重组蛋白制备.pptx

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1、如何获得重组蛋白？重组蛋白制备重组表达载体构建目标蛋白重组表达最高效的蛋白分离纯化方法——亲合纯化重组表达载体构建基因克隆基因克隆(GeneCloning):亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化(克隆)重组子的技术。基因克隆程序1）目的基因片段获得2）目的载体的获得3）目的基因与载体DNA的限制性酶切4）酶切目的基因与载体DNA片段的连接重组5）连接重组质粒转化大肠杆菌6）含目的基因插入片段的重组子鉴定基因克隆所需通用材料需要克隆的目的DNA片段。克隆载体，用于接入目的DNA片段。限制性内切核酸酶，消化目的DNA片段与克隆载体，产生连接反应所

2、需要的DNA粘性末端。DNA连接酶，将目的DNA片段与克隆载体连接在一起，构建重组载体。大肠杆菌感受态细胞，用于筛选含有插入目的DNA片段的阳性克隆。基因克隆流程图一、目的基因片段获取1）聚合酶链式反应——PCR2）反转录-聚合酶链式反应——RT-PCRPCRPCR：PolymeraseChainReaction多聚酶链式反应美国KaryB.Mullis1985年建立(1993诺贝尔化学奖获得者)PCR反应的三个基本步骤模板双链DNA的变性：～94℃引物与单链模板的退火：～55℃引物的延伸：～70℃一个PCR循环(PCRcycle)包括变性—退火—延伸三个步骤；理论上可使靶序列数

3、量增加一倍。30个循环后，可获得106个靶分子PCR循环PCR反应五要素DNA聚合酶：影响PCR反应的产量引物：影响PCR反应特异性的关键因素dNTP：影响PCR反应扩增效率的关键因素模板：决定PCR反应成败的关键环节之一Mg2+：影响PCR反应扩增的特异性和产量RT-PCR以RNA作为模板，反转录酶合成互补DNA（cDNA）以cDNA作为模板，PCR指数扩增目的基因片断。与普通PCR相同。反转录反应反应原理：反转录酶以RNA为模板指导互补DNA链合成。反应组分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板反应特点：特异性以mRNA作为模板。注意事项：防止核酸酶A（RNaseA）污染

4、，RNaseA会降解RNA模板，使反转录反应失去模板而失败。与PCR区别：1）PCR反应为链式反应，产物以指数方式扩增；反转录为线性扩增，且只能合成一条与RNA互补的DNA链。2）PCR为热循环反应，DNA聚合酶具有热稳定性；反转录为常温反应，反转录酶不具有热稳定性，高温使反转录酶失去酶活性。二、限制性酶切反应反应原理限制性内切核酸酶识别双链DNA的特异性序列，并在此特异性序列处或附近切断双链DNA。反应特点切割位点具有碱基序列特异性，只在特定碱基序列处切断双链DNA。注意事项a不同限制性内切核酸酶反应缓冲液有很大差别，b一部分限制性内切核酸酶活性受DNA识别序列甲基化修饰影响三

5、、克隆载体－质粒质粒的相关概念可以在宿主细胞内进行复制的环形DNA分子。不同质粒在宿主细胞内的分子数(拷贝数)不同。在体外不能复制、传代；但DNA可长期保存生命活力。微生物基因组DNA不再具有生命活力。根据宿主细胞差异，质粒分为多种类型。根据用途差异，质粒分为:克隆载体和表达载体。人工构造的质粒具有的必需功能元件：复制起始区、抗性筛选标记、多克隆位点。pUC18质粒图谱pUC18多克隆位点四、DNA连接反应反应原理：DNA连接酶催化DNA分子3’羟基（3’-OH）与5’磷酸基团（5’-P）间形成磷酸二酯键反应组分：DNA连接酶及相应辅基，DNA分子。DNA连接种类：1）ATP作辅

6、基的DNA连接酶，例如T4DNA连接酶，pfuDNA连接酶2）NAD＋作辅基的DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶应用：1）DNA重组构建重组质粒2）DNA连接反应检测单核苷酸多态性连接反应获取重组环状DNA分子五、DNA转化反应DNA转化原理在某些特殊生理条件下，宿主细胞可以高效吸收外源DNA，从而将外源DNA转入特定宿主菌。DNA转化方法1）化学转化：用某些二价金属离子，例如50mMCaCl2，处理宿主细胞，使宿主细胞处于高效吸纳外源DNA的生理状态，称之为感受态。之后将外源DNA转化进入宿主菌细胞。2）电转化：高电压瞬时处理（电击）宿主菌，可使宿主菌处于极高效吸纳外源DN

7、A的生理状态。电转化效率是化学转化效率的10－100倍。主要应用将可自我复制的外源DNA，如各种质粒，转入宿主菌，并在宿主菌内繁殖这些质粒，实现相应质粒的大规模制备。六、重组质粒鉴定方法1）PCR鉴定利用目的基因特异性的引物，重组质粒作为模板，利用PCR进行鉴定。若能扩增出DNA产物，则重组质粒含有目的基因；反之不含目的基因，为空质粒。2）限制性酶切鉴定利用插入目的基因时所用的限制性内切核酸酶消化重组质粒，若能产生对应大小的DNA片段，重组质粒含有目的基因；反之不含目的基因，为空