DB22∕T 2921-2018 禽白血病ABJ亚群检测 PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：62766-2019DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2921—2018禽白血病A/B/J亚群检测PCR法DetectionmethodofPCRofavianleukosisA,BandJ-subgroups本标准仅供内部使用不得翻印2018-11-12发布2018-12-30实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2921—2018本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省

2、畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新华、苑淑贤、程荣华、邵洪泽。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2921—2018本标准仅供内部使用不得翻印禽白血病A/B/J亚群检测PCR法1范围本标准规定了禽白血病A/B/J亚群PCR检测方法的技术要求。本标准适用于禽白血病A/B/J亚群的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改

3、单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂或材料3.1试剂本标准仅供内部使用不得翻印3.1.1病毒基因组DNA提取试剂盒。3.1.2阳性对照，为禽白血病病毒基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA。3.1.3阴性对照，健康鸡血液或血清DNA。3.1.410×PCR缓冲液，见附录A.1。3.1.510mmol/LdNTPs。3.1.62U/μLTaqDNA聚合酶。3.1.7水为DEPC处理过的双重蒸馏水（ddH2O），符合GB/T6682的规定。3.1.850×TAE电泳缓冲液，见附录A.2。3.1.910mg/mL溴化乙锭（EB）溶液，

4、见附录A.3或其他同类型可替代物。3.1.101.0%琼脂糖凝胶，见附录A.4。3.1.11上样缓冲液，见附录A.5。3.1.12标准分子量DL2000Marker。3.2材料3.2.110μL、200μL和1000μL吸头。3.2.21.5mL离心管。3.2.3无菌棉拭子。3.2.40.2mL薄壁PCR管。3.3引物引物序列、浓度及扩增长度见表1。1DB22/T2921—2018表1引物序列及浓度本标准仅供内部使用不得翻印引物引物序列使用浓度扩增长度上游引物F5′-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3′AR5′-AACCCAGATACCAAGGAACC-3′3

5、75bp10μmol/L下游引物BR5′-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3′581bpJR5′-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3′683bp4仪器设备4.1微量移液器，2.5μL、20μL、200μL、1000μL。4.2电子天平，感量0.1mg。4.3均质器。4.4低温高速离心机。4.5PCR扩增仪。本标准仅供内部使用不得翻印4.6核酸电泳仪。4.7紫外凝胶成像仪。5样品5.1血液或血清样品的处理用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清样品500μL（3.2.1）于1.5mL的离心管（3.2.2）中，以病毒基因组DNA提取试剂盒（3.1.1）提

6、取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.2鸡胚尿囊液的处理用移液器吸取鸡胚尿囊液500μL于1.5mL的离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.3肿瘤或其他组织的处理称取（4.2）100mg肝脏、脾脏或胰腺等组织用均质器（4.3）研碎，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.4喉拭子和泄殖腔拭子的处理将喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5mL离心管中，以少量ddH2O浸润，用离心机（4.4）3000r/min离心15min，取上清液500μL于1.5mL离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒

7、提取样本DNA，操作方法按说明书进行。2DB22/T2921—20186试验步骤6.1PCR扩增本标准仅供内部使用不得翻印分别设立以ddH2O为模板的空白对照、阳性对照（3.1.2）、阴性对照（3.1.3）和待检样品，采用50μL反应体系，在0.2mL薄壁PCR管（3.2.4）中依次加入表2所示的试剂后，瞬时离心混匀，做好标记，于PCR仪（4.5）中扩增。表2PCR反应体系成分用量10×PCR缓冲液（3.1.4）5μLdNTPs（3.1.5）4μLTaqDNA聚合酶（3.1.6）1μL引物F（3.3）4μL引物AR（3.3）2μL引物BR