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分类号：密级：研究生学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维论文题目（中文）化作用及其机制研究Anti-fibrosisActivityandMechanism论文题目（外文）ResearchofRapeseed-derivedAntioxidantPeptideRAPinDiabeticNephropathy研究生姓名张明艳学科、专业生物学·生物化学与分子生物学多肽生物化学与药物化学研究方向学位级别硕士导师姓名、职称王锐院士论文工作起止年月2015年9月至2018年6月论文提交日期2018年4月论文答辩日期2018年5月学位授予日期校址：甘肃省兰州市 缩略语（Abbreviation）缩写中文名英文名DM糖尿病DiabetesmellitusDN糖尿病肾病DiabeticnephropathyBUN血清尿素氮BloodureanitrogenScr血清肌酐SerumcreatinineTG血清甘油三脂TriglycerideMDA丙二醛MalondialdehydeSOD超氧化物歧化酶SuperoxidedismutaseCAT过氧化氢酶CatalaseSTZ链脲佐菌素StreptozotocinECM细胞外基质ExtracellularmatrixHFD高脂高糖饲料High-fatdietTGF-β1转化生长因子-β1Transforminggrowthfactor-β1CTGF结缔组织生长因子ConnectivetissuegrowthfactorFN纤连蛋白Fibronectinα-SMA平滑肌肌动蛋白α-smoothmuscleactinGMC肾小球系膜细胞GlomerularmesangialcellsMTT3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-5-二苯基四氮唑溴盐2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromideHG高糖培养基HighGlucoseCOL4IV型胶原CollagenIVI 油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究摘要研究背景和目的：糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病最严重、最常见的微血管并发症之一。肾脏纤维化是DN的主要病理结局，也是晚期肾病（ESRD）的主要病因。DN的病理变化主要包括正常肾单位的丢失、大量成纤维细胞和肌成纤维细胞增生、细胞外基质（ECM）如胶原蛋白和纤连蛋白（FN）过量生成并堆积以及肾小球内Kimmelsstiel-Wilson（KW）结节形成，并且伴随着肾小球与肾小管基底膜增厚、肾小管间质纤维化，最终导致肾小球硬化。目前防治DN的措施主要包括控制血糖、血压和血脂等，但目前临床和基础研究阶段的药物只能延缓而不能阻止DN的进展，且大都具有较严重的副作用。因此，寻找有效防治DN的方法与药物具有重要的理论与实践意义。植物来源的生物活性肽由于其潜在的营养和药用价值被广泛应用于各个领域，目前发现的这类多肽有降胆固醇肽、血管紧张素I抑制肽、抗菌肽、免疫调节肽和抗氧化肽等，但这类多肽目前还未应用于抗肾脏纤维化研究。鉴于氧化应激在DN中的重要作用，我们选择了具有抗氧化作用的多肽RAP（序列为YWDHNNPQIR），研究其在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病模型和高糖诱导的肾小球系膜细胞（GMC）中的抗纤维化作用。方法：（1）体内实验：8周龄雄性C57BL/6小鼠连续5天腹腔注射STZ45mg/kg/day，正常组注射相同体积的柠檬酸缓冲液，平衡72h后检测血糖，血糖值大于11.1mM认定为糖尿病模型成功，然后将小鼠随机分成正常对照组（normalcontrolgroup,Control,n=6）、糖尿病模型组（diabeticmodelgroup,DM,n=8）、RAP低剂量组（RAPlowdosegroup,0.1mg/kg,RAP-L,n=8）和RAP高剂量组（RAPhighdosegroup,0.1mg/kg,RAP-H,n=8），进行隔天皮下注射给药，其中正常组给予相同体积的PBS溶液，并同时给予糖尿病模型组和给药组高脂高糖饲料（HFD）喂养12周。实验结束前用代谢笼收集尿液检测尿蛋白，取血后检测血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）和血清TGF-1水平。解剖收集肾脏后通过六胺银基底膜（PASM）、HE、Masson和天狼星红（SiriusRed）染色进行病理学检测，同时用WesternBlot、RT-PCR和免疫组化实验检测I 小鼠肾脏中TGF-1、CTGF、FN和-SMA的mRNA水平和蛋白水平表达，还检测了小鼠肾脏中ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。（2）体外实验：高糖诱导GMC细胞后用MTT实验检测RAP对细胞增殖的影响和毒性作用，确定RAP的最佳浓度为50M和100Μ。同时，在mRNA水平和蛋白水平，检测高糖诱导GMC细胞中TGF-1、CTGF、FN和-SMA的表达情况，及ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。此外，用ELISA实验检测细胞培养液中胞外基质FN和COL4的含量。结果：（1）与糖尿病组相比，RAP能够改善DN肾脏纤维化症状，包括改善BUN、Scr和TG等肾脏指标，改善氧化应激指标SOD和MDA，抑制肾脏中TGF-1、CTGF、FN和-SMA的表达量，减轻肾脏中胶原纤维沉积，改善肾小球肥大及基底膜增厚现象，同时能够抑制肾脏MAPK和NF-B信号通路。（2）RAP能够显著抑制高糖诱导下GMC细胞培养液中FN和COL4的表达，同时能够下调TGF-1、CTGF、FN和-SMA在mRNA和蛋白水平的表达。此外，RAP抑制GMC细胞中MAPK和NF-B信号通路。结论：多肽RAP能够通过抑制MAPK和NF-B信号通路来改善STZ诱导的DN肾脏纤维化和高糖诱导的GMC细胞纤维化作用。关键词：抗氧化肽，糖尿病肾病，胞外基质，肾脏纤维化，MAPK，NF-BII Anti-fibrosisActivityandMechanismResearchofRapeseed-derivedAntioxidantPeptideRAPinDiabeticNephropathyAbstractBackgroundandpurpose:Diabeticnephropathy(DN)isoneofthemostcommonandseriousmicrovascularcomplicationsofdiabetes.Kidneyfibrosisisthemainpathologicalchangeindiabeticnephropathy(DN),whichisthemajorcauseofendstagerenaldisease(ESRD).ThepathologicalchangesofDNmainlyincludethelossofthenormalnephron,hyperplasiaofalargenumberoffibroblastsandmusclefibroblasts,andexcessiveaccumulationofextracellularmatrix(ECM)includingcollagenandfibronectin(FN),thustheglomeruliKimmelsstiel-Wilson(KW)nodulesareformed.Inaddition,glomerulusandrenaltubularbasementmembranethickeningandrenaltubularinterstitialfibrosis,eventuallyleadtoglomerularsclerosis.ThestrategyofDNtreatmentistocontrolbloodglucose,lowerbloodpressureandcontrolhyperlipidemia.Existingtreatmentsmayslowdowntheprocess,buttheycannotstopESRDfromoccurringandcausingsideeffects.Therefore,itisofgreattheoreticalandpracticalsignificancetodevelopnoveltherapeuticagentsthattargetthemajorpathologicalmechanismsofDN.Plant-derivedbioactivepeptidesinfoodstuffsarewidelyusedinmanyfieldsduetotheirpotentialpharmaceuticalandnutraceuticalbenefits.Majorbiologicaleffectsofplant-derivedpeptidesincludeloweringcholesterol,inhibitingangiotensinI,antibiosis,immunoregulationandantioxidant.However,thiskindofpeptidehasnotyetbeenstudiedinrenalfibrosis.PreviousstudiesindicatedthatthepeptideRAP(thesequenceisYWDHNNPQIR),anaturalpeptidederivedfromrapeseedprotein,hasanti-oxidativestresseffect.Theoxidativestressisbelievedtobeassociatedwithdiabeticnephropathy.TheaimofthisstudywastoevaluatethepharmacologicaleffectsofRAPagainstrenalfibrosisofDNandhighglucose(HG)-inducedmesangialdysfunction.Methods:(1)Invivoexperiments,eight-week-oldmaleC57BL/6micewereinducedbyinjectingSTZatdosageof45mg/kgfor5consecutivedays,andthesamedoseofcitricacidbufferwasinjectedinthenormalgroup.Thebloodglucoselevelwasmeasured72hoursafterSTZinjection.Micewithfastingbloodglucoselevelsabove11.1mMwereconsidereddiabetic.Next,micewererandomlyassignedtothefourexperimentalgroups:normalcontrol(control,n=6),diabeticmodel(DM,n=8),diabetic+lowdoseRAP(RAP-L,0.1mg/kg/day,n=8)anddiabetic+I highdoseRAP(RAP-H,0.5mg/kg/day,n=8).Treatmentwascontinueduntilthe12thweekandwithfreeaccesstoHFD.IntheRAPtreatmentgroup,micewereadministratedwithRAPeverytwodays.ThesamevolumeofPBSwasgiventothemiceinboththenormalcontrolgroupanddiabeticgroup.After12weeksoftreatment,allanimalswerehousedinmetaboliccagestoallow24-hoururinecollectionandmeasurementofalbuminuria.Theserumcreatinine,bloodureanitrogen,triglycerideandserumTGF-1weredetectedafterbloodcollection;themRNAandproteinlevelsofTGF-1,CTGF,FNandα-SMAinthemousekidneysweremeasuredbywesternblot,immunohistochemicalandRT-PCRanalysis.ThephosphorylationlevelsofERK1/2,p38andp65inthemousekidneysweredetectedbywesternblotandimmunohistochemicalanalysis.Invitroexperiments,GMCwereinducedbyhighglucose,andtheMTTassaywasusedtomeasurecellproliferationandcytotoxicitytoselectedRAPeffectiveconcentrations(50and100μM)inoursubsequentexperiments.ThemRNAandproteinlevelsofTGF-1,CTGF,FNandα-SMAinducedbyHGinGMCweredetected.ThephosphorylationlevelsofERK1/2,p38andp65inGMCinducedbyHGweremeasured.Inaddition,wemeasuredthelevelsofFNandCOL4inthesupernatantofGMCusingELISAanalysis.Results:(1)After12-weeektreatment,RAPimprovedthediabeticsyndromesandrenalfibrosiscomparedwithDNmice,including:ImprovesrenalfunctionindexesBUN,ScrandTG;AmelioratesoxidativestressparametersSODandMDA;InhibitedtheexpressionofTGF-1,CTGF,FNandα-SMAinDNmice;Reducedcollagendepositioninthemousekidneys;Decreasedglomerularhypertrophyandthickeningofbasementmembrane;InhibitedtheMAPKandNF-κBsignalingpathwaysinDNmousekidneys.(2)Comparedwithhighglucosegroup,RAPtreatmentinhibitedthelevelsofFNandCOL4inthesupernatantofGMC.Meanwhile,onmRNAandproteinlevels,theexpressionofTGF-1,CTGF,FNandα-SMAwerereducedbyRAP.Inaddition,RAPtreatmentrestrainedtheMAPKandNF-BsignalingpathwaysinHG-inducedGMC.Conclusions:RAPcanattenuatefibrosisinvivoandinvitrobyantagonizingtheMAPKandNF-Bpathways.Keywords:Antioxidantpeptide,diabeticnephropathy,extracellularmatrix,kidneyfibrosis,MAPK,NF-B.II 目录缩略语.....................................................................................................I摘要.....................................................................................................IAbstract...................................................................................................I第一章前言...........................................................................................11.1糖尿病肾病及其发病机制................................................................................11.1.1糖尿病肾病与肾脏纤维化简介............................................................11.1.2DN肾脏纤维化发展中的重要细胞生长因子.....................................11.1.3DN肾脏纤维化相关重要信号通路......................................................31.1.4氧化应激与糖尿病肾脏纤维化.............................................................61.2DN肾脏纤维化治疗药物进展..........................................................................71.2.1CTGF基因靶向治疗...............................................................................71.2.2抑制ECM沉积及促进其降解相关药物..............................................81.2.3内皮素受体拮抗剂.................................................................................91.2.4肾素-血管紧张素系统阻断剂...............................................................91.2.5抗氧化应激治疗药物...........................................................................101.2.6多肽治疗药物.......................................................................................121.3食品中植物来源的生物活性肽概述.............................................................131.3.1存在于食品中的植物来源生物活性肽..............................................131.3.2目前发现植物来源多肽的主要生物活性.........................................13参考文献...............................................................................................16第二章RAP改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏纤维化.....................262.1引言...................................................................................................................262.2实验材料...........................................................................................................27III 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.2.1实验动物.................................................................................................272.2.2主要药品与试剂...................................................................................272.2.3实验仪器................................................................................................272.3实验方法...........................................................................................................282.3.1多肽RAP固相合成与纯化..................................................................282.3.2糖尿病肾脏纤维化体内实验设计.......................................................292.3.3STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏纤维化模型构建..................................292.3.4样本采集与检测...................................................................................302.3.5病理切片染色实验...............................................................................302.3.6WesternBlot实验..................................................................................322.3.7RT-PCR实验.........................................................................................352.3.8数据统计分析.......................................................................................362.4实验结果...........................................................................................................372.4.1RAP对糖尿病小鼠体重及血糖的影响..............................................372.4.2RAP对糖尿病小鼠血清TGF-1、肾功及氧化应激指标的影响..382.4.3RAP对肾脏常规病理变化的影响......................................................392.4.4RAP对糖尿病小鼠肾脏胶原蛋白沉积的影响.................................392.4.5RAP对糖尿病小鼠肾脏中TGF-1及CTGF表达的影响.............402.4.6RAP对糖尿病小鼠肾脏中FN及α-SMA表达的影响....................412.4.7RAP对糖尿病小鼠肾脏中MAPK及NF-κB信号通路的影响......432.5讨论...................................................................................................................45参考文献...............................................................................................47第三章RAP改善高糖诱导的肾小球系膜细胞（GMC）纤维化......503.1引言...................................................................................................................503.2实验材料...........................................................................................................513.2.1细胞........................................................................................................51IV 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究3.2.2主要药品与试剂...................................................................................513.2.3主要仪器................................................................................................513.3实验方法...........................................................................................................513.3.1细胞培养与溶液配制...........................................................................513.3.2MTT法检测RAP对高糖诱导GMC细胞增殖作用及细胞毒性...523.3.3ELISA实验............................................................................................523.3.4WesternBlot实验.................................................................................533.3.5RT-PCR实验.........................................................................................533.3.6数据统计与分析...................................................................................533.4实验结果...........................................................................................................533.4.1RAP在无毒性前提下抑制高糖诱导系膜细胞过度增殖.................533.4.2RAP抑制高糖诱导下GMC细胞胞外基质沉积..............................543.4.3RAP抑制高糖诱导GMC细胞中TGF-1和CTGF水平..............543.4.4RAP抑制高糖诱导GMC细胞中FN和α-SMA水平.....................553.4.5RAP抑制高糖诱导GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路......573.5讨论...................................................................................................................58参考文献...............................................................................................60第四章总结与展望.............................................................................624.1主要结论...........................................................................................................624.2研究展望...........................................................................................................62在学期间的科研成果............................................................................64致谢.....................................................................................................65附录.......................................................................................................66V 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究第一章前言1.1糖尿病肾病及其发病机制1.1.1糖尿病肾病与肾脏纤维化简介随着人们生活及饮食方式的变化，糖尿病的发病率逐年增加，据统计，2015年全球糖尿病患者的数量已达到4.15亿，预计到2040年将增加至6.42亿，且印度和中国是糖尿病患者最多的两个国家（占患者总数的48%）。糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病最严重的并发症，约1/3的病人最终都会发生DN，它是导致终末期肾病（endstagerenaldisease,ESRD）的首要原因1。其病理改变包括正常肾单位不断破坏，并且伴随着纤维分子的大量增生、纤连蛋白（fibronectin,FN）和胶原蛋白等胞外基质的异常堆积2，肾小球与肾小管基底膜增厚，肾小球内Kimmelstiel-Wilson（KW）结节形成，肾小管间质纤维化，最终导致DN肾脏纤维化（renalfibrosis）3。此外，DN肾脏纤维化过程中常伴随着炎症及肾小管硬化4。由于DN肾脏纤维化的发生是一个非常复杂的慢性病理过程，很多细胞生长因子及炎性因子参与其中，因此，DN肾脏纤维化的预防及其发病机制的研究始终是国内外肾脏病领域的研究重点。我们结合国内外文献，对DN肾脏纤维化的重要发病机制总结如下：1.1.2DN肾脏纤维化发展中的重要细胞生长因子1.1.2.1转化生长因子转化生长因子（TGF-）是一种分泌型多肽，由deLarco等人在1980年研究病毒时首次发现，主要包括TGF-1、TGF-2和TGF-3，其中研究最多的是TGF-1。长期以来，TGF-1被认为是肾脏纤维化的主要介质，并通过激活其下游的Smad和非Smad信号通路来诱发肾脏纤维化5。事实上，TGF-1与糖尿病肾病、膜性肾病和其它慢性肾脏疾病都有联系，它诱发肾脏纤维化的基本机制是上皮细胞间质转变（EMT）导致肾小管上皮细胞的形态和表型发生变化，以及引起肾脏细胞从肾小管基底膜脱离并转移到间质中6,7。大量数据证明在体外实验和体内实验模型以及糖尿病肾病患者中，TGF-1都是主要的致纤维化因子8。在DN患者肾小球以及高糖诱导的GMC细胞中，胞外基质胶原纤维出现大量沉积现象9,10。此外，在体外和体内的糖尿病肾病模型中，TGF-1还可以对miRNAs进行反馈调节，进而放大TGF-1的促肾脏纤维化作用9。例如在糖尿病患者体1 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究内，TGF-1可以下调miR-192，使E-cadherin下调，从而导致EMT发生。TGF-1还可以通过上调miR-377引起FN的沉积11,12。以上这些结果都说明TGF-1是ECM沉积导致肾脏纤维化的主要刺激因子。1.1.2.2结缔组织生长因子结缔组织生长因子（CTGF/CCN2）是一种多域的母细胞蛋白，它在不同的组织中起到调节原纤维的作用。高葡萄糖、氧化应激和AngII等外界刺激能够使体内TGF-1表达量增加，从而诱导CTGF活化，进一步诱导其下游的纤维化作用。虽然CTGF的具体靶细胞目前尚不清楚，但研究发现CTGF能够激活Smad、ERK和Wnt等信号通路13,14。在肾脏中，CTGF能够通过裂解成很小的碎片来激活基质细胞和肾小管上皮细胞。Guha等人在1型和2型糖尿病小鼠模型中研究了CTGF的作用，结果发现在糖尿病模型肾脏中，CTGF表达量显著增加，并且在单侧输尿管阻塞模型（UUO）中，CTGF反义寡核苷酸能够抑制肾脏纤维化程度15。Yokoi等人发现，在转基因的糖尿病模型中，CTGF的表达量也显著增加，与此同时，小鼠24h尿蛋白含量增加、肾小球基底膜增厚、ECM大量沉积16。Mason等人的研究发现，CTGF还能够与细胞表面的整合素结合，激活p42/p44丝裂原活化蛋白激酶，从而导致系膜细胞中FN和COL4等ECM蛋白大量积聚，而用整合素抗体处理后，又能够显著抑制ECM蛋白的合成17。图1-1CTGF在肾脏纤维化中的作用机制2 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究最近的一项研究表明，CTGF在周细胞纤维化过程中虽然不是必须因素，但在UUO小鼠中，CTGF的表达量随着炎症和纤维化作用显著增加14。有趣的是，最近Kinashi等人发现了CTGF的新功能，那就是它可以直接调控纤维化肾脏中淋巴血管的生成，在这项研究中，CTGF能够减轻UUO以及缺血再灌注动物模型的肾脏损伤，同时还能够抑制VEGF-C表达以及淋巴血管生成，在体外实验中，完整的CTGF片段能够抑制HK-2细胞中VEGF-C的表达18。因此，CTGF在肾脏纤维化中扮演着重要角色。图1-1对CTGF在肾脏纤维化中的作用进行了总结。1.1.2.3肝细胞生长因子肝细胞生长因子（HGF）是一种促进肝细胞再生的多肽生长因子，在肾脏等多种器官中广泛表达，并且具有多种生物活性。除了它的再生特性，众多研究表明HGF也是一种内源性的抗纤维化因子，在各种各样的实验动物模型中具有改善子宫损伤和保护器官等功能。此外，研究发现HGF不仅具有抑制肾脏纤维化的作用，还可以防治肾小球肾炎19、UUO肾脏20-22、切除性残余肾脏23,24和环孢霉素肾病25,26等多种慢性肾脏病的发生发展。有害刺激导致肾脏损伤后HGF表达开始增加，然而长期暴露于有害刺激最终会导致HGF下降，并且伴随着TGF-1的增加。大量研究发现，HGF可以抑制纤维化肾脏中TGF-1/Smad、HIF和NF-B信号通路27。在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中，HGF可以抑制肾小球肥大和系膜细胞增生，并且降低肾脏中FN、COL1和-SMA的mRNA及蛋白表达，而用HGF抗体治疗后，小鼠病情又出现加重现象28。此外，HGF还可以通过激活肾小管上皮细胞和系膜细胞中MMP/TIMPs和PA/PAI两条通路来促进ECM降解，通过维持肾小管细胞中E-cadherin的表型来防止EMT发生29。目前HGF已经应用于临床肝脏纤维化的治疗，但其对肾脏纤维化的作用还处于基础研究阶段。1.1.3DN肾脏纤维化相关重要信号通路目前研究认为，肾脏纤维化是进行性的、不可逆的病变，虽然当前关于肾脏纤维化以及药物的研究非常普遍，但其发病机制仍未完全阐明，主要原因是肾脏纤维化发生机制非常复杂，许多信号通路直接或间接参与了该过程。目前研究比较普遍的与肾脏纤维化相关的重要信号通路及其相互之间作用如图1-2所示。3 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究图1-2DN相关信号通路之间相互作用图301.1.3.1TGF-/Smad信号通路Smad蛋白是TGF-1受体的胞内激酶底物，也是目前被唯一证实的介导TGF-1在细胞内信号传导的物质，主要有TGF-1受体I（TbRI）和TGF-1受体II（TbRII）2种受体。TGF-1受体II（TbRII）与TGF-1结合后刺激TGF-1受体I（TbRI）激酶，导致Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3能够与正常的Smad4聚合，从而激活细胞内信号通路31。Smad2、Smad3和Smad4的聚合物转移到细胞核中调控目标基因Smad7的转录，Smad7是Smad2和Smad3的抑制物，它通过靶向与TbRI结合来抑制Smad2/Smad3的活化32。在哺乳动物体内，Smad2和Smad3是纤维化因子TGF-1的特异性受体，而Smad1、Smad5和Smad8是骨形态蛋白（BMP）的特异性受体。除了依赖于Smad的途径之外，TGF-1还通过与非Smad途径作用来发挥其生物作用，如有丝分裂蛋白激活蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇3激酶和Rho激酶途径等33。研究发现，TGF-/Smad信号通路在1型和2型DN病人中被高度激活，即肾小球和肾小管细胞中Smad2和Smad3都发生磷酸化作用。此外，在纤维化肾脏中，Smad2和Smad3的激活还与其抑制物Smad7的减少有关，这说明TGF-/Smad信号通路的激活在肾小球硬化和肾小管间质纤维化过程中起着关键作用34。在体外，高葡萄糖、AGE和4 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究AngII等因素也可以使肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和肾小管平滑肌细胞中的Smad2和Smad3磷酸化。因此，Smad信号通路在DN肾脏中是严重失调的，也说明在DN肾脏中重新调节TGF-/Smad信号通路可能是一种有效的治疗策略。1.1.3.2MAPK信号通路丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一种存在于细胞中的蛋白调节激酶。MAPKs家族成员主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-JunN端激酶（JNK）和p38MAPK。MAPKs是细胞外刺激-介导信号传导过程的重要组成部分35。MAPKs的激活是通过一系列连锁反应来调节的，首先，MAP3Ks（MEKKs/MAPKK激酶）通过磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基来激活MAP2Ks（MEKs/MAPK激酶），活化的MAP2Ks通过将丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化来激活MAPKs36，说明这两种氨基酸残基的磷酸化对刺激生长因子和有丝分裂之间的信号转导过程至关重要。ERK1/2的激活取决于细胞外的反应，如生长因子和激素的刺激。其他的MAPK家族成员，如p38MAPK和JNK，能够在各种压力刺激下被激活，因此被联合命名为压力激活蛋白激酶37。Lakshmanan等人发现奥美沙坦可以调节体内ACE-2和Ang-(1–7)受体，从而起到抑制ERK1/2、p38MAPK和JNK磷酸化的作用38。此外，在糖尿病大鼠和高糖培养的GMC中，Jung等人发现p38MAPK抑制剂FR167653能够改善肾小球中FN的mRNA和蛋白表达水平，减少系膜细胞凋亡39。Medicherla等人发现，在DN中，SCIO-469能够抑制中性粒细胞和巨噬细胞中p38磷酸化，此外Ang-(1–7)能够抑制高糖诱导下p38MAPK的活化40。因此，MAPK在DN肾脏纤维化中起着至关重要的作用，研究药物对MAPK信号通路的抑制作用可能会很好的抑制DN引起的肾脏纤维化进程。1.1.3.3NF-B信号通路NF-B是核转录因子家族成员，它在许多细胞受外界刺激后的转录调节过程中起着关键性作用。目前的研究认为大多数参与炎症反应的基因都是由NF-B介导的。NF-B对糖尿病肾病和肾间质纤维化等多种肾脏疾病的发生发展起着关键调节作用41。大量证据表明，蛋白尿、梗阻和脓毒血症等均可激活肾小管细胞、足细胞及系膜细胞内NF-B信号通路，从而导致肾小管受损以及肾小球缺血性损伤。此外，许多研究表明，MAPK与NF-B信号通路之间存在直接和间接的关系，Je等人发现活化的NIK/IKK和p38MAPK信号通路能够激活NF-B通路，然后NF-B转移到细胞核中，进一步调控相关因子的表达42。越来越多的证据表明，在DN动物模型中，NF-B的活化会导致肾小管扩张和ECM过量沉积，最终发生肾脏纤维化43。在多种肾脏纤维化模型中抑制NF-B信号通路能够很5 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究好地缓解纤维化进程，例如，在UUO大鼠模型中，抑制NF-B的表达能够显著降低肾脏中胶原纤维IV沉积、减少-SMA的表达44。此外，血管紧张素抑制剂和PDTC也可通过抑制NF-B来减弱DN肾纤维化进程。还有研究报道糖皮质激素与RelA直接作用后可抑制NF-B与相关蛋白的结合45。因此，利用药物阻断NF-B信号通路，或者以抑制NF-B信号通路为中心来开发新药物有望成为治疗肾纤维化的新策略。1.1.4氧化应激与糖尿病肾脏纤维化近年来，随着对肾脏纤维化认识的不断深入，氧化应激在肾脏纤维化中的作用越来越受到人们的重视。氧化应激在糖尿病患者及慢性肾脏疾病中普遍存在，并且是促使其发生肾脏纤维化主要因素。在正常的生理条件下，体内氧自由基的生成和消除处于平衡状态，而在糖尿病等病理状态下，这种平衡破坏导致体内产生大量活性氧，从而引起细胞损伤46,47。越来越多的实验和临床研究证据表明，高血糖、氧化应激和糖尿病并发症之间存在密切联系48,49，氧化应激可能是导致糖尿病肾病发病以及晚期肾病发展的主要原因50,51。研究表明，活性氧(ROS)与血管收缩、血管平滑肌细胞生长和迁移、内皮功能障碍、细胞外基质(ECM)蛋白沉积以及肾脏中钠的重吸收有关52,53。将氧化应激抑制剂应用于STZ诱导的DN动物模型中，发现其可以显著抑制糖尿病肾病的发展进程，表明氧化应激与DN之间存在密切联系54。此外，研究还发现在转基因糖尿病小鼠中，Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶（SOD-1）的过度表达可以减弱糖尿病患者的肾脏损伤55。在体内，氧化应激可以通过不同机制促进细胞因子的生成。首先，氧自由基作为第二信使，激活核转录因子B（NF-B）和活化蛋白-1（AP-1），从而导致编码细胞因子、生长因子和ECM相关蛋白的基因开始转录56,57。活化的NF-B能够通过与系膜细胞相互作用引起肾脏损伤58。AP-1能够介导高糖诱导的肾小球系膜细胞中TGF-1的生成，反之位于TGF-1上游的AP-1结合位点的突变能够降低高糖诱导的系膜细胞中TGF-1的表达59。而过氧化氢在糖尿病炎症中起重要作用，它能够降低一氧化氮的生物利用度60。此外，巨噬细胞的大量转移会导致炎症和原纤维细胞因子的释放，从而进一步刺激ROS的产生61。因此，在DN中，氧化应激通过诱导细胞因子的生成进一步促进氧化应激作用，从而形成恶性循环（图1-3）。6 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究62图1-3糖尿病肾病发病机制中高血糖、氧化应激和炎症细胞因子之间的关系1.2DN肾脏纤维化治疗药物进展目前，糖尿病肾病在临床的主要治疗策略有控制血糖、减少尿蛋白、控制血压和血脂等63。虽然目前的治疗能够减缓糖尿病肾病的进程，但长期治疗效果仍不尽人意。近年来，糖尿病肾病及肾脏纤维化治疗引起了广泛的关注，并且在药物研发、基因靶向治疗方面取得了一定的进展，下面对国内外一些临床和基础研究进行总结介绍。1.2.1CTGF基因靶向治疗CTGF存在于人体多种器官中，在肾脏中含量最高，同时也是TGF-1的一个重要下游因子64。CTGF也可以作用于TGF-1，它可以促进TGF-1与其受体之间的亲和力，从而导致肾脏发生纤维化，同时尿中CTGF也可作为肾脏纤维化的生物标记物65。研究发现，TGF-1只可诱导短期纤维化，而在慢性纤维化的维持过程中CTGF起着关键性作用66。由于TGF-1不只是致纤维化的关键因子，它还具有与纤维化和伤口无关的抗炎、抗增殖和抗肿瘤等免疫调节作用67。而系统性抑制TGF-1会导致机体产生很多不良反应，如出现自身免疫性疾病、炎症和肿瘤等64。因此，通过特异性抑制TGF-1来治疗肾脏纤维化目前仍然存在争议。CTGF的一个关键优点是它具有致纤维化作用，但对机体无免疫调节作用，7 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究靶向阻断CTGF不但可以抑制肾脏纤维化，并且能够避免免疫系统紊乱导致的其他疾病。体外和体内研究发现，在DN模型及高糖诱导的系膜细胞中，CTGF的表达水平显著增加，这说明CTGF在DN的发生发展中起着重要作用。此外，在UUO动物模型中，蛋白尿含量、ECM蛋白及CTGF表达量显著增加，但用CTGF反义寡核苷酸（ASO）治疗后CTGF的表达显著降低。更有趣的是，在这个模型中，虽然TGF-1表达没有被抑制，但肾脏纤维化病理状态仍可被CTGF反义寡核苷酸缓解68。将CTGF反义寡核苷酸应用于1型和2型糖尿病动物模型中，发现动物体内血肌酐、血尿素氮和蛋白尿被缓解，肾脏中ECM的生成也显著降低69。在慢性肾纤维化模型（肾移植）中，通过尾静脉注射方法将CTGF反义寡核苷酸注入大鼠体内，发现大鼠肾脏中CTGF表达显著降低，同时改善肾功能指标以及降低纤维化相关因子的表达18。总之，CTGF既是诱导纤维化的关键因子，也是治疗肾脏纤维化的潜在靶标之一，但还需更多的临床研究来评估CTGF在糖尿病肾病中的安全性和有效性。1.2.2抑制ECM沉积及促进其降解相关药物吡非尼酮（PFD）是一种小分子化合物，最初发现其具有止痛、抗热和抗炎作用。在临床上被用于治疗特发性肺纤维化，它不仅能够抑制肺间质纤维化，降低患者死亡率，甚至还能逆转纤维化过程70。到目前为止，PFD已经被用于多种与糖尿病相关的心脏病和肾脏疾病的基础和临床试验71。临床研究发现，PFD可以改善DN肾脏纤维化患者的表皮生长因子（EGFR）水平。在体外实验中，Takakuta等人发现用TGF-1诱导NRK52E细胞后，FN表达量显著增加，PFD干预后能够抑制胞外基质FN的过量表达72。研究还证实PFD与小鼠肾脏中成纤维细胞的激活和有丝分裂密切相关73。此外，大量的基础研究证实PFD具有显著抗肾脏纤维化的作用，例如在UUO和DN模型中，PFD均被证实具有抗肾脏纤维化的作用74,75。因此，大量的基础实验为PFD的临床应用奠定了基础。芬戈莫德（FTY720）是一种鞘氨醇磷酸酯（ISP-I）的模拟物，最初作为一种新型免疫抑制剂被开发利用，与其他免疫抑制剂相比，FTY720具有副作用小、抑制效果强和作用机制独特等优点。因为它可防止肾脏移植过程中的产生的排斥反应，目前已经运用于临床III期肾移植治疗76。在成熟的T细胞中，S1P1是一种由胸腺分泌的重要调节因子，磷酸化的FTY720与S1P1具有高亲和力，两者结合后诱导受体内化，从而导致免疫细胞对S1P浓度不敏感。有趣的是，在中枢神经系统（CNS）的许多炎症下，FTY720靶向与S1P受体信号结合后能够起到保护肾脏的作用，如FTY720在脑缺血和脊髓损伤模型均具有肾脏保护作用77。目前，大量研究证实FTY720在肾脏移植及纤维化治疗中均有良好的应用前景，8 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究例如，FTY720在膜性肾小球肾炎、慢性肾小球硬化和高血压肾病模型中均表现出良好的肾脏保护作用78,79。在缺血再灌注大鼠损伤模型中，FTY720能够抑制肾脏中ECM蛋白FN、COL1和COL4的沉积，从而减轻肾脏损害80。1.2.3内皮素受体拮抗剂内皮素（ET）是日本学者Yanagisawa等人发现的小分子生物活性肽，含有21个氨基酸残基。它是迄今发现最强的收缩血管物质，在人体有ET-1、ET-2和ET-3这3种异构体，肾脏中存在的内皮素主要是ET-181，它与多种器官如皮肤、肺脏、肾脏和心脏的纤维化密切相关82,83。在肾脏纤维化过程中，ET-1能够通过与其受体ET-A和ET-B结合，从而诱导肾脏中I、III型胶原和FN的生成83。目前，ET-1受体拮抗剂被广泛应用于治疗器官纤维化。它的种类繁多，包括肽类和非肽类。目前进入临床应用的ET受体拮抗剂主要有波生坦、替唑生坦、阿曲生坦、恩拉生坦以及安贝生坦等，其中以波生坦研究得最多，研究发现，在系统性硬化症（SSc）病人中，波生坦能够通过抑制TGF-1和胶原纤维的沉积来抑制皮肤纤维化和肺脏纤维化84,85。此外，在DN大鼠模型和UUO模型中，波生坦能够抑制肾小球系膜扩张、肾间质胶原纤维沉积和肾脏中TGF-1和CTGF等致纤维化因子的表达86,87。当归和川芎是被广泛应用的传统中药，众多研究表明这两者均具有抗肾脏纤维化作用88，从这两者中提取出来的阿魏酸钠（FA）是一种非肽类ET拮抗剂，它具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用，在肾间质纤维化模型中，FA能够通过抑制肾脏中TGF-1，α-SMA和FN等因子的表达来改善UUO模型的肾纤维化作用89。此外，在2型糖尿病模型中，FA能够通过抗炎和抗氧化作用来抑制肾脏纤维化90。1.2.4肾素-血管紧张素系统阻断剂肾素-血管紧张素系统（RAS）是人体内重要的体液调节系统。糖尿病肾病患者的血液循环和肾脏组织中RAS活性都显著提高，RAS活性的增加在肾损伤的血液动力学和非血流动力学机制中均扮演着重要角色，AngII是RAS系统中的最重要的成员，因此，血管紧张素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）和AngII受体阻断剂（ARB）已成为治疗糖尿病肾病及肾脏纤维化的有效方法91。然而，众多研究发现ACEI和ARB并不能完全阻断肾脏中的RAS系统，即尽管采用ACEI或ARB治疗后，许多患者的肾脏疾病仍在恶化92-94，其主要原因是这两者抑制血管紧张素系统后会产生负反馈作用，导致肾素的分泌和合成增加95。近年来，人们发现了肾素直接抑制剂（DRI），为RAS的阻断开辟了新的治疗途径，DRI可以直接阻断肾素与血管紧张素原的结合，在源头上直接阻断RAS。9 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究Aliskiren是首个进入市场的抑制剂，能通过降低血浆和局部肾素的活性，从而有效地抑制高血压96。大量证据表明，Aliskiren能够降低糖尿病患者体内的尿蛋白含量，同时在不影响血压的情况下，具有保护肾脏、心血管和抗动脉粥样硬化等作用97-99。此外，研究还发现在2型糖尿病模型（db/db鼠）中，Aliskiren能够显著减缓糖尿病肾病的进程，起到保护肾脏的作用100。Gross等人也发现在肾间质纤维化模型（UUO）中，Aliskiren能够抑制肾间质纤维化及肾脏中TGF-1和α-SMA的表达101。因此，肾素-血管紧张素系统阻断剂在肾纤维化治疗中有很大潜力，但还需要大量的实验及临床研究来证实。目前在RAS系统基础上建立起来的应用于糖尿病肾病中的新药物如表1-1所示。表1-1在传统RAAS系统抑制的基础上建立起来的治疗糖尿病肾病新药物102DifferentinhibitorypathwaysDrugsAGEsreduction:aminoguanidine,pyridoxamine;PPARagonsts:fenofibrate,thiazolidinediones;Glucose-dependentpathwayIncretins:GLP-1receptor,DPP-4inhibitor;SGLT2inhibitor:canagliflozin,dapagliflozin;AMPKactivator:AICAR,adiponectin,statins;RAASsystem:aliskiren,HRP,spironolactone,eplerennoe;Vasoactive-pathwayEndothelialantagonism:avosentan,atrasentan;PKC-βinhibition:ruboxistaurin;IntracellularsignalingRhokinaseinhibitors:fasudil;ProscleroticGFsinhibitionAnti-PDGF,Anti-TGF-β,anti-CTGF,pirfenidone;Adenosine,pentoxifylline(TNF-αinhibition),adiponectin,Anti-inflammatorypathwaystatins,mTORinhibitor;Anti-oxidativepathwayBardoxolonemethyl,N-acetylcysteine,probucol;OthersGlycosaminoglycan,sulodexide,paricalcitol;1.2.5抗氧化应激治疗药物随着氧化应激在慢性肾病中的深入研究，氧化应激已经成为肾脏纤维化治疗的一个新的靶目标，抗氧化应激治疗有助于减轻肾损伤，延缓慢性肾病的发展。近年来通过抗氧化应激来治疗肾纤维化已经取得一定进展。10 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究1.2.5.1他汀类药物他汀类药物是目前临床上广泛使用的降脂药，根据目前的报道，他汀类药物不仅可以降低胆固醇水平、抑制肾小球系膜细胞增殖、降低蛋白尿和抑制炎症等，还具有抗氧化作用，可以通过抑制NADPH氧化酶和胞质小G蛋白的活性来清除活性氧103。此外，他汀类药物还能抑制脂质过氧化物的产生，例如普伐他汀能够抑制高糖诱导的GMC过度增殖，降低细胞MDA含量，同时还能增加系膜细胞中抗氧化酶CAT和SOD的表达，辛伐他汀能够抑制高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的过氧化作用，还可通过增加NO的生成来发挥其肾脏保护作用。1.2.5.2硫辛酸硫辛酸是一种存在于线粒体中的辅酶，在体内具有消除自由基的作用。研究发现，硫辛酸可以改善早期DN患者中的氧化应激水平和炎症状态，降低尿蛋白和白蛋白排泄率水平，从而延缓DN的发展104。因此，硫辛酸可以改善早期DN患者体内的氧化应激水平，从而起到缓解DN发生发展的作用。1.2.5.3噻唑烷二酮类药物噻唑烷二酮类药物是口服降糖药物，通过增加机体对胰岛素的敏感性发挥降糖作用，此外还能够降低2型糖尿病患者的心血管风险。大量研究表明，噻唑烷二酮类药物除了降糖之外，在DN患者中具有抗氧化应激的作用。在DN中，由线粒体引起的反应性活性氧（mtROS）能够通过激活PGC-1信号通路来加快DN的发展，而噻唑烷二酮类药物吡格列酮和环格列酮能够抑制高糖诱导的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）中活性氧的产生，这两种药物都能够上调NRF-1、TFAM和MnSOD在mRNA水平的表达。此外，吡格列酮还能够增加mtDNA和线粒体DNA的密度。以上结果都说明噻唑烷二酮类药物能够通过抑制氧化应激反应来改善DN105。1.2.5.4NADPH氧化酶抑制剂NADPH氧化酶的作用是促进NADPH的氧化过程，在DN引起的氧化应激过程中，NADPH氧化酶使ROS增加，从而引起肾脏损伤，最终导致肾脏纤维化。NADPH氧化酶目前已经成为治疗肾脏纤维化的靶目标，其抑制剂已应用于治疗肾脏纤维化，其中应用最广泛的是apocynin，研究发现apocynin能够通过抑制NADPH氧化酶的活性来抑制细胞增殖和细胞外基质沉积，同时抑制肌成纤维细胞的转化，从而起到抑制肾脏纤维化的作用106。随着研究的不断深入，越来越多的NADPH氧化酶抑制剂被应用于治疗肾脏纤维化，并在动物及细胞实验中取得了一定的疗效107。但由于NADPH氧化酶在整个人体中分布广泛，并且对免疫器官有一定的作用，因此将其抑制剂直接应用到人体还有一定的限制。11 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究1.2.5.5PKC抑制剂PKC信号系统在DN的高糖环境下被激活，这是DN主要发病机制之一。大量研究证明，PKC信号系统和氧化应激之间相互促进，从而产生恶性循环，即PKC信号系统活化后能够刺激ROS的产生，大量的ROS又能够刺激PKC信号系统活化。因此，目前已有大量研究将PKC酶抑制剂应用于抑制氧化应激，如在DN中用PKC-抑制剂LY379196干预后，肾脏中NADPH氧化酶、MnSOD和8-OHdG都被显著抑制108。还有研究发现PKC-抑制剂LY333531能够抑制与DN有关的VEGF/VPF有丝分裂和渗透作用109。这些结果说明PKC酶抑制剂能够降低DN体内ROS水平，进而抑制氧化应激的发生。1.2.5.6其他研究发现维生素C、谷胱甘肽、褪黑素和维生素E等也可减轻机体内的氧化损伤。此外，研究报道银杏叶提取物、黄芪等中草药也具有一定的抗氧化作用，但还需要进一步的研究证实。另有报道显示，二甲双胍可通过抑制动物体内氧化应激的水平发挥对肾脏的保护作用。临床研究还发现用水丹红注射液和胰岛素联合治疗早期DN可减少患者体内的尿白蛋白和肌酐含量。1.2.6多肽治疗药物目前，多肽类药物在肾脏纤维化治疗方面报道较少，且大都处于基础研究阶段。螺旋肽B（HBSP）是一种由红细胞生成素衍生的线性肽，vanRijt等人发现将HBSP应用于45分钟缺血的猪肾脏模型中，灌注7天后能够显著改善肾脏纤维化，但是由于HBSP的半衰期只有7分钟，所以限制了其在临床上的应用110。杨成等人用一种新颖的环化策略将HBSP优化，合成了硫醚螺旋B肽（CHBP），它具有显著的肾脏保护作用。该研究中，CHBP能够显著改善IRI诱导的波形蛋白和胶原蛋白I的沉积，同时在体外实验中，CHBP能够改善TGF-1诱导的E钙粘蛋白的下降和-S、波形蛋白的上调，还能够抑制Akt和FoxO3a的磷酸化水平，说明CHBP能够通过抑制Akt和FoxO3a信号通路来抑制肾脏纤维化和上皮间充质转化111。LSKL是一种抗血小板-1（TSP-1）的抑制肽，研究发现在UUO模型中，LSKL能够抑制TSP-1、TGF-1和α-SMA蛋白和mRNA水平的表达，同时还能够抑制smad2磷酸化，说明LSKL能够抑制TSP-1介导的TGF-1的活化，从而抑制肾脏纤维化112。此外，apelin（也称为APLN）是一种由APLN基因编码的肽，是某些细胞表面G蛋白偶连APJ受体的内源性配体，研究发现，在UUO模型中，apelin能够抑制α-SMA的表达，还能够抑制TGF-1和其I型受体的结合。在体外实验中，apelin能够显著抑制TGF-1诱导的HK-212 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究细胞EMT反应，这说明apelin具有潜在的肾纤维化预防作用，有望发展成为延缓CKD进展的有效药物113。1.3食品中植物来源的生物活性肽概述1.3.1存在于食品中的植物来源生物活性肽目前，存在于食品中植物来源的生物活性肽由于其潜在的医疗和营养价值被广泛研究114。由于其成本低、获取方便，在世界上很多不发达地区，天然生物活性肽的应用更为广泛。存在于植物性食品中的生物活性肽大多是水解产物，它们的初级形态无活性，这类水解产物来源于微生物（特别是发酵产物），经过胃肠消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）或体外培养的蛋白水解酶作用后或暴露于高温、极端pH下产生，其中大多数在食品发酵或储存过程中积累，比如在奶酪和酸奶中大量存在115。天然来源的生物活性肽被鉴定为“营养药物”，这是因为它们可以被特定地添加到食品中，并对人体的健康有益116。天然生物活性肽的疗效与细胞中的传递和吸收密切相关。但由于细胞中存在多种蛋白酶和肽酶，很多肽无法发挥其治疗效果。此外，它们还能与其他植物化合物发生反应，从而混淆治疗效果，所以用实验方法合成和纯化的生物活性肽更加直接可靠。但由于这些肽最终都要通过胃肠道，所以人们创造了模拟人类胃肠道的新型实验方法117，例如将人类肠道中的细菌加入植物蛋白中，并在添加或不添加益生菌补充剂的情况下，研究生物活性肽的产生118。1.3.2目前发现植物来源多肽的主要生物活性根据农作物蛋白质组数据，目前至少有6000多种蛋白质可能含有生物活性肽。这些肽类的生物活性主要有以下几个方面：1.3.2.1降胆固醇肽这类肽中，有一部分肽的作用是刺激胆汁酸的分泌，还有一些主要作用是改变肝脏的脂质代谢和影响激素、胆固醇受体。它们都能抑制甘油三酯和胆固醇的合成和释放、抑制低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）的生成、提高高密度脂蛋白（HDL）的含量。它们还与胆汁的不同成分相互作用，刺激血液中胆固醇的转化119。此外，FDA提出富含大豆蛋白的饮食可以降低血液中LDL的浓度，即大豆食品可以帮助降低冠状动脉疾病的风险。例如，从大豆蛋白中提取的一些生物活性肽能够抑制甘油三酯的合成，且组成这类肽的氨基酸大多是疏水性的（如亮氨酸、色氨酸和酪氨酸）。1.3.2.2血管紧张素I转化酶抑制肽13 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究目前对肾素-血管紧张素通路的调节主要是通过抑制血管紧张素I转化酶（ACE）来起到降低高血压的作用。ACE是一种二肽羧肽酶，能够将10肽血管紧张素I转变成8肽血管紧张素II，植物活性肽以竞争和非竞争方式对ACE进行抑制120。ACE抑制肽的特点是短且携带疏水残基（包括脯氨酸）和一些带正电荷的残基119，其中C末端芳香族氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）的存在能够促进其抑制作用121。ACE抑制肽有一部分来源于亚麻籽、豌豆和大麻，这类多肽能够成功地通过肠道内屏障而不被降解，还有一部分能够通过降低平滑肌细胞血管中Ca2+的浓度起到保护血管的作用122。Roy等人声称，在豌豆衍生食品中存在的ACE抑制肽比牛奶中的ACE抑制肽对消化作用的抵抗更强。此外，研究发现可可豆的自溶产物及从大豆蛋白衍生出来的产物中也含有ACE抑制肽123。1.3.2.3抗氧化肽研究发现，在植物源性食物中含有大量的抗氧化肽。抗氧化肽的作用主要是通过抑制活性氧引起的损伤来抑制必需脂肪酸的过氧化，其中含有的半胱氨酸、赖氨酸，组氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸都能有效地清除氧自由基119。另外，啤酒中的大麦脂质转移蛋白LTP1中含有半胱氨酸、91个氨基酸残基和一个10kDa肽，整体可作为一种抗氧化剂，通过消除产品中的活性氧来保持啤酒的味道124。还有一些抗氧化肽是在消化或发酵过程中产生的，如Amigo-Benavent等人发现了大豆在胃肠道消化过程释放的抗氧化肽，并对其活性进行了综合全面的研究125。此外，在多种谷物蛋白的酵母产品中也发现了抗氧化肽126。可可豆中也存在抗氧化肽，其中有一些已被用于预防动物模型中的阿尔茨海默病127。还有一系列与植物食品相关的物质（包括橄榄油和咖啡），是由其中含有的肽类、多酚类和类黄酮共同发挥抗氧化作用128。另外，谷硫酮存在于多种植物性食品中，虽然它的肠道吸收效果差，但对肠道中的氧化损伤有一定保护作用129。1.3.2.4免疫调节肽食品来源的免疫调节肽一般不会直接与病原体发生反应，但可通过介入胃肠道的免疫系统从而增强机体的免疫反应130。免疫调节肽可以加快免疫细胞的增殖和成熟，增强自然杀伤细胞（NK细胞）的活性和巨噬细胞的吞噬作用，调节抗体、趋化因子和细胞因子的合成，并激活炎性化合物131。研究发现来源于各种牛奶蛋白的降解产物中的多肽可以激活或抑制免疫反应132，大豆中存在的多肽能够与巨噬细胞和中性粒细胞表面的受体相互作用，从而引发类似于细菌感染产生的免疫系统信号133，目前发现的由大豆衍生的43种多肽中，有10种以上具有免疫调节特性134。此外，小颗粒谷物中也存在类似的有免疫调节作用的小分子肽135。研究还发现从油菜籽中提取出来的水解酶能够抑制重组的HIV蛋白酶活性，从而起到免疫调节作用136。14 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究1.3.2.5阿片肽由于结构与内啡肽和内酮相似，植物中存在的阿片肽也被称为外啡肽，它通过N末端的酪氨酸残基、远离N端的第三和第四个芳香族氨基酸与受体结合137，阿片肽的脯氨酸残基对侧链的延伸方向起着关键作用。此外，阿片肽能够通过与平滑肌的相互作用和增加电解质的吸收对肠道功能产生直接影响138。存在于小麦和大豆食品中的阿片肽类物质具有与内源性配体相结合的活性，它们对生理的影响包括改变行为、降低食欲和减少肠道蠕动等139。由麦胶蛋白衍生而来的GM7肽，跟吗啡有相似的作用，能够抑制半胱氨酸的吸收，破坏谷胱甘肽的甲基化和氧化形式之间的平衡，从而破坏细胞氧化还原状态140。15 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究参考文献[1].D.K.Packham,T.P.Alves,J.P.Dwyer,R.Atkins,D.deZeeuw,M.Cooper,S.Shahinfar,J.B.Lewis,H.J.LambersHeerspink,RelativeincidenceofESRDversuscardiovascularmortalityinproteinurictype2diabetesandnephropathy:resultsfromtheDIAMETRIC(DiabetesMellitusTreatmentforRenalInsufficiencyConsortium)database.AmJKidneyDis.2012;59:75-83.[2].P.Balakumar,M.K.Arora,J.Reddy,M.B.Anand-Srivastava,Pathophysiologyofdiabeticnephropathy:involvementofmultifacetedsignallingmechanism.JCardiovascPharmacol.2009;54:129-138.[3].J.Ahmad,Managementofdiabeticnephropathy:Recentprogressandfutureperspective.DiabetesMetabSyndr.2015;9:343-358.[4].T.Wu,S.Qiao,C.Shi,S.Wang,G.Ji,Metabolomicswindowintodiabeticcomplications.JDiabetesInvestig.2017.[5].H.Y.Lan,DiverserolesofTGF-beta/Smadsinrenalfibrosisandinflammation.IntJBiolSci.2011;7:1056-1067.[6].M.H.Branton,J.B.Kopp,TGF-betaandfibrosis.MicrobesInfect.1999;1:1349-1365.[7].S.Chen,S.W.Hong,M.C.Iglesias-delaCruz,M.Isono,A.Casaretto,F.N.Ziyadeh,Thekeyroleofthetransforminggrowthfactor-betasysteminthepathogenesisofdiabeticnephropathy.RenFail.2001;23:471-481.[8].K.Sharma,T.A.McGowan,TGF-betaindiabetickidneydisease:roleofnovelsignalingpathways.CytokineGrowthFactorRev.2000;11:115-123.[9].M.G.Pezzolesi,E.Satake,K.P.McDonnell,M.Major,A.M.Smiles,A.S.Krolewski,CirculatingTGF-beta1-RegulatedmiRNAsandtheRiskofRapidProgressiontoESRDinType1Diabetes.Diabetes.2015;64:3285-3293.[10].P.V.Kitsiou,A.K.Tzinia,W.G.Stetler-Stevenson,A.F.Michael,W.W.Fan,B.Zhou,E.C.Tsilibary,Glucose-inducedchangesinintegrinsandmatrix-relatedfunctionsinculturedhumanglomerularepithelialcells.AmJPhysiolRenalPhysiol.2003;284:F671-679.[11].S.Putta,L.Lanting,G.Sun,G.Lawson,M.Kato,R.Natarajan,InhibitingmicroRNA-192amelioratesrenalfibrosisindiabeticnephropathy.JAmSocNephrol.2012;23:458-469.[12].Q.Wang,Y.Wang,A.W.Minto,J.Wang,Q.Shi,X.Li,R.J.Quigg,MicroRNA-377isup-regulatedandcanleadtoincreasedfibronectinproductionindiabeticnephropathy.FASEBJ.2008;22:4126-4135.[13].H.M.Kok,L.L.Falke,R.Goldschmeding,T.Q.Nguyen,TargetingCTGF,EGFandPDGFpathwaystopreventprogressionofkidneydisease.NatRevNephrol.2014;10:700-711.[14].B.G.Johnson,S.Ren,G.Karaca,I.G.Gomez,C.Fligny,B.Smith,A.Ergun,G.Locke,B.Gao,S.Hayes,S.MacDonnell,J.S.Duffield,ConnectiveTissueGrowthFactorDomain416 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兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究第二章RAP改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏纤维化2.1引言众所周知，糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，是糖尿病患者致死和致残的主要原因，严重影响糖尿病患者的寿命和生活质量，给家庭和社会造成重大的经济负担。糖尿病肾病早期的主要病理表现为肾脏细胞增殖和肥大、细胞外基质成分增多、血清中肌酐和尿素氮水平升高，并伴随着蛋白尿等症状。如不及时治疗，随着病情的发展就会出现肾小球硬化和肾小管间质纤维化，造成不可逆的损伤，最终发展至终末期肾病1,2。目前存在于临床及基础研究的治疗DN的药物大都具有副作用，并且没有完全阻止DN发展的药物存在，因此，寻找治疗DN肾脏纤维化的药物是国内外研究的热点。目前，存在于食品中的植物来源的生物活性肽由于其潜在的医疗和营养价值被广泛研究，这种肽成本低、可获得性高，并且由于其是天然来源，所以副作用小。最初，Agyei和Danquah等人针对这类多肽在治疗方面存在的问题，进行了相关策略的研究4。此外，Hou等人提出食品加工残留物可以作为蛋白质来源，并从中分离纯化出生物活性肽5。随后出现了大量关于天然生物活性肽提取及活性研究的报道。目前，已经发现的存在于食品中的天然来源活性肽有6000多种6，其中主要包括抗氧化肽、降胆固醇肽、降血压肽、抗菌肽、阿片肽、免疫调节肽和血管紧张素I转化酶抑制肽7-10。但这类多肽是否对糖尿病肾病小鼠肾脏损伤具有保护作用，至今还未见报道。RAP（序列为YWDHNNPQIR）是最近由许菲然等人从油菜籽中提取出来的一种生物活性肽，在人结肠癌细胞（Caco-2）中表现出良好的抗氧化活性11。本研究以RAP为代表，研究食品中的天然来源活性肽对糖尿病肾病的肾脏保护作用。建立糖尿病动物模型的方法包括自发性模型、胰腺切除、链脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶等化学物质诱导和转基因模型等。化学物质诱导糖尿病模型因操作简单易行，在糖尿病机理、治疗和药物开发研究中被广泛应用；其中链脲佐菌素诱导模型因其对肝肾等脏器损害较轻最为常用，它的原理是破坏胰岛β细胞，造成胰岛素分泌不足3。本研究拟以链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠肾病模型，通过皮下注射给药，结合糖尿病肾病相关生化指标、组织病理学变化及相关标志性蛋白的表达或含量变化，探讨RAP对糖尿病肾病小鼠肾脏损伤，特别是对肾脏纤维化发生发展的影响，为生物活性多肽药物的进一步开发利用提供新的数据和理论依据。26 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.2实验材料2.2.1实验动物8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重为20-25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，正式试验开始前小鼠给予普通饲料适应性饲养一周，期间自由饮水与进食，隔日更换垫料。小鼠状态良好，皮毛光亮，活动与进食均正常。动物饲养环境为SPF级，实验室保持安静通风，室温20-25℃，光暗时间各12小时。小鼠普通饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，高脂高糖饲料（HFD）D12492购自广东省医学实验动物中心。2.2.2主要药品与试剂（1）F-moc保护的L-型氨基酸购自成都凯泰新技术有限责任公司，MBHA树脂（取代值为0.5mmol/g）购自天津南开合成科技有限公司，乙腈和三氟乙酸购自百灵威。（2）链脲佐菌素（STZ）、葡萄糖、SDS和TEMED购自美国sigma公司，血糖仪及试纸购自德国罗氏诊断有限公司，尿蛋白、血肌酐、尿素氮、甘油三酯试剂盒及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）均来源于南京建成生物工程研究所，小鼠TGF-1ELISA试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供。（3）Trizol试剂盒、反转录试剂盒、Q-PCR试剂盒及PCR引物均购自日本Takara公司。（4）RIPA蛋白裂解液、5x蛋白上样buffer和BCA蛋白定量试剂盒购买于北京普利莱基因技术有限公司，PMSF、30%Acr/Bic和Tween20购自北京索莱宝科技有限公司，蛋白上样Maker购自美国ThermoForma公司，牛血清白蛋白（BSA）购自上海生物工程股份有限公司。（5）FN、TGF-1和CTGF一抗购自Abcam公司，α-SMA一抗购自美国GeneTex公司，p-p38、p38、p-pERK1/2、ERK1/2和p-p65一抗购自德国CST公司，α-tubulin和GAPDH一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，抗鼠和抗兔荧光二抗购自美国LI-COR生物公司，其他均为国产分析纯。2.2.3实验仪器真空旋转蒸发仪（德国Heidolph公司），反相高效液相色谱仪（Waters600），超纯水仪（重庆阿修罗科技发展有限公司），电热恒温鼓风干燥箱、恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司），台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司），常温离心机（湖南凯达科学仪器有限公司），涡旋振荡器（上海康华生化仪器制造27 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究厂），小鼠代谢笼（原阳县振华教学仪器有限公司），-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司），酶标仪（美国Bio-Rad公司），紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），光学倒置显微镜（Nikon公司），偏光显微镜（德国CarlZeiss公司），高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），电子天平、pH计、微量移液枪（德国sartorius公司），PCR仪（澳大利亚Rotor-Gene公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），荧光成像系统（Odyssey荧光成像系统）。2.3实验方法2.3.1多肽RAP固相合成与纯化（1）树脂活化：称取一定量MBHA树脂置于多肽合成仪中，加入二氯甲烷（DCM）浸泡30min使树脂完全溶胀，然后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）清洗3次后抽干，取出少量用茚三酮试剂茚检，树脂呈无色透明即可进行下一步操作。（2）脱Fmoc保护基：加入体积比为1:4的哌啶/DMF溶液，在惰性气体（氩气）保护下进行脱保护反应，用茚三酮试剂茚检，树脂呈蓝紫色表明Fmoc保护基已脱去，可进行氨基酸连接反应。（3）缩合反应：多肽序列的氨基酸C端至N末端依次进行缩合反应，计算后称取Fmoc保护氨基酸、HOBT和HBTU，用适量DMF溶液溶解后加入启动剂DIEA，然后整体立即加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应45min后用DMF溶液冲洗合成壁上的树脂，继续搅拌15min。然后用茚三酮试剂茚检，树脂呈无色说明氨基酸已成功接上，重复此步骤至整条肽链全部合成。（4）肽链切割与冻干：多肽全部缩合完毕后用DCM和甲醇以2:1:1:2的比例清洗树脂，用真空泵抽干树脂成粉末状，加入切割试剂（Tris:水:三氟乙酸（TFA）=2.5:2.5:95），切割时间为3h，切割完成后萃取、冻干得到粗肽粉末。（5）多肽纯化与分析：得到的粗肽产物用RP-HPLC分离纯化后冷冻干燥得到纯肽，然后用电喷雾电离质谱（ESI-MS）进行表征（结果见附录I）。根据目标肽的理论分子量确定所收集纯肽的正确产物峰，得到目标纯肽后取样配成1mg/mL溶液，离心后用RP-HPLC分析柱检测纯肽保留时间及纯度（保留时间为16.019min，纯度为97.1%，结果见附录II）。28 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.3.2糖尿病肾脏纤维化体内实验设计实验方案及流程如图2-1所示。图2-1糖尿病肾脏纤维化体内实验技术路线图2.3.3STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏纤维化模型构建（1）0.1mol/L枸橼酸缓冲液的配制：称取2.101g枸橼酸溶解于100mL蒸馏水中，然后称取2.941g枸橼酸钠溶于100mL蒸馏水中，将以上两种溶液按比例混合，使其pH值为4.5。（2）首次注射诱导药物之前，先检测小鼠的血糖、体重值。在每个1.5mLEP管中称取9mg链脲佐菌素（STZ），用时加1mL浓度为0.1mol/L枸橼酸缓冲液，配制过程在冰上操作，现配现用，在10分钟内完成腹腔注射，注射剂量为45mg/kg，连续注射5天。对照组注射等体积的枸橼酸缓冲液。每次给药前，小鼠禁食不禁水8h。（3）STZ注射结束后小鼠继续喂养72h，首先将小鼠禁食不禁水6h，后取尾静脉第二滴血检测血糖值，稳定5天后，再以同样的方法检测一次血糖值，血糖值稳定且>11.1mmol/L的小鼠，即视为诱导成功的糖尿病模型小鼠，然后将小鼠随机分成以下几组：①空白对照组；②糖尿病模型对照组；③RAP低剂量组（0.1mg/kg）；④RAP高剂量组（0.5mg/kg），用PBS溶液溶解药物后，皮下注射隔天给药，空白对照组注射相同体积的PBS溶液，实验持续12周。29 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.3.4样本采集与检测（1）实验结束前各组小鼠用代谢笼收集24h尿液（不需要禁食），记录尿量后3000rpm离心10min，去除沉淀后置于-20oC冰箱中待测24h尿蛋白含量。（2）各组动物空腹8h-12h后称重并检测血糖。乙醚麻醉后眼眶静脉丛取血，转入已灭菌的1.5mLEP管中（取血量>500μL），冷冻离心机4℃5000rpm离心30min，分离血清，置于-20oC冰箱保存，待测相关血清指标。（3）固定小鼠，进行肾脏取材，将右侧肾脏置于1.5mLEP管中放入-80oC冰箱中保存（用于提取mRNA和蛋白质）。将左测肾脏用10%福尔马林溶液固定，24h后取出，用手术刀片将肾脏沿正中矢状面纵向剖开，进行石蜡包埋（用于HE染色、Siriusred染色、Masson染色和免疫组化实验，切片厚度为3-4μm）。（4）24h尿蛋白含量用磺基水杨酸法检测，血肌酐用肌氨酸氧化酶法检测，血清甘油三酯含量用GPO-PAP酶法检测，血尿素氮用脲酶法检测。氧化应激相关指标包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）用检测试剂盒检测。以上指标检测所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，检测过程中用分光光度计或酶标仪读取吸光值，血清中TGF-1含量用ELISA方法根据试剂盒说明书进行检测。2.3.5病理切片染色实验将实验结束后所取的小鼠肾脏组织用10%福尔马林溶液固定后，进行石蜡包埋和切片，其中切片厚度为3-4μm。然后将组织切片按常规方法进行HE、Masson、PASM、天狼星红和免疫组化染色。2.3.5.1HE染色（1）石蜡切片常规脱蜡至水。（2）将切片依次放入无水乙醇I、II，95%乙醇I、II和80%乙醇中脱二甲苯各2min。（3）温水清洗2次，每次2min。（4）置于苏木素染液中染色2-5min（根据苏木素配制时间长短调整时间）。（5）用自来水充分清洗2次，每次2min。（6）放入0.5%盐酸酒精中分化2s，立刻浸入水中。（7）用淡氨水返蓝5-10s，清水充分洗涤后浸入酒精中。（8）5%伊红溶液滴染2s。（9）依次浸入95%乙醇I、II各1min，无水乙醇I、II各1min。（11）吹风机吹干后用二甲苯透明2min，再吹干。（12）适当中性树脂封片。30 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究染色结果：镜下观察，蓝色为细胞核，红色为细胞质。2.3.5.2Masson染色（1）将石蜡切片常规脱蜡至水。（2）浸入苏木素和三氯化铁溶液中染色5min-10min。（3）用乙醇和盐酸水溶液分化后充分水洗。（4）淡氨水溶液返蓝后用蒸馏水充分水洗。（5）浸入丽春红和酸性品红溶液中染色5-10min后用乙酸水溶液清洗1min。（6）放入磷钼酸水溶液中清洗1-2min后再用乙酸水溶液洗1min。（7）直接放入苯胺蓝和弱酸中染色1-2min后用乙酸水溶液洗1min。（8）95%乙醇、无水乙醇I、II、III脱水各5-10s。（9）二甲苯I、II、III透明各1-2min。（10）用中性树胶封片。染色结果：细胞核被染成蓝紫色、胞浆呈红色，胶原纤维/胶原蛋白呈蓝色。染色结果分析：400倍视野下随机选取不重叠的10-30个视野，用ImageJ软件计算胶原纤维面积与整个视野面积的百分比，然后进行作图。2.3.5.3天狼星红染色（1）石蜡切片放入60℃烘箱中烘干60min。（2）脱蜡，顺序依次为二甲苯I、II各20min、无水乙醇I、II各15min、95%乙醇10min、90%乙醇各5min、80%乙醇各5min。（3）放入双蒸水中静置5min。（4）暗室中，浸入天狼星红染液中染色60-80min。（5）浸入0.5%冰醋酸溶液中上下涮洗15s。（6）脱水透明，每个缸中3-5s，顺序依次为75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、II、二甲苯I、II。（7）片子未干时用中性树脂封片。染色结果分析：显微镜下观察胶原纤维被染成红色，偏光下4种胶原纤维呈现不同颜色（I型胶原纤维呈黄色或红色，II型胶原纤维呈不同颜色的疏松网状，III型胶原纤维呈绿色，IV型胶原纤维呈淡黄色），400倍视野下随机选取不重叠的10-30个视野，用ImageJ软件计算胶原纤维面积与整个视野面积的百分比，然后进行作图。2.3.5.4PASM染色染色开始前配制六胺银工作液：六胺银原液体积：硼酸钠溶液体积=1：1，现配现用。（1）石蜡切片常规脱蜡至水。31 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（2）将切片放入过碘酸溶液中氧化15min。（3）自来水清洗后再用蒸馏水洗2min。（4）放入铁明矾溶液中染色10min。（5）自来水清洗后用蒸馏水洗2min。（6）放入之前配置好的六胺银工作液中，60℃水浴染色大约25-30min直到切片呈烟草黄色或黑色时停止，用蒸馏水彻底清洗。（7）氯化金溶液调色1-2min后用蒸馏水洗2min。（8）置于海波溶液中1min后用自来水清洗。（9）淡绿溶液复染1-2min后用自来水清洗。（10）将片子依次放入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、II中各2min，二甲苯I、II中各2min，二甲苯透明，后用中性树胶封固。染色结果：肾小球囊基底膜和肾毛细血管基底膜呈黑色，背景呈绿色。2.3.5.5免疫组化实验（1）石蜡切片常规脱蜡至水。（2）修复抗原：高压锅中倒入柠檬酸修复液煮沸10min。（3）滴加3%过氧化氢溶液孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，后用PBS冲洗3次，每次3min。（4）滴加山羊血清，室温下封闭15min后倾去，不洗。（5）滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS溶液清洗3次，每次3min。（6）滴加生物素标记山羊抗兔/小鼠IgG，37℃孵育18min，PBS冲洗3次，每次3min。（7）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃孵育18min，PBS冲洗3次，每次3min。（8）用DAB显色剂显色。（9）自来水充分冲洗。（10）根据需要用苏木素进行复染、脱水和透明。（11）用中性树脂封片。结果分析：光镜下观察，肾组织内黄色颗粒为阳性，在400×光镜下每组随机选取10-30个含肾小球的视野，用ImageProPlus软件计算不同染色因子的光密度值（OD），其中OD=阳性染色积分光密度（IOD）/阳性染色面积（Area）。2.3.6WesternBlot实验2.3.6.1肾脏组织蛋白提取第一步：提取蛋白32 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（1）准备好PIRA裂解液及100mM的PMSF溶液，临用前每1mLPIRA裂解液中加入10LPMSF溶液。（2）将小鼠肾脏组织从冰箱中取出，然后将每组肾脏取部分称重后迅速放入研钵中，加入液氮充分研磨，然后加入裂解液，体积按1mg组织加6L裂解液计算，用移液器转移至EP管中吹打均匀。（3）冰上放置1h后用冷冻离心机（4℃）12000rpm离心30min，取上清液，储存于-20℃备用。第二步：BCA法检测组织蛋白浓度及蛋白变性（1）配制蛋白标准样：按照试剂盒说明书配制不同浓度（0，25，50，100，200，400，800，1600g/L）的BSA标准样品，然后加入到96孔板中。（2）将蛋白原液稀释20倍后与标准品等体积加入96孔板中。（3）将BCA两种工作液按体积比1:50配好后加入到96孔板中，37℃孵育30min，用酶标仪在570nm波长下检测每孔吸光值，计算蛋白浓度及蛋白上样体积。（4）根据计算的上样体积加入蛋白溶液、5×上样buffer，体积不一致的用超纯水补齐，离心混匀后置于变性机中100℃变性10min，备用。2.3.6.2试剂配制（1）1.5mol/L的Tris・Cl（pH为8.8）：称取Tris（分子量121.14）45.43g，溶解到200mL蒸馏水中，磁转子搅拌充分溶解后，用HCL调节pH至8.8，最后用超纯水定容至250mL，高温灭菌后4℃保存。（2）0.5mol/L的Tris・Cl（pH为6.8）：称取Tris15.14g，溶解在200mL双蒸水中，置于磁力搅拌器完全溶解后，双蒸水定容至250mL，4℃保存。（3）10%SDS溶液（分子量288.38）：称取SDS粉末10g，双蒸水溶解后定容至100mL，50度水浴下溶解，室温保存。（4）10%过硫酸铵（AP）（现用现配）：称取过硫酸铵0.1g至EP管中，加入1mLPBS溶液充分溶解后4℃保存。（5）分离胶的配制（10%分离胶，2块胶的用量）双蒸水7.9mL30%Acr/Bic6.7mLTris.HCl8.8(1.5mol/L)5.0mL10%SDS0.2mL10%AP0.2mLTEMED0.008mL33 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（6）浓缩胶的配制（5%浓缩胶，2块胶的用量）双蒸水4.1mL30%Acr/Bic1.0mLTris.HCl6.8(0.5mol/L)0.75mL10%SDS0.06mL10%AP0.06mLTEMED0.006mL（7）10×电泳缓冲液Tris30.3g甘氨酸（分子量75.07）144gSDS10g蒸馏水定容至1L，磁转子搅拌充分溶解后常温保存，用时稀释10倍。（8）10×电转缓冲液Tris58g甘氨酸（分子量75.07）29gSDS3.7g蒸馏水定容至1L，磁转子搅拌充分溶解混匀，保险膜覆盖，配制好后4度保存，用时稀释10倍，并加入20%的甲醛溶液。（9）10×TBST缓冲液Tris24.2gNaCl80.1g蒸馏水定容至1L，磁力搅拌器搅拌充分混匀，用HCl调节pH至7.6后4℃保存，用时稀释10倍，每升加入1mL左右Tween20，即成TBST缓冲液。（10）5%BSA封闭液：称取BSA粉末5g，用TBST缓冲液定容至100mL，充分混匀后4℃保存。2.3.6.3实验步骤（1）配胶：首先根据配方配制分离胶，凝固40min后配制浓缩胶，然后静置1h。（2）电泳：垂直轻轻拿出梳子，上样前用60V电压预电泳10min，上样后将电压调成80V，电泳蓝色条带过浓缩胶后将电压换成120V，随时观察电泳速度，直至电泳结束。（3）转膜：准备12张新滤纸，停止电泳后取出玻璃板，轻轻撬起小玻璃板，切下浓缩胶、弃去，根据Marker条带分子量用切胶板切取需要的分离胶，并按照分离胶的大小剪取硝酸纤维素膜（PVDF），打标后放入甲醇溶液中活化5min，34 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究再在电转液中浸泡几分钟，在方盘中放入转膜用的夹板、两块海绵垫和滤纸浸泡。夹板黑色面向下，向上依次为3层滤纸、胶、膜、3层滤纸、海绵垫，赶走气泡后合起夹子，整个操作均在电转液中进行，将夹子放入电转槽中，夹子的黑面对准电泳槽的黑面，夹子的白面对准电泳槽的红面，电泳槽两侧放入冰袋，整个电转槽置于冰盆中，300mA恒流转膜90min。（4）免疫反应：取出PVDF膜，迅速浸入TBST缓冲液中置于摇床上摇动，清洗3次，每次10min。然后用5%BSA溶液封闭2h，置于摇床上摇动。用一抗稀释液或5%BSA溶液稀释一抗后将膜铺于一抗中，4℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗3次，每次10min。然后将PVDF膜置于TBST稀释的荧光二抗（1:10000）中，常温下避光孵育1h后取出PVDF膜，用TBST缓冲液避光洗3次，每次10min。（5）显影：用奥德赛红外成像系统进行扫描、显影。（6）WesternBlot条带分析：以α-tubulin或GAPDH为内参，用Odyssey荧光成像系统软件对条带的光密度进行统计分析。2.3.7RT-PCR实验2.3.7.1肾脏组织总RNA提取（1）准备工作：将要使用的枪头及EP管灭菌，研钵泡酸洗干净后用锡箔纸包起来灭菌，准备剪刀和镊子并灭菌。（2）将肾脏组织从冰箱中取出，每组称取30mg左右迅速放入研钵中，加入液氮充分研磨，每组加入1mLRNAisoPlus，后转移至1.5mLEP管中，用移液器反复吹打至裂解液中无明显沉淀。（3）室温（15-30℃）静置5min，开始从核蛋白中提取分离RNA，向以上EP管中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧管盖后充分混匀乳化至溶液呈乳白色，室温静置5min。（4）冷冻离心机（4℃）12000g离心15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为3层：最上层为无色液体（含有RNA），中间层为乳白色（大部分为DNA），最下层为有机相。（5）吸取上层液体转移至新的无菌离心管中，向每个管中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后室温下静置10min。（6）冷冻离心机（4℃）12000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀。（7）小心弃去上清液，加入与RNAisoPlus等体积的75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，4℃7500g离心5min后小心弃去上清液，RNA沉淀干燥10min后加入适量的RNase-free水或DEPC水溶解沉淀。35 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（8）检测RNA浓度，计算反转录体系中要加入的RNA体积。2.3.7.2RNA反转录成cDNA（1）去除基因组DNA反应：将5×gDNAEraserBuffer、gDNAEraser、RNA和RNAseFreedH2O混匀后总体积为10L，42℃反应2min（或室温下静置15min）。（2）反转录反应：将步骤1反应液、PrimescriptRTEnzymeMixI、RTPrimerMix、5XPrimescriptBuffer2和RNAseFreedH2O混匀后总体积为20L，37℃15min，85℃5s，4℃放置，后转入-20℃冰箱中保存备用。2.3.7.3PCR（1）RNA体系：将cDNA、引物、RNAseFreedH20和SYBR混匀后总体积为20L，引物序列见表2-1。（2）按两步法PCR扩增程序进行扩增：预变性（95℃30s），PCR反应（95℃5s，60℃31s）。（3）用2-ΔΔct法对实验结果进行相对定量分析，以GAPDH为内参。表2-1RT-PCR实验引物序列GenesForwardprimer(5'-3')Reverseprimer(5'-3')MouseFNGATTGGCGACAAGTGGAGTAGGTGAACGGGAGGACATGF-β1ATGGTGGACCGCAACAACCCAAGGTAACGCCAGGAACTGFGGGCCTCTTCTGCGATTTCATCCAGGCAAGTGCATTGGTAα-SMAACTGGGACGACATGGAAAAGCATCTCCAGAGTCCAGCACAGAPDHAGGAGTAAGAAACCCTGGACCTGGGATGGAATTGTGAGRatFNCAGGGGAAGAAAAGGAGCCCCACGAAGTGTGGTTCCCCTCTGF-β1TGACATGAACCGACCCTTCCCCAGGCTCCAAATGTAGGGGCTGFTAGCAAGAGCTGGGTGTGTGTTCACTTGCCACAAGCTGTCα-SMAACTGGGACGACATGGAAAAGCATCTCCAGAGTCCAGCACAGAPDHGTTACCAGGGCTGCCTTCTCACCAGCTTCCCATTCTCAGC2.3.8数据统计分析所有实验至少重复进行三次，数据分析以平均值±SD表示，两组之间的统计学差异用t检验计算，多组之间的统计学差异用单因素方差分析（GraphPadPrism5.0,USA），P<0.05代表具有统计学差异。36 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.4实验结果2.4.1RAP对糖尿病小鼠体重及血糖的影响糖尿病模型构建成功并分组后开始给药，给药过程中每周检测血糖和体重，由于给药方式为隔天给药，因此我们选择在给药当天检测血糖和体重。上午给药结束后检测体重，禁食6h后检测血糖，如图2-2A所示，连续检测血糖4周，发现糖尿病模型与对照组相比，血糖浓度显著增加，并一直处于高水平状态，但RAP给药组跟糖尿病模型组相比无论是高剂量还是低剂量，血糖浓度均无降低现象，这说明多肽药物RAP无降糖作用。因此，在之后的给药过程中，我们不再检测血糖和体重。给药12周后，检测空腹血糖和体重，如表2-2所示，与糖尿病模型组相比，RAP给药组在高低剂量对小鼠血糖仍然无影响。根据体重实验结果，我们发现，与对照组相比，糖尿病组的体重明显减轻，这是由于高血糖引起组织蛋白的分解代谢，导致糖尿病小鼠的体重损失与肌肉损失，这与SutariyaB等人之前的研究结果一致12，而用RAP治疗后体重出现上升现象，结果如图2-2B。图2-2RAP对糖尿病小鼠血糖及体重的影响。（A）血糖值；（B）体重。表2-2RAP对糖尿病小鼠给药前后体重及血糖的影响Fastingbloodglucose(mmol/l)Bodyweights(g)GroupsBeforetreatmentAftertreatmentBeforetreatmentAftertreatmentControl7.93±0.627.45±0.7622.91±2.1928.473±1.27DM21.25±3.18###19.68±2.97###22.07±1.8124.844±1.98#DM+RAP-L20.21±4.1820.11±2.1523.02±2.1227.39±1.95*DM+RAP-H22.51±5.1218.71±2.4921.78±1.2926.24±1.61*注：模型组与对照组相比，#p<0.05，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.0537 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.4.2RAP对糖尿病小鼠血清TGF-1、肾功及氧化应激指标的影响图2-3A为24h尿蛋白含量检测图，根据实验结果，糖尿病模型组的尿蛋白含量达到正常对照组的10倍左右，而RAP给药组与糖尿病组相比，尿蛋白含量显著降低。图2-3B-D为肾功能指标血肌酐、血尿素氮和甘油三脂的实验结果，同样，这三项指标在糖尿病小鼠中显著增加，但经过RAP干预后，又显著降低。图2-3E为血清中TGF-1含量，ELISA实验结果显示，TGF-1含量在糖尿病小鼠血清中显著增加，而RAP给药组显著降低这一指标。图2-3RAP对糖尿病小鼠血清TGF-β1、生化指标及氧化应激指标的影响。（A）24h尿蛋白；（B）血肌酐；（C）血尿素氮；（D）甘油三脂；（E）血清TGF-β1；（F）过氧化氢酶；（G）丙二醛；（H）超氧化物歧化酶。注：模型组与对照组相比，##p<0.01，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.00138 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究此外，我们还检测了氧化应激相关指标包括SOD、CAT和MDA，如图2-3F-H所示，在四组实验中，除CAT的数据无统计学意义之外，糖尿病小鼠与正常对照组相比，SOD显著降低而MDA显著增加，RAP治疗组能够显著改善这种氧化损伤现象。2.4.3RAP对肾脏常规病理变化的影响HE染色结果如图2-4，与正常对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠细胞外基质显著增多，系膜细胞扩张增生，肾小囊出现粘连肾小球体积增大、充血，同时伴随毛细血管腔变形塌陷、毛细血管袢肥大和瘤样扩张，肾小管上皮细胞出现空泡变性。RAP药物低剂量组跟糖尿病组相比，病理变化有所改善，仅出现少量系膜细胞增生，肾小管上皮细胞逐渐恢复正常，肾小球体积减小。在高剂量时改善效果更加明显，肾小球体积大小基本恢复正常，系膜基质增生不明显，其他细胞外基质沉积显著减少，肾小球周围几乎恢复正常状态。由PASM染色结果可以看出，糖尿病组肾小球基底膜呈弥漫性增厚，系膜基质重度增生，甚至出现结节状硬化现象，结节增大导致挤压毛细血管腔。然而经过RAP干预后，增厚的基底膜明显变薄，毛细血管腔恢复正常，系膜基质减少。图2-4小鼠肾脏HE和PASM染色结果2.4.4RAP对糖尿病小鼠肾脏胶原蛋白沉积的影响为了检测RAP对糖尿病小鼠肾脏中胶原纤维沉积的影响，我们用天狼星红和Masson染色两种方法对肾脏中的胶原纤维进行了染色，如图2-5A所示，Masson染色的结果是胶原纤维呈蓝色，大都分布在肾小球周围及基质中，肾小球中也含有少量纤维。天狼星红染色的结果显示胶原纤维呈红色，在偏光显微镜下可以观察到不同类型的4种胶原，不同胶原纤维在偏振光显微镜下的形态学表现分别为：Ⅰ型胶原纤维呈黄色、橙色和红色的粗纤维，紧密排列，并且显示强39 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究的双折光性；Ⅱ型胶原纤维呈现各种不同的颜色，具有弱的双折光性，呈疏松网状；Ⅲ型胶原纤维是绿色的细纤维，呈疏松网状，具有弱的双折光性；Ⅳ型胶原纤维为浅黄色，在基底膜上显示弱的双折光。根据实验结果，糖尿病模型组的胶原纤维总量较正常组显著增加，而RAP给药组胶原纤维含量则显著降低，统计结果如图2-5B,C所示。图2-5小鼠天狼星红和Masson染色及统计结果。（A）Masson及天狼星红染色；（B）Masson胶原面积统计；（C）天狼星红胶原面积统计。注：模型组与对照组相比，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0012.4.5RAP对糖尿病小鼠肾脏中TGF-1及CTGF表达的影响如图2-6，免疫组化实验结果显示，糖尿病模型肾脏中CTGF和TGF-1阳性染色面积显著增加，且大都表达于肾小球周围，肾小球中也有少量表达，与糖尿病对照组相比，用RAP干预后CTGF和TGF-1在肾脏中的表达量显著降低，40 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究并且呈现剂量依赖性。此外，在mRNA水平，我们用RT-PCR实验方法检测了纤维化因子CTGF和TGF-1的表达情况，结果显示在糖尿病模型组这两种因子的mRNA表达显著增加，而用RAP治疗后这种过量表达现象明显改善。图2-6小鼠肾脏中CTGF及TGF-β1表达。（A）免疫组化实验结果；（B，C）免疫组化阳性染色面积统计；（D，E）RT-PCR实验结果。注：模型组与对照组相比，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0012.4.6RAP对糖尿病小鼠肾脏中FN及α-SMA表达的影响如图2-7，免疫组化实验结果显示，糖尿病模型肾脏中FN和α-SMA阳性染色面积明显增加，其中肾小球周围毛细血管腔及边缘染色较深，与DN模型组相比，RAP干预后的小鼠肾脏中FN和α-SMA在肾脏中的表达量显著降低，并且呈现剂量依赖性。41 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究图2-7RAP抑制FN及α-SMA在肾脏中过量表达。（A）免疫组化实验结果；（B，C）免疫组化阳性染色面积统计；（D）Westernblot实验结果；（E，F）RT-PCR实验结果。注：模型组与对照组相比，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.05，**p<0.0142 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究此外，如图2-7D-F所示，我们分别用WesternBlot和RT-PCR实验方法检测了FN和α-SMA在蛋白水平和mRNA水平的表达，结果显示DN模型组肾脏中这两种因子在蛋白水平和mRNA水平的表达都明显增强，而RAP能够显著下调DN小鼠肾脏中这两种因子的过量表达。2.4.7RAP对糖尿病小鼠肾脏中MAPK及NF-κB信号通路的影响接下来，我们研究了RAP减轻肾脏纤维化的分子机制。已有研究表明，在STZ诱导的DN大鼠肾脏中，MAPKs磷酸化水平明显上调13，大量研究也表明MAPK信号通路在糖尿病肾病中扮演重要角色14-16。ERK和p38是MAPK通路的两个主要成员。因此，我们通过检测ERK1/2和p38的磷酸化与非磷酸化水平来评估RAP对MAPK信号通路的影响。如图2-8，免疫组化实验结果显示，与正常小鼠相比，STZ诱导的DN小鼠肾脏中，p-ERK1/2和p-p38的阳性染色区域面积显著增加，而RAP在0.1mg/kg和0.5mg/kg剂量下能够抑制肾脏组织中p-ERK1/2和p-p38的表达，且差异具有统计学意义。此外，我们用WesternBlot方法验证该实验结果，WesternBlot实验结果与免疫组化实验结果一致。。NF-κB在不同的组织中均有表达，在糖尿病肾病中，它是调节炎症与纤维化的重要因子17，其主要成员是p65。如图2-8，我们检测了不同肾脏组织中p65的磷酸化水平，免疫组化和WesternBlot实验结果都显示，与正常组小鼠相比，STZ诱导的糖尿病模型组小鼠肾脏中p-p65的表达显著上升，而用RAP治疗12周后，小鼠肾脏中p65的磷酸化水平又被显著抑制。43 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究图2-8RAP抑制糖尿病小鼠肾脏中MAPK及NF-κB信号通路。（A）免疫组化实验结果；（B，C，D）免疫组化阳性染色面积统计；（E）Westernblot实验结果；（F，G，H）Westernblot实验统计结果。注：模型组与对照组相比，###p<0.001，给药组与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.00144 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究2.5讨论实验结果显示，RAP通过减少胞外基质（ECM）沉积、抑制胶原纤维生成、降低尿蛋白来改善DN。此外，RAP还能够改善DN小鼠氧化应激指标，并抑制体内MAPK和NF-κB信号通路。无论在短期还是长期的糖尿病患者，通都常会出现“三多一少”现象，即体重会减少，这是由于高血糖会引起组织蛋白代谢过度。在我们的实验中，STZ诱导的糖尿病模型组与正常对照组相比，体重明显降低，但是经过RAP治疗后，体重出现上升现象，这说明RAP能够改善糖尿病中的体重损失现象。然而，RAP对糖尿病小鼠无降血糖作用。此外，与肾脏功能相关的指标包括血肌酐、甘油三脂和血尿素氮在DN小鼠中显著升高，而RAP能够显著改善这些肾脏功能指标。蛋白尿是目前临床上预测肾损伤的关键指标18，严重的蛋白尿通常反映肾小球病变所引起的进行性肾小球硬化。之前有研究表明，STZ和高脂高糖共同诱导C57小鼠8周后，尿蛋白含量达到正常小鼠的4倍左右19，我们的诱导时间是12周，由结果可知，在12周时，尿蛋白含量已经达到正常对照组的10倍左右，这说明随着诱导时间增加，肾脏损伤越严重，导致尿蛋白含量显著上升。重要的是，RAP治疗组跟糖尿病组相比，尿蛋白含量显著降低。氧化损伤在DN形成中扮演着决定性的角色，慢性高血糖会激活肾小球上皮细胞产生ROS20，众所周知，SOD是一种超级氧化物的主要清除剂，它同时催化H2O2转化为H2O和O221，因此，如果SOD的活性增加，氧化应激就会减弱，有研究证明在STZ诱导的糖尿病小鼠体内，胞质Cu2+/Zn2+的过度表达能够减轻糖尿病模型的肾脏损伤22。过氧化氢酶（CAT）是一种酶清除剂，它的主要功能是催化H2O2分解为H2O和O2，从而清除体内的H2O2，使细胞免遭H2O2毒害，是生物防御体系的关键酶之一。丙二醛（MDA）是纸质过氧化作用的终产物，它的产生能够加剧生物膜的损伤，因此可通过检测MDA的含量了解细胞膜脂过氧化的程度以及药物的抗氧化特性。在我们的实验中发现，STZ诱导后的小鼠体内SOD含量降低、MDA含量增加，而RAP治疗后，这种氧化损伤现象显著改善。细胞外基质（ECM）沉积是糖尿病肾病的主要病理特点23,24，ECM不仅是细胞组成的骨架，而且在细胞增殖、表型转化、肾间质纤维化和肾小球硬化中起着重要作用。FN是其主要成分，它是肌纤维母细胞分化的关键因素，而肌纤维母细胞分化后的主要特征是α-SMA过量表达。我们的实验结果显示，STZ诱导的DN小鼠肾脏中FN和α-SMA无论在蛋白水平还是分子水平，其表达量均显著高于正常组，而多肽RAP在剂量为0.1mg/kg和0.5mg/kg时均能够抑制α-SMA和FN的过量表达。TGF-1是ECM积累的主要诱导因子，而CTGF是TGF-145 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究下游细胞因子，TGF-1在不同组织中能够诱导CTGF的表达。GuhaM等人的研究证明，在UUO模型、1型和2型糖尿病中CTGF对肾脏损伤均起着至关重要的作用25。另外有研究证明CTGF可以诱导近端管状上皮细胞的EMT转化，且这种效果与TGF-1的存在无关，此外这两种生长因子可以协同导致EMT转化26和smad2磷酸化27。这些研究结果表明，CTGF有可能在一定程度上通过与TGF-1结合来传递信号。有趣的是，我们的实验结果表明，多肽RAP能够显著抑制糖尿病小鼠肾脏中TGF-1和CTGF的表达。所有这些数据表明，RAP通过抑制TGF-1及其下游因子CTGF的表达来抑制ECM积累。接下来，我们研究了RAP抗肾脏纤维化分子机制。我们选择了两条肾脏纤维化的重要信号通路MAPK和NF-κB。MAPKs主要包括ERK1/2和p38，是一个由丝氨酸/苏氨酸激酶组成的家族。大量研究表明，在糖尿病和肾纤维化小鼠肾脏中，MAPK信号通路活化28。MAPK信号通路抑制剂目前也被应用于抑制肾脏纤维化中ECM的沉积，例如当p38MAPK被特定的阻滞剂SB203580阻断时，α-SMA的表达会显著降低29。NF-κB是一种具有多种调节功能的核转录因子，它调节各种炎症细胞因子、趋化因子和纤维化因子的合成，还参与细胞增殖和ECM沉积，在DN中扮演着重要的角色30。此外，MAPK和NF-κB之间还存在很多直接和间接的联系，例如活化的ERK和p38MAPK信号通路能够活化NF-κB31,32。目前大多数用于减轻DN纤维化进展的基础和临床药物，如噻唑二酮类、血管紧张素系统抑制剂和吡咯嗪（PDTC），都是通过抑制NF-κB通路来实现的33-35。我们的研究结果显示，在糖尿病肾脏中，p38、ERK1/2和p65的磷酸化作用显著增强。然而，这些变化均能够被RAP抑制。这表明，RAP可能是通过抑制MAPK和NF-κB信号通路来抑制DN肾脏纤维化的。46 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究参考文献[1].P.Balakumar,M.K.Arora,J.Reddy,M.B.Anand-Srivastava,Pathophysiologyofdiabeticnephropathy:involvementofmultifacetedsignallingmechanism.JCardiovascPharmacol.2009;54:129-138.[2].D.Choudhury,M.Tuncel,M.Levi,Diabeticnephropathy--amultifacetedtargetofnewtherapies.DiscovMed.2010;10:406-415.[3].R.Gunnarsson,C.Berne,C.Hellerstrom,CytotoxiceffectsofstreptozotocinandN-nitrosomethylureaonthepancreaticBcellswithspecialregardtotheroleofnicotinamide-adeninedinucleotide.BiochemJ.1974;140:487-494.[4].D.Agyei,BioactiveProteinsandPeptidesfromSoybeans.RecentPatFoodNutrAgric.2015;7:100-107.[5].H.Hou,Y.Fan,B.Li,C.Xue,G.Yu,Z.Zhang,X.Zhao,PurificationandidentificationofimmunomodulatingpeptidesfromenzymatichydrolysatesofAlaskapollockframe.FoodChem.2012;134:821-828.[6].N.Marmiroli,E.Maestri,Plantpeptidesindefenseandsignaling.Peptides.2014;56:30-44.[7].C.-F.Chi,F.-Y.Hu,B.Wang,T.Li,G.-F.Ding,Antioxidantandanticancerpeptidesfromtheproteinhydrolysateofbloodclam(Tegillarcagranosa)muscle.JournalofFunctionalFoods.2015;15:301-313.[8].X.Fang,N.Xie,X.Chen,H.Yu,J.Chen,Optimizationofantioxidanthydrolysateproductionfromflyingsquidmuscleproteinusingresponsesurfacemethodology.FoodandBioproductsProcessing.2012;90:676-682.[9].S.McClean,L.B.Beggs,R.W.Welch,Antimicrobialactivityofantihypertensivefood-derivedpeptidesandselectedalanineanalogues.FoodChem.2014;146:443-447.[10].N.Xie,B.Wang,L.Jiang,C.Liu,B.Li,HydrophobicityexertsdifferenteffectsonbioavailabilityandstabilityofantioxidantpeptidefractionsfromcaseinduringsimulatedgastrointestinaldigestionandCaco-2cellabsorption.FoodResInt.2015;76:518-526.[11].F.Xu,L.Wang,X.Ju,J.Zhang,S.Yin,J.Shi,R.He,Q.Yuan,TransepithelialTransportofYWDHNNPQIRandItsMetabolicFatewithCytoprotectionagainstOxidativeStressinHumanIntestinalCaco-2Cells.JAgricFoodChem.2017;65:2056-2065.[12].B.Sutariya,M.Saraf,Betanin,isolatedfromfruitsofOpuntiaelatiorMillattenuatesrenalfibrosisindiabeticratsthroughregulatingoxidativestressandTGF-betapathway.JEthnopharmacol.2017;198:432-443.[13].Z.Jiao,J.Chen,Y.Liu,T.Liu,K.Chen,G.Li,RoleofERK1/2andJNKphosphorylationiniodinecontrastagent-inducedapoptosisindiabeticratkidneys.RenFail.2015;37:1349-1355.[14].X.Cheng,W.Gao,Y.Dang,X.Liu,Y.Li,X.Peng,X.Ye,BothERK/MAPKandTGF-Beta/Smadsignalingpathwaysplayaroleinthekidneyfibrosisofdiabeticmice47 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兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究[29].B.Y.Chin,A.Mohsenin,S.X.Li,A.M.Choi,M.E.Choi,Stimulationofpro-alpha(1)(I)collagenbyTGF-beta(1)inmesangialcells:roleofthep38MAPKpathway.AmJPhysiolRenalPhysiol.2001;280:F495-504.[30].S.Tamada,T.Asai,N.Kuwabara,T.Iwai,J.Uchida,K.Teramoto,N.Kaneda,T.Yukimura,T.Komiya,T.Nakatani,K.Miura,Molecularmechanismsandtherapeuticstrategiesofchronicrenalinjury:theroleofnuclearfactorkappaBactivationinthedevelopmentofrenalfibrosis.JPharmacolSci.2006;100:17-21.[31].J.H.Je,J.Y.Lee,K.J.Jung,B.Sung,E.K.Go,B.P.Yu,H.Y.Chung,NF-kappaBactivationmechanismof4-hydroxyhexenalviaNIK/IKKandp38MAPKpathway.FEBSLett.2004;566:183-189.[32].B.Jiang,S.Xu,X.Hou,D.R.Pimentel,P.Brecher,R.A.Cohen,TemporalcontrolofNF-kappaBactivationbyERKdifferentiallyregulatesinterleukin-1beta-inducedgeneexpression.JBiolChem.2004;279:1323-1329.[33].F.T.Lee,Z.Cao,D.M.Long,S.Panagiotopoulos,G.Jerums,M.E.Cooper,J.M.Forbes,InteractionsbetweenangiotensinIIandNF-kappaB-dependentpathwaysinmodulatingmacrophageinfiltrationinexperimentaldiabeticnephropathy.JAmSocNephrol.2004;15:2139-2151.[34].S.Ohga,K.Shikata,K.Yozai,S.Okada,D.Ogawa,H.Usui,J.Wada,Y.Shikata,H.Makino,Thiazolidinedioneamelioratesrenalinjuryinexperimentaldiabeticratsthroughanti-inflammatoryeffectsmediatedbyinhibitionofNF-kappaBactivation.AmJPhysiolRenalPhysiol.2007;292:F1141-1150.[35].K.Tashiro,S.Tamada,N.Kuwabara,T.Komiya,K.Takekida,T.Asai,H.Iwao,K.Sugimura,Y.Matsumura,M.Takaoka,T.Nakatani,K.Miura,Attenuationofrenalfibrosisbyproteasomeinhibitioninratobstructivenephropathy:possibleroleofnuclearfactorkappaB.IntJMolMed.2003;12:587-592.49 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究第三章RAP改善高糖诱导的肾小球系膜细胞（GMC）纤维化3.1引言GMC是肾脏中主要固有细胞之一，也是肾小球内最具活力的细胞，占肾小球细胞总数的30%-40%。高葡萄糖环境会导致无法控制的细胞增殖和肥大，GMC细胞过度增殖会导致细胞外基质积累和肾小球硬化1。此外，GMC细胞增殖已被证实与血糖控制程度密切相关，这表明高血糖是DN中的一个关键危险因素2。GMC在正常情况下主要行使收缩、吞噬和合成细胞外基质以及产生一些生长因子和细胞因子的功能。例如吞噬进入肾小球的大分子物质，如脂类和免疫复合物等，还受细胞因子、细胞外基质（ECM）和内皮细胞等的调节3。在病理条件下，GMC能够产生FN和COL4等细胞外基质，还能够大量生成TGF-1、CTGF、IL1、IL6和ETI等细胞因子，这些细胞因子又可以刺激GMC增殖及细胞产生胞外基质，从而形成恶性循环，最终导致肾间质纤维化和肾小球硬化。因此，系膜细胞在肾纤维化和肾损伤过程中的作用及其相关机制的研究一直都是国内外对该器官研究的热点。TGF-1在肾小球硬化及肾间质纤维化中都是诱导胞外基质沉积的主要细胞因子，它刺激GMC细胞分泌和合成FN和COL4等，还可以改变机制降解酶系统的活性，导致ECM降解减少4。α-SMA是肌成纤维细胞纤维化的标志，在正常GMC细胞中表达量极少或无表达，但在高糖环境下，α-SMA表达量显著增加，此时α-SMA可以作为一种感应器来响应GMC在焦粘连接处接收到的信号5。如果药物能够抑制α-SMA的表达，表明其对糖尿病肾病具有潜在的抗纤维化效果。整体动物模型中的结果提示我们，RAP可能通过影响改善肾功能指标、影响肾脏纤维化因子来改善肾脏环境，降低其工作负荷，从而发挥抗肾脏纤维化的作用。然而，在体内环境中涉及到多种神经和体液之间相互作用，它们之间的关系错综复杂，难以寻找进一步研究的重点。因此，我们试图从整体动物水平过渡到细胞水平，在尽可能排除整体各种干扰因素的前提下，单纯模拟糖尿病的体内环境，并研究多肽RAP在细胞水平上的作用。因此在本章中，我们根据文献报道，采用高糖条件培养肾小球系膜细胞（GMC），模拟糖尿病的体内环境，研究了RAP对纤维化相关指标及相关信号通路的作用。50 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究3.2实验材料3.2.1细胞细胞：大鼠肾小球系膜细胞（Ratglomerularmesangialcells,GMC），品系为HBZY-1，由北京北纳创联生物技术研究院提供。3.2.2主要药品与试剂L-DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司，二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司，MTT、HEPES购自美国Sigma公司，其余试剂同第二章。3.2.3主要仪器二氧化碳细胞培养箱（ThermoFisher公司），超净工作台（日本AIRTECH公司），细胞培养瓶、培养板（美国Corning公司），其余仪器同第二章。3.3实验方法3.3.1细胞培养与溶液配制3.3.1.1细胞培养将GMC细胞培养于含有5%二氧化碳的37℃恒温培养箱中，培养液为低糖DMEM+10%FBS，待细胞长满培养瓶后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代，然后根据实验需要接种于培养板或冻存。3.3.1.2溶液配制（1）多肽RAP：用PBS将RAP溶解后配制成10mM母液，然后根据实验需要对其进行稀释。（2）低糖培养基（L-DMEM，5.5mM葡糖糖）：将gibco低糖培养基粉末一袋（10g）全部倒入1L烧杯中用少量蒸馏水将袋内少量残留培养基清洗后液体并入容器，加水温为20-30℃的蒸馏水800mL，轻微搅拌溶解，加入2.0g碳酸氢钠和3.08gHEPES，轻微搅拌溶解，用盐酸和氢氧化钠调节pH至7.1-7.4，蒸馏水定容至1L，用0.2μm滤膜正压过滤除菌，4℃避光保存。（3）高糖培养基（H-DMEM，22mM葡糖糖）：除了加入2.972gD-葡萄糖之外，其余配制方法同低糖培养基。（4）MTT：称取100mgMTT粉末至棕色瓶中，加入20mLPBS溶液使其浓度为5mg/mL，过滤除菌后4℃避光保存。51 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（5）双抗：青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。配好后-20℃保存，用时以1/100的体积加入到DMEM培养液中。3.3.2MTT法检测RAP对高糖诱导GMC细胞增殖作用及细胞毒性待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，然后用血球计数板计数，用L-DMEM+10%FBS培养液将GMC细胞均匀接种于96孔板中，细胞浓度为104个/孔，待细胞汇合至70%左右时，将培养液换成无血清L-DMEM培养液平衡24h使细胞处于同一时期（G0期），然后将培养液换成：（1）含有5.5mM葡萄糖的DMEM（normalglucose,NG）；（2）含有22mM葡萄糖的DMEM（highglucose,HG）；（3）HG加不同浓度的多肽RAP。培养箱孵育48h后，每孔加入10%培养液体积的MTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h后，将培养液全部移去，每孔加入150μLDMSO溶液，放入振荡器震荡15min后，用酶标仪在570nm波长下测定培养板各孔吸光值，然后计算细胞存活率，从而判定细胞增殖程度及药物对细胞增殖的抑制作用。计算公式为：细胞存活率=吸光值（HG或RAP组）/吸光值(NG组)×100%，其中将NG组细胞存活率设定为100%。为了判定RAP对高糖诱导GMC的抑制作用是不是依赖于其毒性作用，因此，我们用MTT实验同时检测了RAP在该浓度下的细胞毒性作用，不同的是，该实验过程中不用高糖培养基，全过程使用低糖培养基，其余方法同上。3.3.3ELISA实验将GMC细胞均匀接种于24孔板中，细胞浓度为3×104个/孔，培养液为L-DMEM+10%FBS，待细胞汇合至70%左右时，将培养液换成无血清L-DMEM培养液平衡24h使细胞处于同一时期（G0期），然后将培养液换成：（1）含有5.5mM葡萄糖的DMEM（normalglucose,NG）；（2）含有22mM葡萄糖的DMEM（highglucose,HG）；（3）HG加不同浓度的多肽RAP。孵育48h后，收集细胞培养液上清，用ELISA实验方法检测其中FN和COL4的表达含量。实验步骤如下：（1）将配制好的标准工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度加2孔，每孔100μL，待测样品以相同体积加入到其他孔中，待测样品需要先稀释不同梯度进行浓度摸索，确定最佳稀释倍数后统一稀释（加样时间应控制在10min以内），酶标板覆盖薄膜，37℃孵育90min。（2）弃去孔中液体后甩干，不用洗涤，然后每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀后覆盖薄膜，37℃孵育60min。52 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（3）用力甩尽孔内液体后每孔加入洗涤液350μL浸泡2min，然后吸出并甩干孔内液体，该步骤重复三次。（4）每孔加入酶结合物工作液100μL后覆盖薄膜，37℃下孵育30min，然后甩干孔内液体，再按步骤3方法洗涤5次。（5）将底物溶液加入酶标孔中（每孔90μL），覆盖薄膜后避光孵育15min左右（根据实际显色情况调整时间，酶标孔中标准曲线出现明显梯度时终止）。（6）最后，每孔加入终止液50μL以终止反应，立即在450nm波长下用酶标仪检测各孔吸光值。统计结果后计算。3.3.4WesternBlot实验用WesternBlot实验方法检测细胞中不同因子在蛋白水平的表达，具体实验操作同第二章。3.3.5RT-PCR实验用RT-PCR实验方法检测细胞中不同因子在mRNA水平的表达，具体实验操作同第二章。3.3.6数据统计与分析所有实验至少重复进行三次，数据分析以平均值±SD表示，两组之间的统计学差异用t检验计算，多组之间的统计学差异用单因素方差分析（GraphPadPrism5.0,USA），P<0.05代表具有统计学差异。3.4实验结果3.4.1RAP在无毒性前提下抑制高糖诱导系膜细胞过度增殖由图3-1A可知，与正常对照组相比，高糖培养下，系膜细胞显著增殖，然而，RAP给药组从50μM开始即可显著抑制高糖诱导的GMC细胞过度增殖现象，并且我们选定的5个浓度均对系膜细胞无毒性，结果见图3-1B。说明RAP对高糖诱导GMC细胞增殖的抑制作用与其毒性无关。因此，在之后的细胞实验中，我们选定50μM和100μM为细胞作用浓度。53 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究图3-1高糖诱导GMC细胞增殖及毒性实验结果。（A）细胞增殖实验结果；（B）细胞毒性实验结果。注：高糖组与对照组相比，#p<0.05，药物干预组与高糖组相比，*p<0.05，**p<0.013.4.2RAP抑制高糖诱导下GMC细胞胞外基质沉积根据ELISA实验结果，与正常对照组相比，在高糖环境下，胞外基质COL4和FN在细胞培养液中的表达量显著增加，RAP干预后则显著下降，这说明RAP在50μM和100μM时，均能显著抑制细胞外基质的过度沉积，结果见图3-2。图3-2高糖诱导GMC细胞培养液中COL4和FN的表达。（A）细胞培养上清中COL4含量；（B）细胞培养上清中FN含量。注：高糖组与对照组相比，###p<0.001，药物干预组与高糖组相比，**p<0.01，***p<0.0013.4.3RAP抑制高糖诱导GMC细胞中TGF-1和CTGF水平我们用WesternBlot实验对TGF-1和CTGF在GMC细胞中的表达量进行了测定。结果显示，与正常组相比，高糖环境能够显著刺激TGF-1和CTGF的表达，而将高糖培养基和RAP共同孵育时，这两种细胞因子的表达量被显著抑制，说明在这两个浓度下，RAP能够抑制致纤维化因子TGF-1和CTGF的表达，并且呈浓度依赖性。此外，为了进一步确认实验结果的正确性，我们用RT-54 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究PCR实验检测了这两种因子在mRNA水平的表达。实验结果显示，RAP同样能够抑制TGF-1和CTGF的表达，其中抑制TGF-1作用最为明显，当RAP浓度为50μM时，TGF-1的表达量就已经达到正常水平以下。结果见图3-3。图3-3高糖诱导GMC细胞中TGF-β1和CTGF的表达。（A）Westernblot实验结果；（B，C）Westernblot实验结果统计；（D，E）RT-PCR实验结果。注：高糖组与对照组相比，##p<0.01，###p<0.001，药物干预组与高糖组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0013.4.4RAP抑制高糖诱导GMC细胞中FN和α-SMA水平根据WB实验及统计结果，在正常对照组中，FN和α-SMA由一定量的基础表达，在高糖诱导下，GMC细胞较正常对照组相比，FN及α-SMA的蛋白表达量显著性增高，给予RAP药物干预后，两者表达量均显著性降低，其中RAP浓度为100μM时，FN的表达几乎被全部抑制，α-SMA的表达对RAP有浓度依55 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究赖作用，且在100μM时，其表达量与正常组相当。同时，我们还检测了系膜细胞中FN及α-SMA在mRNA水平的表达，与正常对照组相比，高糖组FN及α-SMA在mRNA水平的表达量显著增加，不同浓度的RAP药物能够抑制这种过量表达现象，差别具有统计学意义，且随着浓度增加，抑制效果更加明显。结果如图3-4所示。图3-4RAP对高糖诱导GMC细胞中FN和α-SMA表达的影响。（A）Westernblot实验结果；（B，C）Westernblot实验结果统计；（D，E）RT-PCR实验结果。注：高糖组与对照组相比，##p<0.01，###p<0.001，药物干预组与高糖组相比，*p<0.05，***p<0.00156 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究3.4.5RAP抑制高糖诱导GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路图3-5RAP对高糖诱导GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路的影响。（A）Westernblot实验结果；（B，C，D）Westernblot实验结果统计。注：高糖组与对照组相比，##p<0.01，###p<0.001，药物干预组与高糖组相比，*p<0.05，**p<0.0157 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究大量研究表明，MAPK和NF-κB信号通路在系膜细胞中起着重要作用6-11，因此，我们用WesternBlot实验方法检测了p38、ERK和p65的磷酸化水平，在预实验中，我们选择的磷酸化时间分别是30min、1h和3h，通过实验结果发现，在这三个时间段中，高糖刺激1h时磷酸化效果最好，因此，我们在之后都选择这个时间进行实验。实验结果显示，跟正常组相比，高糖诱导后p38、ERK1/2和p65的磷酸化作用被激活，但其总量不变，多肽RAP在50μM和100μM时均能显著抑制其磷酸化程度，其中，RAP对p-ERK1/2的抑制作用呈现浓度依赖性，而这两个浓度对p-p38和p-p65的抑制作用相当，未出现浓度依赖现象。结果见图3-5，这说明RAP对高糖诱导下GMC细胞纤维化的抑制可能与抑制MAPK和NF-κB这两条信号通路密切相关。3.5讨论鉴于GMC在糖尿病肾病中的重要作用，我们用高糖（22mM）模拟糖尿病体内环境，试图观察GMC细胞在该条件下的病理变化，并且以此为基础，研究采用干预后药物的作用。在本实验中，我们观察到高糖条件可以显著促进GMC细胞过度增殖，导致COL4和FN的表达显著上升，出现典型的纤维化的病理改变。而给予RAP干预后，RAP能够显著抑制GMC细胞增殖，并且能够抑制胞外基质FN和COL4的过度累积。此外，高糖诱导后GMC细胞中致纤维化因子TGF-1和CTGF含量显著增加，而RAP在浓度为50和100μM时能够抑制这两种细胞因子的产生，GMC细胞增殖又与α-SMA的激活密切相关，在该实验中，我们也发现α-SMA在高糖诱导下激活并过量生成，但RAP干预后α-SMA的表达量被显著抑制。此外，我们进一步探讨了RAP在GMC细胞中的作用机制，结果发现RAP能够抑制GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路，表明这两条信号通路对RAP在GMC中的作用至关重要。NF-κB存在于肾脏的各种细胞中，p65是其家族的主要成员，被活化后转移到细胞核中并与靶向基因启动子上特定DNA序列结合12。TGF-1是糖尿病中主要的致纤维化因子，并且在高糖环境下会导致糖尿病动物体内TGF-1基因和蛋白质水平的过度表达，从而促进肾脏纤维化13。有研究报道NF-κB与TGF-1启动子中-715到-717之间的一段序列（AGGGGACTT）相结合，从而引起TGF-1基因转录14。此外，越来越多的证据表明NF-κB与GMC细胞增殖密切相关，例如，有报道称RSVK可以通过NF-κB信号通路抑制高糖诱导的系膜细胞过度增殖15。我们的实验结果表明，在高糖诱导下，GMC细胞中TGF-1及其下游因子CTGF的表达量在分子和蛋白水平均显著增加，并且胞外基质FN也出现过量58 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究表达现象，p65磷酸化作用在高糖诱导下被活化，这些变化都能够被多肽RAP抑制，说明NF-κB在GMC细胞中起着至关重要的作用，并且RAP可能是通过抑制该通路来发挥其抗纤维化作用的。有丝分裂的蛋白激酶（MAPK）家族目前研究确定的主要有三种，包括细胞外信号-调控激酶（ERK）、c-JunNH2-末端激酶（JNK）和p38MAP激酶。这些激酶可以被不同的细胞外刺激物如生长因子和环境压力激活，然后在细胞肾脏和其他功能信号转导级联中发挥重要作用16。虽然目前GMC增殖的确切机制还未被阐明，但是研究发现ERK1/2MAPK对高葡萄糖刺激GMC的反应很灵敏17。在高糖环境下，ERK1/2在糖尿病大鼠的肾小球系膜细胞中被激活，而且在很多细胞中，ERK1/2通过依靠PKC机制激活18。此外，p38在炎性肾病、缺血性或肾毒性损伤和糖尿病肾病中被激活19，从而导致肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积20。p38抑制剂SB-239063能够预防和改善GMC细胞增殖、细胞外基质积累21。另外据报道，氨基胍、麦可酚酸和肾上腺素可以通过抑制p38来发挥其肾脏保护作用22-24。与这两种激酶不同的是，有研究发现JNK在糖尿病大鼠的肾小球和在高葡萄糖诱导下并未激活25。因此，我们选择对GMC细胞中ERK1/2和p38两种激酶进行研究。我们的研究结果显示，在GMC细胞中，高浓度的葡萄糖刺激p38MAP激酶和ERK1/2MAP激酶的磷酸化水平。然而，通过RAP治疗后p-ERK和p-p38的活性显著降低。说明RAP可以通过抑制p-ERK和p-p38的活化来改善GMC的增殖。在这部分实验中，我们的研究发现RAP能够抑制GMC细胞中致纤维化因子TGF-1和CTGF以及细胞外基质FN和COL4的过量表达，同时还能够抑制肌成纤维细胞纤维化的标志物α-SMA的表达。此外，研究结果显示RAP还能够抑制高糖诱导的GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路，这提示我们，RAP可能是一种存在于植物中潜在的抗肾脏纤维化药物，这为以后植物来源的多肽药物在抗肾脏纤维化方面的研究提供一定的依据。59 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究参考文献[1].H.Jia,X.Qi,S.Fang,Y.Jin,X.Han,Y.Wang,A.Wang,H.Zhou,Carnosineinhibitshighglucose-inducedmesangialcellproliferationthroughmediatingcellcycleprogression.RegulPept.2009;154:69-76.[2].A.D.Hodgkinson,T.Bartlett,P.J.Oates,B.A.Millward,A.G.Demaine,Theresponseofantioxidantgenestohyperglycemiaisabnormalinpatientswithtype1diabetesanddiabeticnephropathy.Diabetes.2003;52:846-851.[3].F.N.Ziyadeh,TheExtracellularMatrixinDiabeticNephropathy.AmericanJournalofKidneyDiseases.1993;22:736-744.[4].M.H.Branton,J.B.Kopp,TGF-betaandfibrosis.MicrobesInfect.1999;1:1349-1365.[5].F.H.Qi,P.P.Cai,X.Liu,G.M.Si,Adenovirus-mediatedP311amelioratesrenalfibrosisthroughinhibitionofepithelial-mesenchymaltransitionviaTGF-beta1-Smad-ILKpathwayinunilateralureteralobstructionrats.IntJMolMed.2018;41:3015-3023.[6].C.Guijarro,J.Egido,Transcriptionfactor-kappaB(NF-kappaB)andrenaldisease.KidneyInt.2001;59:415-424.[7].J.H.Je,J.Y.Lee,K.J.Jung,B.Sung,E.K.Go,B.P.Yu,H.Y.Chung,NF-kappaBactivationmechanismof4-hydroxyhexenalviaNIK/IKKandp38MAPKpathway.FEBSLett.2004;566:183-189.[8].Z.M.Lv,Q.Wang,Q.Wan,J.G.Lin,M.S.Hu,Y.X.Liu,R.Wang,Theroleofthep38MAPKsignalingpathwayinhighglucose-inducedepithelial-mesenchymaltransitionofculturedhumanrenaltubularepithelialcells.PLoSOne.2011;6:e22806.[9].J.Wu,C.Mei,H.Vlassara,G.E.Striker,F.Zheng,Oxidativestress-inducedJNKactivationcontributestoproinflammatoryphenotypeofagingdiabeticmesangialcells.AmJPhysiolRenalPhysiol.2009;297:F1622-1631.[10].C.Yang,K.Patel,P.Harding,A.Sorokin,W.F.Glass,2nd,RegulationofTGF-beta1/MAPK-mediatedPAI-1geneexpressionbytheactincytoskeletoninhumanmesangialcells.ExpCellRes.2007;313:1240-1250.[11].B.Yi,X.Hu,H.Zhang,J.Huang,J.Liu,J.Hu,W.Li,L.Huang,NuclearNF-kappaBp65inperipheralbloodmononuclearcellscorrelateswithurinaryMCP-1,RANTESandtheseverityoftype2diabeticnephropathy.PLoSOne.2014;9:e99633.[12].X.Xie,J.Peng,K.Huang,J.Huang,X.Shen,P.Liu,H.Huang,Polydatinamelioratesexperimentaldiabetes-inducedfibronectinthroughinhibitingtheactivationofNF-kappaBsignalingpathwayinratglomerularmesangialcells.MolCellEndocrinol.2012;362:183-193.[13].A.Wang,F.N.Ziyadeh,E.Y.Lee,P.E.Pyagay,S.H.Sung,S.A.Sheardown,N.J.Laping,S.Chen,InterferencewithTGF-betasignalingbySmad3-knockoutinmicelimitsdiabeticglomerulosclerosiswithoutaffectingalbuminuria.AmJPhysiolRenalPhysiol.2007;293:F1657-1665.[14].Y.Lan,Q.Zhou,Z.L.Wu,NF-kappaBinvolvedintranscriptionenhancementofTGF-60 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兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究第四章总结与展望4.1主要结论本研究将食品植物来源的生物活性肽应用于治疗DN肾脏纤维化，并研究了油菜籽来源的抗氧化肽RAP的抗肾脏纤维化作用，得到以下结论：（1）STZ诱导的C57BL/6小鼠具有典型的糖尿病肾病症状：血糖明显升高，血肌酐、尿素氮和尿蛋白等肾功能指标水平升高，体内出现氧化损伤现象。通过病理切片染色及免疫组织化学观察，进一步证实了DN小鼠的肾脏纤维化病变。（2）肾小球系膜细胞用高糖（22mM）培养基诱导，模拟体内糖尿病环境，并采用ELISA，WesternBlot和RT-PCR等方法研究了高糖诱导后细胞外基质及细胞中相关因子的表达现象。结果发现细胞中纤维化指标FN和α-SMA以及致纤维化因子TGF-1和CTGF的表达均显著升高。证明经过高糖诱导后的系膜细胞也发生纤维化病变。（3）在整体动物水平和细胞水平，用多肽RAP药物干预后，纤维化病变均出现显著改善现象，DN小鼠在RAP治疗后不仅通过改善肾脏功能指标起到保护肾脏的作用，还可以通过抑制胞外基质和胶原纤维沉积，起到缓解肾脏纤维化的作用。在细胞中，RAP可以抑制高糖诱导的系膜细胞过度增殖以及细胞中FN、α-SMA、TGF-1和CTGF的表达。（4）通过进一步研究，RAP还可以通过抑制糖尿病小鼠肾脏和系膜细胞中ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平，从而抑制MAPK和NF-κB信号通路。4.2研究展望本研究中，我们在动物和细胞水平初步证实了RAP对STZ诱导的糖尿病肾病模型和高糖诱导的肾小球系膜细胞的改善作用，取得了较好的结果，未来对于RAP为代表的植物来源生物活性肽在肾脏纤维化方面的研究还可以从以下方面进一步展开：（1）肾脏纤维化其他模型治疗：由于在该研究中，多肽RAP能够显著抑制糖尿病小鼠的肾脏纤维化进程，但无降糖作用。因此，可以将RAP应用于单侧输尿管梗阻（UUO）和腺嘌呤诱导等肾间质纤维化模型，进一步观察RAP是否对肾间质纤维化具有更好的治疗效果。62 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究（2）成药性研究：在该研究中，虽然RAP具有抗糖尿病肾脏纤维化的活性，但RAP是否能够发展成为先导化合物还需要进一步的研究。因此，可以通过研究RAP的药代动力学、生物化学性质、物理化学性质和毒副作用等，并优化其结构，使其从苗头化合物转换成先导化合物。（3）发现更多类似药物：由于将食物中植物来源的生物活性肽应用于治疗肾脏纤维化还未见报道，我们选择一条来源于油菜籽的具有抗氧化作用的多肽进行抗肾脏纤维化研究且取得良好的实验结果。因此，寻找和研究更多具有抗肾脏纤维化作用的植物来源生物活性肽，选择具有更好药效的多肽化合物，并优化改造获得治疗肾脏纤维化的候选药物，将为肾脏纤维化的治疗提供新策略。63 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究在学期间的科研成果一．发表论文ZhangM,YanZ,BuL,AnC,WangD,LiuX,ZhangJ,YangW,DengBC,XieJ*,ZhangB*.Rapeseedprotein-derivedantioxidantpeptideRAPalleviatesrenalfbrosisthroughMAPK/NF-κBsignalingpathwaysindiabeticnephropathy.DrugDesign,DevelopmentandTherapy.2018;12:1255-1268.64 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究致谢研究生生活转眼就要接近尾声了，回首这三年的时光，我不仅学会了很多知识，而且成熟了许多。我感谢这三年来老师们对我知识的传授、同学们对我友爱的表达，我感谢这段时间所有的经历对我的磨练，使我能自信而坚强地面对以后的工作和生活。首先，我要感谢我的导师王锐教授，给我们提供了一个非常好的科研平台，同时王老师严谨的治学态度和实事求是、精益求精的精神给了我很深刻的印象，让我在整个实验过程中，始终严格要求自己，认真细致。在此，对王老师致以最诚挚的谢意！其次，特别感谢张邦治老师和谢俊秋老师，他们在实验过程中给予了我悉心的指导。从论文资料的收集整理、研究课题的设计、计划实施、到最后结果的整理分析、论文的修改，都给了我极大的帮助。也很感谢张伟老师和宋竟婧老师在实验中给予我的指导和帮助。谢谢老师们不遗余力地给与我知识，以身作则地告诫我人生要奋斗、要努力，我永远都不会忘记各位老师的良苦用心，不会辜负老师们的谆谆教诲。感谢马盼盼师姐、张豹师兄、王娟丽师姐、闫志斌、刘欣、李晶、卜莉莉、安春妹、王丹、邓铂川，因为有你们，我的研究生生活才变得丰富多彩，也因为有你们的帮助，我才能顺利完成毕业论文的相关工作，真的很怀念我们一起学习的日子。感谢我的家人在背后对我的默默支持和帮助，是你们的爱让我奋勇直前、永不退缩。最后感谢我的舍友谢秀月、夏雪宁、蒋晖在生活中给予我的支持和帮助。在论文完成之际，谨向尊敬的老师、热心帮助我的师兄师姐、师弟师妹以及参加论文评阅和答辩的老师们致以最真诚的谢意！65 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究附录附录多肽RAPESI-MS及HPLC分析谱图I.多肽RAPESI-MS谱图II.多肽RAPHPLC分析谱图66 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究I.多肽RAPESI-MS谱图67 兰州大学硕士学位论文油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究II.多肽RAPHPLC分析谱图68
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