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1、实验一、质粒DNA的提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA的提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子，是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。在基因克隆的实验屮，耍把一个有用的外源基因通过重组DNA技术，送进牛物细胞屮去繁殖和表达。实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体，细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。作为基因工程的载体需具备下列条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞小能大量增殖，只有高复
2、制率才能使外源基因在受体细胞屮大量扩增;3）载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；⑷载体具有选择的遗传标记，如抗氨节青霉素基因（Amp；抗新霉素基因（7eo"）等，以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞屮分离筛选出来.细菌质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，与染色体复制相关联，每个细胞只含有一个或几个质粒分了，如ColEI质粒（含有产牛大肠杆菌毒素EI基因）,pBR322就是ColEI衍牛的质粒。后者在整个细胞周期屮随时可以复制，具多拷
3、贝，一般在120个以上。木实验分离纯化的质粒为PQE30,为高拷贝质粒。通过本实验学习了解质粒DNA的特点，掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞屮分离、捉取质粒DNA.实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的牛长;②细菌的收获和裂解;③质粒DNA的纯化。本实验以碱件SDS快速法小量制备pQE30质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓冇成效。该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下,破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒
4、DNA链Ft］于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂屮和），质粒DNA链迅速得到准确呢置,重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后町得到质粒DNA.如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化絶一溟化乙锭梯度平衡法。环状双链的质粒DMA分子具有三种不同的构型：当其两条多核甘酸链均保持着完整的环形结构时，称Z为共价闭合环状DNA(CCCDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型;如果两条多核昔酸链屮只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个
5、缺口时，称之为开环DNA(OCDNA),此即0C构型;若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割Z后，发生双链断裂而形成线性分子(LDNA),通称L构型。质粒DNAMr-般在10°〜10’之间，常以kb表示(lkb双链DNA二6・6X105),$
6、1质粒pUC19的壯为1.8X106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA,尽管M相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNAo二仪器、材料与试剂(一)仪器1.恒温培养箱2.恒温摇床3.台式离心机4.高压灭菌锅(二)材料1.葡萄糖2.三為屮基
7、氨基屮烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5•十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.RNA酶6.氨节青霉素7.蔗糖13•渙酚蓝14•酚15.8—疑基嗤琳16.0—疏基乙醇17•盐酸(HC1)1&含PUC19质粒的大肠杆菌19•吸头、小指管(一)试剂1.溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三径甲基氨基甲烷(Tris)Tris-IICL(pI18.0)10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH&0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾冰乙酸水6
8、0mL11.5mL2&5mL4.TE缓冲液10mmol/LTris-HCI1mmol/LEDTA(pH8.0)570%乙醇(放-20°C冰箱中，用后即放回)6.、膜RNA酶将R7A酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mniol/LNaCL中，配成10mg/mL的浓度，于100°C加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20°C。7.终止液:40%蔗糖、0.25%漠酚兰6.酚。三实验步骤1.将2mL含相应抗生索的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pQE30质粒的人肠杆菌，37°C振荡培养过夜。2.取1.5mL培养物倒入微量离心管
9、中10000r/min离心2min.3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能T燥。4.将
