苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的筛选

《苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

密级：论文编号：中国农业科学院学位论文苹果抗再植病真菌病害相关基因ＭｒｄＣＪＥＲＫ１的克隆及其互作蛋白的筛选ＣｌｏｎｉｎａｎｄＩｎｔｅｒａｃｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｒｅｅｎｉｎｏｆａｎＡｌｅＲｅｌａｎｔｇｇｇｐｐｐＤｉｓｅａｓｅＦｕｎａｌＰａｔｈｏｅｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＧｅｎｅＭｄＣＥＲＫ１ｇｇ博士研究生：周喆指导教师：丛佩华研究员申请学位类别：农学博士专业：果树学研究方向：果树遗传育种培养单位：果树研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的筛选CloningandInteractingProteinScreeningofanAppleReplantDiseaseFungalPathogenResistanceAssociatedGeneMdCERK1博士研究生：周喆指导教师：丛佩华研究员申请学位类别：农学博士专业：果树学研究方向：果树遗传育种培养单位：果树研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCloningandInteractingProteinScreeningofanAppleReplantDiseaseFungalPathogenResistanceAssociatedGeneMdCERK1Ph.D.Candidate：ZhouZheSupervisor：PeihuaCongResearcherMajor：PomologySpecialty:FruitTreeGeneticsandBreedingJune2018 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日I 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表苹果抗再植病真菌病害相关基因MdCERK1的克隆及其互作蛋白的论文题目筛选论文作者周喆专业果树学研究方向果树遗传育种指导教师丛佩华培养单位（研究所、中心）果树研究所硕（博）姓名职称单位专业签名导师硕导□评博导□硕导□阅博导□人硕导□博导□答辩硕导□主博导□席硕导□博导□硕导□博导□答硕导□博导□辩硕导□博导□委硕导□博导□员硕导□博导□硕导□博导□会议记录（秘书）论文答辩时间地点II 摘要苹果再植病是一个复杂又难以解决的历史性问题，也是保障我国苹果产业可持续健康发展必须解决的问题。筛选抗重茬苹果砧木品种是目前防治苹果再植病最为环保且有效的途径。开展苹果砧木中参与调控抗再植病相关基因的筛选及作用机制研究，对于通过基因工程手段选育苹果再植病抗性砧木具有重要意义。以往研究表明，苹果再植病的关键发病因子主要是真菌，几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分。模式植物研究结果显示，植物的几丁质受体蛋白可通过识别几丁质而触发植物的免疫反应，从而对随后的病原菌侵染表现出抗性。本研究借鉴了模式植物的研究成果，通过生物信息学分析，结合两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种（G.935与B.9）的转录组分析结果，成功获得了抗苹果再植病相关基因MdCERK1，并通过qPCR、pull-down及质谱测序等技术对该基因的表达特性及相互作用蛋白进行了筛选，获得了以下主要的研究结果：1.使用Pythiumultimum分别对两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种进行侵染，通过RNA-seq筛选差异表达基因来获得在苹果再植病抗病中起关键作用的目标基因。因为CERK(chitinelicitorreceptorkinase)基因包含的胞外LysM（lysinmotif）结构域，对几丁质的识别具有特异性。理论上，CERK基因对苹果再植病真菌性病原菌具有广谱抗性，具有很高的研究意义和应用价值，所以我们选择其作为进一步研究的目标基因。2.在利用qPCR研究基因表达时，需要内参基因对实验过程进行校正，而当前有关苹果根组织响应不同胁迫条件后的基因表达尚少有研究。所以我们利用了我们的转录组数据，选择了10个表达水平变化最小的基因和5个之前有过报道的内参基因。然后采用DeltaCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper等分析方法对这15个基因在不同实验条件与不同基因型根组织中的稳定性进行了分析。结果表明，MDP0000095375、MDP0000147424、MDP0000233640、MDP0000326399和MDP0000173025等5个基因无论是非生物胁迫还是生物胁迫条件下都较为稳定，可以用作相关研究的内参基因。3.利用已公布的苹果基因组数据库GDR和TheAppleGenomeandEpigenome，鉴定苹果LysM基因家族成员。通过系统的鉴定，共得到30个苹果LysM家族成员。使用在线工具ExPASyProteomicsServer对MdLysM蛋白的基本信息进行预测。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C三组，且C组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚族，说明它们的功能可能已经发生了分化，基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。MdLysM蛋白结构域预测的结果及基因结构分析的结果均与进化树聚类结果吻合。序列相似性及对MD09G1111800的基因组结构、结构域组成的序列分析以及其对外源几丁质的响应等结果显示，MD09G1111800是AtCERK1的同源基因，因此我们将其命名为MdCERK1。4.组织特异性表达分析显示，相比花、果实、种子等组织来说，MdCERK1还是主要在根、叶等营养组织中表达。立枯丝核杆菌侵染的苹果根组织中MdCERK1的转录调控模式证明，MdCERK1是一个功能性模式识别受体（patternrecognitionreceptorprotein，PRR）。pull-down结果显示，GST-MdCERK1具有几丁质分子绑定能力，进一步从生化角度上证明了其就是苹果中的几丁质受体蛋白基因。其在不同抗性品种均能响应病原侵染，但是调控模式存在差异。5.使用pull-down联合质谱筛选到MdCERK1可能的互作蛋白PR4，进一步解析MdCERK1的抗病信号转导机制。III 综合以上所有的数据，得到结论，MdCERK1是一个几丁质绑定受体类激酶，主要在苹果营养器官中发挥作用，并且在响应苹果再植病病原菌侵染中发挥重要作用。关键词：苹果再植病，MdCERK1，几丁质，LysMIV AbstractApplereplantdisease(ARD)isahistoricalproblemwhichiscomplicatedandhardtosolve,atthesametime,itisalsoaproblemneededtobesolvedtoensurethesustainableandhealthydevelopmentofChina'sappleindustry.Fornow,screeningofappleARDresistantrootstocksisthemostenvironmentallyfriendlyandeffectivewaytopreventARD.ItisofgreatsignificancetocarryoutresearchaboutselectinggenesinvolvedinARDregulationandeluciadatingtheirdiseaseresistancemechanism.AlltheseresearchworkwillcontributetoprovidingtheoreticalbasisforbreedingARDresistantapplerootstocksthroughgeneticengineeringmethods.ThereisresearchresultsshowedthatfungiarethekeydiseasefactorforARD,whosevirulenceisdirectlycontrolledbychitin.Inmodelplants,chitinreceptorproteinscanrecognizechitin,triggerimmuneresponsesandthusshowingresistancetosubsequentpathogeninfections.Ourresearchtookmodelplants’researchresultsasreferences,usingbioimfomaticanalysisandsuccessfullyobtainedanARDassociatedgeneMdCERK1.qPCR,pull-downcoupledwithnanosprayLC/MS/MSanalysiswereusedforgeneexpressionspecificityidentificationandintereactingproteinscreening.Themainresultsareasfollows:1.AfterverifyingthatG.935andB.9havedifferentresistancetowardsARD,Pythiumultimumwasusedtoinoculatethetwocultivars.ThentheRNA-seqwasemployedtoscreenthetargetgenesfunctionedinrespondingtoARDthroughfindingdifferentialexpressedgenes.Amongaseriesofcandidategenes,theCERK(chitinelicitorreceptorkinase)waspicked.CERKcontainsanextracellularLysM(lysinmotif)domain,whichcanspecificallyrecognizechitin.Theoretically,CERKgeneshouldberesistanttoaboardspectrumoffungalARDpathogens,andthushashighresearchsignificanceandapplicationvalue.2.WhenusingRT-PCRtostudygeneexpressionpatterns,areferencegeneisneededfornormalization.Whilegeneexpressioninapplerootsinresponsetovariousstressconditionsisaless-exploredresearchsubject,itisnecessarytohaveanappropariatereferencegeneforrelevantexperimentstoyieldanaccurateresult.WetookadvantageofourRNA-seqdata,asetof10applegeneswasselectedbasedontheirlowvarianceofgeneexpressioninappleroottissues.Fivepreviouslyreportedapplereferencegenesfromothertissuetypeswerealsoincluded.Fourmethods,DeltaCt,geNorm,NormFinderandBestKeeper,wereusedtoevaluatetheirstabilityinappleroottissuesofvariousgenotypesandunderdifferentexperimentalconditions.Asmallpanelofstablyexpressedgenes,MDP0000095375,MDP0000147424,MDP0000233640,MDP0000326399andMDP0000173025wererecommendedfornormalizingquantitativegeneexpressiondatainapplerootsundervariousabioticorbioticstresses.3.BasedonapplegenomedatabaseGDRandTheAppleGenomeandEpigenome,theLysMfamilygeneswereidentified.Asumof30LysMgeneswasidentifiedsystematicallyinapple.ExPASyProteomicspredictServerwasusedforthepredictionofthebasicinformationofMdLysMproteins.Accordingtothephylogeneticanalysis,30MdLysMproteinscanbeintothreegroups(groupA,BandV C),ofwhichgroupCwasdividedintothreesubgroupsaccordingtothephylogenyrelationshipandgenestructures;thisimpliesthatfunctiondifferentiationmayhavehappened.Thepredictedresultsoftheproteindomainswerecongruentwiththeclusteringinphylogenetictree.Sequenceanalysisonthegenomicstructure,domaincompositionandtranscriptionalresponsetoexogenouschitintreatmentindicatedthatMD09G1111800istheorthologAtCERK1andwasthereforenamedasMdCERK1.4.TissuespecificexpressionpatternsindicatedthatMdCERK1isprimarilyfunctionalinvegetativetissuesofleafandroot,ratherthanflower,fruitandseedofappleplant.ThetranscriptionalregulationpatternsinresponsetoinfectionbyRhizoctoniasolanidemonstratedthatMdCERK1isafunctionalpatternrecognitionreceptorprotein(PRR)inappleroottissues.TheabilityofpurifiedGST-MdCERK1fusionproteintobindchitinmoleculesaddedbiochemicalevidencesforitsroleasachitinbindingreceptor.MdCERK1canresponsetopathogeninoculationinalltestedgenotypes,butitsregulationpatternsaredifferent.5.Non-targetproteomicapproachwasalsoemployedforidentifyingitsputativeinvivointeractingpartnersfromappleplantcells,whichsujgeststheexistenceofafunctionalreceptorcomplexbetweenMdCERK1andPR4.ThesedatasupporttheconclusionthatMdCERK1isachitinbindingreceptorkinasefunctioninginapplevegetativetissues,whichplaysanimportantroleindefenseactivationinresponsetopathogeninfection.Keywords:ARD,MdCERK1,chitin,LysMVI 目录第一章引言...................................................................................................................11.1苹果再植病研究进展..................................................................................................11.1.1苹果再植病的危害及发病原因...........................................................................11.1.2苹果再植病的防治方法.......................................................................................31.2植物模式识别受体......................................................................................................51.2.1植物识别病原菌的两道防线..............................................................................51.2.2细菌主要PAMP分子的识别机制.......................................................................61.2.3真菌和卵菌PAMP分子的识别机制...................................................................71.2.4模式识别受体下游信号转导..............................................................................91.3本研究的意义............................................................................................................10第二章试验材料和方法.................................................................................................112.1试验植物材料............................................................................................................112.2试验方法....................................................................................................................112.2.1苹果再植病抗病候选基因筛选.........................................................................112.2.2苹果根部材料实时荧光定量的内参基因筛选.................................................132.2.3苹果LysM基因家族成员鉴定及生物信息学分析..........................................162.2.4苹果MdCERK1的确定及鉴定..........................................................................162.2.5MdCERK1-GFP重组载体的构建及其在洋葱表皮细胞中的表达..................192.2.6几丁质亲和性实验.............................................................................................212.2.7转录水平检测MdCERK1对RhizoctoniasolaniAG-5的响应.......................222.2.8蛋白组学鉴定病原菌侵染条件下MdCERK1的互作蛋白.............................222.2.8.1诱饵蛋白GST-MdCERK1的制备.................................................................222.2.8.2捕获蛋白的制备..............................................................................................232.2.8.3MdCERK1互作蛋白筛选................................................................................23第三章试验结果...............................................................................................................253.1砧木品种G.935和B.9对苹果再植病的抗性差异鉴定.........................................253.2特异性响应P.ultimum侵染的目标基因的确定.....................................................283.3根据苹果根转录组数据筛选候选内参基因............................................................283.3.1对RNA-seq数据进行筛选的参数和筛选结果................................................28VII 3.3.2引物特性、扩增效率及候选基因的表达水平.................................................303.3.3使用geNorm对候选基因稳定性进行评估......................................................323.3.4四种基因表达稳定性评估方法结果的综合分析.............................................333.3.5利用目标基因校验内参基因可信度.................................................................343.4苹果LysM基因家族的生物信息学分析.................................................................373.4.1MdLysM家族基因成员鉴定...............................................................................373.4.2苹果LysM家族成员系统进化及基因结构分析..............................................383.4.3苹果中LysM基因的染色体定位......................................................................413.5MdCERK1基因的鉴定、序列分析及其组织表达特异性...................................413.6MdCERK1的几丁质绑定能力验证......................................................................453.7MdCERK1的亚细胞定位......................................................................................453.8MdCERK1对Rhizoctoniasolani的响应...............................................................473.9MdCERK1互作蛋白鉴定......................................................................................483.10MdCERK1的互作蛋白响应几丁质处理后的表达水平....................................49第四章讨论...................................................................................................................51第五章全文结论.............................................................................................................54参考文献.............................................................................................................................55附录.................................................................................................................................67致谢.................................................................................................................................68作者简历.............................................................................................................................69VIII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称ARDAppleReplantDisease苹果再植病AGAnastomosisGroup菌丝融合群PAMPPathogen-associatedMolecularPattern病原相关分子模式PTIPAMP-triggeredImmunity病原相关分子模式触发的免疫PRRPattern-recognitionReceptor模式识别受体RLKReceptorLikeKinase受体类激酶RLPReceptorLikeProtein受体类蛋白ROSReactiveOxygenSpecies活性氧2+CDPKCa-dependentProteinKinase钙离子依赖蛋白激酶MAPKMitogen-activatedProteinKinase裂原激活蛋白激酶ETSEffector-triggeredSusceptibility效应因子触发的易感性ETIEffector-triggeredImmunity效应因子触发的免疫HRHypersensitiveResponse过敏反应EF-TuElongationFactorTu延伸因子LRR-RLKLeucine-richRepeatReceptor-likeKinase富亮氨酸重复受体类激酶PGNPeptidoglycan肽聚糖CERKChitinElicitorReceptorKinase几丁质激发子受体类激酶GBPBeta-glucan-bindingProtein葡聚糖绑定蛋白SERKSomaticEmbryogenesisReceptor-likeKinase体细胞胚胎发生受体类激酶GEFGDP/GTPExchangeFactorGDP/GTP交换因子FRETForsterResonanceEnergyTransfer共振能量转移HspHeatShockProtein热激蛋白90TUBβ-tubulinβ-微管蛋白UBQPolyubiquitin多聚泛素GAPDHGlyceraldehyde3-phosphateDehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶ACTβ-actinβ-肌动蛋白TUAα-tubulinα-微管蛋白UBCUbiquitin-conjujatingEnzyme泛素连接酶CTABCetyltrimethylammoniumBromide溴化十六烷基三甲铵DEPCDiethyPyrocarbonate焦碳酸二乙酯EDTAEthylenediaminetetraacetic乙二胺四乙酸二鈉IX 续表英文缩写英文全称中文名称CVCoefficientVariance变异系数SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelSDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳ElectrophoresisGSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽S-转移酶CRECis-regulatoryElement顺势作用元件PRPathogenesis-relatedProtein病程相关蛋白GFPGreenFluorescentProtein绿色荧光蛋白Cpn60β2Chaperonin60SubunitBeta2分子伴侣60亚基β2NFRhizobialNodulationFactor结瘤因子CFUColony-formingUnit菌落形成单位X 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言1.1苹果再植病研究进展1.1.1苹果再植病的危害及发病原因1.1.1.1苹果再植病害的危害苹果再植病害（Applereplantdisease，ARD）指的是在曾经栽种过苹果或相似树种的果园里再次种植苹果幼苗而导致的新树长势弱甚至死亡的现象。从最早有相关再植病的记载至今，已有超过200年的历史(Mai&Abawi,1981)。其中发病时间最快的，可在再植后一年内出现症状(Pitcheretal.,1966)。发病植株表现出发育迟缓、树冠小、节间缩短、顶端萌发受阻、叶片颜色浅、根系统发育不良、变色、根尖坏死、产量降低等病征(Granatstein&Mazzola,2001,贾克功,1995)。苹果作为世界范围内最重要的果树之一，所有主要的苹果产区包括中国(Hongkeetal.,2009,于继洲etal.,2004)、北美（Mazzola,1998,Braun,1991,Jaffeeetal.,1982,Traquair,1984）、欧洲(Manicietal.,2002,Wennekeretal.,2012)、南非(vanSchooretal.,2009)等，都有对苹果再植病发病的记录和报道(Pitcheretal.,1966)。苹果再植病对果园产量的影响十分持久，发病果园通常比正常无病果园要晚结果2至3年，且结果量显著低于无病果园。以美国华盛顿州为例，由于当地无法对苹果再植病进行有效的控制，导致在十年的时间里，该州每公顷的苹果园损失高达4万美元。我国是苹果生产大国，苹果栽培面积（3450万亩，2016）和产量（4380万吨，2016）均位居世界第一。然而，我国有将近70%的果园建园都已经超过20年，许多主要的苹果产区都步入了由盛果期逐渐走向衰退的阶段。当前，我国每年约有超过1.4万公顷的果园需要更新，苹果再植病害已成为限制我国苹果持续健康发展的最主要问题之一。1.1.1.2苹果再植病的发病原因在过去的几十年中，人们关于苹果再植病开展了大量的研究，一般来说，引起苹果再植病的因素可以分为非生物因素和生物因素两类。1.非生物因素早期的时候，人们将再植病归咎于诸多的非生物类因素，例如pH过高或过低、植物毒素（根皮素、苦杏苷、根皮苷等）、土壤养料匮乏、土壤结构差、排水不良、重金属污染、干旱、冻害等(Traquair,1984）。然而试验观察发现，使用相同土壤栽植的其他果树却长势良好，并没有出现类似的生长问题(Mai&Abawi,1981)。人们在再植果园中引入土壤熏蒸，熏蒸过的区域和未熏蒸过的区域表现出极大的不同，熏蒸显著的改善了果树长势(Mai&Abawi,1981)。随后，土壤熏蒸开始兴起。2.生物因素引起苹果再植病的生物因素主要包括细菌、真菌、卵菌和线虫等(于继洲etal.,2004)。土传微生物因为参与土壤矿质营养释放、植物抗病以及植物病害，因此被认为是土壤功能非常重要的1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言组成成分(Zhangetal.,2013)。早期的研究最先发现了线虫参与苹果再植病发病(Wennekeretal.,2012,Pitcheretal.,1966,杨兴洪etal.,1994)。现在已知的线虫有8万多种，是世界上数量最多的多细胞动物，其中靠寄生在植物中生存的有2500余种。在众多的植物寄生性线虫中，能引起苹果树体根部损伤进而给果园带来损失的线虫主要有三种：根腐线虫、根结线虫与剑线虫。与苹果再植病发病有关的根腐线虫主要是穿刺根腐线虫（Pratylenchuspenetrans）、草地根腐线虫(Pratylenchuspratensis)、和Pratylenchus.vulnes。根腐线虫利用自身锋利的口针刺穿植物根部，取食皮层组织或在皮层组织中迁移运动，使皮层组织出现隧道状伤口。当寄主被破坏到一定程度后，根腐线虫便从受病组织中游出，向新的寄主根靠拢。他们在果树根部生存并繁殖，使被侵染的根组织更容易被土壤真菌侵染，严重时可能导致根大面积坏死从而无法为地上部分供给养料。与苹果再植病发病有关的根节线虫主要是根瘤线虫（Meloidogynespp.）(Magarey&Bull,1998)，属于植物内寄生性线虫。它们一旦进入植物根部，寻找到适宜生存的部位后便不再离开植物体。它们这种寄生方式严重损害了果树根部功能，被害根部因细胞的巨型化而形成肿瘤，阻断了根部养分和水分摄取(Elling,2013)。与苹果再植病发病有关的剑线虫主要是属于迁移性内寄生的美洲剑线虫（Xiphinemaamericanum）(Isutsa&Merwin,2000)。它们是病毒常见的载体，在利用口针刺穿根表皮细胞的同时，也将病原菌引入果树体内。尽管研究表明线虫可以诱发苹果再植病，但研究人员一致认为线虫仅仅是引发再植病的部分原因，还有其他病原菌参与发病。土壤中的各类真菌和卵菌被认为是引起苹果再植病的关键因子(Mazzola&Manici,2012)。根据土壤类型、栽植作物以及栽培方式的不同，真菌和卵菌之间可以形成不同的根腐病害系统（rootrotcomplex）。参与形成病原菌复合体的卵菌包括腐霉属（Pythium）和疫霉属（Phytophthora）。腐霉菌属于腐生卵菌，它包含几个兼性植物病原菌的种，可以单独或和其他微生物以复合体的形式造成严重的作物减产(Levesque&DeCock,2004)。被鉴定具有致病力且与苹果再植病有关的腐霉菌主要包括紫堇腐霉（P.intermediumdeBary）、畸雌腐霉（P.irregulareBuisman）、P.sylvaticumCampbell&Hendrix、终极腐霉（P.ultimumTrow）、钟器腐霉（P.vexansdeBary）(Jaffeeetal.,1982,Mazzola,1998,Tewoldemedhinetal.,2011b,Mazzola,2002)。大多数的疫霉种是植物病原菌，可以对包括苹果在内的许多种类的树木造成严重伤害。真菌中，因为柱孢菌属（Cylindrocarpon）、镰刀菌属（Fusarium）和丝核菌属（Rhizoctonia）等3个属在不同的再植地点频繁的被发现，所以被认定在引起苹果再植病发病中起关键作用(Tewoldemedhinetal.,2011a,Keldereretal.,2012,王树桐etal.,2011,刘志,2013)。柱孢菌属包含约125个种，通常被认为是致病力很弱的一类病原菌。在苹果上，引起根部病害的主要是C.destructans(Zinnsm.)Scholten(Mazzola,1998,Dullahideetal.,1994,Manicietal.,2002)。镰刀菌属包括超过70个种，在全世界广泛分布。其中许多种存在于土壤生态系统中，在根际或/和植物体内定殖(Leslie&Summerell,2006)。镰刀菌属作为经常从发病苹果根部被分离的真菌之一，其与植物之间的互作关系种类繁多，从高度致病到促进植物生长。所以尽管被分离鉴定到的次数多，但大多数并没有致病性，所以镰刀菌属是否是苹果再植病的致病菌还存在争议。丝核杆菌属是一个组成比较多样的属，根据其每个菌丝细胞中细胞核的数量不同，它可以被分成多核丝杆菌和双核丝杆菌(Yamamoto&Uchida,1982,Snehetal.,1991)。分离株根据它们与已知测试分离株的菌丝相容性进一步的被划分为不同的菌丝融合群2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言（anastomosisgroups,AGs）(Carlingetal.,2002)。丝核杆菌属的真菌中包含一部分具有重要经济价值的土传病原菌，但是也有不小的一部分病原菌作为腐生菌或以与植物菌根的形式存在(Snehetal.,1991)。苹果上，有部分多核和一小部分双核立枯丝核菌融合群(RhizoctoniasolaniKühnAGs)因能导致严重的根腐甚至再植苹果树死亡而被鉴定为致病菌(Mazzolaetal.,1997)。除此之外，与苹果再植病有关的真菌还包括：Torulomyceslagena、Trichodermahamatum、被孢霉(Mortierellasp.)发光假密环菌(Armillariellatebescens)、伏革菌(Corticiumgalactinum)、蜜环菌(Armillariamellea)、Peniophorasacrata、Clitocybetabescens、白羽纹菌（Rosellinianecatrix）等。对于苹果来说，在所有真菌和卵菌中致病性最强的是立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）和腐霉菌（Pythiumspp.）(Sunetal.,2017)。关于细菌在苹果再植病发病中作用的研究相较真菌而言要少的多，而且它们在其中起到的作用还是存在争议(Pitcheretal.,1966,Mazzola,1998,Dullahideetal.,1994,Hoestra,1968)。尽管有研究结果显示，参与苹果再植病的细菌包括放线菌属（Actinomycetes）、芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞杆菌属（Pseudomonas），但是只有枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）分离株表现出了对植911物生长的抑制作用。而且，此研究中所使用的细菌接种浓度高达8.8x10至1.2x10个菌落形3成单位/500cm土样。任何细菌的浓度在到达如此高度时，都会对植物生长和发育起到抑制作用(Schaadetal.,2001)。一部分放线菌，特别是链霉菌属（Streptomyces）的放线菌，可以缓解立枯丝核菌R.solaniAG-5菌丝融合群对根部的侵染。但其中也存在一部分分离株，其自身就可引起叶片坏死以及苹果幼苗根部发育不良(Zhaoetal.,2009)。以上这些证据都说明了，苹果再植病更多的体现的是一种生物类的效应。1.1.2苹果再植病的防治方法1.1.2.1农业措施果园覆草是欧美和日本等国家广为采用的生物改良方法。传统的覆草方法是树行不覆草，树间种植草皮。果园覆草不仅能改善土壤肥力、土壤结构、土壤质量、控制杂草，它对土壤生物学和果树生长的也有一定的影响(Hoaglandetal.,2008,McDonald,2007,Merwinetal.,1996,Merwinetal.,1995,Sánchezetal.,2007)。对于防治线虫来说，主要是通过使用非寄主植物或种植能够产生直接抑制线虫化感物质（allelochemicals）的植物来控制，效果已得到广泛的验证。例如，对果园覆草原草（prairiegrass）或者燕麦后，苹果长势良好。虽然之后又有研究鉴定了一系列能抑制线虫的覆盖作物，但是它们减轻再植病发病的能力是具有果园特异性的(Merwin,1995,Pruyneetal.,1994)。此外，研究还发现，种过小麦的土壤形成的土壤微生物群落，可以抑制由R.solaniAG-5引发的苹果病害，并在多个再植果园都得到了验证(Mazzola&Mullinix,2005)。尽管这些农业措施的效果对于抵抗某一种或几种病原菌的效果明显，但由于仍旧局限于有限的病原菌种类，而且轮作耗时过久，在生产中应用价值还有待进一步研究。1.1.2.2土壤消毒土壤消毒的方法主要分为化学方法和物理方法两类。土壤熏蒸是化学防治中最有效的方法，3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言其引入始于十九世纪八十年代。由于最初对苹果再植病发病原理的不确定，防治的方法主要依赖于生物性广谱土壤杀菌剂，例如甲基溴（methylbromide）等(Mai&Abawi,1981)。甲基溴在过去的几十年中，一度被认为是最有效、最为广泛使用的防治苹果再植病的熏蒸剂。虽然广谱熏蒸剂能够有效的控制再植病，但其应用起来难度大、成本高、对人体和环境都存在潜在危害。有些挥发性的熏蒸剂的作用效果有时候还会受到温度和土壤湿度的影响。更重要的是，土壤熏蒸破坏了病原菌和拮抗微生物之间的天然平衡(Baker&Roessler,1957,Munnecke,1984)。1993年，美国环保署（U.S.EnvironmentalProtectionAgency，EPA）宣布甲基溴属于消耗大气臭氧层的物质。与此同时，联合国环境规划署在蒙特利尔议定书中确定了逐步淘汰甲基溴的时间表。一些科学家尝试使用物理熏蒸，对苹果果园进行土壤巴氏消毒，虽然目标微生物的数量减少，植物长势有所提高，但无法消除非生物类因素的影响，果树仍旧存在发育迟缓的问题(Hoestra,1968,Jaffeeetal.,1982,Tewoldemedhinetal.,2011a)。随着对苹果再植病研究的不断深入，大部分的研究都表明，真菌是整个土壤微生物生物量中所占比例最大的组分，病原真菌实际上是苹果再植病的主要诱因(Mazzola,1998,Browneetal.,2006,Savory,1969,Savory,1966)。栽植在再植土壤中的苹果根部分离出来的常见的真菌对杀菌剂表现出不同敏感度，喷施一种或几种真菌杀菌剂均可以在一定程度上提高果树长势。例如，苯菌灵可以抑制C.destructans、Fusariumspp.、Trichoderma生长，甲霜灵可以抑制Phytophthora和Pythiumspp生长，甲醚苯环可以抑制Trichodermaspp.和C.destructans生长，咯菌腈可以抑制R.solaniAG5生长(Mazzola,1998)。虽然果园可以有针对性的喷施杀菌剂，但是效果并不理想，无法达到甲基溴的作用效果，而且对人体健康和环境仍旧存在危害。1.1.2.3生物防治不像土壤消毒需要巨额投入购买杀菌剂，也不会对人、非目标物种以及环境产生毒害影响，生物防治成为一项很好选择。它更安全、更容易生物降解、推广起来费用更低。土壤有机质是土壤抑病性的一个主要组分，所以提高土壤有机质含量是控制苹果再植病的可行方法之一。很多研究都证明，使用堆肥或者有机废料作为土壤改良剂来提高土壤有机质含量，可以有效控制土传疾病。常见的有机土壤改良剂种类繁多，从动物粪便到加工动、植物产品产生的废物，都可以用作土壤改良。堆肥的种类和土壤的来源不同，对疾病的控制以及真菌、细菌菌落的形成有着不同的影响。例如，加入新鲜的废料或者绿肥后，土壤中的碳含量升高，使得Pythium、Rhizoctonia等一部分土传病原菌数量短期内增加；而如果使用高度降解或者腐殖化的堆肥，它们在提高土壤有机质含量的同时，也不会产生包括土传病原菌含量增高或植物可用硝酸盐含量降低等副作用。这种堆肥的使用，虽然在一定程度上提高了土壤的质量，但是从短期内控制苹果再植病来说，效果捉摸不定，难以预测它对土壤功能到底有怎样的影响。堆肥作为苹果再植病短期防治方法因为局限性而对其相关研究逐渐减少。除了堆肥之外，其他一些组分相对明确的有机废料也可以用作土壤改良剂。例如，十字花科植物的残留物。十字花科植物可以产生硫代葡萄糖苷（glucosinolates），硫代葡萄糖苷在水解的时候可以产生异硫氰酸酯（isothiocyanates，ITCs）等生物活性物质(Angusetal.,1994,Brown&Tworkoski,2004)。相对于绿肥，此类的有机废料非常容易获取，榨油过程后产生的大量菜籽残渣4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言就可以用来加工土壤改良剂。和绿肥相比，十字花科菜籽粕的优点在于可以控制使用的比例，可以被用作有机肥料，可以根据生物群落有选择性的调整组分(Reardon&Mazzola,2010,Cohen&Mazzola,2006)。研究表明，掺入芜菁（Brassicarapa）或甘蓝型油菜（Bnapus）籽粕后的土壤中，病原菌生长的速度和野草的生物量都显著降低，且掺入菜籽粕的数周或数月后，可以观察到土传病原菌得到控制。芥菜型油菜（B.juncea）籽粕可以长期抑制由Pythiumabappressorium引发的苹果根部感染(Weerakoon,2011)，对R.solani发病也有抑制作用。在加入芥菜型油菜籽粕后的24h内，它靠产生挥发性烯丙基异硫氰酸酯（allylisothiocyanate，AITC）来调控，AITC的产生使得真菌菌落组成发生巨大改变，促进抑病型土壤形成。与此同时，由于真菌种群显著的改变，对控制线虫也有促进作用。1.1.2.4抗性砧木的选择不同基因型的苹果砧木形成的根际微生物不同，对不同土传病原菌的感病力也有所不同。寄主的遗传背景影响着其根际微生物群落的丰度和组成。一个抗性的砧木本身就具有有效的防御机制，所以可以抑制病原菌数量增加。苹果抗病砧木选育最著名的是由康奈尔大学和美国农业部农业科学研究所联合主持的Geneva®苹果砧木育种计划。该计划始于1968年，致力于选育抗病、高产的苹果砧木。到目前为止，该项目选育出的对苹果再植病具有抗性的砧木包括G.41、G.214、G.935、G.969、G.210、G.890等。有田间实验表明，对土壤进行熏蒸，只有在果园起步的2-3年内促进植物生长的效果显著，随后效果逐渐削弱至完全消失。但是利用砧木固有的遗传耐受性或抗病性，这种抗病的效果会一直存在。所以综合比较各种防治苹果再植病的方法，选育抗病的砧木是目前为止最有效的方法。1.2植物模式识别受体1.2.1植物识别病原菌的两道防线与实验室生长在无菌环境下的植物不同，自然界里健壮的植物都是聚集生长，并且和大量的、不同类型的微生物之间存在相互作用，其中包括细菌、真菌、卵菌等。所有的这些微生物被统称为植物微生物群（plantmicrobiota）。植物的一部分生态位（Ecologicalniche），最典型的代表就是根际，组成性的聚集着一个巨大的微生物群落。这些定殖微生物对寄主适应性（hostfitness）的影响严格的依赖于其适应宿主环境的方式。共生关系（symbiosis）代表寄生关系对微生物与植物双方都有积极的影响。如果两者中只有其中之一受影响，另一方没有明显变化，则两者的关系被称为植物-微生物共生体（plant-microbeassociations）。还有一种情况是，定殖的微生物和宿主植物存在对抗性，对宿主产生损伤，这样的微生物通常就被称作病原菌。侵染性病原菌最终能否在具体的寄主环境中处于优势，完全取决于其病毒因子能否成功的侵入宿主、能否产生稳定的侵染结构、能否抑制宿主的防御系统、干扰宿主微生物养分吸收甚至抑制宿主其增殖。因为植物固着生长，无法像哺乳动物可以通过有效地移动来躲避外界侵害，所以植物的根、茎、叶、花、果甚至维管束系统都成为了微生物侵袭的目标。另外，由于植物本身缺少一个循环免疫系统，所以它们基本上是依靠每一个单独的细胞触发5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言先天免疫反应来对抗潜在的病原微生物。植物的免疫系统包含病原相关分子模式（pathogen-associatedmoleculepattern,PAMP）触发的免疫（PAMP-triggeredimmunity,PTI）与效应因子（effector）触发的免疫（effector-triggeredimmunity,ETI）两个进化上相关的分支。其中，PAMP指的是植物能通过位于细胞表面的模式识别受体（pattern-recognitionreceptors,PRRs）识别微生物表面结构保守、鲜有变异的病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs），然后将识别这些异己的信号传递到胞内，激活对抗病原微生物的反应并限制病原菌的生长。其在进化上更原始，被认为是植物最早的免疫反应。现有已知的植物PRRs分为两大类：一类是受体类激酶（receptorlikekinase,RLK），它是一类单向跨膜蛋白，通常包含一个参与配体绑定的胞外富亮氨酸重复结构域、一个跨膜结构域和一个胞内激酶结构域；PAMP因子被识别后，最先监测到的反应有细胞膜2+上离子通量迅速改变、胞质Ca水平上升、胞外产生活性氧（reativeoxygenspecies,ROS）(Boller2+2+&Felix,2009)。紧接着，Ca依赖性蛋白激酶(Ca-dependentproteinkinase，CDPK)和裂原激活蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）级联反应相继活化并将免疫信号传递到细胞核，从而在转录水平上重编程以建立PTI。另一类是受体类蛋白（receptorlikeprotein，RLP），除了缺少胞内激酶结构域外，它和RLK的结构基本相同(Shiu&Bleecker,2001)。因此，RLPs通常需要依赖受体类激酶辅助其将识别的抗病信号传递至胞内。配键识别和进一步的PRR复合体活化后，一系列的信号转导级联反应在数min内就可以启动，推动相应的局部和系统性的防御反应，有些反应甚至可以持续数日(Boller&Felix,2009)。为了压制植物的第一道防线，病原菌进化出了一系列相应的对策，一个是入侵识别系统，一个是抑制下游信号转导。多数情况下，病原菌抑制PTI主要依靠于分泌有毒性的effectors，引起效应因子触发的感病性（effector-triggeredsusceptibility，ETS）。而在与病原菌斗争的过程中，植物不断进化产生能够直接或间接的识别效应因子的核苷酸绑定富亮氨酸重复蛋白(nucleotide-bindingdomainleucine-richrepeatproteins，NBS-LRR，NLR)抗性蛋白（resistantproteins，Rproteins）。通过R蛋白识别effectors而触发的免疫反应被称为效应因子触发的免疫（effector-triggeredimmunity，ETI），也被叫做基因对基因抗性（gene-for-generesistance），在植物免疫中起着十分重要的作用。在植物与病原菌漫长的协同进化过程中，不断的有新的能特异识别效应因子的NLR形成，因此NLR基因组成了开花植物中进化最快的基因家族。ETI时常伴随着局部细胞死亡，也被称作过敏反应（hypersensitiveresponse，HR）。在过去的一个世纪里，对于植物免疫的研究主要都集中在引起破坏性植物疾病的病原微生物和只能针对有限植物种类提供特定防护的R（resistance）基因上(Dodds&Rathjen,2010)。相较ETI，关于PTI的研究相对有限。但是近年来，科学家们逐渐意识到PTI对病原菌的抗性具有广谱、持久的特点，所以越来越多的人开始投入到PTI的研究当中。1.2.2细菌主要PAMP分子的识别机制1.2.2.1鞭毛蛋白的识别FLS2（FLAGELLIN-SENSING2）识别细菌鞭毛蛋白，是植物中发现并鉴定的第一对PAMP/PRR。FLS2是一个富亮氨酸重复受体类激酶（leucine-richrepeatreceptor-likekinase，LRR-RLK）(Chinchillaetal.,2006)。FLS2可以识别鞭毛蛋白N端一个由22个氨基酸残基组成的、6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言高度保守的肽段——flg22(Felixetal.,1999)。FLS2最早是在模式植物拟南芥中被鉴定的(Gómez-Gómez&Boller,2000)。Flg22可以被许多高等植物识别(Boller&Felix,2009)。烟草（Nicotianabenthamiana）、水稻(Oryzasativa)、西红柿(Solanumlycopersicum)、葡萄藤(Vitisvinifera)中也都已鉴定到了拟南芥FLS2功能性同源蛋白。拟南芥FLS2突变体更容易受到病原细菌Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000(PtoDC3000)的侵染(Zipfeletal.,2004)。NbFLS2沉默型本氏烟对一系列细菌的感病性增强(Hann&Rathjen,2007)。1.2.2.2延长因子（elongationfactorTu，EF-Tu）的识别拟南芥LRR-RLKERF(EF-Tureceptor)识别细菌EF-Tu是另外一对研究较多的PAMP/PRR。ERF可以直接识别EF-Tu在N端乙酰化的包含18个氨基酸的肽段elf18(Zipfeletal.,2006,Kunzeetal.,2004)。EF-Tu具有一个典型的PAMP因子应有的所有特征：丰度高、序列高度保守、对微生物生存至关重要。它和FLS2同属于LRRXII亚组(Zipfeletal.,2006)。拟南芥efr突变体对根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）和PtoDC3000的感病性增强(Zipfeletal.,2006)。植物中仅有十字花科的植物具有识别elf18的能力(Boller&Felix,2009)。但是如果通过转基因手段，让ERF在其他植物中表达，目标植物也因此具有elf18的识别能力。所以，可以通过植物科间进行PRR转基因来提高植物抗病能力。1.2.2.3肽聚糖（peptidoglycans，PGNs）的识别PGN是细菌细胞壁的重要组分(Kurata,2014)。在拟南芥中，对PGNs的识别主要依赖2个含有胞外LysM基序（lysinemotif，LysM）的RLPs——AtLYM1和AtLYM3(Willmannetal.,2011)。虽然PGN诱导的免疫反应同时需要AtCERK1（chitinelicitorreceptorkinase1）的参与，但其本身并不具有PGN绑定能力(Willmannetal.,2011)。水稻中对PGN的识别，主要是通过OsLYP4和OsLYP6(Liuetal.,2012a)。1.2.3真菌和卵菌PAMP分子的识别机制1.2.3.1几丁质的识别几丁质是一种N-乙酰基-D-葡糖胺（N-acetyl-D-glucosamine）的聚合物，它是真菌细胞壁的重要组成成分(Eckardt,2008,Lenardonetal.,2010)。植物中首个被鉴定的几丁质受体是水稻中的CEBiP（chitinelicitorbindingprotein）(Fliegmannetal.,2011,Hayafuneetal.,2014)。它包含两个胞外LysM结构域和一个跨膜结构域，沉默该基因的水稻植株几乎完全丧失对几丁质的响应(Kakuetal.,2006)。由于OsCEBiP缺乏胞内激酶结构域，所以在完成几丁质信号转导时，它还需要一个受体类蛋白激酶OsCERK1的参与。两个OsCERK1在OsCEBiP同源聚合体两侧包裹形成三明治状复合体，共同完成几丁质的识别(Shimizuetal.,2010,Hayafuneetal.,2014)。CEBiP-RNAi的水稻植株中，几丁质诱导的活性氧爆发与几丁质响应基因的表达均被严重抑制，植株也变得更为感病(Fliegmannetal.,2011,Hayafuneetal.,2014)。OsLYP4和OsLYP6除了参与PGN的识别外，同7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言时也参与几丁质的绑定和响应，但不能与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结合，无论是沉默OsLYP4还是OsLYP6，植株的抗病性都被削弱(Liuetal.,2012a)。基于水稻中的研究成果，拟南芥中的几丁质受体基因AtCERK1很快得到了鉴定(Wanetal.,2008,Miyaetal.,2007)。AtCERK1包含3个胞外LysM结构域、一个跨膜结构域和一个胞内激酶结构域。其中第二个LysM功能域（LysM2）能够与几丁质直接结合，然后促进AtCERK1/AtLYK1形成二聚体并将激活位于胞内的激酶结构域，从而将几丁质信号由胞外传递到胞内；突变植株感病性明显增强(Liuetal.,2012b)。进一步的研究发现，该基因还参与植物对非生物逆境抗性(Kimetal.,2010)。拟南芥的几丁质识别机制和水稻的不同，AtCERK1可以直接绑定几丁质，进而诱导AtCERK1形成同源二聚体完成信号转导(Miyaetal.,2007,Wanetal.,2008,Liuetal.,2012b,Petutschnigetal.,2010)。在拟南芥5个含LysM功能域的LYK中，除了CERK1/CERK1对几丁质响应是必需的，AtLYK4在几丁质响应和天然免疫中也具有重要作用。AtLYK4基因缺少内含子，编码一个612个氨基酸长度的蛋白。包含3个胞外LysM结构域，一个跨膜结构域和一个胞内Ser/Thr激酶结构域。该蛋白和AtCERK1具有进化上的相关性。沉默Atlyk4后，突变体无论是对真菌还是细菌病害的感病性都增强，下游几丁质响应基因的表达受到明显的抑制(Wanetal.,2012)。虽然AtLYK4参与几丁质响应，但和Atcerk1相比Atlyk4单突在几丁质处理后，活性氧的产生只有轻微减少。AtLYK5与AtLYK4在进化树中归属于同一分支，所以它们在功能上可能存在冗余。AtLYK4和AtLYK5的二突植株完全丧失了对几丁质的响应能力，包括活性氧的产生、MAPK磷酸化以及对真菌病原菌A.brassicicola的抗性(Wanetal.,2012,Caoetal.,2014)。该结果证明AtLYK5和AtCERK1对几丁质有强烈的响应，而AtLYK4可以部分弥补AtLYK5缺少后造成的功能缺失。几丁质亲和性试验证明，在相同的试验条件下和AtCERK1相比，AtLYK5的结合力高出其大约200倍(Caoetal.,2014)。免疫共沉淀结果显示，在有几丁质存在的情况下，AtCERK1能和AtLYK5强烈互作，且几丁质诱导的两者间的互作要比AtCERK1的自身二聚体化强烈的多(Caoetal.,2014)。AtLYK5不仅对AtCERK1的二聚化至关重要，对于随后的蛋白磷酸化也有着重要作用。AtLYK2、AtLYK3和AtLYK5以及AtLYP1、AtLYP2、AtLYP3等基因，无论是单突变体还是多突变体中，下游的几丁质响应基因均无明显变化(Zhangetal.,2002,Eckardt,2008)。但有研究发现，拟南芥中能够与几丁质相互作用的的LYPLYM2可以不改变已知的几丁质下游基因的表达而通过降低胞间连丝的分子流（molecularflux）来提高植株抗病性，而AtCERK1则未见有此功能，暗示在拟南芥中至少存在两条不同的几丁质信号调控途径(Eckardt,2008)。此前，拟南芥中的另外LYPLYM1和LYM3被证明能够与肽聚糖（peptidoglycan,PGN）相互作用并提高植株对细菌病害的抗性(Willmannetal.,2011)。随着研究的不断深入，近来，大麦、番茄与小麦等1年生作物中的LYP/LYK基因的抗病功能也相继得到了鉴定。豆科植物百脉根（Lotusjaponicus）的LysMRLK——NFR1和NFR5是结瘤因子（nodulationfactor）的受体。结瘤因子是一种脂甲壳素（lipo-chitin）小分子，对结瘤产生至关重要，它和NFR1以及NFR5直接相互作用，促进根瘤产生(Kawaharadaetal.,2015,Madsenetal.,2003)。1.2.3.2其他PAMP分子的识别番茄Cf-9是第一个被鉴定到参与植物免疫且抗丝状真菌黄枝孢菌（Cladosporiumfulvum）8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言的LRR-RLP(Jonesetal.,1994)。还有几对PRR/PAMP之间的关系被暂且鉴定为植物-真菌互作。其中包括番茄受体类蛋白Eix2和真菌木聚糖酶、番茄Ve1和在多种植物致病真菌中序列保守的Ave1、拟南芥中RBGP1/RLP42和真菌内聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonases，PGs）、油菜受体类蛋白LepR3和油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeriamaculans）分泌的AVRLM1(Fradinetal.,2009,DeJongeetal.,2012,Zhangetal.,2014,Larkanetal.,2013,Zhangetal.,2013b)。此外一些PRRs，激发它们的PAMP虽然尚不明确，但仍有识别病原菌的潜在可能。例如，拟南芥受体类蛋白RLP30可能具有识别油菜菌核病（Sclerotiniasclerotorium）分离的SCFE1的能力、水稻B型凝集素受体类激酶Pi-d2参与水稻稻瘟病（Magnaporthegrisae）的抗病过程、小麦受体类蛋白激酶TaLRK10对叶锈病具有抗性、大豆可溶性β-葡聚糖结合蛋白（beta-glucan-bindingprotein，GBP）可是识别卵菌大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）产生的heptaglucoside(Chenetal.,2006,Feuilletetal.,1997,Zhouetal.,2007,Jiangetal.,2013,Fliegmannetal.,2004)。1.2.4模式识别受体下游信号转导无论是RLK还是RLP都可以在细胞膜上与类受体激酶形成动态的复合体，进而触发免疫信号转导。例如，拟南芥的FLS2和EFR都可以和BAK1（BRI1-associatedreceptorkinase1）以及体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶(Somaticembryogenesisreceptor-likekinases,SERKs)互作。BAK1作为FLS2识别flg22的共受体，对触发信号转导至关重要(Sunetal.,2013)。FLS2、BAK1的胞外结构域以及flg22一起晶体化后发现，FLS2的C端绑定的flg22像“分子胶”一样，紧紧黏靠BAK1的胞外结构域以稳定FLS2-BAK1异源复合体(Sunetal.,2013)。虽然水稻的几丁质受体很早就被发现并鉴定，但是OsCEBiP-OsCERK1受体复合体几丁质信号传导的下游元件，直到近些年才有报道。水稻RacGDP/GTP交换因子（OryzasativaRacGDP/GTPexchangefactor1，OsRacGEF1)--OryzasativaRac1(OsRac1)参与几丁质诱导的免疫反应早期阶段的信号转导。OsRac-GEF1是OsCERK1的直接底物，OsCERK1磷酸化OsRac-GEF1后进一步促进OsRac1激活活性。几丁质处理后，OsRacGEF1的S549氨基酸位点被OsCERK1磷酸化，OsRacGEF1进而被激活。OsRacGEF1被激活后，因为其可以被OsRac1绑定，所以OsRac1被其激活。OsRac1是一个植物Rac/Rho相关型的小GTP酶（Rac/RhorelatedGTPasefromplant，Rop）。研究显示，OsRac1参与真菌病原菌的激发子（例如几丁质、鞘脂）诱导的PTI(Onoetal.,2001,Suharsonoetal.,2002)。使用荧光共振能量转移（Forsterresonanceenergytransfer，FRET)传感器分析显示，几丁质处理3min内就可以激活OsRac1(Akamatsuetal.,2013)。此外，热激蛋白90（heatshockprotein90，Hsp90）和其分子伴侣Hop/Sti也可以和OsCERK1互作，它们负责OsCERK1的成熟以及成熟后从内质网到细胞膜地转运(Akamatsuetal.,2013,Chenetal.,2010)。OsRac1介导一个多蛋白的防御网络调控水稻的免疫反应，该网络中包括Hsp90、Hsp70、Hop/Sti1、支架蛋白OsRACK1、木质素生物合成酶OsCCR1（OryzasativaCinnamoyl-CoAreductase1）、OsMAPK3、OsMAPK6和RAI1(RacImmunity1)。OsCERK1还能够与胞质内的RLKRLCK185相互作用(Yamaguchietal.,2013)。沉默/突变OsCEBiP、OsCERK1和RLCK185均会导致植株更易感病(Kakuetal.,2006,Shimizuetal.,2010,Yamaguchietal.,2013)。MAPK在调节植物细胞响应胞内、胞外刺激（包含病原菌侵染）中的作用至关重要(Meng&9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言Zhang,2013)。越来越多的研究表明，它们也在几丁质信号转导中扮演重要角色。例如，拟南芥的MAPK3和MAPK6能被几丁质迅速激活，它们的激活依赖上游的MAPKK4和MAPKK5(Gallettietal.,2011,Kongetal.,2012)。所以拟南芥的几丁质信号转导路径中很有可能有MAPKK4、MAPKK5、MAPK3和MAPK6参与。转录因子在对植物细胞响应包括几丁质在内的各种刺激的基因重编程中具有重要作用(Dayetal.,2001,Ramonelletal.,2005)。实时荧光定量PCR和基因探针联合分析显示，有118个TF基因参与响应几丁质(Libaultetal.,2007)，这些TF基因中的很多之前已经被证明参与植物防御应答（例如，WRKY33），其诱导表达依赖于上面提到的MAPK级联反应(Eulgem,2006)。这也说明，这些TF基因可能也参与调控一些其他的几丁质响应基因（chitinresponsivegene,CRG）。拟南芥中，基因探针检测显示，在mRNA水平上，大概有将近900个基因能响应几丁质激发(Ramonelletal.,2005,Wanetal.,2008)。同样的，在水稻里，也有相当多数量的基因受几丁质调控(Dayetal.,2001)。与几丁质激发子作用一致，这些受调控的基因中很多的都是防御相关基因，例如有病程相关蛋白（pathogenesis-relatedproteins）、WRKY转录因子、抗病相关蛋白等(Ramonelletal.,2005,Wanetal.,2008)。1.3本研究的意义对于果树再植病，尤其是苹果再植病，整个研究领域的研究目标都集中在如何明确的界定并控制其发生。与此同时，种植者们也在尽量的尝试非熏蒸类的新方法。虽然果园土壤系统原有的生物资源可以用来协助减少功能性病原菌复合体的数量，但是这仍旧需要积极有效的调控，只有生物量在数量和质量上都达到必要水平，才能在病原菌抑制上表现出作用。传统的杂交育种方法，耗时长、对资源的占用密集（包括实验室、温室、苗圃、果园等），随后要通过多轮病原菌侵染、对重要的果园性状进行分子标记、对重复实验果园里的年度数据（包括产量、产量效率、树活、养分吸收效率等）进行评估来缩小目标范围。精选留下的砧木还要再进行一系列高度重复的胁迫实验，与此同时，精选得到的砧木还会被送去不同的商业苗圃进行7-12年的数据统计，最后选出理想的、可推广的砧木。整个过程平均耗时20-30年，且财力投入巨大。本研究希望通过基因工程手段，找到苹果再植病发病过程中发挥作用的关键基因MdCERK1，为通过基因工程手段培育抗再植病砧木提供基因资源和理论依据。对于苹果这类多年生的、非模式植物的果树类经济作物，有关其几丁质模式识别受体在防御激活或者是病原菌抗性中的研究少之又少。理论上，MdCERK1对苹果真菌病害应该具有广谱抗性，如果能成功的解析其抗病机理，无论在育种实践层面还是科学研究层面都具有十分重要的意义。10 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法第二章试验材料和方法2.1试验植物材料本试验所用的植物材料主要有：嘎啦组培苗（Malus×domestica‘RoyalGala’）、#58组培苗（‘Ottawa3’x‘robusta5’）、#75组培苗（‘Ottawa3’x‘robusta5’）、#58（‘Ottawa3’x‘robusta5’）、B.9组培苗（‘M8’בRedStandard’）、G.935组培苗（‘Ottawa3’x‘robusta5’）、#115组培苗（‘Ottawa3’x‘Robusta5’）、#132组培苗（‘Ottawa3’x‘Robusta5’）、#161组培苗（‘Ottawa3’x‘Robusta5’）、#5257（‘Ottawa3’x‘Robusta5’）。用于组织表达的叶、花、果、种子等植物材料是从ColumbiaView试验站（Orondo，WA）十年树龄的嘎啦上取样，根取自嘎啦组培苗。2.2试验方法2.2.1苹果再植病抗病候选基因筛选2.2.1.1植物材料组织培养和根系统土壤驯化B.9和G.935组培苗的获取，依据的是Yepes和Aldwinckle的方法(Yepes&Aldwinckle,1994)。得到组培苗后，将小苗移至包含生根培养基(Yepes&Aldwinckle,1994)的Magenta™盒子中，培养温度为25°C±1，光周期为12h/12h。组培苗经过4周生根培养后移栽至装有灭菌土（烤箱85°C连续加热过夜两晚）的营养钵，炼苗1周后进行苹果再植病病原菌Pythiumultimum侵染等处理。2.2.1.2苹果材料根部病原菌Pythiumultimum接种及表型评价该试验中使用的P.ultimum菌株来自于美国华盛顿州Moxee的‘Gala’/‘M26’苹果根部。培养P.ultimum使用的是液体培养基（1L水中加入20g胡萝卜和20g去皮土豆煮沸30min，加入两滴小麦胚芽油）。P.ultimum接种到液体培养基后于22°C培养4～5周。使用双层纱布先分离卵孢子和菌丝体，剩下的层状生长物放入搅拌机中破碎30s。破碎的菌丝段和卵孢子重悬在0.5%的甲基纤维素中，终浓度为2000CFU/mL。将苹果苗根部浸入接种溶液5s，然后移至灭过菌的基质中，浇足水。对照的植株浸入无病原菌的0.5%的甲基纤维素中，其余处理相同。小心的将病原菌侵染过30d之后的植物从土中取出，用于测量根组织生物量、地上部生物量以及根组织长度。附着在根组织上的土壤，用自来水仔细的清洗掉。在逐颗测量每株植株的生物量之前，使用浸湿的纸巾独立包裹保存。侵染实验共进行了两个生物学重复，每个重复包含150颗植株。使用MicrosoftExcel中的Student-t检验对测量结果进行统计分析。2.2.1.3显微观察基因型特异的抗性反应在设定的取样时间点将植株从土中小心取出，并在流动的自来水下轻轻洗去附着的土壤。对照处理和P.ultimum侵染过的根部样品，均保存在清水中，直到进行显微观察。显微观察需在取样后两h内进行。每个基因型每种处理，至少显微观察6颗植物材料。根组织的图像的获取使用11 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法的是安装在OlympusSXZ12解剖显微镜上的DP73数码相机和随机附带的celSense软件套装（Olympus，CenterValley，PA）。根据需要使用PhotoshopCS3对根组织图像进行轻微修改包括大小修改、裁剪和调整亮度。2.2.1.4总RNA提取及高通量mRNA测序mRNA测序使用的是P.ultimum侵染的B.9和G.935根组织。侵染方法如2.2.1.2节所述。样品收集分别于接种前、接种后24h、48h和72h取样。每个基因型的植物在每个时间点、每个处理均设置3个生物学重复，每个重复包括6株植物根部样品。取样后，液氮冷冻，-80°C保存。1.苹果根组织RNA的提取苹果根组织总RNA的提取，采用的是CTAB法。操作步骤如下：1）试剂配制（1）CTAB母液（10%）：称取10gCTAB溶于80mL水中，完全溶解后定容至100mL，DEPC处理后灭菌使用；（2）Tris-HCl母液（1M，pH8.0）：称取12.114gTris-Base溶于80mL灭菌的DEPC水中，用浓HCl调pH至8.0，冷至室温后定容至100mL，用pH试纸测定；（3）EDTA母液（0.5M，pH8.0）：称取18.612g金属鏊合剂EDTA溶于80mL水中，加NaOH使之溶解，定容至100mL，DEPC处理后灭菌使用；（4）NaCl母液（5M）：称取29.22gNaCl溶于80mL水中，加热溶解，定容100mL，DEPC处理，灭菌；（5）体积比为24:1的氯仿：戊醇；（6）LiCl母液（10M）：称取42.4gLiCl溶于80mL水中，定容至100mL，DEPC处理后灭菌保存；（7）NaAc母液（3M，pH5.2）：称取40.8gNaAc﹒3H2O溶于80mL水中，用醋酸调pH至5.2，DEPC处理后灭菌保存。CTAB提取液配制终浓度配制10mL所需母液量配置50mL所需母液量2%CTAB2mL10mL0.1MTris-HCl1mL5mL0.02MEDTA0.4mL2mL1.4MNaCl2.8mL14mL2%2-mercaptoethanol0.2mL1mL2%PVP0.2g1gddH2O补齐至10mL补齐至50mL2）实验步骤（1）液氮研磨2-3g冷冻的苹果组织，移至装有CTAB提取液的50mL离心管，斡旋震荡均匀后放回60°C保温25-30min；12 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法（2）加入10mL氯仿：异戊醇（24：1）混合液，斡旋震荡2min，离心，10000g，4˚С，10min；（3）转移上清至新的离心管，氯仿：异戊醇（24：1）重新抽提，离心，10000g，4˚С，10min；（4）转移上清至新的离心管，加入1/4体积10M氯化锂混合均匀，4˚С过夜；（5）第二天早上离心，14000g，4˚С，30min，弃上清，将离心管倒置于Kimwipe上干燥，加入2mL70%的酒精清洗沉淀，离心，14000g，4˚С，10min，弃上清，将离心管倒置于Kimwipe上干燥5-10min；（6）将RNA溶解于500𝜇LDEPC水中并转移至1.5mL离心管；（7）向离心管中加入1/10体积3M醋酸钠（pH5.2）和2个体积的无水乙醇，-80˚С沉淀1-3h；（8）离心，14000g，4˚С，30min，70%的酒精清洗沉淀，离心，14000g，4˚С，10min，去上清；（9）将离心管倒置于Kimwipe上干燥5-10min，让剩余的酒精彻底挥发；（10）加入50-100𝜇LDEPC水溶解RNA，测量RNA浓度并跑胶检测期完整性。2.高通量mRNA测序测序前再次测量RNA完整性数（RNAintegritynumber，RIN），确定RIN≥8后开始进行测序。使用Oligo(dT)magneticbeads来抓取含有polyA尾结构的mRNA，加入片段化缓冲液将mRNA破碎成小的片段。接着这些小的片段被用作模板，使用反转录酶和一个随机的六聚体引物进行cDNA第一链的合成。第二链的合成使用的是DNApolymeraseI、dNTPs、RNaseH以及相应的酶缓冲液。然后对合成好的cDNA进行纯化和双端修复（pair-endrepair）并连接到测序接头（sequencingadapter）上，PCR扩增后得到最终的双端cDNA文库。文库构建及150bp的双端RNA测序在俄勒冈州立大学的基因组研究与生物计算中心完成，测序设备为IlluminaHiSeqTM3000(IlluminaInc.,SanDiego,CA,USA)。3.匹配测序结果使用Bowtie2-2.2.5对B.9（感病品种）和G.935（抗病品种）的测序结果和苹果基因组中预测编码基因的核苷酸序列进行匹配，得到每个编码序列的计数数据(Lanubileetal.,2015)。使用DEseq2和Rx643.3.1(https://www.r-project.org/)在每个样品的三个重复中使用计数数据对每个基因的表达水平进行估算和统计分析(Shinetal.,2014,Mazzola,1997)。通过对NR（nonredundantproteinsequences）数据库进行BLASTP和在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、苜蓿(Medicagotruncatula)、水稻(Oryzasativa)和西红柿(Solanumlycopersicum)基因组中进行BLAST得到基因注释。2.2.2苹果根部材料实时荧光定量的内参基因筛选2.2.2.1候选内参基因筛选及引物设计利用上述RNA-seq数据进行候选内参基因的筛选，筛选参数为：a.变异系数（coefficientvariance，CV）小于0.3；b.该基因在每个株系、每个时间点处计算出来的Log2FC（foldchange）13 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法的值位于±0.1之间；c.该基因在每个株系、每个时间点处的basemean值位于500至3000之间。确定好候选内参基因后，从苹果基因组数据库GDR(http://www.rosaceae.org/)中下载其序列，使用PrimerQuesttool(IntegratedDNATechnologies)设计引物。引物要求GC含量45–65%、Tm>50°C、引物长度20–24bp、扩增长度150–200bp。设计好的引物由IDT公司（IntegratedDNATechnologies，Coralville，Iowa）合成。2.2.2.2内参基因筛选的非生物胁迫处理及病原菌侵染处理1.非生物胁迫处理非生物胁迫处理使用的材料为嘎啦组培苗。4周大的组培苗经过1周炼苗后，对其进行渗透、干旱、寒冷以及缺素胁迫处理。所有的处理都是以pH5.6的1/2MS（MurashigeandSkoog）液体溶液为基质，经不同的胁迫处理后，对移栽的苹果苗进行浇灌。对照的植株只浇1/2MS溶液。渗透和干旱处理的植株，分别在1/2MS溶液中加入200mM的NaCl和15%PEG6000。寒冷胁迫的植株在浇透1/2MS溶液后放入透光玻璃门4°C展示冰柜。缺素处理的植株只浇不含任何养分的超纯水。所有处理植物的其他培养条件均相同，光周期为12h/12h。每个处理分别设置3个生物学重复，两天后取样，液氮速冻，-80°C保存。2.病原菌侵染处理P.ultimum侵染的方法及取样时间如2.2.1.2节所述。R.solani接种使用的是R.solaniAG-5strain1007。R.solani先接种于1/5PDA培养基上。取一小块R.solani在培养基上的生长物再次接种在无菌的含有250mL燕麦麸和80mL蒸馏水的500mL烧杯中，20°C密封培养14d。14天后去掉封口，在通风处内风干。风干后的培养物倒入料理机中打成粉末，将粉末按0.25%的体积分数均匀混入灭菌基质中。对照为灭菌土。将病原菌处理和对照的植物分别移至相应的基质里，浇足水。分别于接种前、接种后24h、48h和72h取样。每个基因型的植物在每个时间点每个处理设置3个生物学重复，每个重复包括6棵植物根部样品。组合为P.ultimum侵染#58、P.ultimum侵染#75、R.solani侵染#115。取样完成后液氮速冻，-80°C保存。2.2.2.3cDNA合成及qPCR1.cDNA的合成2𝜇gRNA加RNasefree水补齐至11𝜇L，加入1𝜇L浓度为100𝜇M的OligodTPrimer，PCR仪上65˚С，10min，至于冰上5min；在离心管中加入如下反应液并混合均匀：5xFirst-StrandBuffer4𝜇L0.1MDTT2𝜇L10mMdNTPMixture1𝜇LRecombinantRNasinRibonuclaseInhibitor1𝜇L(40U/𝜇L)SuperscriptIIRTenzyme1𝜇L(200U/𝜇L)总体积:9𝜇L放置于PCR仪中，42˚С，1h，65˚С，15min，-20˚С长期保存。14 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法2.实时荧光定量PCR将反转录得到的cDNA稀释20倍。每15𝜇L的qPCR反应体系加入2.4𝜇L稀释后的cDNA、®7.5𝜇LiQ™SYBRGreenSupermix、3.9𝜇L水、0.2𝜇M正/反向引物。qRT-PCR反应使用的是iQ5realtimeqPCRdetectionsystem(BioradLab,Hercules,CA)，所有反应都在96孔板中进行。反应条件如下：95°C3min;95°C10s,59°C30s,共40个循环；从55°C升至95°C,每30s上升0.5°C。所有实验都包括3个技术重复和没有模板的阴性对照。在计算PCR扩增效率是，使用的Gala无处理的根组织cDNA。设置5个数量级倍数连续梯度的cDNA稀释溶液（1:5、1:25、1:125、1:625和1:3125）。得到RT-qPCR数据后，在MicrosoftExcel2016中生成标准曲线，利用标准曲线的斜率计算PCR效率和回归系数。2.2.2.4基因表达稳定性的统计分析对基因的稳定性评估，采用了四种不同的方法：ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper(Silveretal.,2006,Vandesompeleetal.,2002,Andersenetal.,2004,Pfaffletal.,2004)。最后使用RefFinder对四个软件的结果进行整合，得到综合排序(Xieetal.,2012)。RT-qPCR得到的原始Ct值需要转化成相对值才能用于ΔCt、geNorm和NormFinder分析基因表达水平稳定性。相对值的ΔCt计算公式为Q=E，公式中E代表的是该基因的扩增效率，ΔCt等于该组数据中最小的Ct值减去目标Ct值。BestKeeper可以直接输入原始Ct值进行基因稳定性分析。geNorm根据基因稳定值(averageexpressionstability，M)来对候选基因转录稳定性进行排序，M值是通过计算每个基因和剩下其余的候选基因之间的平均配对变异参数(pairwisevariations，V)得到的。基因的M值越低，则该基因在测试条件的表达水平就越稳定。此外，V值也被用来决定目标基因表达水平标准化时需要的内参基因的最佳数量。如果V（n/n+1）小于或等于0.15，则不需要添加额外的内参基因(Vandesompeleetal.,2002)。NormFinder是ANOVA的模型，同时把组间和组内变化纳入计算过程来评估基因表达稳定性(Andersenetal.,2004)。在分析时，变化值越小说明基因表达模式越稳定。BestKeeper对基因稳定性的排序基于3个指标：标准差(standarddeviation，Stddev)、变异系数（coefficientofvariation，CV）、相关系数（coefficientofcorrelation，r）(Pfaffletal.,2004)。标准差和变异系数越小代表基因稳定性越高。最后四个软件评估的稳定性结果，通过一个在线软件RefFinder来做综合评价(Xieetal.,2011)。2.2.2.5内参基因分析验证我们选择了两个在病原菌侵染后在根部表达量较高的基因——MdLecRLK5(MDP0000228426)和MdMAPK3(MDP0000187103)对筛选出的内参基因的可靠性进行验证。验证所用的植物材料是P.ultimum侵染#58和R.solani侵染#115。RNA提取和cDNA合成步骤如2.2.1.4节和2.2.3.3节所述。目标基因表达水平分别使用该植物材料该病原菌侵染条件下选出的表达稳定性排名第一、表达稳定性排名第二以及表达稳定性排名最末的内参基因进行标准化。在进行RT-qPCR时，MdLecRLK5的正反向引物分别为5’-GAATGCCAGCTTCAGAGTTAGA-3’(正向)和5’-TCCGATCCCTTTCTCTTGTTTC-3’(反向)，MdMAPK3的正反向引物分别为5’-15 中国农业科学院博士学位论文第二章试验材料和方法GAGAAGAAAGTCCTCCACCAAA-3’(正向)和5’-GTGGCGTCGAACATCAAATTC-3’(反向)。−ΔΔCT目标基因的表达水平使用2进行计算(Livak&Schmittgen,2001)。所有的计算结果通过SPSSV19.0进行单因素方差分析（ANOVA）检测和多次比较。2.2.3苹果LysM基因家族成员鉴定及生物信息学分析拟南芥AtCERK1、AtLYK2、AtLYK3、AtLYK4、AtLYK5、AtLYP1、AtLYP2、AtLYP3、AtLysMe1、AtLysMe2、AtLysMe3、AtLysMn1、AtLysMn2、AtLysMn3的序列下载自TAIR（http://www.arabiodpsis.org）。使用拟南芥LysM家族基因的氨基酸序列，通过在线网站Plaza（https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/）进行BlastP，得到30个苹果同源基因。从苹果基因组网站GDR数据库（http://www.rosaceae.org/node/1）和TheAppleGenomeandEpigenome(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/jbrowse)中下载这30个苹果基因的氨基酸和核苷酸序列。使用ClustalX软件对苹果中30个LysM蛋白及拟南芥中已知的LysM蛋白进行氨基酸序列比对，比对结果通过MEGA5软件生成进化树，进化树的构建采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），校验参数Bootstrap重复1000次(Tamuraetal.,2011)。使用在线工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）检测得到的30个苹果LysM基因编码的蛋白质是否含有LysM结构域。利用ExPASyProteomicsServer(https://web.expasy.org/protparam/)预测30个苹果LysM基因编码的蛋白质的基本信息，其中包括蛋白质的长度、分子质量以及等电点(Artimoetal.,2012)。MdLysM基因的基因结构获取自在线工Plaza(http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)。通过GMDO(http://www.gmod.org/wiki/Main_Page)获取染色体定位信息后，利用Mapinspector软件进行染色体定位作图。2.2.4苹果MdCERK1的确定及鉴定2.2.4.1MdCERK基因的筛选和进化树构建从TAIR（www.arabidopsis.org）上获取拟南芥AtCERK1的氨基酸序列。使用AtCERK1序列6到苹果基因组中进行BlastP，筛选苹果中的同源基因，筛选时默认期望值50°C、引物长度20–24bp、扩增长度150–200bp(表2-1)。表2-1基因描述及其qRT-PCR引物序列Table2-1GenedescriptionsandprimersequencesforqRT-PCRGene#PrimersF/R[5’-3’]GenedescriptionMD09G1111800F-5’GGACTCGGTTCCCAACATATAC3’ChitinelicitorreceptorkinaseR-5’TAGCTGTTGAACCACTCCAAG3’MD17G1102100F-5’CATCCTGCTGGAAGGACCTA3’ChitinelicitorreceptorkinaseR-5’AGGCCTCTTGATTCGGAACT3’MDP0000095375F-5’ACATCGAGAGCTTTGGCTAAC3’ReferencegeneR-5’CTCCATCAGAACCACTGACATC3’3.MdCERK基因的实时荧光定量PCRR.solani的侵染方法如2.2.3.2节所述。R.solani侵染的#115根组织、R.solani侵染的G.935根组织、R.solani侵染的#132根组织、R.solani侵染的#161根组织、R.solani侵染的#5257根组织、嘎啦的根、叶、花、果、种子以及几丁质处理的嘎啦根组织的RNA提取如2.2.1.4节所述。使用DNaseI去除RNA中残留的DNA。cDNA的合成方法及实时荧光定量PCR方法如2.2.3.3节所述。2.2.4.3MdCERK1基因序列特性分析1.MdCERK与其他物种中已知CERK基因的进化树构建从TAIR（www.arabidopsis.org）上获取拟南芥AtCERK1的氨基酸序列。使用AtCERK1序列6到苹果基因组中进行BlastP，筛选苹果中的同源基因，筛选时默认期望值