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1、目录实验一、质粒DNA的提取实验二、细菌基因组的提取实验三DNA的限制性内切酶解及电泳实验四、PCR基因扩增及电泳实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验一、质粒DNA的提取质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。在基因克隆的实验中,要把一个有用的外源基因通过重组DNA技术,送进生物细胞中去繁殖和表达。实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体,细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。作为基因工程的载体需具备下列条件:（1）是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细
2、胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3)载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来.细菌质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,与染色体复制相关联,每个细胞只含有一个或几个质粒分子,如ColEI质粒(含有产生大肠杆菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍
3、生的质粒。后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。本实验分离纯化的质粒为pQE30,为高拷贝质粒。通过本实验学习了解质粒DNA的特点,掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA.一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长;②细菌的收获和裂解;③质粒DNA的纯化。本实验以碱性SDS快速法小量制备pQE30质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁(小量制备可省略不用溶菌酶),去污剂SDS可使细胞壁裂解,并使蛋白质变性
4、,在碱性条件下,破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和),质粒DNA链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中,乙醇沉淀后可得到质粒DNA.如需进一步纯化,可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环状DNA(CCCDNA),这样的DNA通常
5、呈现超螺旋SC构型;如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(OCDNA),此即OC构型;若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂而形成线性分子(LDNA),通称L构型。质粒DNAMr一般在106～107之间,常以kb表示(lkb双链DNA=6.6×105),如质粒pUC19的Mr为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA,尽管M相同,仍具有不同的电泳迁移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNA。二仪器
6、、材料与试剂(一)仪器1.恒温培养箱2.恒温摇床3.台式离心机4.高压灭菌锅(二)材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS)6.乙酸钾7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.RNA酶11.氨苄青霉素12.蔗糖13.溴酚蓝14.酚15.8一羟基喹琳16.β一巯基乙醇17.盐酸(HCl)18.含pUC19质粒的大肠杆菌19.吸头、小指管(三)试剂1.溶液I50mmol/L葡萄糖5mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸
7、(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL4.TE缓冲液l0mmol/LTris-HCI1mmol/LEDTA(pH8.0)570%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.、膜RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴酚兰8.酚。三实验步骤1.
8、将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入上述的含pQE30质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。2.取1.5mL培养物倒入微量离心管中10000r/min离心2min.3.吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。4
