分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用

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1、分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用*陈俊锋r俞纯方I,黄兵笃韩静芳3（1.西南大学动物科技学院，重庆400715；2.中国农业科学院上海家畜寄牛虫病研究所，农业部动物寄牛虫学重点开放实验室，上海200232）摘要：分子标记与形态标记、细胞学标记和生化标记3类遗传标记技术相比，具有直接以DNA的形式表现，在动物的任何生长阶段都可检测,遍布整个基因组，多态性高，检测手段简单迅速，无基因多效性，能够明确辨别等位基因，试验重复性好等优点。目前，在寄生虫分类鉴定上常用的分子标记技术有RFLP,PCR-RFLP,RAPD和AFLP。文章综述了4种分

2、子标记技术的基本原理、主要优缺点以及在寄生虫分类鉴定中的应用情况。关键词：分子标记；RFLP;PCR-RFLP；RAPD;AFLP；寄生虫；分类鉴定在20世纪60年代以前，寄生虫分类鉴定的主要依据是形态学、流行病学、生活史、宿主与地理分布、生理与生化等方面的特征，也有少量是应用细胞学特征⑴。随着现代科学技术的发展，人们意识到传统的方法已经不能完全解决寄生虫种、株的鉴定问题，需要新的方法和技术来解决这些问题。分子标记是随分子生物学和生物技术的迅速发展而发展起来的一种新的较为理想的遗传标记，它虽还冇一定的局限性，然其以遗传物质⑴劝）的多态性为

3、基础，可以反映生物的个体和群体特征。与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，它具有以卜•优越性：①直接以DNA的形式表现，在寄生虫的各个组织和发冇时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；②数量极多，遍及整个基因组；③多态糾攵稿FI期：2006-03-24基金项冃：国家科技基础平台项冃（2004DKA30600）作者简介：陈俊锋（1978-）,男，河南宜阳人，硕士研究牛，主要从事寄牛虫分子牛物学方面的研究。*通讯作者性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；④表现为“中性”，即不影响口标性状的表达，与不良性状

4、无必然的连锁；⑤有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，是一种最先进、最能揭示生物木质的标记技术

5、网，因而在寄生虫的分类鉴定上得到了广泛的应用，并且取得了显著成绩，使用比较成熟的主要有RFLP、PCR-RFLP、RAPD和AFLPo1RFLP技术及其在寄生虫分类鉴定上的应用Botstein等(1980)首先提岀限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,简称RFLP)作为标记构建遗传连锁图的设想。其原理为限制性内切酶对序列的识别具冇专一性，碱基的

6、改变和染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DXA片段酶切位点的变化，用限制性内切酶切割改变的DNA,则产生长短、种类、数口不同的限制性片段，这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，在凝胶上呈现不同的带状分布，具有差异的DNA片段可通过Southern杂交检测出来。优点：①RFLP标记的等位基因是共显性的，对选择隐性基因极为冇利；②RFLP标记反映基因型差异，无表型效应;③RFLP标记之间相互独立，互不干扰,通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异，在数量上无任何限制。缺点：①有种属特异性，因而在实际应用中受到限制；②需耍制备放射性探针和进行S

7、outhern转移及杂交，因而费时、繁琐、污染大，对坏境和人体造成不良影响；③对DNA含量与纯度要求高，且多态性水平低，技术难度高，只适应单/低拷贝。1.1用于蠕虫的分类鉴定为了进一步了解中国各地日本血吸虫的特性,谢觅等⑷采用RFLP技术，经限制性内切酶酶切的屮国大陆具冇区威分布代表性(云南、四川、广西、湖北、湖南、江西、安徽)、中国台湾和日本山梨的日本血吸虫(Schistosomajaponicum)雄虫DNA与探针杂交，图谱显示屮国大陆的日木血吸虫DNA杂交图谱弱杂交带数H呈现差异,而强杂交带数0则相同；中国台湾及口本山梨的D本血吸虫

8、DNA朵交图谱不仅弱朵交带数口呈现差异，而且强杂交带数口亦有不同；由此认为中国与H本山梨的H本血吸虫核基因组存在着遗传变异，冃台湾省的H本血吸虫的遗传变异程度远较其他省份的更为显著。徐恒等国对分离自黄牛、水牛和耗牛的肝片形吸虫(Fasciolahepatica)的基因组DNA以限制性内切酶消化，同吋进行印迹杂交，结果表明耗牛肝片形吸虫与黄牛肝片形吸虫、水牛肝片形吸虫的亲缘关系相对较远，水牛肝片形吸虫与黄牛肝片形吸虫的亲缘关系较近，由此认为这3种不同宿主的肝片形吸虫可能属于不同的亚种或不同的种。1.2用于线虫的分类鉴定诸欣平等⑹以旋毛虫国际

9、标准虫株旋毛形线虫JTrichinellaspiralis'),本地毛形线虫(T.nativa)和南方旋毛虫JT.nelsoni}作对照，利用限制性片段长度多态性差异对分离自屮国黑龙江省不同宿