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1、蛋白免疫印迹杂交（WesternBlotfWB）蛋白提取与样本制备（-）操作步骤1•提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化;2•根据样本数配制混合溶液:PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1:100,现用现配）；3裂解组织：每个样品称取50rng,加1ml混合液,在冰上用组织剪剪减为碎屑,电动匀浆后4弋静置2h使其充分裂解，离心12000g,4°C15min,取上清;4•蛋白定量：1）取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2）标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍
2、比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul+生理盐水80ul）;稀释液8Oul标准品80ul标准品8Oul稀释液8Oul稀释液8Oul稀释液80ul稀释液80ul8BC2.5ul/ul1.25ul/ulA5ul/ul^nuE^nHUUD0.625ul/ul0.3125ul/ulF（空曰）3）配制显色剂BCA混合液:a液:b液=50:1。配制量=200肿（孔数+6）;4）加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5）贴上封口胶,37弋震荡混匀30min;6）562nm波长处测吸
3、光度OD;7）根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。5•样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）;7.100°C变性5mino8•分装并存于・20°C,避免反复冻融。二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS(g)10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。（二）1.5MTris/HCI（pH8.8）试剂剂量Trisbase(g)18.17双蒸水（m
4、l）80用浓盐酸调至pH8.8,最后定容至100mlo室温下保存。（三）0.5MTris/HCI（pH6・8）试剂剂量Trisbase(g)6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8,最后定容至100mlo室温下保存。试剂剂量（四）丙/双丙（i口罩称取）丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g）2去离子水（ml）230加热溶解后,定容至250ml,4。（：棕色瓶避光保存。使用时注意恢复至室温且无沉淀（五）10X电泳涤缓冲液试剂剂量Trisbase(g)15甘氨酸（g）72SDS(g)5去离子水（ml
5、）500用HCI调pH至8.3。已经配制了500ml的储存液。室温保存。（A）10X的TBS溶液配制试剂剂量Trisbase(g)24.2NaCI(g)80去离子水（ml）1000用HCI调整PH为7.6，己经配制了1000ml的10X的TBS液。室温保存。（七）洗涤液的配制（TBST）试剂剂量10XTBS(ml)50TWeen-20(ul)500去离子水(ml)450TWeen-20的体积为TBST的0.1%o室温保存。三.制胶(-)制作分离胶1.注意要点：(1)下表中的数据为配制一板胶的用量；⑵W%过硫酸钱
6、溶液现用现配；⑶根据所测蛋白分子量大小选择配制合适浓度的凝胶；(4)胶的凝固速度与10%过硫酸钱和IEMED的使用量呈正相关,冬天可适当加量或提高室温；⑸加胶(水)时，从左上角沿着边缘缓慢匀速加入,避免混入气泡(或胶面不平整)；(6)加入的胶中混有小气泡时可轻弹玻璃板使之浮出；2.操作方法：(1)配制10%过硫酸披溶液500ul:选用1.5ml的EP管，在微量天平上去皮,称取过硫酸鞍粉末50mg,加入去离子水500ul,在振荡器上混匀至过硫酸钱完全溶解。取酒精棉球擦拭干净玻璃板正反两⑶固定玻璃板到底座上：先对齐
7、下缘和左右缘,再夹左右的夹子(4)测试是否泄漏：向玻璃夹缝中加入约3ml的去离子水，静置1分钟,检查玻璃板下缘与胶条相交处是否有漏出的水。无泄漏则连底座一起拿起向一侧倾斜倒掉玻璃夹缝中的水，并伸入干净的滤纸条吸干残留的水。有泄漏则需重新固定玻璃板。⑸按照下表中的剂量和顺序依次添加并混合均匀各种试剂。适用蛋白分子量〈20kDa20-60kDa60-100kDa〉100kDa15%12%10%7.5%水（ml）1.442.042.462.941.5MTris(pH8.8)(ml)1.5丙/双丙（ml）3.02.41
8、.981.510%SDS(ul)60W%过硫酸披（ul）30TEMED(ul)9（6）加入配制好的胶，量为略高于两侧夹子上缘为宜（1mm玻璃板加4.3mlX⑺在分离胶上方加满水封闭（1mm玻璃板加1.6mlX（7）待可观察到明显的水胶分界线时，倒掉水并用干净的滤纸条吸干残留的水珠。（二）制作浓缩胶1.注意要点：⑴插入梳子时，注意正反面，上缘光滑的一面对着大玻璃插入⑵待EP管内剩余的浓缩
