广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选-论文.pdf

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1、中国震学c丕报2014，30(16)：164—169ChineseAgriculturalScienceBulletin广东紫珠ISSR—PCR反应体系建立及引物筛选房海灵，聂群，卢艳花，朱培林(江西省林业科学院，南昌330032；华东理工大学，上海200237)摘要：为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR．PCRg．_应体系，以广东紫珠总DNA为试验材料．通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Me浓度、引物浓度和Tat／酶用量进行优化，确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0．25mmol／L

2、dNTPs、1．00UTaqDNA聚合酶、0．75~mol／L引物、2．0mmol／LMg~、100ng模板DNA，总反应体积为25。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃，5min；变性94℃，30S；退火温度与每个引物相对应，退火45s；72℃延伸90S；34个循环；后72℃延伸10min；4~C保存，扩增结束。用来自不同居群4个个体，以100个ISSR引物进行PCR扩增，筛选出扩增效果较好的20个引物。关键词：广东紫珠；体系优化；ISSR—PCR；引物筛选中图分类号：R931文献标志码：A论文

3、编号：2013．2921OptimizationofISSR_-PCRReactionSystemandPrimersScreeninginCallicarpakwangtungens~FangHailing，NieWei，LuYanhua。ZhuPeilin(JiangxiAcademyofForestry，Nanchang330032；2EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237)Abstract：Inordertoestablishastable，rep

4、eatableISSR—PCRreactionsystemofCallicarpakwangtungensis，thefactorsincludedtheconcentrationofDNAtemplate，dNTPs，Mg，primersandTaqDNApolymerasewerestudiedthroughthesinglefactortests。orthogonaltestswiththetotalDNAofCkwangtungensisasexperimentalmateria1．Andthebestreactions

5、ystemofISSR—PCRtoC．kwangtungensiswasestablishedas~llows：0．25mmol／LdNTPs，1．O0UTaqDNApolymerase，O．75I~moULprimem，2．0mmol／LMgn，100ngtemplateDNAin25Lreactionvolume．PCRamplificationprogramofbetterrepeatabilityandstabilitywassetupafterapre—degeneration5minat94~C；degenerati

6、on30Sat94℃；annealingtime45S，annealingtemperaturecorrespondstoeachprimer；extension90Sat72oC；34cyclefromdegenerationtoextensionintotal；thenextension10rainat72℃．finallyconservedat4℃．OnehundredISSRprimemwereusedtoscreenthesuitableprimerswith4samplesfromdiferentpopulation

7、sofCkwangtungensis．and20ISSRpfime~withgoodamplificationwerescreenedout．Keywords：CallicarpakwangtungensisChun．；optimizationofsystem；ISSR—PCR；primersscreening0引言青”之名始载于清代《植物名实图考》n)，具有止血、止广东紫珠(CallicarpakwangtungensisChun．)为马鞭痛之功效，临床上用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫草科紫珠属植物，在中国用药历史相对较短，

8、以“万年颈炎等症[2】。《中国药典》(2010年版)将广东紫珠作为基金项目：江西省科技支撑计划项目“广东紫珠种质资源质量评价及优良种质筛选研究”(20111BBG70030．4)；江西省博士后科研择优资助项目“广东紫珠种质资源多样性评价及药材品质形成的影响机制研