乌贼墨汁粗多糖的抗菌活性研究【开题报告+文献综述+毕业设计】

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本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全乌贼墨汁粗多糖的抗菌活性研究一、选题的背景与意义乌贼具有高营养、生活史较短（通常一年）、生长快和分布广等特点，是一类很有发展前景的海水养殖种类，也是海洋中最大、最具潜在价值的蛋白质资源。我国乌贼产量丰富，但是在乌贼的加工过程中，往往将乌贼墨囊丢弃或把墨汁洗尽，造成资源的浪费和一定的环境污染。开发利用乌贼墨不仅可变废为宝，获得经济效益，还可以改善环境，取得良好的社会效益。目前，研究乌贼墨粗多糖的相对较少。为提高乌贼的利用价值，本实验对乌贼墨汁粗多糖的抗菌活性进行研究，具有一定的药物开发价值，对目前遇到的菌种抗药性问题也可能是一种可行的解决办法。二、研究的基本内容、拟解决的主要问题与预期达到的目标：（一）研究基本内容：1、乌贼墨多糖的粗提粗多糖中多糖含量的测定2、乌贼墨粗多糖的抗菌活性分析：1）一定浓度乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌效果的比较2）不同浓度乌贼墨汁粗多糖的抑菌性比较3）确定乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度（MIC）4）乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌率（二）拟解决的主要问题：1、乌贼墨汁多糖提取及其含量的测定；2、乌贼墨粗多糖的抗菌活性分析。（三）预期达到的目标乌贼墨汁多糖对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和曲霉、青霉中的一种或几种具有抗菌活性及其最低抑菌浓度、抑菌率等。15 三、研究的方法与技术路线：（一）研究的方法：1、粗多糖的提取：取墨汁→加酶水提→灭酶→离心取上清液→三氯乙酸除杂蛋白→浓缩→乙醇沉淀，得粗品2、多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测多糖含量3、抗菌活性测定：（1）菌种选择：细菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌）、真菌（曲霉、青霉）；（2）培养基：营养琼脂培养基（用于细菌培养）马铃薯培养基（用于真菌培养）（3）抗菌实验：根据抑菌圈直径大小判断1）一定浓度乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌效果的比较2）不同浓度乌贼墨汁粗多糖的抑菌性比较3）确定乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度（MIC）4）乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌率（二）技术路线:15 四、研究的总体安排与进度：2010年9月—2010年10月：1.实验前的准备工作：查找资料，写开题报告和论文综述；2.仪器、药品的准备和各种实验材料的准备。2010年11月—2011年3月：1.采用硫酸-苯酚法测多糖含量，并绘制标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线，得出回归方程和相关系数；2..采用酶-醇沉法粗提乌贼墨汁多糖；3.进行抗菌实验研究，分析一定浓度乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌效果，不同浓度的乌贼墨汁粗多糖的抑菌效果，确定乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度（MIC），乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌率等。4.翻译外文文献。2011年4月—2011年5月：1.补充相关数据，整理试验结果；2.撰写论文初稿；15 3.论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献：[1]张彦民,李宝才,朱利平,等.多糖化学及其生物活性研究进展[J].昆明理工大学学报(理工版),2003,28(3):140-149.[2]刘天龙,许剑琴.多糖现代研究及应用进展[J].中国兽医杂志,2004,40(3):24-26.[3]马宝瑕,陈新,邓军娥.中药多糖研究进展[J].中国医院药学杂志,2003,23(6):360-362.[4]姚新生.天然药物化学[M].第三版.北京:人民卫生出版社,2002,53-106.[5]CuixianYang,NingHe,XuepingLing,etal.Theisolationandcharacterizationofpolysaccharidesfromlonganpulp[J].SeparationandPurificationTechnology,2008,(63):226–230.[6]王洪伟,崔崇士,徐雅琴.南瓜多糖复合酶法提取与纯化的研究[J].食品科学,2007,(6):247-249.[7]黄永春,马月飞,谢清岩,等.超声波辅助提取茶多糖及其分子量变化的研究[J].食品科学.2007,28:170-173.[8]苏秀榕,娄永江,常亚青,等.海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究[J].营养学报,2003,25(2):181-183.[9]SuboWang,YannaCheng,FengshanWang,etal.InhibitionactivityofsulfatedpolysaccharideofSepiellamaindroniinkonmatrixmetalloproteinase(MMP)-2[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2008,(62):297-302.[10]李东霞,李德全,张双全.鲨鱼软骨多糖的理化性质及其与DNA分子相互作用的研究[J].海洋科学,2000,24(5):40-43.[11]苏现波,刘安军.羊软骨粘多糖的提取与分离[J].食品科学,2004,25(5):99～102.[12]李珺,钟耀广,刘长江.香菇多糖的分离纯化方法研究进展[J].北方园艺,2008,(12):84-85.[13]韩春然,唐娟.黑木耳多糖的酶法提取、纯化及性质研究[J].食品科学,2007,28(2):53-55.[14]朱小霞,罗学刚.多糖提取与纯化技术应用进展[J].食品研究与开发,2007,28(3):186-188.[15]于涛,张烈,柴淳.白僵蚕多糖的甲醇提取与热水提取工艺的比较[J].光谱实验室,2010,27(1):305-308.[16]刘兴杰,刘传琳,任虹,等.海葵等四种动物粘多糖碱提取的比较研究[J].烟台大学学报,2001,14(4):264-268.[17]赵启铎,贡济宇,高颖,等.超临界流体萃取技术在中草药成分研究中的应用[J].中医药学刊,2003,21(5):821-823.15 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毕业论文文献综述食品质量与安全多糖的研究概况摘要：多糖具有多种生物活性,在生物体内起着重要作用,现已成为许多学科研究的热点。本文介绍了多糖存在和分布情况，对多糖的种类和化学组成、结构、研究方法进行了概括，重点综述了多糖的提取分离方法、分析测定和生物活性。关键词：多糖；提取分离；分析测定；生物活性0引言多糖是生物体中广泛存在的物质,是生物体内重要的生物大分子,是维持生命活动正常运转的基本物质之一。自20世纪70年代以来，科学家发现多糖及糖复合物在生物体中不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能[1]。多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系。此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在临床上、食品工业、发酵工业及石油工业有着广泛的应用[2]。由于多糖多种多样的生物活性功能以及在功能食品和临床上广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。本文试图对多糖的存在和分布、种类和性质、提取和分离、分析和测定以及生物活性等方面的研究进行概括和综述。1多糖的存在、分布与种类多糖存在和分布极为广泛，几乎存在于所有植物、微生物、动物等有机体中。在植物中,尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。糖类又称为碳水化合物,是植物光合作用的初生产物,是一类最丰富的天然产物,除了作为植物的贮藏养料和骨架之外,还通过它们进行合成了植物中的绝大部分成分[4]。如龙眼[5]、南瓜[6]、茶[7]等皆含有大量糖类。植物多糖包括淀粉,纤维素，果聚糖,半纤维素,树胶,粘液质,粘胶质,卡拉胶及其它葡聚糖[4]。动物多糖几乎存在于所有动物组织器官中，如海洋动物中的棘皮动物(海参[8])、软体动物(乌贼[9])、鱼类(鲨鱼[10])等，哺乳动物(羊[11])等的某些组织(皮、软骨、分泌腺、细胞壁等)都有多糖的存在。动物多糖主要存在于细胞间质中，但机体中多糖的分布不是均一的，而是随组织类型而定。动物多糖包括糖原,甲壳素,肝素,硫酸软骨素,透明质胶,硫酸角质素,酸性粘多糖或糖胺聚糖。肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖,15 由于在体内常以蛋白质结合状态存在,故统称为蛋白聚糖[4]。微生物多糖，主要研究的是真菌多糖，如香菇[12]、黑木耳[13]等。2多糖的化学组成及结构[1]糖是α-碳原子上带有羟基的多羟基醛或多羟基酮,或能水解生成这样的化合物的物质.可分为四类:单糖、二糖、寡聚糖(含3个以上的单糖)和多糖。糖分子中一般都含有几个不对称原子,所以大都具有旋光性。多糖是天然化合物中最大族之一,它是有机体能量的主要来源。多糖是由许多单糖分子,通过苷键连接而成的多于20个糖基的糖链。由于连接方式不同,可以形成直链多糖、叉链多糖,有时也可以形成环状的多糖。多糖的组成因所含单糖的种类、比例及其它原子基团的多少和位置而异,因组成所含苷键的类型,苷键的比例以及与此相关的支链程度等有所不同。多糖的结构分析较为复杂。因为组成多糖的单糖品种繁多,而且即使只有一种单糖,其连接方式也不同及可能有分枝。多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。3研究方法3.1多糖的提取方法多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取前是否做预处理，动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖，而植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，应先用低级性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理[14]。目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法，生物提取法，强化提取法等3.1.1溶剂法3.1.1.1水提醇沉法水提醇沉法[15]是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来。该法提取多糖无需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法.但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。3.1.1.2酸提醇沉法某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH15 值下难以溶解，故在水提醇沉法的基础上发展了酸提法。可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。由于H+的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。3.1.1.3碱提醇沉法多糖在碱性溶液中稳定，例如粘多糖的提取多采用碱提取法[16]。稀碱液提取法适用于多糖与蛋白质间结合型的转化，碱提取法是基于蛋白多糖中的糖肽键对碱的不稳定性，提取过程应在温和条件下，以避免氨基多糖的碱降解。碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。3.1.1.4超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解度，具有气体易于扩散和流动的特性，。对于萃取和分离更有用的是，在临界点附近温度和压力的微小变化会引起超临界流体密度的显著变化，从而使超临界流体溶解物质的能力发生显著的变化，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝31.06℃,Tp＝7.39MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂[17]。廖周坤等[18]采用超临界CO2萃取法从藏药雪灵芝中提出了多糖类成分。3.1.2酶解法3.1.2.1单一酶解法单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术.其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等.蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。苏现波等[11]采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶提取羊软骨中的粘多糖，提取率分别为13.5%和12.3%。谢红旗等[19]采用中性蛋白酶解法提取香菇多糖。姜晓燕等[20]采用纤维素酶水提灵武长枣多糖。15 3.1.2.2复合酶解法复合酶解法是采用一定比例的果胶酶、纤维素酶及蛋白酶来酶解提取多糖。在提取植物多糖时主要利用纤维素酶和果胶酶水解纤维素和果胶，使植物组织细胞的细胞壁破裂，释放细胞壁内的活性多糖，如侯轩等[21]采用复合酶（纤维素酶和果胶酶）提取白术多糖，王洪伟[6]等复合酶法(果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶)提取南瓜多糖。酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。3.1.3物理强化法3.1.3.1微波辅助提法微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。Yang等[5]利用微波铺助提取法提取龙眼多糖。微波萃取效率高，操作简单，且不会引入杂质，多糖纯度高，能耗小，操作费用低，符合环境保护要求，是很好的多糖提取方法。3.1.3.2超声波铺助提取法超声波提取是利用超声波的机械效应、空化效应及热效应。机械效应可增大介质的运动速度及穿透力，能有效的破碎生物细胞和组织，从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；空化效应使整个生物体破裂，整个破裂过程在瞬间完成，有利于有效成分的溶出；热效应增大了有效成分的溶解速度，这种热效应是瞬间的，可使被提取成分的生物活性尽量保持不变；此外，许多次级效应也能促进提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。黄永春等[7]正是利用超声波辅助法来提取茶多糖的。超声波提取，萃取充分，提取时间短，提取率高。3.2多糖的分离3.2.1除蛋白3.2.1.1Sevage法15 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V(氯仿):V(戊醇或正丁醇)为5:1或4:1，混合物剧烈振摇20-30min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质，效率不高，须反复多次，多糖有损失。但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，因为脂蛋白溶于氯仿。韩春然等[13]在酶法提取的黑木耳多糖的实验中，在多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈震荡30min，脱蛋白质效果较好。3.2.1.2三氯乙酸法三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。该法是在多糖水提液中滴加5%～10%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。叶姜瑜等[22]对紫芝多糖纯化时用三氯乙酸法和Sevage法进行比较，发现三氯乙酸法的脱蛋白质率高于Sevage法，多糖损失率低。还有三氟三氯乙烷法、盐析法、有机溶剂萃取等方法除蛋白。3.2.2多糖的分离3.2.2.1利用溶解度不同的分离方法（沉淀法）[1]沉淀法是最简便最常用的方法，此法是利用多糖在不同溶剂中的溶解度不同。多糖具有较强极性,在其水溶液中加入乙醇、丙酮或甲醇等有机溶剂,即可产生沉淀。不同多糖所含极性基团及分子量也不同，分子量小的溶解度大，分支多的较直链的水溶性好，采用不同浓度的有机溶剂,可得不同组分的多糖。沉淀法中常用的沉淀剂有:乙醇、钡盐或锌盐(用于硫酸皮肤素)、硫醇铵-吡啶(用于透明质酸)、乙酸钾(用于肝素)等。常用的方法为：乙醇沉淀法；含盐溶液沉淀法。3.2.2.2利用电离性质不同的分离方法[23]多糖具有较强极性,在其水溶液中加入乙醇、丙酮或甲醇等有机溶剂,即可产生沉淀。不同多糖所含极性基团及分子量也不同。分子量小的溶解度大,分支多的较直链的水溶性好,采用不同浓度的有机溶剂,可得不同组分的多糖。沉淀法中常用的沉淀剂有：乙醇、钡盐或锌盐(用于硫酸皮肤素)、乙酸钾等。常用的方法为：①乙醇沉淀法；②含盐溶液沉淀法。3.2.2.3其它方法除上述几种方法可对多糖进行分离外，还有其它一些方法，如：离子交换层析法[5]、平板技术法、凝胶过滤(凝胶色谱或分子筛色谱)法、酶法、超离心法、高效液相色谱(HPLC)法等。3.3多糖的测定15 3.3.1多糖的定性方法[1]常用的有电泳法(如鉴定粘多糖和中性多糖),薄层分析法(如硫酸皮肤素、硫酸皮质素的鉴定),离子交换层析法(阴、阳离子交换层析法),纸色谱法,柱色谱法,气相色谱法,高效液相色谱(HPLC)法,酶解法等，另外,还可以根据比旋光度,红外吸收光谱(IR)和紫外吸收光谱(UV)进行定性分析。3.3.2多糖的定量方法[1]多糖的定量方法有比色定量法,分光光度法,原子吸收法，磷钼比色法，纸色谱法,离子交换色谱法,薄层色谱法,酶法,高效液相色谱(HPLC)法,凝胶电泳法,亲和电泳法,次亚碘酸盐定量法,硫酸-苯酚法，蒽酮-硫酸法等。每种方法均对某些多糖的测量效果较好。比色法,分光光度法,离子交换色谱法,酶法和电泳法等都可同时用于多糖的定性、定量分析。3.3.3分子量的测定[1]用于多糖分子量的测定的方法有渗透压法，蒸汽压渗透计法,端基法,粘度法,光散射法,凝胶色谱法,超过滤法,沉淀法,凝胶电泳法,高效液相色谱(HPLC)法,超离心分析法和分子筛色谱法等。近年来已有人将高效凝胶渗透色谱法、小角激光散射法用于多糖分子量的测定。多糖的分子量的分布一般比较分散,平常所称的分子量是指大小分子的平均数,即平均分子量。一个分子量较分散的样品,若用不同性质的分子量测定法测定它的分子量结果,往往存在一定的差异。4生物活性4.1抗肿瘤、提高免疫力动物多糖具有抗肿瘤、提高免疫力作用。多糖抗癌的原因大多是激活了体内免疫系统，改善了机体免疫力。苏秀榕等[8]研究发现海参粗多糖具有明显的抗肿瘤活性,其抑瘤率为73.56%。从皱纹盘鲍[24]中提取的鲍鱼多糖能够明显增加巨噬细胞吞噬能力,增强迟发超敏反应。王夙博等[9]将曼氏无针乌贼墨汁中多糖硫酸化，其产物（SIP-SⅡ）无细胞毒性,在体外试验中对肿瘤细胞生长有抑制作用,并能显著减弱人卵巢癌细胞SKOV3中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达和活性、抑制SKOV3细胞的侵袭和迁移。4.2抗氧化、抗衰老赵艳景等[25]利用超声波提取法对缢蛏多糖，结果表明其多糖对超氧阴离子具有一定的清除能率。钦传光等[26]发现泥鳅多糖具有清除活性氧的作用和对·OH导致DNA链损伤的抑制作用,实验表明泥鳅多糖能够有效地清除O2、·OH、H2O2等活性氧，对DNA链具有良好的保护作用。15 4.3抗菌陶海南等[27]对紫萁多糖抗菌活性进行了研究，结果表明从紫萁中分离到的紫萁多糖，对金黄色葡萄球菌和藤黄色八叠球菌均有一定的抑制作用，应用于临床外科烧烫伤的治疗时发现该多糖在生物体皮肤上具有协同的抗菌护肤功效。叶锦林等[28]发现紫球藻水提物和胞外分泌物抗菌性能较强，对革兰氏阳性细菌(特别是对金黄色葡萄球菌和八叠球菌)的抑菌作用较为明显。夏乾峰等[29]研究发现方格星虫多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌埃希茵、枯草杆菌有明显的抗茵活性。4.4其他生物活性刺参酸性粘多糖[30]能够抑制纤维蛋白单体的聚集，机理是提高纤溶活性，增加纤溶敏感性，改变凝胶结构以促进纤溶和直接降解纤维蛋白。鲨鱼软骨酸性多糖具有一定的降血脂的作用[31]，机理可能与其提高毛细血管内脂蛋白脂酶活性并促进该酶释放有关。李东霞等[10]证实中华鳖多糖、壳聚糖具有极显著的抗疲劳活性，能有效减轻运动机体中乳酸的堆积并能迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐力，从而延缓小鼠机体疲劳的发生并加速疲劳的恢复。5展望多糖作为一类重要的天然活性物质,其最大优点是毒副作用小,来源广泛。目前已有多种多糖应用于临床,它们在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖等方面的作用使多糖类药物显示了诱人的前景。我国多糖资源丰富,具有较大的开发潜力。由于多糖本身结构比较复杂，种类繁多，其结构测定和分离纯化有很大的难度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关，给多糖的研究和应用带来许多的挑战。随着多糖的分离纯化、结构、合成、药理及临床研究的不断深入,多糖类药物将具有更广阔的应用前景。参考文献[1]张彦民,李宝才,朱利平,等.多糖化学及其生物活性研究进展[J].昆明理工大学学报(理工版),2003,28(3):140-149.[2]刘天龙,许剑琴.多糖现代研究及应用进展[J].中国兽医杂志,2004,40(3):24-26.[3]马宝瑕,陈新,邓军娥.中药多糖研究进展[J].中国医院药学杂志,2003,23(6):360-362.[4]姚新生.天然药物化学[M].第三版.北京:人民卫生出版社,2002,53-106.[5]CuixianYang,NingHe,XuepingLing,etal.Theisolationandcharacterizationofpolysaccharidesfromlonganpulp[J].SeparationandPurificationTechnology,2008,(63):226–230.[6]王洪伟,崔崇士,徐雅琴.南瓜多糖复合酶法提取与纯化的研究[J].食品科学,2007,(6):247-249.15 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摘要：乌贼墨是乌贼加工中的废弃物，但其具有一定的利用价值。本实验以金乌贼(SepiaesculentaHoyle)墨汁为原料，对乌贼墨汁粗多糖的抗菌活性进行研究，分析乌贼墨多糖对细菌或真菌是否具有抗菌活性。采用碱性蛋白酶-醇沉法从新鲜乌贼墨囊中提取获得占乌贼墨汁总重量为3.899%的粗多糖。本实验主要是根据抑菌圈的有无及其直径大小来判断乌贼墨汁粗多糖对细菌和真菌的抑菌效果。结果表明，乌贼墨汁粗多糖对青霉和黑曲霉无明显抗菌作用，但对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌有明显的抗菌作用，浓度越高抗菌活性越强；乌贼墨汁粗多糖对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最明显，金黄色葡萄球菌次之，大肠埃希氏菌第三，并且测得乌贼墨汁粗多糖对该三种细菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为7.5mg/mL、9.0mg/mL、10.0mg/mL，抑菌率分别为2.260、1.521、1.505。关键词：乌贼墨汁；粗多糖；抗菌活性Abstract:Cuttlefishinkisthecastoffofcuttlefishprocessing,butithasacertainvalueinuse.ThepolysaccharidescontainedinCuttlefishinkwereobtained.TheantibacterialactivityofcrudepolysaccharideincuttlefishinkwasstudiedanditwasanalysedthatifthepolysaccharidescontainedinCuttlefishinkshowedantibacterialactivityonfungusesorbacteria.Crudepolysaccharideswereextractedfrominksacofcuttlefishbyalcalase-alcoholmethodanditsyieldobtained3.899%.Crudepolysaccharidescontainedincuttlefishinkdoesn'tshowantibacterialactivityonPenicilliumglaucumandAspergillusnigerandshowssignificantantibacterialactivityonStaphylococcusaureus,EsaherichiacoliandBacillussubtilis,theantibacterialactivitywasincreasedindose-dependentwaysbypolysaccharidescontainedinCuttlefishink.Someofthecharactersoftheantibacterialsubstancewerestudied.TheantibacterialactivityonBacillussubtilisisthemostsignificant,anditisthethirdobviousnessonEsaherichiacoli.Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofthecrudepolysaccharidesonBacillussubtilis,StaphylococcusaureusandEsaherichiacoliare7.5mg/mL,9.0mg/mLand10.0mg/mL,,respectively.TheantibacterialrateofthecrudepolysaccharidesonBacillussubtilis,StaphylococcusaureusandEsaherichiacoliare2.260,1.521and1.505,respectively.Keywords:Cuttlefishink;Crudepolysaccharide;Antibacterialactivity 1绪论1.1概述乌贼(Cuttlefisk)属于软体动物门(PhylumMollusca)头足纲(ClassCephalopode)乌贼目(SepioideaNaef)乌贼科(SepidacKefertein)乌贼属(SepiaLinnaeus)的一种海洋生物，具有较高营养和多种药用功能。其种类繁多，最常见的有：金乌贼(SepiaesculentaHoyle)、曼氏无针乌贼(SepiallamaindronideRochebrune)、虎斑乌贼(SepiapharaonisEhrenberg)、白斑乌贼(SepialatimanusQuoyetGaimrd)、拟目乌贼(SepialycidasGray)等[1]。乌贼墨存在于墨囊中，是乌贼遇到天敌时喷出来染黑周围水域的黑色物质，以混乱天敌视野和麻痹天敌嗅觉[1]，是一种防身物质，主要是由黑色素和蛋白聚糖组成[2]。王夙博等[2]通过酶解作用和阴离子交换-凝胶渗透色谱法从曼氏无针乌贼的墨汁中分离得到的曼氏无针乌贼墨汁多糖（SIP），其主链是由海藻糖、N-乙酰半乳糖胺和甘露糖以2:2:1的摩尔比组成，通过高效凝胶过滤色谱-光散射（HPSEC-MALLS）分析法得到SIP是分子量为1.13×104Da的均匀结构。日本Mochizuki指出shiokara(一种腌制发酵的鱿鱼产品)中加入乌贼墨明显改善该产品的保存性能[3]，这表明乌贼墨还具有抗菌作用。王劲松[3]研究了乌贼墨中抗菌活性物质的提取及其抗菌活性，得到一种具有有较强的抗菌活性的物质，该物质吸水后变棕黄色。1.2多糖的研究状况1.2.1简介1.2.1.1分布与种类多糖存在和分布极为广泛，几乎存在于所有植物、微生物、动物等有机体中。在植物中,尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要。糖类又称为碳水化合物,是植物光合作用的初生产物,是一类最丰富的天然产物,除了作为植物的贮藏养料和骨架之外,还通过它们进行合成了植物中的绝大部分成分[4]。如龙眼[5]、南瓜[6]、茶[7]、芦荟[8]等皆含有大量糖类。植物多糖包括淀粉,纤维素，果聚糖,半纤维素,树胶,粘液质,粘胶质,卡拉胶及其它葡聚糖[4]。动物多糖几乎存在于所有动物组织器官中，如海洋动物中的棘皮动物（海参[9]）、软体动物（乌贼[2]、鲍鱼[10]、缢蛏[11]）、鱼类（鲨鱼[12,13]）等，哺乳动物等的某些组织（皮、软骨、分泌腺、细胞壁等）都有多糖的存在。动物多糖主要存在于细胞间质中，但机体中多糖的分布不是均一的，而是随组织类型而定。动物多糖包括糖原,甲壳素,肝素,硫酸软骨素,透明质胶,硫酸角质素,酸性粘多糖或糖胺聚糖。肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖,由于在体内常以蛋白质结合状态存在,故统称为蛋白聚糖[4]。微生物多糖，主要研究的是真菌多糖，如香菇[14]、黑木耳[15]等。1.2.1.2化学组成及结构[16]多糖是由许多单糖分子,通过苷键连接而成的多于20个糖基的糖链。由于连接方式不同,可以形成直链多糖、叉链多糖,有时也可以形成环状的多糖。多糖的组成因所含单糖的种类、比例及其它原子基团的多少和位置而异,因组成所含苷键的类型,苷键的比例以及与此相关的支链程度等有所不同。 多糖的结构分析较为复杂。因为组成多糖的单糖品种繁多,而且即使只有一种单糖,其连接方式也不同及可能有分枝。多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。SuboWang等[5]的研究表明龙眼多糖（LPSs）是一种β型吡喃环杂多糖，其次级产物LPS-N是由木糖和葡萄糖以1:1.9的质量比组成的；LPS-A1由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖以质量比1:1.64:4.33:2.28构成；LPS-A2仅由鼠李糖组成。LPS-A1和LPS-A2的总糖醛酸含量分别为6%和19%。这些发现表明了龙眼多糖各种各样的化学结构以及其丰富的单糖和糖醛酸的化学组成。1.2.2多糖的作用1.2.2.1抗肿瘤、提高免疫力动物多糖具有抗肿瘤、提高免疫力作用。多糖抗癌的原因大多是激活了体内免疫系统，改善了机体免疫力。王夙博等[2]将曼氏无针乌贼墨汁中多糖硫酸化，其产物（SIP-SⅡ）无细胞毒性,在体外试验中对肿瘤细胞生长有抑制作用,并能显著减弱人卵巢癌细胞SKOV3中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达和活性、抑制SKOV3细胞的侵袭和迁移。苏秀榕等[9]研究发现海参粗多糖具有明显的抗肿瘤活性,其抑瘤率为73.56%。从皱纹盘鲍[10]中提取的鲍鱼多糖能够明显增加巨噬细胞吞噬能力,增强迟发超敏反应。1.2.2.2抗氧化作用赵艳景等[11]利用超声波提取法对缢蛏多糖，结果表明其多糖对超氧阴离子具有一定的清除能率。钦传光等发现泥鳅多糖[17]具有清除活性氧的作用和对·OH导致DNA链损伤的抑制作用。1.2.2.3抗菌作用陶海南等[18]对紫萁多糖抗菌活性进行了研究，结果表明从紫萁中分离到的紫萁多糖，对金黄色葡萄球菌和藤黄色八叠球菌均有一定的抑制作用，应用于临床外科烧烫伤的治疗时发现该多糖在生物体皮肤上具有协同的抗菌护肤功效。叶锦林等[19]发现紫球藻水提物和胞外分泌物抗菌性能较强，对革兰氏阳性细菌(特别是对金黄色葡萄球菌和八叠球菌)的抑菌作用较为明显。夏乾峰等[20]研究发现方格星虫多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌埃希茵、枯草杆菌有明显的抗茵活性。1.2.2.4其他作用刺参酸性粘多糖[21]能够抑制纤维蛋白单体的聚集，机理是提高纤溶活性，增加纤溶敏感性，改变凝胶结构以促进纤溶和直接降解纤维蛋白。鲨鱼软骨酸性多糖具有一定的降血脂的作用[12]，机理可能与其提高毛细血管内脂蛋白脂酶活性并促进该酶释放有关。李东霞等[13]证实中华鳖多糖、壳聚糖具有极显著的抗疲劳活性，能有效减轻运动机体中乳酸的堆积并能迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐力，从而延缓小鼠机体疲劳的发生并加速疲劳的恢复。1.3研究目的、意义与主要内容日本学者Takaya指出，海洋生物中含有结构我们熟悉或不熟悉的、具有生理活性的物质，很多生理活性还没有被深入的研究，而这些研究都可能引导我们去开发一种新的药物资源或得到一种新的有药用的化合物[1]。 乌贼具有高营养、生活史较短、生长快和分布广等特点，是一类很有发展前景的海水养殖种类，也是海洋中最大、最具潜在价值的蛋白质资源。在乌贼加工后一般会产生的墨囊（包括墨汁)、皮、骨、内脏等废弃物。在当前乌贼资源日渐衰竭的情况下，这是一项非常可观的资源。开发利用乌贼墨不仅可变废为宝，获得经济效益，还可以改善环境，取得良好的社会效益。目前，有关乌贼墨和动物多糖的研究日益增多，但文献报道中对乌贼墨汁多糖的研究较少，为提高乌贼的利用价值，本实验以金乌贼(SepiaesculentaHoyle)墨汁为原料，研究对乌贼墨汁粗多糖的抗菌活性进行研究，分析乌贼墨多糖对细菌或真菌的抗菌活性，从而提高乌贼资源的利用率并开发新的抗菌剂。2材料与方法2.1材料与试剂金乌贼（购于宁波庄市菜市场）。生理盐水、氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙醇、丙酮均为国产分析纯。供试菌种:细菌：大肠埃希氏菌（Esaherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）；真菌：青霉（Penicilliumglaucum）、黑曲霉（Aspergillusniger）。营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司），用于细菌培养，其主要成分为：蛋白胨、牛肉粉、氯化钠、琼脂；用法：取本品35g，加1000ml蒸馏水，煮沸溶解。经115℃，15min灭菌后备用。马铃薯培养基（杭州微生物试剂有限公司），用于霉菌分离培养，其主要成分：马铃薯浸出粉10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂13.0g/L；用法：取本品43g加1000mL蒸馏水，煮沸溶解。经115℃，15min灭菌后备用。液体培养基，其配方：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L；用法：取酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，加1000mL蒸馏水，煮沸溶解且调pH7.0即可。经115℃，15min灭菌后备用。2.2主要仪器DK-S22恒温水浴锅；AB104-N分析天平；高速冷冻离心机；真空冷冻干燥器；T6新悦可见光分光光度计；RE52-2旋转蒸发器；Delta320酸度计；恒温培养箱；高压灭菌锅；移液管；玻璃平皿；打孔器；超净工作台。2.3方法2.3.1粗多糖的提取本实验采用酶-醇沉法[10,20,27]粗提乌贼墨汁粗多糖。先从乌贼中获得新鲜墨囊，收集起来置于-20℃以下冻藏，4℃解冻刺破墨囊取墨。加水并调pH为8，加4%的碱性蛋白酶后置于50℃的DK-S22恒温水浴锅中3h。然后在100℃条件下灭酶10min后，置于高速冷冻离心机中，9000r/min离心20min取上清液。在上清液中加入四分之一体积的15%的三氯乙酸过夜，再置于高速冷冻离心机中，9000r/min离心20min取上清液。将上清液置于RE52-2 旋转蒸发器中旋转蒸发浓缩，再调pH为7，并加入4倍乙醇进行沉淀。取沉淀物冷冻干燥，得微黄色多糖样品。2.3.2多糖含量的测定本实验采用苯酚-硫酸法[5,8]测量粗多糖中的多糖含量。标准溶液配制:精密称取100℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100mg置于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，取10mL上述溶液定容至100mL，配制成100μg/mL的葡萄糖标准溶液备用。苯酚溶液的配制:取苯酚6mL，加蒸馏水定容至100mL，得6%的苯酚置于棕色瓶中保存备用。标准曲线的制备:精密吸取标准品溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水，使总体积为2mL，再分别加苯酚试液1mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温，在T6新悦可见光分光光度计上，选择在490nm处测定其吸光度。2.3.3供试菌种活化与菌悬液的制备[3]预先将三种供试细菌接入营养琼脂斜面培养基上进行活化，置于37℃恒温培养箱中培养24h；将两种供试真菌接入马铃薯斜面培养基上进行活化，置于28℃恒温培养箱中培养72h。然后用接种环分别挑取一环已活化好的菌种放入9mL无菌生理盐水中，振荡摇匀，制成各种菌的菌悬液，备用。2.3.4粗多糖加样做抑菌圈[3]在灭菌的平底培养皿中各倒入15~20mL、50℃左右的灭菌培养基，迅速摇匀，水平凝固成平板，每个菌做2个平行。取配好的菌悬液0.1mL接种于相应的培养基上均匀涂布。将粗多糖用无菌水溶解配制成浓度为50mg/mL的溶液，以无菌水作为空白对照。分别于培养皿中用打孔器打3个孔，一个孔中注满无菌水，另两个孔中均加入样品溶液，作为平行实验组。细菌37℃恒温培养24h后，测抑菌圈大小，量取抑菌圈直径取平均值，并照相。真菌28℃恒温培养72h后，测抑菌圈大小，量取抑菌圈直径取平均值，并照相。2.3.5不同浓度粗多糖的抑菌性能的比较[3]在灭菌的平底培养皿中各倒入15~20mL、50℃左右的灭菌培养基，迅速摇匀，水平凝固成平板，每个菌做两个平行。取配好的菌悬液0.1mL接种于相应的培养基上均匀涂布。取粗多糖用无菌水配制成浓度为30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL的溶液系列，分别于培养皿中用打孔器打3个孔，每个孔中分别注满30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL的样品溶液。细菌37℃恒温培养24h后，测抑菌大小，量取抑菌圈直径取平均值，并照相。真菌28℃恒温培养72h后，测抑菌圈大小，量取抑菌圈直径取平均值，并照相。2.3.6确定粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度（MIC）[3]活化菌种，制备菌悬液，分别配制一系列浓度的粗多糖溶液，取无菌的装有8mL液体培养基的试管，分别加入1mL的菌悬液及1mL粗多糖溶液，使粗多糖的最终浓度为5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、10.0mg/mL。每一浓度的粗多糖溶液平行做两次。将装有细菌的试管置于恒温培养箱中37℃培养12h，装有真菌的试管置于恒温培养箱中28℃ 培养48h，另将一支不加粗多糖的试管置于冰箱保存作空白，然后在560nm处测定OD560。其中OD560为0的液体培养基中所加的粗多糖的浓度即是粗多糖的最小抑菌浓度（MIC）。2.3.7粗多糖对不同菌株的抑菌率[3]在4mL液体培养基中添加1mL粗多糖50mg/mL，加入1mL菌悬液，一定温度下培养（细菌37℃，12h，真菌28℃，48h），以没有加样品的培养基（加入同样量的菌悬液）为对照组，计算抑菌率。抑菌率（细菌）=12h后对照组OD值/12h后添加组OD值；抑菌率（真菌）=48h后对照组OD值/48h后添加组OD值。3结果与讨论3.1粗多糖含量的测定3.1.1标准曲线以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，见图1，其回归方程为A=0.0076c-0.0037（R2=0.9991），其中A为吸收度，c为葡萄糖的浓度（μg/mL）。图1标准曲线图3.1.2多糖含量测定精密称取一定量的乌贼墨汁粗多糖粉末，加蒸馏水定容至100mL,取2.0mL测定其吸光度，根据该回归方程计算本实验所得的乌贼墨汁中的多糖含量占总乌贼墨汁含量的3.899%。3.2粗多糖对不同菌株的抑菌作用图2为粗多糖对Staphylococcusaureus 的抑菌效果图，图中编号为3的小孔中注入的为无菌蒸馏水，无明显抑菌圈，编号为1和2的两个小孔中均注入的为50mg/mL的粗多糖，有明显的抑菌圈。图3为粗多糖对Esaherichiacoli的抑菌效果图，图中编号为1的小孔中注入的为无菌蒸馏水，无明显抑菌圈，编号为2和3的两个小孔中均注入的为50mg/mL的粗多糖，有明显的抑菌圈。图4为粗多糖对Bacillussubtilis的抑菌效果图，图中编号为2的小孔中注入的为无菌蒸馏水，无明显抑菌圈，编号为1和3的两个小孔中均注入的为50mg/mL的粗多糖，有明显的抑菌圈。图5为粗多糖对Penicilliumglaucum的抑菌效果图，图中编号为1的小孔中注入的为无菌蒸馏水，无明显抑菌圈，编号为2和3的两个小孔中均注入的为50mg/mL的乌贼墨汁粗多糖，也无明显的抑菌圈。图6为粗多糖对Aspergillusniger的抑菌效果图，图中编号为2的小孔中注入的为无菌蒸馏水，无明显抑菌圈，编号为1和3的两个小孔中均注入的为50mg/mL的粗多糖，也无明显的抑菌圈。图2~6分别为粗多糖在50mg/mL的浓度下对Staphylococcusaureus、Esaherichiacoli、Bacillussubtilis、图2粗多糖对Staphylococcusaureus的抑菌圈图3粗多糖对Esaherichiacoli的抑菌圈 图4粗多糖对Bacillussubtilis的抑菌圈图5粗多糖对Penicilliumglaucum的抑菌圈 图6粗多糖对Aspergillusniger的抑菌圈Penicilliumglaucum、Aspergillusniger的抑菌效果图,以无菌水作为对照组，可判断粗多糖对Staphylococcusaureus、Esaherichiacoli、Bacillussubtilis等三种细菌有明显抗菌效果，对Penicilliumglaucum、Aspergillusniger等两种真菌的抗菌效果则不明显，结果见表1。表1乌贼墨汁粗多糖抑菌效果(mm)乌贼墨汁粗多糖浓度(50mg/mL)菌种StaphylococcusaureusEsaherichiacoliBacillussubtilisPenicilliumglaucumAspergillusniger抑菌效果+++——注：“+”表示有明显抑菌圈，“—”表示无明显抑菌圈。3.3不同浓度粗多糖的抑菌性能的比较图7~11分别为粗多糖在30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL的浓度下对Staphylococcusaureus、Esaherichiacoli、Bacillussubtilis、Penicilliumglaucum和Aspergillusniger的抑菌效果图。其中抑菌性能结果与章节3.2中的实验结果一致，即粗多糖对Staphylococcusaureus、Esaherichiacoli和Bacillussubtilis有明显抑菌效果，而对Penicilliumglaucum和Aspergillusniger的抑菌效果不明显。根据图7~9中的不同浓度粗多糖对一种菌的抑菌圈直径大小比较可判断粗多糖的抗菌强度随着粗多糖的浓度增加而增强，并且同一浓度下的粗多糖对不同菌株的抑菌效果也有差异，表现为对Bacillussubtilis的抑菌效果最明显，Staphylococcusaureus次之，Esaherichiacoli最弱，结果见表2。表2不同浓度乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌效果(mm) 乌贼墨汁粗多糖浓度(10mg/mL)抑菌圈直径(mm)StaphylococcusaureusEsaherichiacoliBacillussubtilis304050 9.610.812.6 9.19.911.210.211.313.9图7不同浓度的粗多糖对Staphylococcus图8不同浓度的粗多糖对Esaherichiacoliaureus的抑菌圈的抑菌圈 图9不同浓度的粗多糖对Bacillussubtilis图10不同浓度的粗多糖对Penicillium的抑菌圈glaucum的抑菌圈图11不同浓度的粗多糖对Aspergillusniger的抑菌圈 3.4粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度(MIC)粗多糖对不同菌株的最小抑菌浓度（MIC）见表3所示。根据表3中的数据比较可知，粗多糖对Bacillussubtilis的抑菌效果最好，Staphylococcusaureus次之。表3乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的MIC(mg/mL)菌种StaphylococcusaureusEsaherichiacoliBacillussubtilis乌贼墨汁粗多糖MIC(mg/mL)9.010.07.53.5粗多糖对不同菌株的抑菌率粗多糖对不同菌株的抑菌率见表4所示。根据表4中的数据比较可知，粗多糖对Bacillussubtilis的抑菌效果最好，Staphylococcusaureus次之。表4乌贼墨汁粗多糖对不同菌株的抑菌率乌贼墨汁粗多糖浓度(10mg/mL)菌种StaphylococcusaureusEsaherichiacoliBacillussubtilis抑菌率1.5211.5052.2604小结本实验以金乌贼(SepiaesculentaHoyle)墨汁为原料，采用碱性蛋白酶-醇沉法从新鲜乌贼墨囊中提取获得占乌贼墨汁总重量为3.899%的粗多糖。本实验主要是根据抑菌圈的有无及其直径大小来判断乌贼墨汁粗多糖对细菌和真菌的抑菌效果。结果表明，粗多糖对Penicilliumglaucum和Aspergillusniger无明显抗菌作用，但对Staphylococcusaureus、Esaherichiacoli和Bacillussubtilis有明显的抗菌作用，浓度越高抗菌活性越强。并且分析发现粗多糖对Bacillussubtilis的抑菌效果最明显，Staphylococcusaureus次之，Esaherichiacoli最弱。通过本实验还测得了粗多糖对该三种细菌（Bacillussubtilis、Staphylococcusaureus和Esaherichiacoli）的最小抑菌浓度分别为7.5mg/mL、9.0mg/mL和10.0mg/mL，抑菌率分别为2.260、1.521和1.505。对乌贼墨汁粗多糖抗菌具体机制还有待进一步研究。 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