资源描述：
《《基因工程研究法》实验指导书》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、《基因工程研究法》实验指导书课程要求：（1）本课程为研究法课程，一切实验由各组自行完成，老师仅提供实验过程中所需药品等。（2）请各位自行分组（每组3-5人），并在以下3个实验中选取1次进行，实验过程中请做好实验记录。（3）课程结束后每组完成一篇研究论文，格式按《农大学报（自然科学版）》发表论文格式，并附上所有实验记录。如有其它回题请联系：艾育芳13314931020基因工程菌中Taq聚合酶的提取及活性鉴定一、目的学习基因工程工程酶的提取和鉴定，加深对基因工程理论知识和操作技能的巩固。二、原理聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermusaquatic
2、us）内，故命名为聚合酶（Taqpolymerase）,也称为TaqDNA聚合酶，简称Taq酶或Taq。Taq聚合酶常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。从嗜热水生菌Thermusaquaticus中分离的TaqDNA聚合酶，分子量为94kDa,由832个氨基酸残基组成，热稳定性好，在75~8（TC条件下每个酶分子每秒钟可聚合约150个核昔酸，是目前聚合酶链式反应（PCR）中最为常用的聚合酶。TaqDNA聚合酶具有很高的热稳定性，作用温度范围在20°C〜85°C,在92.5°C下其活性半衰期为130min,所以75°C高温处理对该酶的活力影响都不大。普通E.coli菌
3、体蛋白不具有忍受低温和高温处理的能力，在溶菌酶、PMSF（强大的蛋白酶抑制剂）、EDTA（变性剂和稳定剂）、吐温・20（非离子表面活性剂）、NP-40（非离子表面活性剂）、DTT（还原剂）作用下细菌胞膜就会破裂而释放菌体蛋白，续以75°C孵育后，除了TaqDNA聚合酶，其他蛋白在75°C水浴条件下会变性而与DNA大分子缠绕，再经离心就可直接去除杂质而达到分离纯化酶的目的。蛋白质的盐析中对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析；将大量盐加到蛋白质溶液中，
4、高浓度的盐离子（如硫酸铁的S04和NHJ有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。硫酸铁的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。三、器材旋涡混合器，移液枪，枪头，1.5ml微量离心管，40或50ml离心管，双面离心管架，台式冷冻
5、离心机，紫外分光光度剂，水浴锅，制冰机，PH计，恒温摇床,磁力搅拌器，电泳仪，梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，烧杯，针筒，滤头，培养皿，试剂瓶。四、材料（1）菌种：含TaqDNA聚合酶基因的E.coliX程菌（2）酵母提取物，蛋白脓，NaCl,琼脂粉，AMP（氨节青霉素），葡萄糖，EDTA（乙二胺四乙酸），Tris（三軽甲基氨基甲烷），溶菌酶，盐酸，氯化钾，PMSF（苯甲基磺酰氟），吐温-20,NP・40（乙基苯基聚乙二醇）,DTT（二硫苏糖醇）,甘油,IPTG,无水酒精五、实验准备（1）LB培养基酵母提取物5g蛋白脓10gNaCl10g琼脂10〜15g水定容1000mL(2
6、)试剂存储液可高压灭菌：tris-hcl(PH7.9)0.5mol/L;EDTA0.25mol/L;KC1lmol/L;甘油;无菌水过滤除菌：IPTG100mM/L;DTTlmol/L;AMPlOOmM/L,-20°C保存其他：PMSFlOOmM/L,4°C保存洗脱缓冲50mmolL-1三(軽甲基)氨基甲烷盐酸盐pH7.9;50mmolL-1葡萄糖;1mmol-L-1乙二胺四乙酸,4°C保存（3）试剂配方：（以下均为终浓度）预裂解缓冲液：洗脱缓冲液加4g・L・1溶菌酶（最好现用现加）裂解缓冲液：10mmol-L三（軽甲基）氨基甲烷盐酸盐pH7.9;50mmol-U1氯化钾
7、；1mmoHJ乙二胺四乙酸；1mmol-L"1苯甲基磺酰氟（PMSF,剧毒，入水会慢慢分解，需新鲜加入，临用前加）；0.5%吐温・20;0.5%乙基苯基聚乙二醇NP-40储存缓冲液：50mmol-L-1三（轻甲基）氨基甲烷盐酸盐pH7.9;50mmol-L-1氯化钾；0.1mmolf1乙二胺四乙酸;1mmol・L（二硫苏糖醇DTT;0.5mmol-L-1苯甲基磺酰氟（PMSF,剧毒，入水会慢慢分解，需新鲜加入，临用前加）；体积分数50%甘油储存透析液：除去甘油（4）透析袋前处理使用前处理：1.带手套将透析袋剪成适当长度（10・
