南极多环芳烃低温降解菌的筛选及其降解特性研究

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南极多环芳绘低温降解菌的筛选及其降解特性研究摘要从南极嗜冷菌中筛选出1株降解多环芳姪的菌株NJ49,采用16SrRNA分子鉴定方法鉴定其属于希瓦氏菌属(Shewanella)o其降解特性研究表明：它可以在以蔡为唯一碳源和能源的无机盐培养基中生长，在5°C低温坏境中降解多环芳桂，这可为我国低温养殖海域多环芳桂的清除提供新的途径。关键词南极低温菌；多环芳怪；筛选；降解特性多环芳怪(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)是环境中持久存在的污染物，是重要致癌污染物Z-o这种自毒的化学物质遍布于海洋环境，有的被生物体吸收，有的附着在生物体上，有的存在于水体中，因而构成了海洋中的一类特殊的污染物。这类物质可为某些海洋生物所富积或贮存，并经食物链进入人体。我国养殖海域的PAHs污染比较严重，这不仅影响到该海域的生物多样性，也影响到养殖业的发展和水产品的食用安全［1］。研究表明微生物降解是环境中多环芳姪去除最主耍的途径［2］。目前，对于我国养殖海域PAHs的微生物降解研究口益增多，但主要集中在常温微生物降解PAHs的研究，对低温微生物降解PAHs研究较少。我国黄海和渤海海域的冬春季水温较低，常温微生物很难清除低温海域的PAHs,因此研究低温微生物对PAHs的降解具有重要意义。木文从南极海洋低温菌中筛选得到1株能降解荼的低温菌NJ49,并对其低温降解特性进行了初步研究，以期为我国低温养殖海域PAHs的清除提供新的技术途径。1材料与方法1・1菌株南极细菌菌种是从2002〜2003年南极第19次科学考察所采南极海水、海冰和海泥屮分离纯化得到的，现存放于国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室。1.2培养基分离纯化培养基为2216E固体：蛋口月东5g；酵母粉lg；用过滤陈海水定容至1000mL,pH值7.0〜7.5,12TC下湿热灭菌20min。筛选培养基为人工海水培养基(MMC)［3］,灭菌后补加适量微量元素混合 液；并补以蔡作为唯一碳源，蔡及微量元素经0.2pm滤膜过滤除菌。1.3生长曲线测定将待测菌株在2216E培养基中，5°C>120rpm低温摇床振荡培养7d。移取5.0mL活化的菌液，用无菌MMC在6OOOrpm卜•离心5min,洗涤2次，取菌体接入装有100mL以蔡为唯一碳源的MMC液体培养基屮，于5°C>120rpm下振荡培养，每隔24h取样1次，以未接菌的MMC液体培养基做空口，用分光光度计测540nm的吸光值（OD540）。以培养时间为横坐标、OD540为纵坐标绘制生长曲线。1.4荼降解能力的测定移取5.0mL活化的菌液，加入到1OOmL蔡初始浓度为200mg/L的MMC液体培养基中，在5°C.120rpm上摇床振荡培养10d,每24h取样1次。取出的培养液中加入等体积环己烷，剧烈振荡lOmin后，萃取蔡，用适量环己烷稀释待测萃取液，在275nm处以环己烷为参比测定其吸光度，根据蔡■环己烷标准曲线计算茶的质量浓度。1.5菌种鉴定按照CTAB方法捉取细菌总DNA[3],采用细菌16SrDNA的通用引物PCR扩增16SrDNA,构建16SrDNA文库，完成16SrDNA序列测定与系统进化关系的分析。2结果与分析2」南极荼降解低温菌的筛选将385株南极嗜冷菌在以蔡为唯一碳源的MMC液体培养基屮培养，从屮筛选到1株生长旺盛的芳香坯降解菌，编号为NJ49。南极低温菌NJ49能以蔡为唯一碳源进行生长，且生长态势良好。2.2南极低温菌NJ49在蔡培养基中的生长曲线南极低温菌NJ49在蔡培养基中的生长曲线如图1。南极低温菌NJ49在蔡培养基中培养lid后达到指数生长期，并逐渐进入稳定期，此时南极低温菌NJ49细胞数量达到最高峰，生长与死广处于一个动态平衡中。第12天后，由于培养基中的营养基本被消耗，生长速率小于死亡速率，细菌数量开始减少，进入衰亡期。2.3南极低温菌NJ49对荼的降解活性 南极低温菌NJ49对茶的降解率如图2。随着吋间的推移，南极低温菌NJ49对蔡的降解率不断增人。降解前期，降解率缓慢增人，第7天的降解率为17%；在第8犬降解率明显提高，为44%；第13天达到最高，为66%。2.4南极蔡降解菌NJ49的分子鉴定对南极蔡降解菌NJ49的16SrRNA基因序列的相似性进行比较，菌株NJ49序列同Shewanellafrigidimarina,Shewanellalivingstonis序列相似性为98.9%。系统发育分析采用Mega2软件的邻接法进行，并通过自举分析进行置信度检测，自举数据集为1000次，构建的系统发育树如图3。由系统进化树可知，菌株NJ49和Shewanellafrigidimarina及Shewanellalivingstonis聚在一起，属于变形菌门(Proteobacteria),丫■变形菌纲(Gammaproteobacteria),交单胞菌目(Alteromonadales),希瓦氏菌科(Shewan-ellaceae),希瓦氏菌屈(Shewanella)o一般认为，16SrRNA基因序列同源性低于97%,可以认为屈于不同种；同源性低于95%,可以认为属于不同属。由此可知,菌株NJ49是Shewanella属，种待定。3结论与讨论南极海洋系统内常年低温，通常在・1.8〜2.0°C,在这样一个低温的自然环境里，海洋微牛物必然具备了适应低温的牛理牛化和分子机制，因此南极微生物是极佳的低温微生物来源。木文筛选出南极芳香坯低温降解菌NJ49属于希瓦氏菌属(Shewanella),口J以在以蔡为唯一碳源和能源的无机盐培养基中生长，并能在低温环境中高效的降解多环芳姪，为我国低温养殖海域中PAHs的生物降解提供了新的技术途径。4参考文献[1]林建清，王新红，洪华生•养殖水体中多环芳坯污染对水产品安全的影响[J].食品科学,2006,27(12)：41-45.[2]GIBSONDT,MAHADEVANV,JERINADM,etal.Oxidationofthecarcinogensbenzo[a]pyreneanddibenz[a]anthracenetodihydmdiolsbyahacteritum[J].Science,1975(189)：295-297・[3]WILSONK.PreparationofgenomicDNAfrombacteria[J].Currentpro-tocolsinmolecularbiology,2001(11)：210-212.