面函圄gacaatccagtcaacctataaggcaacagcatccgattatacaaacg(HN-L)gcagateⅫa98641∞c．cmtcttctatatmattatg【gasaaccagatatgatgtataaaaatttaaaaacaaa8701gcatgaatagacatttatatgacaaataga垣五固ct蝠亟函kctgcct8761atttgtcaaatHPI．2(NC-003443)(F-HN)gaaatctatcacaagtctatatatgtccacaattga6481cccRaagaaccaacttccaacgattatccgthamitttaagtataatagtttaaaaatt654laacattaagcctccagataccaatgaatatgaatatatctcttagaaaacctgattaua6601tgtgatagcgtagtaca近亟面面玉ctaaaataagcacgaaccCttaaggtgtc6661gtaacgtctcgtgacaccgggttcagttcaaatatcgacctctaacccaatttaacacc。6721artctt拉!!!g苎bcacagtataatttaatcacaaaagaccttmaa∞ctgacacagct83 6781tgatceaeteaacatataattgtaagattaataata(HN-L)tactangaatgaagactccagaRcaataataattgaaaggctctct8581atcrmtgeaatagttatacgtmggctgtattagaatgttamganctgctgttm8641cccatatgaageaatcetteaacaccgacttaggttcaattttctcatcatttactgttg8701taattcaatcttaetaaagttaRccga叫丛!!!g!§!!!!I∞cctttatataatgta8761acaata蚴tgatataggccagaHPI-3(NC-001796)(F-HN)acatatctatagatcatcagatattaasat6721ta圆ct垣面画k‰gcaat[ccaactctactcatacaattgagaaagaacccaatagacaaatccaaattcgag(HN—L)ttaaccataatatgcattaacctatctataatacaagtatBIV-3(NC-002161)(F-HN)gactatacacgatcaaatataa枷周6721困ct厩五亟园gtIgttc,aac,aoagcagcaccgaatagaccaaaaggcagcgcagaggcgacaccaaactcaaaa(HN-L)at8521tgateatcgcatatcggatgcaagatgacattaaa鹅agaeeaceagaeagacaacacag8581gagacgatgcaagatataaa弹妪巫函砸五函面bgcaagmSENDAl(NC-001&52)(F-HN)ccstaactcttgttagatatttggUaagcaggtatg6601gtatttgctgaggtctgtac咖圃c蜒面五困agnaggttgctcacc6661actatagctttcacctcaagtaagtacagatc(HN-L)atttcaccgatcaacaggctagtcggctctgccgacacag8461gggtcattactggatatcctcaacatctcctagtctctcacattctccacagⅫ迪蚓8521固c啦五面园cg鳍aageetgtcattggctN|PAH(NC．002728)(F-G)tgtattcagattgatgaaattatgttagagaaatcagamtacttct8341gactttcagaaatggattgtatacaattagttagatcatcctgaataatcgaggtgagaa84 8401cattgcaactataaaatcagatcatgtaaatagttgtaaaaaattaaaagcttcttttaa8461ttcttttgaacaataatttaattaatatataacatattctctcacacgagcgctaaccta8521tacactctctactaatattttatactcataattaatgatataatgacaaataaggattca8581aattggattatgatatagtttcatactacaatagcatttcgaccaagaaaatatccttac8641aattatacaatgtacttaaccgtgaatatgtaattgataatttccctttag∞删垡!纠8701圆ct蜮函盈ccataactcaRggatacttaactgtatctttctaagcta8761tcacatatcaaaggagagattgaatgcttttttggagatctagatcattactatatgtgt8821ctcctataatcacatcataggagtgaaccataatacacatctRgggtaggggaaggaaa8881gtattgttgacgtactgattgatctgcttgagtcaaataatcagt∞场acaattcaaga894laa(G·Lt)aaatcaacctcataatttaatggattgatctaatataatgataataatc10801gtacaaagacatgtgatgtaaacaaaattgttgtaattaaataagtcctcagctgaatac10861ttttttaagattagcaatagcatgtttttccagttattggatagttgamatataatlct10921gaaactgggttaataaataatcttgatcggtgatctttgagaacaatgatatcatatagt10981tcatcaagtgataatcaattctttatatgtacactttagagtatattttgagacttagtaI1041ttttcggcccgaatgttaaatttaatagttcatacataacctaaactcaagttctagca1101taatgataacaattaatgcgaacagtcagatgtaaggaagamgatatmactgagaI161ctccacagatatagtagagctgaatcttgtaaataaaRataatgsatagtttattcaa11221agattatcattcatatlagtgIa速画函砸五亟五永atgattatg11281ccaattttctcgagaaatcattcaattgaccatagactgaaagcgttgttacctagttct11341tcagaagagatcttattagaaRaatttatatgatctaattcccRaaaaactgaatacc1140laaaaaacaaaaAPMV-6(NC-003043)(SH·HN)caatacaactcagcgctgagatgcaacctgggtaccatcc6961aggtgattgatcctcctaacatgctggcagagtctaccccaccaagatctgttcttgtac7021tgcugmga固ttgtgatttatataaaaacataatggc7081gcctggtgtcaccgctggtgaccactccccagctggtggca(HN-L)tgancactgcagcttgtacataacaattctcttact9001tcctctatttgcagagtaaatcagaagaatgacggtcggtgaRgaccgaactcaattag9061atggtgacatatagcccgcatttgtcttga刨ggggagetgttataac85 9121atagcagartgacgg鹊caagacccgcggagacaacgaat铲a近矗五五iiikcagg9181ctgggatcacgtcccagttgtagccttccccgattcaatctacttagtatcaacaagtca9241anc蟾ctcgcagaggtcatctgaaagggttgctgtgL^SOTA(^F077761)(F-HN)acacagatgaggaacgaaggtttccctaatagtaa6241mgtgtgaaagttetggtagtctgtcagttcagagaglttaagaaaaa||ctaccggttgt6301agatgaccaaa踣acga诅《!盟黜丝g垫kggIaagagaggccgcccctcaaUgcgag6361ccaggcttcacaacctccgttctaccgcRcaccgacaacagtcctcaatc(HN．L)Rgagteaattataa8161aggagttggaaagatggcattgtatcacctatettctgcgacatcaagaat。aaa。。gaa8221tgccggcgcgtgctegaattccatgttgccagttgaccacaatcagccagtgctcatgcg929latcagaRaagccttgtcattaatctcttga匮望璺罂璺坚曼璺}LgIaag【ggcaatgagatr‘————————]8341acaaggeaaaacagctcatg鳓∞taa懊!丝g!!gg璺|cBl(AF309418)(F-HN)tgtgaacacagatgaggaacgaaggmccctaatagtaa6241tttgtgtgaaagttctggtagtetgtcagttcggaga啦!!g!!!婪苎|ctaccggttgt6301agatgaccaaa髂acgata411鳐g鱼g苎苎|cggtaagagaggccgcccctcaattgcgag6361ccagacttcac瓣cctccgttctaccgc啦caccgacaaeagtccteaate．,atggaecgc0aN-ugctagttgagtcaactatga8161aagagttggaaagatggcattgtatcacctatcttctgcgacatcaagaatca∞ccgaa8221tgccggcgcg．tgctcgaattccatgtcgccagttgaccacaatcagccagtgctcatgcg8281ateagattaagccttgtcaatagtctcttg删gtaagtggcaatgagat8341衄acagctcatggtaaataatacgggtaggacZJl(AF431744)(NP-P)tcgacaacacccagcccgcc“cacagga1621ccacaccaaaCCCCCCgCCCaaaactctcccacactccccgacccacaaccccgc”98c1681cacacc柚caaaagctcccccccaccc姒CCCCCaCCCCcagccacacgatcccaccc81741cccgggacaacacaggcacagctcggctcgtcgacaacccgcccagagcccaaggtad陋l1801匝面函画画面玉agagacatccagagaccaagacgagtcaccaagttctctg86 1861nctcccnctacccagtggattagggtgaag(NP—M)tggccatcacaactcataacaggctcccgtcactttagcg3121tcacacggaatccctcgggggccccccctcgcaaatccacgcttcaacacccaaaacaac3181agccctctctcacccccctcaatcccccgaatgatcgcacaactgcaaccaatccagctg3241cattagaaatk!!g!!!!!目例cagagtgccRgaRgcaccaaa(M—F)caggaaataagttgcatccctaagactgcagttcacctgctttctcgaatcaccaaacar————14441ccagacaatgatccatctcgactgcttatagttagttcacctgtctagca∞堆婪倒4501E酗￡g鳐垒g§gkagtctggatcccgaccggcacaUcaggacgcaata(F-HN)atgcagataagaggtggatatataeccaa6241cagcagcctgtgtgtcaaaccgataacctgtcaagtagaaga删tact6301gggaacaagcaaccaaagagc柚诅电!鳇g塑g!坐ggtcagaggagccacccRcaat6361cgggaattaggcttcacaacatccgttctatcacatcaccgacaacaagagtcaatc(HN-L)tagagtttaagaagctagacRggccgattgagccaa8161tcataggatggttgggaagacgacaccacaccaatcatctcccacaatgcttagagtcaa8221gctgaatattaacataagccaggatcccatgttgttgggcagccacaaccagacaatgct8281gacatgattattctgagtcccgcccactatcaetttattaagaaaaaatacagaaagcat8341tgag硝函i运玉aaccaacaagag鹊州面五玉五玉 附图3．4质粒文库构建策略ExtraFig3．4StrategyforcDNAlibrary，——型L——～矿一f篡茹太⋯。。2“”{，d。NgTPgC’N蕊“瓣未I．P^温土飘她P庀一一P熙fJDNAlilaC：、＼、痧、＼o一一Smo●●，●●●●占；；书、、～一圹飞、，力“¨二=¨U 1材料第四部分HN基因的原核表达1．1病毒lYucapia标准毒株。由本实验室保存。1．2SPF鸡胚：山东家禽研究所提供。1．3菌种l大肠杆菌ER25∞系美国王力先生赠送，基因型为F．kfhuA2【10n】opmTlac：：FtgenelgalsulAu△(mcrc·mrr)114：：ISl0R(mer73：：miniTn,o-TetshR(29b210：：Tnld(Tets)endAl[dcm】1．4表达载体lpTYB-2由陈福勇教授惠赠。pTYB-2全长7474bp。含有T7聚合酶启动子．严格调控基因表达。T，启动子上游为两个串联转录终止子(rmBTIT2)减少背景水平的转录；下游为Lac操纵子，受LacI基因产物的阻遏。载体含有噬菌体M13的复制原点，在辅助噬菌体的存在时可产生单链DNA。多克隆位点的上游是sD序列，下游是编码约55kDa酿酒酵母自身裂解元件的VMAl基因，其产物于低温条件下介导自身裂解。VMAl基因的下游是几丁质结合域(CBD)。与几丁质特异结合，是亲和标签。1．5试射盒：RNA提取试剂：TRIZOL试剂购于GIBCO公司；DNA纯化回收试剂盒．购于鼎国公司。1．6工具酶及化学试剂IpfIl保真酶、dNTP购于上海生工；RNasin、EcoRl、Smal购于宝生物公司：T4DNA连接酶购于Promega公司：胰蛋白胨及酵母粉为OXOID公司产品；低分子量蛋白Marker、IPTG购于经科公司；三羟基甲基氨基甲烷(Tris碱)、甘氨酸购于Amersham公司；N’N’．二甲基甲叉双丙烯酰胺、丙稀酰胺购自欣经科公司。1．7引物l上游引物：5’-GGAQ墅虹丑狐TGGATTTCCCATCTAGGG-3’下游引物：5'-GAT要￡￡鱼鱼鱼CTCAGATTTACCGGTG·3’由上海生物工程公司合成，PAGE纯化。2试齐9配{I；9所有配制的溶液除经特殊说明外．均经15磅，平方英寸高压蒸汽灭菌20min，而后贮藏 于4"C。凡用于RNA实验的双蒸水、试剂(含Tris的试剂除外)、容器均用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理并高压。(1)0．5mol／LEDTA(pH8．0)I在160ml水中加入37．279EDTA-Na·2H20，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10NNaOH溶液(约15m1)调节pH值至8．0，然后定容至200ml。(2)1mol／LTris·CI(pn8．0)z在160ml水中加入24．229Tris碱，加入浓HCI调节pH值至8．0，定容至200ml。(3)TEBuffer(pH8．0)zlmllmol／L的Tris·Cl(pH8．o)和0．2ml0．5moFLEDTA(pH8．0)混合，定容至lOOml。(4)50XTAE：12lgrris碱。28．55ml冰乙酸，50ml0．5moFLEDTA(pH8．0)混合，定容至500ml。(5)6×凝胶加样缓冲液l0．0259溴酚兰，0．0259二甲苯青FF，3ml甘油加入一定量水中溶解混匀，定容至10ml，分装，4"C保存。(6)1％琼脂糖凝胶llXTAElOOml加入lg琼脂糖，加热融化后加入5ulEB(溴化乙锭，10mg／m1)，混匀，室温放置。(7)20mg／ml氨苄青霉素贮存藏t100mg氨苄青霉素溶于5ml灭菌水中。过滤除菌，分装冻存。(8)O．IMCaChl在100ml双蒸水中溶解1．479CaCl2·2H20。(9)LB培养基l950ml去离子水中加入胰化蛋白胨log，酵母提取物59，NaCI109。溶解后，用5NNaOH调节pH值至7．0，加水定容至lL。分装lO磅高压灭菌，贮存于4"C。(10)舍氨苄青霉素LB平板：500mlLB培养基中加入7．59琼脂粉，融化后高压灭菌，待冷却至约50'c左：E，加入氨苄青霉素至终浓度为100“g／ml，倾倒平板。(11)SOB培养基l在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨209，酵母提取物59，NaCl0．59。完全溶解后，加入250mmol／LKCI溶液100ml，用5mol／LNaOH溶液调pH值至7．0，加去离子水定容至1L，高压灭菌20min。使用前加入经过滤除菌的2MMg”(1MMgCl2。1MMgSO+)。(12)SOC培养基lSOB培养基1L经高压灭菌，冷却后，加入10ml经O．22Bm滤膜除菌的3M葡萄糖溶液。(13)3MNaAc(pH5．2)l在80ml双蒸水中溶解40．gigNaAc·3H20。用冰醋酸调pH值至5．2，加水定容至100m1．90 (14)RNA酶溶液l将胰RNA酶溶于10mMTris·CI(pH7．5)，15raMNaCI中，配成10mg／ml的浓度，于100"CJJfl热15rain，灭活DNA酶，缓慢冷却至室温，分装成小份。冻存于．20℃。(15)10％SDSl在90ml双蒸水中溶解109电泳级SDS，加热至68"C左右助溶，加入几滴浓盐酸调pH至7．2，加水定容至100ml。无需灭菌即可置室温备_}Ij。(16)IOmoFLNaOHI409NaOH加80ml水溶解，定容至100ml，室温保存。(17)IFrGl250mgIPTG溶于1．25ml双蒸水中，过滤除菌，分装冻存备用。(18)2×Cracking涪液：0．IMNaOH，0．01MEDTA(pH8．o)，1％SDS，0．05％溴甲酚绿，10％甘油。(19)制备提取质粒DNA的试剂·STE：1．179NaCl，2ml1mol／LTris·HCI(pH8．0)和0．4mlO．5ml／LEDTA(pH8．O)，加160ml双蒸水溶解混匀，定容至200ml。·溶液Il0．999葡萄糖，2．5miImol／LTris·HCI(pH8．0)和2ml0．5mol／L的EDTA(pH8．0)，加80ml双蒸水溶解混匀，定容至lOOml，10b／in2高压灭菌。·溶液Ⅱl0．2mol／LNaOH，I％SDS，现用现配。·溶液Ⅲ：60ml5mol／I．,KAC，11．5ml冰乙酸，双蒸水28．5ml，总体积为100ml。(此溶液无需灭菌)。·苯盼l氯仿l异戊醇。Tris饱和酚静置分层后吸取下层溶液25ml，氯仿24ml，异戊醇lml。混匀，上层覆盖O．1mol／LTris·HCI(pH8．O)．装于棕色瓶内，4"C保存。(20)SDS．PAGE溶液的胃翻·I蒗so％iq燃(w／v)l309丙稀酰胺，0．8克甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml灭菌去离子水中，PH值不能超过7．0，过滤。于棕色玻璃瓶中4"C保存。·II淮1MTris-CI缓冲液(PH8．8)lTris碱121克溶于超纯水，用浓盐酸调PH至8．8，定容到lL。·ⅡI液1MTris·Cl曩冲液(PH6．8)lTris碱121克溶于超纯水，_}}=|浓盐酸调PH至6．8，定容到lL。·Ⅳ液10％SDS(w，、，)I109SDS溶于100ml去离子水中·加热助溶。·v液10％过硫酸饺(W／V)：0．1克过硫酸胺溶于lml去离子水中，现Hj现配。·vI液lTEMED原蒗9l ·10X电极缓冲液(PH8．3)ITris30．3克，甘氨酸144．2克，SDS10克，溶于去离子水并定容至lL，使用时10倍稀释。·2×SDS样品缓冲液：SDS500mg，巯基乙醇10ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，1MTris·CI(PH6．8)，用去离子水定容到10ml，小份分装，一20℃保存。·染色液l考马斯亮蓝R2501克，甲醇450ml，冰醋酸100ml，加水50ml，溶解后过滤使用。‘脱色渡l醋酸70ml，甲醇200ml，加水730ml，混匀使用。(21)western-blotting试剂·转印缓冲液I甘氨酸2．9克，Tris碱5．8克，SDSo．37克，甲醇600ml，加水至总量为1L。·封闭液(合1％白明胶的包被液)l白明胶109，包被液：无水碳酸钠1．59克，碳酸氢钠2．93克，用去离子水溶解并定容至1L，调节PH值至9．6。·洗涤液lPBST(0．01MPH7．3的PBS吐温-20溶液)89Nacl，0．29KH2P04，2．99Na2HP04，0．2gKCI溶于900ml水中，定容至lL，用1MNaOH调节PH值至7．3，每lL的溶液中加入0．5ml的吐温．20。·底物溶液(OPD-H20D：现用现配．在100ml底物缓冲液中加入OPD40mg，3％H202O．15ml。·终止液(2MH2s04)l76ml的浓硫酸(98％)溶于500ml蒸馏水水中，混匀。3主要仪器·超高速冷冻膏心机IBeckmanLT．65Ultracentrifuge·水浴箱t星球电子恒温水浴锅·MilliQ超纯水仪·PeR扩增仪：HYBAID公司产品·高速冷冻离心机1日立18PR-52·台式高速冷冻离心机：Hettich公司产品·稳压稳流电泳仪及电泳槽装置·北京博思拜公司·蛋白电泳及转印装置tE．C120型·紫外检舅仪·2F一3上海长兴仪器厂·紫外分光仪：PE公司，UV／VISSpectrometerLambdaBi02．092 。成像仪IAIphalmager2000．AlphalnnotechCorporation·空气浴摇床。哈尔滨东明仪器厂4方法4．1病毒繁殖及纯化将病毒接种10龄sPF鸡胚，连续传代5代，使HA效价稳定大于27之后进行扩毒。收获接毒鸡胚的尿囊液，于4℃，7,000rpm高速离心45分钟。取上清，再以35，0009离心3．5小时，沉淀溶于原尿囊液l％体积的pH7．2的PBS中。-30"C保存备用。4．2引物设计与合成根据已测的HN基因的序列，用PrimerPremier5．0软件设计一对特异性引物。上游引物：5'-GGA蚴ATTTCCCATCTAGGG-3’下游引物：5'-GAT￡￡￡鱼鲫TCAGATrTAccGGTG．3’根据表达载体的特点，在上游引物的5’端加了一个EcoRI酶切位点，在下游引物的5’端加了一个Smal酶切位点。用下划线标出。上游引物含有起始密码子，用方框框出，下游引物不含有终止密码子。由上海生物工程公司合成，PAGE纯化．上、下游引物以灭菌去离子水配制成20州溶液，于-80℃冻存。4．3TRIZOL法提取病毒RNA(1)在2501tlYucaipa病毒病毒浓缩液中加入750pITRIZOL液，剧烈振荡15s，直至液体变粘稠。(2)室温放置5min。(3)加入200ul氯仿，充分混匀届．振荡15s，室温放置5rain。(4)混合液4℃，12，000rpm离心15min，取上层水相于另一离心管中。(5)加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min。(6)12．000rpm离心18min，沉淀RNA。(7)小心弃尽上清，用冰冷的75％7,醇lml洗涤沉淀，混悬后12，000rpm离心10rain。小心弃净上清。(8)超净台内风干RNA沉淀，约15min。93 (9)用DEPC处理的灭菌双蒸水201al溶解沉淀，并加入llJRNasin。5山／管分装，一80。C冻存。4．4RT．PCR4．4．1反转录：o．5ml微量离心管中加入病毒RNA，并依次加入下列成分RNA溶液51．tl上游引物(20uM)21xlDEPC水10p,I离心混匀，70"C作用8min，RNasin(40U／斗I)5x反转录缓冲液dNTP(10mMeach)M-MLV(200U／p．I)迅速冰浴5rain，离心后加入0．7lal51111．31tl1pl瞬时离心混匀，42"C作用2h。4．4．2PCRI总体积为50山，在0．2mlPCR管中加入病毒的cDNA溶液，并依次加入下列成分：cDNA溶液51．tldNTP(2．5raMeach)5pl上游引物(20laM)2p．I下游引物(201．tM)2¨l10XBufier51ttl双蒸水301ttlTaq(5U／$t1)1ul瞬时离心，混匀，小心加入30p．I灭菌石蜡油。95℃变性5min，94"(2lmin，52"(21min，72"C3min，2个循环；94"(2lmin，57"C1min，72"C3min，20个循环：94"Clmint66"Clmin，72"(23min，20个循环。取31．tlPCR产物_I}JI％琼脂糖电泳分析，并拍照记录。余者保存于．80℃。 4．5PCR产物回收纯化用DNA回收纯化试剂盒，操作按说明书进行。1)将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下含目的片段的凝胶，装入己称量过的离心管，管内凝胶重量最好接近于O．19。2)加入3倍体积的溶胶液B，50"C水浴10min，其间旋涡振荡3次，使凝胶完全溶化。3)将溶液加入离心柱中．静置2min，>一8000rpm离心lmin。4)取出离心柱，倒掉液体，将离心柱重新放入离心管中，加入500“1C液(用前用无水乙醇l：1稀释)于离心柱中，>18000rpm离心lmin。5)重复步骤4。6)≥15，000rpm离心lmin，以甩干剩余液体。7)将离心柱置于新的离心管中，加入≥50℃预热的D液15Ⅲ，保温静置2min。8)≥15．000rpm离心Imin，管底即为所需DNA。9)重复步骤7和8，再次回收剩余的DNA。10)分别取第一次回收的产物1山、第二次回收产物3山与Marker一起电泳，估测回收产物的浓度。4．6纯化回收的PCR产物的醇切回收产物12ⅢEcoR105u／td)2u1SmaI00V／gi)2td0．I％BSA29l10xbufferT21xl总反应体系为209l，混匀，短暂离心后，于30℃温育酶切过夜，酶切结束后补水至300ttl，用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀洗涤后。-20℃保存备用。4．7载体pTYB-2的酶切与4．6作同样处理。 4．8酶切的片段与质粒载体的连接经过酶切处理的目的片段，与同样处理过的质粒载体连接构建重组质粒pTYB．HN。在0．5ml微量离心管中依次加入下列成分：10×buffet1．5ulpTYB·2lglPCR产物7m(依PCR产物量而定)T4DNA连接酶lI_tl(3帅1)加水至终体积为15p．1，匀后瞬时离心，16℃连接过夜后再4"C连接过夜。4．9感受态细胞的制各1)将大肠杆菌ER25∞从甘油冻存管中取出，在LB固体平板上划线。37"C倒置培养过夜。2)挑取1个单菌落分别接种于3mlLB液体培养基中，2，00rpndmin，37"C振摇培养12．16h，取lml培养物分别加入到100mlLB液体培养基中，37"C振摇培养2．5h，使培养物OD600达到0．4．0．6。3)将培养物冰浴10min，4"C4,000rpm离心10rain，弃上清。4)将沉淀重悬于10ml预冷的O．Imol／LCaCl2内，冰浴1h．5)4"C4，000rpm离心10min，弃上清。6)沉淀用2ml预冷的含15％甘油的O．1mol／LCaCl2重悬，冰浴数分钟后，200p．I，管分装，．80"C冻存。4．10质粒的转化1)从．80"C冰箱取出l管感受态细胞，置于冰上化开。2)将10山连接产物加入到感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30rain。3)42"C水浴90s整，不要摇动离心管。4)迅速冰浴5min。5)加入800p1SOC培养基，37"C，150rpm振摇培养1．5h。6)取100I_tl振摇培养物涂布在含Amp的LB平板上，37"C放置至液体被吸收。7)倒置平皿，于37℃培养20h。 4．11阳性克隆的初步筛选．细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查1)用无菌牙签挑取单菌落的--d'部分，在含抗生素的琼脂母板上划线。所有的茁落均照此影印妥当之后，将平板于37"C培养若干小时，然后保存于4"C。2)将原始平板上白斑的剩余部分分别转移到不同微量离心管中，管中放有301．tl1xCracking溶液，剧烈振荡30s。取转化了pTVa-2质粒的ER2566菌落做同样处理，制备阴性对照。3)用1％琼脂糖电泳检查。4．12阳性克隆鉴定；重组质粒鉴定的方法有多种，本试验选用了限制性内切酶酶切的方法米对阳性克隆鉴定。4．17．．1碱裂解法提取质粒1)挑取数个初步鉴定为阳性的菌落，分别接种于1．5ml含Amp的LB液体培养基中的Eppendorf管中，37℃振摇培养16h。2)4，000rpm离心5min，弃上清。3)用0．5mlSTE冲洗沉淀，离心弃上清。4)加入1001．d预冷的溶液1．剧烈振荡，使沉淀完全溶解，冰浴5min。5)加入2001al新配溶液II，迅速轻轻颠倒几次Eppendorf管(勿振荡)，冰浴5min。6)加入1501．tl溶液Ⅲ，轻轻振摇10s。混匀，冰浴5min。7)12，000rpm离心5min，将上清小心转移至另一离心管，切勿吸到下层液体。(必要时，可用苯酚：氯仿：异戊醇抽提一次。)8)上清中加入2倍体积的无水乙醇，室温放置10min或一20"C放置2h。9)12，000rpm离心5min，弃净上清。10)加入lml70％Z,醇洗涤沉淀，12，000rpm离心5min，弃净上清。11)置无菌台内风干30rain，直至完全干燥。12)沉淀溶于201．tlTE(含50ng／mlRNase)中，37"(2作用30min。13)-20℃冻存。 4．12．2重组质粒酶切鉴定根据已知序列的酶切位点图谱，选用EcoR1、Smal对所提质粒DNA进行酶切鉴定所加样品如下：DNA溶液：6121EcoRI(15U／I．t1)：1．5ulSmaI(10U／I．t1)：1．5ul0．1％BSA：2p_l10×BufferT：2ul双蒸水：12u|离心，混匀，37"C作用4h，65"C灭活20min。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，观察结果。4．13HN基因的诱导表达4．13．1诱导表达取单菌落接种于3mlLB(含100pg／mlAmp)培养基中，37"12培养，过夜复壮。取出0．05ml接种到5ml的LB(含100pg／mlAmp)培养基中，3TC培养3h(oD600至0．64)．9)加入IPTG至终浓度为O．5mM．诱导表达，37℃培养4h。4．13．2电泳样品倒鲁取2ml菌液离心，去上清，加入lOOp．1灭菌去离子水，悬浮沉淀，并加入等体积的上样Buffer，混匀，煮沸8分钟，离心去沉淀。4．13．3SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS．PAGE)(1)洗净玻璃板，烘干，装好制胶板，用1．5％琼脂封闭缝隙。(2)成胶液的配制：表1．17．5％分膏胶、浓缩胶的配倒比倒· 各组分按表中所给的量混合，配制成7．5％的分离胶注入胶液(梳子离胶面的距离约为lcm)，用灭菌去离子水盖住胶面，放置20～30min，使胶凝聚，吸干胶面上的水；导入配好的浓缩胶，装上梳子，放置20～30min即可。(3)上样：加入309l处理好的样品，并加入蛋白分子量标准。(4)电泳：由负极泳向正极，电压为180V。当溴酚蓝指示剂到达胶管底部时(大约45min)停止电泳。关闭电源。(5)脱色：凝胶用5倍体积的染色液染色30min。(6)染色：将凝胶置于脱色液中，脱色期间更换脱色液数次。直至有清晰条带出现。4．13．4Western—blotting检测(1)诱导表达后，菌体裂解物作SDS-PAGE。(2)电泳完毕，拆卸凝胶夹层，切下标准分子量条带，除去浓缩胶，考马斯亮蓝染色。(3)以适量的转印缓冲液室温平衡分离胶30min。(4)转印盒置于大托盘中，用足量的转印缓冲液浸泡。(5)转印夹层的组装：海绵——滤纸(预先用转印缓冲液浸泡)——凝胶——转印膜一一滤纸(预先浸泡)——海绵，用玻璃棒赶出各层间的气泡，扣紧转印盒完成组装。(6)往转印槽ee自n,x,转印缓冲液，将转印盒放入电转仪中，凝胶位于负极，转印膜位于正极。接通电源与冷却条件下，200mA恒流转印1h。(7)关闭电源，拆卸转印装置，取出转印膜，于膜上剪取一小角。凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转印效率。(8)转印膜用1％明胶封闭液于37"C封闭lh。(9)将封闭好的NC膜置于用封闭液稀释好的Yueaipa病毒的阳性血清中。37"C孵育2h。(10)用PBS漂洗3次，每次10min。(11)置于用封闭液稀释500倍的HRP标记的兔抗鸡[gG中，室温振摇lh。(12)洗涤同(10)。(13)把NC膜浸入到配好酌底物溶液中显色，出现颜色时，立即用蒸馏水反复冲洗NC膜来终止反应。(14)用染色好的标准分子量凝胶条带与NC膜一起照相。 5结果5．1HN基因的RT-PCR扩增提取病毒RNA，进行RT-PCR，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，在大约1．7kb处有目的条带，结果见图4．1。圈4．1HN基因的RT-PCR产■电t螬果1．^DNA／EeoRI+HindlIiMarker2．RT-PCR扩增产物Fi94．1TheresoultofRT-PCRofHNseneofYueaipavirus1．^DNA／EcoRI+HindlIIMorhr2．TheproductofRT-PCR5．2重组表达质粒的构建和鉴定5．2．1It组表达质粒的构建纯化回收的RT．PcR扩增产物和表达质粒pTYB一2分别进行E￡oRI和Smal双酶切。酶切产物纯化回收后。以适当的比例，连接过夜，而后转化感受态细胞ER25“。经筛选得到PTYB．I-IN重组质粒。重组质粒载体的构建路线见附图4．1。5．2．2重组质粒pTYB—HN的酶切鉴定：pTYB—HN经EeoRl和Smal双酶切后得到两条大小分别约为7400bp和1700bp的片段。结果见图4．2：00 ％。结果见图4．310I鸶～黧燃叭M啡黝一一一一 圈4．3pTYB—HN重姐质粒在大肠杆■诱导衰达后的SDS-PAGE分折I．低分子量蛋白Marker2．3．诱导4h产钧4．pTYB．2转化的ER2“5．ER2ⅢFig．4．3SDs．PAGEofexpressionproductofHNgeneofYueaipavirus1．Lowproteinmolecularwel曲tmarker2．3．Expressionproduct4．ER2％transfromedbypTYB-25．ER2Ⅲ5．4．表达产物的特异性检测t重组工程菌诱导表达后。离心收集菌体，经2x上样缓冲液处理后．进行SDS．PAGE，而后进行Westem-bloRing检测。于NC膜上出现一条目的条带，该带与标准分子量比较，其大小约为l10kDa，说明大肠杆菌表达的FIN蛋白能与抗Yucaipa病毒阳性血清特异性结合。结果见图6讨论圈4．4诱导寰达的EIN蛋白的Wutern-blotting检■精粟1．低分子量誓白Markr2．WHtern-blotting的螬果Fig4．4ResoultofWestern-blottingofHN1．Lewproteinmolecularweightmarker2,Western-blottingresult6．1关于引物设计根据表达载体的特点，在上游引物的5’端加了一个EcoRl酶切位点，在下游引物的5’端加了一个Sinai酶切位点。在酶切位点的5’端应根据不同的限制性内切酶加上不同数目的保护性碱基，以利用酶切。本实验的EcoRl酶切位点和SmaI酶切位点的最适保护性碱基个数均为3个。通常大家是根据设计的引物的情况，目测后随意添加，而作者在这两个引物5’端所添加的保护性碱基与扩增序列的相应位置的碱基互补，作者在后来的RT-PCR扩增时非常顺利，不知与这一点小小的改动是否有关。 6．2关于PCR扩增由于要进行表达，作者选取高度保真Pfu酶进行PCR扩增，其错配率比一般的Taq酶低10倍。其每分钟延伸的速度是600个碱基，我们的目的片段长约1．7kb，所以延伸时间设为3min。由于Pfu酶具有3’-5’的外切酶活性，会降解引物，所以Pfu酶应最后加入反应体系，并立即进行PCR反应。使用Pill酶扩增的产物为平端，作者在设计PCR反应体系时，去掉了72"(3延伸lO分钟以加A的过程。由于具有外切酶活性。Pfu酶的扩增效率较Taq酶低，其最佳反应温度为65-75"(2，而作者设计的引物的晟佳反应温度为57"(3。在设计PCR反应程序时，由于引物的5’端加了酶切为位点，与扩增条带存在错配，因此作者首先选用52"(2低温扩增两个反应。以利于引物与扩增条带的结合；而后，又选取了引物的最佳反应温度57"C延伸了20个循环：最后选用PfiI酶的最适温度68"(2延伸20个循环。PCR反应非常顺利。6．3关于HN基因的原核表达位于病毒囊膜表面的FIN糖蛋白具有血凝性和神经氨酸酶活性，是宿主的重要保护性抗原之一。FIN基因的ORF长1743bp,编码580个氨基酸。对HN蛋白进行原核表达，期望能用表达、纯化的蛋白制各针对FIN的单抗，为以后的研究工作莫定基础。经Alphar凝胶成像系统ID-MOLTl分析，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的14．3％，表达含量不是很高，需进一步从表达温度、诱导表达时所加的IPTG的浓度、表达产物是否为包涵体、大量表达的最佳时间等方面进行摸索，以提高表达产量。103 附田4．1HN基因重组表选羹体的构建路线圈Fig．4．1Thestrategyoftheconstructionofexpression-vectorofHNprotein酶切回收PCR产物pTYB-2／HN 第五部分总结本文从病毒的复苏、繁殖、提纯开始，利用RT-PCR技术和质粒文库等技术，展开了对病毒的基因组的测序工作，两年多的时间内主要完成了如下工作：1．扩增提纯了四株PMV．2病毒，并制备了透射电镜样品和免疫透射电镜样品。进行了电镜观察。作者还用四株病毒的提纯样品进行过SDS—PAGE电泳，由于三株分离抹的病毒的含量较少，未跑出条带，仅有标准毒株Yucaipa病毒的SDS．PAGE图。2．关于PMV．2的分子生物学方面的报道极少，更未见有关其基因测序方面的书面报道。作者从GENEBANK中以“parainflucnza-2”为关键词，搜索到关于Yucaipa病毒的F基因∞13977)和HN基因的序列(D14030)，但其原文没有发表。为慎重起见，作者先将所查序列与副粘病毒科的几株病毒的F基因、HN基因的核苷酸序列、氨基酸序列进行了同源性比较后，又在HN基因内部设计了一对引物。提取病毒RNA，扩增出了大约900bp的目的条带(这部分内容未采用)。随后，作者又根据本科病毒的基因组结构特点，将PCR扩增的上游引物设计在了F基因的内部，下游引物则包含了HN基因的终止密码子，对四株PMV．2的HN基因进行尝试扩增，结果均获得目的条带，同时也论证了作者对PMV-2基因组该部分结构的推测。3．对HN蛋白的cys残基、糖基化位点及神经氨酸酶位点进行了分析，同时选取了与PMV-2存在一定血清学关系的几株副粘病毒的I-IN蛋白的氨基酸序列的疏水性、表面可能结构、抗原指数进行了比较，填补了这一领域的空白。4．在国际上，首次在分子水平上进一步论证了Murayama病毒可能是Yucaipa病毒或类Yucaipa病毒感染猴后的适应株。ShigeruKusagawa等人认为人类也会感染Yucaipa病毒，而在塞内加尔的人的血清中确实查到了Yucaipa病毒的HI抗体。由此可见，PMV一2在实验动物检测中相当重要的地位。5．从分子水平上进一步证明分离自同一群进I：1七彩文鸟的F4、F6株存在明显差异，与血清学关系差异一致，为两株不同的PMV-2。6．在HN基因的5’端设计步移引物，建立质粒cDNA文库，通过点杂交筛选、Southern杂交鉴定，成功筛选到长约2．3kb的片段，经过BLAST比较、与副粘病毒科病毒的L蛋白的核苷酸序列、氨基酸序列比较，证明所测片段为L基因的3’端序列。从而在国际上首次获得Yucaipa病毒的L基因的3’端序列。并对L蛋白N端的部分性质进行了分析。 7．通过对所测序列及副粘病毒科的十几株病毒的F-I-IN的基因问序列、HN．L的基因问序列分析，发现除了Yucaipa病毒的I-IN与L的基因间序列具备典型的⋯3终止信号．GAA-起始信号一5’”的结构外，PMV_l、PMV-6的这些基因问序列及PMv~2的HN基因与F基因之间不具备这一典型结构，尽管许多关于NDV的基因组结构的报道都曾提到过这～点，但作者对LASOTA、B1、ZJl等几株新城疫病毒的F-HN及HN．L的基因间序列仔细研究后，并未找到“3’一GAA-5⋯的三个碱基的连接序列(在cDNA中的结构为：5’．CTT．3’)。8．所测序列相继发送到GENBANK，GENBANK序列号分别为：AF422844、AF515835、AF515836、AF515837、AF515838、AF515839，在获得GENEBANK序列号后，～些相关文章也将相继发表，9．用PfIl酶扩增HN基因，构建了pTYB-2／HN表达载体，并诱导表达。经SDS．PAGE、Western-blotting检测证明成功表达了l-IN基因。为以后针对FIN蛋白的单抗的制备奠定了一定的基础。根据本文的研究结果。尚有如下工作有待深入研究：1．Yucaipa瘸毒基因组的3’测序l由于本病毒的3’端没有PolyA结构，给其3’端测序带来一定难度．作者曾使用VotyA聚合酶对其基因组RNA的3’端加PolyA，但由于本项工作本身难度就大，而且我们所提的RNA量又相对较少，期间还必需经过几次抽提过程，也会不断造成损失，所以尽管进行了数次尝试。最终仍未成功。对此，可从以下几个方面解决：(1)提高提取病毒的浓缩倍数，进一步提高所提取RNA的含量。而后加PolyA；(2)由于该病毒mRNA的合成不受放线菌素D的抑制。可以在细胞培养液中加入放线菌素D，再提取病毒的mRNA。直接用Oligod(n进行反转录，构建eDNA文库．筛选阳性克隆。进行测序。作者曾用鸡胚成纤维细胞进行过病毒的繁殖，但病毒滴度一直不是很高，所以未采用这种方法。今后，可以进一步提高用细胞培养、大量繁殖Yucaipa病毒的技术。(3)通过查阅资料及作者对数株副粘病毒的NP基因的氨基酸、核苷酸序列的同源性比较．发现在hip蛋白的氨基酸序列的260位附近有一长为6个氨基酸的同源序列，在335位氨基酸附近有一个长为7个氨基酸的同源序列，考虑到不同种病毒在进行翻译时，存在核苷酸选择的偏好性，在分析了这两处的核苷酸序列后，作者合成了一对兼并引物，进行尝试扩增。由于时问仓促，这一部分工作有待进一步完成。如果能够成功。一方面可以使用3’RACE系统很快完成病毒基因组的3’端序列测序；另一方面．整个病毒基因组就可以从3’端NP基因及中间的L基因同时步移测序，加快测序进程。106 2．二次反向筛选筛法：由于建库、筛选周期长，工作量繁重，而且建库质量不稳定，作者设计了比较巧妙的二次反向筛选的方法，以解决上述问题。首先大量提取RNA，用随机引物进行反转录，构建eDNA文库。在测序的L基因的末端(5’端)设计一核酸探针，用于筛选文库。筛到的阳性克隆含盖探针附近的片段。再从该探针的上游约50bp处再合成一段核酸探针，对第一次筛到的阳性克隆进行筛选，结果为阴性的克隆为目的克隆，不含有已测片段，含有的片段为要延伸的片段。同理，我们可以从F基因的3’端向NP基因的方向延伸。该方法使得由原来的步移建库改为核酸探针的步移合成。而且点样的NC膜可将探针洗掉而重复利用，因而大大减少了工作的烦琐程度。同时建议使用地高辛荧光标记探针。由于实验后期提取的RNA质量不高，虽然进行了尝试，但未能建成质量较好的随机文库。由于时间有限，这～部分工作有待于进一步完成。若能成功，将极大提高测序进程，并大大减少繁重的工作量。3．I-IN基因表达产量的提高t由Alphar凝胶成像系统ID-MULTl分析，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的14．3％，表达含量不是很高，可以从表达温度、诱导表达时所加的IPTG的浓度、表达产物是否为包涵体、大量表达的最佳时间等方面进行摸索，以提高表达产量。107 第六部分参考文献1．AlexanderD．J．andAllan、Ⅳ．H．IdentificationofparamyxovirusisolatedfrombirdsdyinginquarantineinGreatBritainduring1980to1981．VeterinaryRecord，11l，571—574，1982．2．AlexanderD．J．AvianParamyxovimsProceedingsthirty-fourthWestPoultryDiseaseConference，121-125，1985．3．AlexanderDJ．AndM．S．Collins．ThestructuralPolypeptidesofAvianParamyxoviruses．ArchivesofVirology67，309—323，1981．4．AlexanderD．J．Avianparamyxovims．Theveterinarybulletin，50，737-752，1980．5．AlexanderD．J．Comparisonofthestructuralpolyp*ptidesoffouravianparamyxoviruses．Archivesfurdiegesamtevirusforschung．，46，291-301，1974．6．AmexisG．，FineschiN．，Chumakovk．CorrelationofgeneticvariabilitywithsafetyofmapsvallineurabeAM9strainvirology,287，234-341，2001．7．AsaharaT．YoshimuraM．andTsubaI【iS．IsolationinJapanofavirussimilartomyxovirusYucaipa(MVY)．BulletinAbabaVeterinaryCollege，26，67．81，1973．8．BaillyJ．E．，McAuliffeJ．M．SkiadopoulosM．H，eta1．．Sequencedeterminationandmolecularanalysisoftwostrainsofbovineparainfluenzavirestype3thatarcattenuatedforprimatesVirusGenes，20，173-182，2000．9．BankowskiR⋯AR．E．CorstertandC．T．Clark．Isolationofanunidentifiedagentfromtherespiratorytruetofchicke∞．Science。132：292-293。1960．10．BankowskiR．A．，ConradR．D．IsolationofahemagglutinatingagentdistinctfromNewcastlediseasefromtherespiratorytractofchickens．AvianDiseases，5，253-268，1961．11．Bankowkil乙A。ConradR．D．andReynoldsB．AvianinfluenzaAandparamyxovirusescomplicatingrespiratorydiseasediagnosisinpoultry．AvianDiseases，12，259-278，1968．12．BinG．。TakemasaS．。KaluoN．eta1．．StructurelFeaturesUniquetoEachoftheThreeAntigenicSitesontheHemaggluitinin-NewrarninidaseproteinofNewcastleDiseasevirus，Virology,163，173-182，1988．13．CatianeoR．，SchmidA．，SpielhoferP．etal。Mutatedandhypermutatedgenesofpersistentmeaslesviruseswhichcausedlethalhumanbraindisease，virology,173，415-425，1989．14．ChangP．C．．HsiehM．L．．ShienJ．J．etal—CompleteNucleotidesequenceofAvianparamyxovirusType6(APMV-6)isolatedfromducks，unpublished．15．CollingsD．F．FittonF．．FittonJ．andAlexanderD．J．Preliminarycharacterizationofaparamyxovirusisolatedfromaparrot．ResearchVeterinaryScience，19：219-221，1975．16．CollinsM．S。StrongI．AndAlexanderD．J．PathogenicityandPhyIogeneticevaluationofthevariantNewcastlediseasevirusestermed‘pigeonPMV-lviruses’basedonthenucleotidesequenceofthefusionproteingene．Arch．Vir01．，14l：635·647，1996．17．CollinsM．S．，StrongI．，AlexanderD．J．EvaluationofthemolecularbasisofpathogenicityofthevariantNewcastlediseasevirusestermed‘pigeonPMV-lvirus’．Arch．viro】．．134：403-411．1994．108 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致谢本论文是在导师赵继勋教授的指导下完成的。从论文的选题、试验的设计与完成到论文的构思与撰写无不凝聚着导师的智慧、心血和汗水。导师渊博的知识、高深的学术造诣、敏锐的观察力、活跃而不失严谨的科学思维、开拓创新、精诚敬业的学风、废寝忘食的工作作风、科学求实的科研态度都将使我终身受益。感谢导师三年来对我孜孜不倦的教诲以及在我人生道路与科学道路上给予的指引。也感谢导师三年来对我生活上的关心与帮助。特别感谢硕士生导师陈福勇教授在我五年的硕、博学习生涯中一直给予的教诲、指导、帮助与关·tL,。值此论文付梓之际当礼谢先生辛劳，谨记先生教诲，开拓创新、勤奋耕耘，以不辜负先生的厚望。由从GENEBANK中查取序列到向GENEBANK输入全新的序列，整个实验使我的科研创新意识、分析和解决问题的能力、独立工作的能力都得到了很大的提高。实验之初有幸得NT崔治中教授、于嘉林教授、王国英教授、彭友良教授的指点与帮助。几位教授广博的知识、敏捷的科学思维和严谨勤奋的治学态度都使我受益终身，在此一并向他们表示诚挚的谢意。感谢郭玉璞教授、甘盂侯教授、刘尚高教授、张中直教授、杨汉春教授、赵德明教授、美国的王力先生一直以来对本实验的关心。感谢苏敬良副教授、吴清民副教授、郭鑫副教授、张冰老师给予的热情帮助与关心·感谢夏春教授在实验之初给予的帮助与指导。感谢国家兽医诊断中心的陈西钊副教授、田克恭副教授、王中立硕士给予的热心帮助·感谢任艳丽老师、查振林老师在实验过程中给予的热心的帮助。感谢师兄李富强博士、祝晓春博士生一直以来对本实验的关心、指导与支持。特别感谢植保学院的秦庆明博士、生物学院的杨树红博士生、曹云鹤博士、方守国博士给予的热心帮助与支持。同时感谢生物学院周云博士、王海英博士、李成霞博士、赵晨博士、杨军博士、植保学院的陈红运博士给予的帮助。感谢我的好友中科院的闫玖胜博士、戴博杰博十生多年来给予我的真诚帮助与关心。感谢师兄田夫林博士、秦卓明硕士、李秦硕士；师弟张国中硕士、王宏俊硕士、宋京真博十生、杨建民博士生、王乐义硕士生、白如念硕士生、白江学士：表妹刘洁博士生、师妹h春亚硕士、韩静硕士生、王小佳博士生在实验过程中给予的热心帮助。同时感谢在¨9
