开题报告-吴雪丽

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毕业设计（论文）开题报告题目：目的基因的合成及其连接、转化与筛选学院：化学与材料工程学院专业：生物工程学号：20074学生姓名：吴雪丽指导教师：徐玲花2011年03月15日 1、课题来源学校命题2、研究目的和意义基因工程一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA（质粒和病毒DNA称作载体）；三是把重组DNA引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。首先，要把所需基因——目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。DNA的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1967年，世界上有5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片体。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一种理想的载体是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故 地能自我复制。因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。将目的基因与质粒经过内切酶的“裁剪”，然后靠连接酶的作用，将目的基因和质粒（或病毒DNA）重新组合起来形成重组DNA。重组DNA就能在质粒（或病毒DNA）的“带领”下进入受体细胞。从生物体内提取DNA不仅过程繁琐而且效果较差，通常含有蛋白质等杂质；而人工合成基因就可以避免这些问题，并且效果良好。人工合成基因多采用PCR技术（聚合酶链技术）。人工合成基因在生命科学研究中有着重要的意义，也是一项常有的技术。现代化工业生产中人工合成基因的方法很多，但往往过程复杂，成本较高。因此探索了一种重复性好、错误率低、低成本和简便的基因设计和全合成方法。,建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。3、国内外研究现状和发展趋势及综述20世纪40年代，Avery在美国的一次学术会议上首次报道了肺炎双球菌的转化，不仅证明了DNA是生物的遗传物质，而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌，理论意义十分重大。1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，即DNA分子是由A（腺嘌呤核苷酸）、G（鸟嘌呤核苷酸）、C（胞嘧啶核苷酸）、T（胸腺嘧啶核苷酸）四种核苷酸按一定的顺序排列而成，成双螺旋结构。DNA的半保留复制机制。1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindⅡ，使DNA分子的切割成为可能。1972年，Bover实验室又发现了名叫EcoRⅠ的核酸内切酶，这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。以后，又相继发现了大量类似于EcoRⅠ这样的限制性核酸内切酶，这样是研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供 了技术基础。基因工程技术突破的另一发现是DNA连接酶。1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种具有更高连接活性的DNA连接酶——T4DNA连接酶。根据1972年前后微生物遗传学的研究成果，有可能用作基因克隆的载体有病毒、噬菌体和质粒等不同的小分子量的复制子。鉴于多年以来分子生物学家一直把注意力集中在病毒与其寄生细菌之间的相互关系上，因此很自然地在一开始就选定噬菌体作为基因克隆的最理想载体。其中研究最深入，而且业已被改建成实用克隆载体是噬菌体载体、质粒分子。特别是属于抗药性R因子的质粒分子，具有分子量小、易于操作和具有抗药性选择记号等优点，目前已被发展成为基因分子克隆中最常用的载体，如Pbr322和pUC13等质粒载体就是其中突出的代表。1970年M.Mandel和A.Higa发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙的适当处理之后，便能够吸收入噬菌体的DNA。1972年，斯坦福大学的S.Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的DNA。从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受体。1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRⅠ,在体外对猿猴病毒SV40的DNA病毒分别进行酶切，然后再用T4噬菌体DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40的入噬菌体DNA重组的杂种DNA分子。1973年，斯坦福大学的S.Cohen等人也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。2010年10月美国研究人员称，他们将8个由60个核苷酸组成的DNA片段，首次人工合成了实验老鼠的线粒体基因组。研究人员表示，这是迄今为止最简单有效的基因合成技术，可用来设计和制造出疫苗、药品，或将细菌的细胞变成清洁能源等。 4、本课题的主要研究内容及拟采取的技术路线、试验方案本项目主要通过设计目的基因的PCR扩增的退火温度，延伸时间来探讨目的基因的PCR扩增的最适条件和最佳方法，通过琼脂糖电泳实验来检测目的基因的合成效果。然后将目的基因与载体连接并转入感受态细胞，通过阳性单克隆筛选来检测目的基因是否合成正确并转入载体。实验过程中的难点是引物的GC含量和长度不同，确定退火温度及延伸时间有一定难度。PCR扩增效果直接影响后续的连接与转化。经初步实验分析，实验过程中主要解决的是PCR扩增的退火温度，延伸时间的确定方法的优化。基本步骤：1、实验分析：根据基因合成大小、引物的平均GC含量及每条引物的GC含量对基因进行分段和确定退火温度及延伸时间。2、按确定好的退火温度及延伸时间进行两轮PCR扩增，再第二轮PCR结束后进行琼脂糖检测回收。3、根据实验方案对载体需要插入的位点进行酶切，并进行琼脂糖检测回收。4、将回收回来的目的基因转入合适的载体并导入感受态细胞。5、将感受态细胞放入LB培养基中37℃、200rpm摇菌1小时6、将菌液4800rpm离心5分钟，将上清倒掉一部分，剩余约50ul左右，将离心下来的菌体用移液器混匀。7、在超净工作台下涂布平板（平板为涂有显色剂IPTG/X-gal，含Amp抗性的培养基上），确保无菌，涂布要均匀。8、将涂布好的平板正面放入37℃培养箱中半小时后，倒置培养过夜。9、将LB培养基加入48孔深孔板，并用镊子拿灭菌的枪头挑选平板上的单菌落到48孔深孔板（一般挑选1排8个克隆）同时在48孔板上做好记号。10、48孔深孔板用封口膜盖好，用针头在封口膜上打孔。把它放在37度摇床上摇一个小时。11、配好的反应液加到96孔反应板中，用排枪加菌液到其中。（注意在96孔反应板上做好标记）96孔反应板放在PCR仪器上盖好橡胶垫，进行PCR反应。 12、向96孔反应板进行琼脂糖电泳检测，然后根据检测图判断阳性克隆。13、照96孔筛选表从48孔深孔板把阳性克隆菌液吸出来，转移到1.5ml的EP管中，并在管上做好标记。填好的测序单和阳性克隆菌液送测序。5、研究基础（1）1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种具有更高连接活性的DNA连接酶——T4DNA连接酶。1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRⅠ,在体外对猿猴病毒SV40的DNA病毒分别进行酶切，然后再用T4噬菌体DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40的入噬菌体DNA重组的杂种DNA分子。（2）试验条件：公司可提供基本的实验材料和试剂，同时具有实验过程中需用到的主要设备：台式电子天平（0.0001g）、PCR仪、紫外透射仪、HH-2数显恒温水浴锅；离心机、超净工作台、电泳槽、震荡器、各种量程移液器、紫外切胶台、计时器、自动恒温摇床、恒温培养箱。b.未具备的条件及提出的解决方案1）徐小花、杨念云对女贞子中黄酮化合物的研究，从醋酸乙酯部位和正丁醇部位中分离得到7个黄酮化合物，分别为芹菜素(I)、大波斯菊苷(Ⅱ)、芹菜素一7—0一乙酰一8一D一葡萄糖苷(Ⅲ)、芹菜素一7—0一p—D一芦丁糖苷(Ⅳ)、木樨草素(V)、木樨草素一7—0一p—D一葡萄糖苷(Ⅵ)、槲皮素(Ⅶ)。（2）试验条件：a.学院可提供基本的实验化学药品，同时具有实验过程中需用到的主要设备，如电子天平（HENGPINGJA31002），循环真空泵（DHZ-D,巩义市英峪华玉仪器厂），离心机（TDL-40B），DN-2型调温电热器，紫外分光光度计（UV1800，岛津公司），LENGGUANG722SPECTROPHOTOMETER，DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器等。其他实验时需用到的组织匀浆机等可由湖北师范学院协助提供。b.未具备的条件及提出的解决方案6、预期达到的目标及进度安排通过本项目的研究不同退火温度、延伸时间时基因合成效果，及连接转化结果确定基因合成的最适条件和最简方法。进度安排如下：2011年3月1日~2010年3月7日查找资料，认真选题2011年3月8日~2010年3月14日完成开题报告，查找资料2011年3月15日~2010年4月20日认真实验探索研究2011年4月21日~2010年5月1日初稿形成2011年5月2日~2010年5月15日终稿形成2011年5月16日~2010年5月22日装订答辩 7、阅读的主要文献、资料[1]李炜东,梁布锋,祁自柏.通过PCR进行长片段DNA的合成[J].遗传,2004,(03)：125-130.[2]郑景生,吕蓓.PCR技术及实用方法[J].分子植物育种,2003,(03)：59-62.[3]廖世奇,张春梅,张雪力,孙雨葳,王黎,王晓辉.一种PCR快速鉴定重组体DNA阳性克隆及插入方向的方法[J].科学技术与工程,2004,(02)：486-490.[4]patriciaV.King,RobertW.Blakesley,陶云霞.用于转化实验的最佳DNA连接反应[J].中国生物工程杂志,1987,(06)：568-572.[5]徐丽,蔡俊鹏.菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较[J]华南理工大学学报(自然科学版),2004,(05)：436-441.[6]生秀杰,周伟强,姜莉,王太一,张学.应用以菌落为模板的聚合酶链反应技术筛选重组阳性克隆[J]中华检验医学杂志,2002,(04).256-261.[7]李华,刘延琳,夏惠,张振文.菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用[J]西北农林科技大学学报(自然科学版),2004,(09).32-38.[8]AllenSJ,HolbrookJJ.Isolation,sequenceandoverex-pressionofthegeneencodingNAD-dependentformatede-hydrogenasefromthemethylotrophicyeastCandidameth-ylica[J].GENE,1995,162:99-104.[9]SchaggerH.Tricine-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kD.AnalBiochem,1987,166:368-379.[10]BomanHG.Peptideantibioticsandtheirroleininnateommunity.AnnuRevImmunol,1995,13:61-92.