鄱阳湖流域肠道病毒及细菌指示物的研究

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分类号：密级：UDC：学号：416524115699南昌大学专业学位硕士研究生学位论文鄱阳湖流域肠道病毒及细菌指示物的研究ResearchOnEntericVirusesandBacteriaIndicatorinPoyangLakeofNanchang朱慧培养单位（院、系）：南昌大学公共卫生学院指导教师姓名、职称：鲁元安教授指导教师姓名、职称：袁兆康教授专业学位种类：医学硕士专业领域名称：公共卫生论文答辩日期：2018年5月答辩委员会主席：评阅人：年月日 一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宂成果，据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书＿使用过的材料一同工作的同志对本研宄所做的任何贡。与我献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字口期：乃戊年夕月口ｎ＾二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留，同意、使用学位论文的规定学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论（光盘版文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊）电＋杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位“论文全文数据库》中全文发表，，并通过网络向社会公众提供信息服务同意按章”规定享受相关权益程。）学位论文作者签名（手写：导师签名丨签字闩期：＞友年孓月｝闩签字日期：以＃年月日丨Ｓ论文题Ｈ鄱阳湖流域肠道病毒及细菌指示物的研宄？学号４□硕士０名朱慧４１６５２１１５６９９论文级別博丄｜＾院／系／所南昌大学尻学院专业公共卫生｜Ｅｍｌａｉ—备注：“”０公开□保密（，）向申清月后公开校学位办获批准为保密年＿＿ 摘要摘要目的：检测鄱阳湖流域肠道病毒的污染现况及其消涨规律，探讨肠道病毒与细菌指示指标之间的关系。方法：根据鄱阳湖流域的地理分布特点确定六个采水点，分别记为：青山闸、观鸟台、托山、吴城、星子、九江渡口；将青山闸、观鸟台、托山采样点划分为鄱阳湖流域上段，吴城、星子采样点划分为鄱阳湖流域中段，九江渡口是鄱阳湖与长江交汇处的入口，为鄱阳湖流域下段。于2016年5月至2017年2月期间，每个月采样一次，保证每个月采样时间一致或相近。水样检测的指标包括：理化指标（气温、水温、GPS定位）；细菌指示指标（菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希式菌、肠球菌）；病毒指标（诺如病毒I型、诺如病毒II型、肠道病毒、腺病毒）。肠道病毒的检测分别使用夏威夷大学环境卫生学实验室制定的定性检测方法和军事医学科学院的载阳电荷滤料法。细菌指示指标参照《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750.12-2006中的滤膜法进行检测。结果：鄱阳湖流域普遍存在肠道病毒污染。病毒定性检测中，诺如病毒I型春季和秋季阳性检出率最高，分别为100.00%和66.70%；诺如病毒II型冬季和春季阳性检出率最高，分别为58.30%和50.00%；肠道病毒春季和秋季阳性检出率最高，分别为83.33%和75.00%；腺病毒检出率最高为春季和秋季，分别是83.30%和75.00%。诺如病毒I型和II型不同采样点之间的检出率的差异无2统计学意义。肠道病毒在不同采样点间差异有统计学意义（=7.321P=0.007），且在星子和九江渡口检出率最高，为71.43%。腺病毒在九江渡口检出率最高，为100.00%。定量检测中，三种病毒（诺如病毒II型、肠道病毒、腺病毒）均有不同程度的检出，其中腺病毒检出率最高，为91.67%，肠道病毒与诺如病毒II型与的检出率分别为86.11%、77.78%。细菌指标检出率分别为菌落总数(100.00%)、总大肠菌群(52.40%)、粪大肠菌群(38.00%)、大肠埃希式菌(21.42%)、肠球菌(40.48%)。五种细菌指示指标之间做相关性分析显示，菌落总数与总大肠菌群、大肠埃希氏菌呈正相关(P<0.01)，大肠埃希氏菌与总大肠菌群、粪大肠菌群呈正相关(P<0.01)。细菌指示指标与气温、水温之间均呈正相关且有统计学意义II 摘要(P<0.01)。病毒之间无相关关系，肠道病毒与细菌指示指标之间也没有相关性。分析两种实验方法的结果显示，夏威夷实验室建立的定性实验方法与军事医学科学院建立的定量检测方法检测肠道病毒的结果差异无统计学意义(P<0.005)。结论：鄱阳湖水系存在肠道病毒污染，在细菌指示指标合格的水中能检测到肠道病毒的存在。但细菌的存在并不能代表病毒的存在，两者之间无关联性。仅使用细菌指示指标作为水质指示指标还不够，有必要使用其它指示指标例如病毒指标来监测水质状况，以便更全面检测水体质量，降低水质疾病风险。两种实验方法：夏威夷大学环境卫生学实验室制定的定性检测方法和军事医学科学院的载阳电荷滤料法检测病毒存在状况时，发现两种方法检测结果差异无统计学意义，并且各有其优缺点。关键词：鄱阳湖；肠道病毒；细菌指示指标；相关性III AbstractABSTRACTObjective:DetectingthecontaminationanditschangeofentericvirusinPoyangLake,discussingthecorrelationbetweenhumanentericvirusandbacteriaindicators.Methods:Inthisstudy,watersamplesweretakenfromsixlocationsalongthePoyangLakeconsideringfactorssuchashumansourcesandenvironmentalimpact,includingQingshanzha、Guanniaotai、Tuoshan、Wucheng,Xingzi、JiujiangDukou.Accordingtothedistributioncharacteristicsofthesesixsites,Qingshanzha、GuanniaotaiandTuoshanaregroupedtoupstreamwhileWuchengandXingziarethemidstream,andJiangxiDukouisthedownstreamofPoyangLakewherewaterflowsintoYangtzeRiver.Allthesesitesweremonitoredforeightmonths(May2016toJanuary2017),Watersamplecollectiontimeswereinitiallydesignedbutadjustedaccordingtoactualsituation,suchnowatersampleswerecollectedbetweenJulyandAugustduetowateroverflowing.Watersampleswereprocessedinthelaboratoryaccordingtoestablishedmethodsandtestedforthefollowings:a)physicalandchemicalindex(airtemperature,watertemperature,GPScoordinates);b)bacteriaindicators(AerobicbacterialCount,totalcoliform,fecalcoliform,E.coliandenterococcus);andc)HUMANentericviruses(norovirusgeno-groupsIandII,enteroviruses,andadenoviruses).Thedetectionofhumanentericvirususingtwomethods:thequalitativedetectiondesignedbyUniverisityofHawaiiandload-chargefiltermethoddesignedbyAcademyofmilitarymedicalsciences.ThebacteriologicalanalysesweredoneaccordingtothefiltermembranemethodofGB/T5750.12-2006《StandardExaminationMethodsforDrinkingWater》ofChina.Results:ThereiswidespreadentericviruscontaminationinPoyangLake.Inthequalitativedetectionofvirus,resultsshowthatthepositivedetectionofnorovirusgeno-groupsIwashighestinspringandsummer,with100.00%and66.70%respectively;thepositivedetectionofnorovirusgeno-groupsIIwashighestinspringandwinter,with58.30%and50.00%,respectively；indicatingstatisticallysignificantIV Abstractdifferencebetweensummerandwinter.Thepositivedetectionofenterviruswashighestinspringandfall,with83.33%and75.00%respectively;thepositivedetectionofadenoviruseswashighestinspringandfall,with83.33%and75.00%respectively.Theresultshownostatisticalsignificantcorrelationinthedetectionofnorovirusgeno-groupsIandnorovirusgeno-groupsIIindiffererntsamplingsites.Itshowstatisticalsignificantindetectionofenterovirusesindiffererntsamplingsites(2=7.321P=0.007),andthehighestpositiveoddratewereshowedinXingziandJiujiangDukou(71.43%).Thehighestpositiverateofadenoviruseswas100.00%inJiujiangDukou.Throughthequantitativedetection,threeviruses(norovirusgeno-groupsII,enteroviruses,andadenoviruses)weredetected,thepositiveoddratewas91.67%ofadenoviruses,norovirusgeno-groupsIIandenteroviruseswere86.11%、77.78%.Thepositivedetectionratesofbacteriaindicators(AerobicbacterialCount,totalcoliform,fecalcoliform,E.coliandenterococcus)were100.00%、52.40%、38.00%、21.42%、40.48%,respectively.AerobicbacterialCount,totalcoliform,fecalcoliform,E.coliandenterococcuswerepositivelycorrelatewithairtemperatureandwatertemperature,andhavestatisticallysignificance(P<0.001).Analysisofthecorrelationshowedthatthedetectionoftraditionalindicatorbacteria,AerobicbacterialCountandtotalcoliform、andE.coliwaspositivelycorrelation(P<0.01).Nocorrelationamongentericvirusesandnocorrelationbetweenvirus(norovirusgeno-groupsIandII,enteroviruses,andadenoviruses)andbacteria(AerobicbacterialCount,totalcoliform,fecalcoliform,E.coliandenterococcus).Besidesbacteroidescannotpredictthedetectiveofvirus.ComparativeanalysisofthetwomethodsemployedinthisstudyrevealsthatthequalitativeexperimentalmethodestablishedattheHawaiilaboratoryandthequantitativedetectionmethodestablishedshowednostatisticalsignificantcorrelationindetectingtheselectedentericviruses(P<0.005).Conclusions:ThisstudyfoundthatthePoyangLakewascontaminatedwithhumansewage,andthepresenceofhumanenteroviruswasdetectedinthewaterthatmeetsthemicrobiologicalstandard.Itwasfoundthatthepresenceofindicatingmicroorganismsdidnotrepresenttheexistenceofthehumanentericviruses,andtherewasnocorrelationindetectionofbacterialindicatorwithhumanpathogenicV Abstractviruses.Thus,itisnotgoodenoughtouesonlyindicatingmicroorganismlikeEcoliaswaterqualitymonitoringindicator,andadditionalindicatorsystemssuchashumanentericvirusandneededinordertoenhancecurrentmonitoringofwaterqualityandimprovetheassessmentofwaterrelatedhealthrisks.Resultsfromthetwoquantitativemethodsforviraldetectionarenotsignificantlydifferent,indicatingeitherofthesemethodcanbeusedinfuture,althougheachmethodhaditsadvantagesanddisadvantages.Keywords:Poyanglake;Enterovirus;Bacterialindicator;CorrelationVI 目录目录第1章前言...............................................................................................................1第2章材料与方法...................................................................................................42.1实验材料···············································································42.1.1实验试剂................................................................................................42.1.2实验仪器及耗材....................................................................................52.1.3主要试剂和材料的配制........................................................................52.2实验方法···············································································62.2.1采样点选择............................................................................................62.2.2理化指标的检测....................................................................................72.2.3病毒的检测............................................................................................82.2.4细菌指示指标的检测–滤膜法........................................................112.2.5技术路线图..........................................................................................132.2.6质量控制..............................................................................................142.2.7统计学方法..........................................................................................14第3章结果.............................................................................................................153.1鄱阳湖流域各项指标的基本情况以及季节地域性差异····················153.1.1理化指标结果.....................................................................................153.1.2病毒定性检测结果.............................................................................163.1.3病毒定量检测结果.............................................................................183.1.4细菌指示指标检测结果.....................................................................193.2指标间的相关性结果······························································243.3两种实验方法检测病毒的比较··················································253.3.1结果比较.............................................................................................253.3.2其他参数比较.....................................................................................26第4章讨论.............................................................................................................27VII 目录4.1鄱阳湖流域水系肠道病毒及细菌污染状况···································274.2中国当前使用的水质指示指标··················································284.3两种检测水中肠道病毒方法分析···············································29第5章结论.............................................................................................................30致谢.........................................................................................................................31参考文献.....................................................................................................................32综述.........................................................................................................................35VIII 中英文缩略词表中英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称ACCAerobicbacterialcount菌落总数TCTotalcoliform总大肠菌群FCFecalcoliform粪大肠菌群E.coliEscherichiacoli大肠埃希氏菌ENTEnterococcus肠球菌CFUColony-formingunit菌落形成单位AdvAdenovirus腺病毒EVEntericvirus肠道病毒EUEuropeanUnion欧盟mFCmFCmediummFC培养基MUGNA-MUGmediumMUG营养琼脂培养基NVNorovirus诺如病毒PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应qPCRQuantitativereal-timePCR实时定量PCRUSEPAU.S.EnvironmentalProtectionAgency美国环境保护署WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织IX 第1章前言第1章前言水是生命之源，在人类生存和发展过程中不可或缺。随着经济的不断发展和人口数量的不断增长，水环境污染日益严重，对人类健康造成巨大的威胁，因此饮水安全问题已经成为人们关注的热点问题。我国是一个水资源短缺、水环境脆弱的国家，正常年份城市缺水60亿立方米，水的重复利用率为50%左右，而发达国家达85%以上。水污染问题较为严重，全国年排放污水总量达到600亿吨，其中绝大部分未经任何处理便直接排入水域。全国有近50%的河段、90%以上的城市水域被严重污染，有1/4的人口饮用不符合卫生标准的水[1]。因此，水生疾病的暴发也越来越成为当今公共卫生关注的主要问题，根据世界卫生组织和学术研究收集的资料显示，全球80%的疾病是由于接触受污染的饮用水造成的，饮用水污染可导致50多种严重疾病的发生，其中包括消化道疾病、感染性疾病、皮肤病、癌症等[2]。在美国，2011-2012年间报道了32起饮水有关的疾病暴发，其中至少431人患病，102人住院，14人死亡[3]。在中国，每年将近2.5亿患感染性疾病的人群中就有一千万到二千万人是感染了饮水相关疾病[4]。水质粪便污染是导致水生疾病发生和传播的主要原因，水中存在的诸如细菌、病毒和原生动物等人类致病微生物能够存活在受污染的水中从而感染水质接触者[5]。随着近几年报道的病毒疾病暴发的不断增长，有必要确立更加完善的水质指示系统。如今，世界上绝大多数国家主要使用细菌学指标作为水质指标。常用细菌学指标主要有以下几种：①总大肠菌群（Totalcoliforms）肠道中普遍存在且数量最多的一类细菌是大肠杆菌[6]，其在水中存在状况与致病菌有一定的相关性，较为符合作为粪便污染检测的指标。总大肠菌群是指在35℃、48h内发酵乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌[7]，是目前国际上断定水质污染程度和卫生质量的主要生物指标。②粪大肠菌群（Fecalcoliforms）粪大肠菌群为总大肠杆菌的一个亚种，指在44.5℃高温条件下仍能生长繁殖，发酵乳糖产酸产气的一类细菌，与粪便污染有关，主要来源于人和温血动物的粪便[3]。1 第1章前言③大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)大肠埃希氏菌是一种能较好地指示人类肠道的耐热大肠杆菌[8]。在温带，大肠埃希氏菌不能长时间存活于水体；在热带地区，其在水体的增殖速度受气温、光照和营养等条件的影响[9]。④肠球菌属（Enterococci）肠球菌能够在高盐、高pH和高温下生长，是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性球菌[10]。目前是用作粪便污染特别是可靠地用于监测海洋环境和娱乐水体的健康风险一种成功的指示菌[11,12]。在中国，饮用水水质指示指标使用细菌总数和总大肠菌群（细菌总数：<100菌落形成单位/毫升，总大肠菌群数不得检出）。但是肠道细菌作为水质指标存在不足和局限：肠道病毒对氯的抵抗力往往比细菌强，一般废水处理过程不能完全使其失活，有时肠道细菌合格的水质也能检测出低量的致病肠道病毒。因此，将人类肠道病毒作为水质指示指标成为当今水质安全的研究重点，并且从八十年代起欧洲的一些国家，比如法国，已经将肠道病毒作为一项微生物指标纳入水质监测系统。人类肠道病毒作为导致水生疾病的主要病原体，已经在世界上许多国家的水质中检测出来。人类肠道病毒属于微核糖核酸病毒科，包括RNA病毒科（脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、柯萨奇病毒、甲肝病毒和艾柯病毒），杯状病毒科（诺如病毒、杯状病毒、星状病毒），腺病毒科（腺病毒）和呼肠病毒科（轮状病毒）。肠道病毒通过粪-口途径传播，其在水中具有耐热和耐紫外线的特性，并且低剂量肠道病毒便可致病。肠道病毒较细菌在环境水体和污水中存在更加稳定和持久，甚至在一些极端环境如PH为3-10和低温的环境下[13]。肠道病毒感染的特点是以隐性感染为主，隐性感染者也可持续数周排泄大量病毒，使肠道病毒出现于下水道、江河水中，甚至污染饮用水水源。一些废水处理过程例如沉淀、活性炭处理和氧化过程也并不能完全消除肠道病毒。这意味着肠道病毒有可能在人群中产生临床症状之前就在生活污水中被检出，曾有报告称在人群中产生临床病例之前，先于生活污水中检出脊髓灰质炎病毒野毒株和疫苗株。人类肠道病毒作为水质指示指标虽逐渐被提出，但由于肠道病毒在环境水体中的浓度较低，检测研究方法难度大，并且易受环境因素影响，操作便易度受限制，要用肠道病毒监测水质，这就意味着需要一种高敏感性的病毒浓缩和优化的提取肠道病毒的实验室方法。因此，本研究首次在鄱阳湖流域采集水样，2 第1章前言了解肠道病毒污染现况及其消涨规律，探讨肠道病毒与细菌指示指标之间的关系。进一步寻找可靠有效的水质监测指标，以便全面检测水体质量，降低水质疾病风险。3 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1实验材料2.1.1实验试剂氢氧化钠（NaOH）西陇科学股份有限公司氯化镁（MgCl2·6H2O）天津市凯通化学试剂有限公司氯化钠（NaCl）西陇科学股份有限公司氯化钾（KCl）天津市凯通化学试剂有限公司无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）天津市凯通化学试剂有限公司磷酸二氢钾（KH2PO4）天津市凯通化学试剂有限公司无水乙醇天津天津市凯通化学试剂有限公司牛肉粉、蛋白胨、甘氨酸京鼎国生物技术有限公司5×TBE北京索莱宝科技有限公司溴化乙锭（EB）加拿大BBI公司DEPC水北京索莱宝科技有限公司载阳电荷滤料自制LegionellaAgarBase美国BD公司肠球菌培养基青岛海博技术有限公司远藤培养基、mFC培养基美国BD公司Tryptone英国OXOID公司琼脂粉天根生物有限公司thePowerWater®RNAIsolationKit美国MoBio实验室EasyScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix北京索莱宝科技有限公司TransTaqHiFiDNA酶北京索莱宝科技有限公司2×TaqPCRMasterMix天根生物有限公司QIAampViralRNAMiniKit德国QIAGEN公司4 第2章材料与方法RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitThermoscientific2.1.2实验仪器及耗材高速冷冻离心机美国SIGMA公司孔径0.45μm直径39mm微孔滤膜北京北化黎明膜分离技术公司孔径为0.45μm的HA型滤膜美国EMDMillipore公司沸水浴装置四川蜀光250ml锥形瓶四川蜀光90mm玻璃平板青岛仁和兴实验科技有限公司恒温培养箱上海左乐仪器有限公司净化工作台北京市医药净化设备厂生物安全柜上海振梓创空气净化设备有限公司病毒富集滤料柱自制病毒富集漏斗装置自制凝胶成像系统ImageQuant350美国GE公司PCR仪美国AB公司ABI7300Real-TimePCR仪美国AB公司磁力搅拌器（EMS-9B）天津欧诺仪器仪表有限公司电泳仪北京市六一仪器厂电泳槽北京市六一仪器厂2.1.3主要试剂和材料的配制（1）载阳电荷粒状滤料实验室自制好[14].（2）甘氨酸复合三倍营养肉汤NaOH（20g/L）；NaCl（15g/L）；无水Na2CO3（0.3g/L）；胰蛋白胨（30g/L）；牛肉粉（15g/L）；5 第2章材料与方法甘氨酸（37.5g/L）。注：每个水样每次需配制2.4L甘氨酸复合三倍营养肉汤（3）PBS缓冲液的配制NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.20g，无水Na2HPO41.15g，溶于1000ml蒸馏水中，高压灭菌，置于常温。（4）远藤培养基：称取5.0g远藤培养基，加入100ml的蒸馏水，加热煮沸，冷却至40℃-50℃后倒入无菌培养皿中（注意不要产生气泡），冷却后备用。（5）mFC琼脂培养基：称取5.0gmFC琼脂培养基，加入100ml的蒸馏水，加热煮沸，冷却至40℃-50℃后倒入无菌培养皿中（注意不要产生气泡），冷却后备用。（6）肠球菌培养基：称取3.8g肠球菌培养基，加入100ml的蒸馏水，加热煮沸，冷却至40℃-50℃后倒入无菌培养皿中（注意不要产生气泡），冷却后备用。（7）MUG营养琼脂培养基：称取2.6gMUG营养琼脂培养基，加入100ml的蒸馏水，加热煮沸，冷却至40℃-50℃后倒入无菌培养皿中（注意不要产生气泡），冷却后备用。2.2实验方法2.2.1采样点选择根据鄱阳湖流域的地理分布特点确定六个采水点，如图1所示，分别记为：青山闸、观鸟台、托山、吴城、星子、九江渡口，根据这6个采样点的分布特点，将1、2、3采样点划分为鄱阳湖流域上段，分别为青山闸、观鸟台、托山；4、5采样点划分为鄱阳湖流域中段，分别为吴城、星子；九江渡口是鄱阳湖与长江交汇处的入口，为鄱阳湖流域下段。定于2016年5月至2017年2月期间，每个月采样一次，并保证每个月采样时间一致或相近。采样可根据具体实际情况进行调整，由于7月和8月期间，为鄱阳湖涨水时期，为确保实验代表性，故这两个月没有安排水样采集。每个采样点每次采集水样60L，分别用消毒的25L和10L的聚乙烯塑料桶储存。6 第2章材料与方法图1鄱阳湖流域采样地点分布2.2.2理化指标的检测2.2.2.1水温和气温使用水银温度计测量水温，将其一段浸入水样中，垂直静置2分钟后，观察读数并记录；同理用水银温度计测量气温，观察值并记录。7 第2章材料与方法2.2.2.2地理坐标采样点的经纬度使用GPS定位仪进行测定并记录。2.2.3病毒的检测本次实验检测的病毒包括：诺如病毒I型、诺如病毒II型、肠道病毒及腺病毒。病毒的定性检测方法依据美国夏威夷大学公共卫生实验室建立的方法。采用滤膜过滤装置，使用孔径为0.45μm的HA型滤膜对水样进行病毒浓集处理，并将附着浓集病毒的滤膜放置于5ML离心管中，进行接下来的操作[15]。病毒的定量检测方法采用的是军事医学科学院建立的方法，利用载阳电荷滤料对50L水样进行浓集后，用甘氨酸复合三倍营养肉汤洗脱液洗脱，在洗脱液中加入PEG6000使之浓度为13%，然后以8000rpm/min的转速对洗脱液进行离心30min，弃上清，用生理盐水反复冲洗离心管壁，最后定容至40ML，放入-80℃冰箱中保存[16,17,18]。2.2.3.1病毒的定性检测-美国夏威夷大学公共实验室建立的方法（1）病毒核酸的提取本实验用于定性检测的病毒为诺如病毒I型和II型、肠道病毒、腺病毒，病毒核酸的提取根据thePowerWater®RNAIsolationKit试剂盒的说明进行操作。准备工作：①水浴锅温度设置为55℃；②PWR1液的加热准备（55℃）；③PWR2、PWR3、PWR4、PWR5、PWR6、PWR8液的准备（室温保存15-25℃）提取的步骤：①吸取990μlPWR1+10μlβME到5ml装有滤膜的离心管中，剧烈震荡5分钟，室温4000rpm离心1分钟，吸上清液放入新离心管中。②加入200μlPWR2，轻微震荡，4℃孵育5分钟，13000rpm4℃离心1分钟，吸上清液放入新离心管中。③加入650μlPWR3和650μlPWR4，轻微震荡，13000rpm4℃离心1分钟，吸上清液放入新离心管中。8 第2章材料与方法④加入650μlPWR5，轻微震荡，13000rpm4℃离心1分钟，吸上清液放入新离心管中。⑤加入650μlPWR4，轻微震荡，13000rpm4℃离心1分钟，吸上清液放入新离心管中。⑥加入62μlPWR8（不要震荡），4℃孵育5分钟，13000rpm4℃离心1分钟，弃吸附柱。⑦分别吸取上述45μl液体用于RNA提取，剩余15μl为提取好的DNA⑧加入5μlPWR6，4μlDNaseI于上述45μl液体中，室温孵育20分钟，加热5分钟后，为已提取出的RNA。⑨将收集好的RNA标记好，放于-20℃冰箱中保存。（2）病毒的逆转录本实验采用Random引物。腺病毒为DNA病毒，直接用水样DNA为模板进行后续检测。①加入Random引物1μl和RNA模板8μl共9μl，轻微震荡后在65℃保持5分钟，然后冰浴2min。②冰浴之后，按照以下条件加入到每个反应体系中，共20μl。2×ESReactionMix10µLEasyScript®RT/RIEnzymeMix1µLTotalvolume20µL轻微震荡并离心。③在PCR仪中设置条件为25℃10min42℃30min85℃5min直接用来做后续实验，或-20℃保存一周。（3）病毒的定性检测反转录后的病毒核酸按照下表的引物进行夏威夷实验室建立的定性PCR检测。9 第2章材料与方法表1定性PCR引物及探针设计病毒引物序列(5'→3')参考文献诺如病毒I型QNIF4CGCTGGATGCGNTTCCAT[19]NV1LCRCCTTAGACGCCATCATCATTTAC诺如病毒II型COG2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG[20]COG2RTCGACGCCATCTTCATTCACA肠道病毒EQ-1ACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCT[21]EQ-2CCAAAGTAGTCGGTTCCGC腺病毒ADV-FGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT[22]ADV-RGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC（4）2%琼脂糖凝胶的配置及电泳1）配制用于电泳及制胶用的0.5×TBE缓冲液。2）称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。3）加入电泳缓冲液。4）在微波炉中加热。待溶液沸腾后，取出锥形瓶，轻轻摇动，使琼脂糖充分熔化，注意不要产生气泡，重复操作大约三次，直至琼脂糖全部熔化。5）吸取适量溴化乙锭滴入锥形瓶中，使其充分混匀。6）在制胶板适当位置插上梳子，将琼脂糖溶液倒入制胶板中。7）室温条件下于通风橱内静置，待胶凝固（大约30min～60min）后放置于电泳槽中进行电泳。8）通过凝胶成像系统观察4种病毒扩增条带。2.2.3.2病毒的定量检测–军事医学科学院建立的载阳电荷滤料法（1）病毒核酸的提取分别采用病毒RNA提取试剂盒和UNIQ-10柱式病毒基因组提取试剂盒，提取病毒的RNA和DNA，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。（2）病毒的逆转录同定性试验操作。10 第2章材料与方法（3）病毒的定量检测反转录后的病毒核酸按照下表的引物进行军事医学科学院建立的定量PCR检测。表2PCR引物及设计病毒引物序列(5'→3')参考文献诺如病毒IINV-II-FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG[23]型NV-II-RTCGACGCCATCTTCATTCACANV-P5`-(FAM)TGGGAGGGCGATCGCAATCT(TAMRA)-3`肠道病毒EV-FGTGGCRGTGGCTGCGYT[23]EV-RACCCAAAGTAGTCGGTTCCGCEV-P5`-(FAM)ATTAGCCGCATTCAGGGGCCGGA(TAMRA)-3`腺病毒Adev-FAACTTTCTCTCTTAATAGACGCCCC[24]Adev-RTGTCCACTAGTCCAAGAGGTGCAdev-P5`-(FAM)GCTGACACGGGCACTCTTCGC(TAMRA)-3`2.2.4细菌指示指标的检测–参照《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750.12-2006中的滤膜法（1）取1ml的待测水样进行梯度稀释，分别稀释至10-1，10-2，10-3备用，记为-1，-2，-3。具体操作方法：①将消毒后的试管排列好，每支试管中加入9ml事先配制好的PBS缓冲液。②吸取1ml待检水样，加进第一支试管中，振荡混匀后标为10-1。从10-1中吸取1ml加进第2支试管中，混匀均匀后，标为10-2，同理稀释10-3。（2）实验器材的准备将抽滤漏斗装置和滤膜置于沸水中煮沸，杀菌消毒后，冷却待用。（3）菌落总数测定按照1，-1，-2，-3各1ml的顺序对水样进行过滤检测，每个梯度平行过滤2张膜。标记为1，-1，-2，-3。具体操作如下：①分别取1ml原液（标记为1），10-1稀释液（标记为-1），10-2稀释液(标记11 第2章材料与方法为-2)和10-3稀释液（标记为-3），分散均匀加在滤膜上，然后连接抽滤装置进行抽滤，将水抽完。②旋开滤斗，用镊子将滤膜轻轻取出，移至相应的培养基上，使用滚动贴膜法将滤膜贴于培养基上，注意滤膜与培养基之间不能有气泡，贴好滤膜以后，相应位置标记。③将平板放于37℃培养箱中培养18至24h。（4）总大肠菌群、粪大肠菌群和肠球菌和测定按照-1稀释液1ml，原液1ml，10ml及100ml的顺序对水样进行检测。分别标记为-1、1、10、100。具体操作如下：①分别取1ml原液（标记为1），10-1稀释液（标记为-1），10-2稀释液(标记为-2)和10-3稀释液（标记为-3），分散均匀加在滤膜上，然后连接抽滤装置进行抽滤，将水样抽完。②旋开滤斗，用镊子将滤膜轻轻取出，移至相应的培养基上，使用滚动贴膜法将滤膜贴于培养基上，注意滤膜与培养基之间不能有气泡，贴好滤膜以后，相应位置标记。③将总大肠菌群、肠球菌平板放于37℃培养箱中，粪大肠菌群放在44.5℃培养箱中培养18至24，计数滤膜上的菌落。（5）大肠埃希氏菌的检测将长有总大肠菌群的滤膜用镊子平行移至MUG营养培养基中，翻转平板，置于37℃培养箱中培养4h后，置于366nm波长的紫外灯荧光检测器下照射，观察有蓝色荧光菌落的即为大肠埃希氏菌。12 第2章材料与方法2.2.5技术路线图消毒采样容器配制甘氨酸复合三倍营养肉汤洗脱液制作培养基采样前准备水样的采集与保存夏威夷方法浓缩水中肠道病毒军事医学科学院载阳电荷滤料法浓缩水样指示微生物的检测肠道病毒核酸的提取甘氨酸复合三倍营养肉汤洗脱每次吸取1ml稀释的不同液浓度的水样于滤膜处过滤洗脱液浓集将滤菌滤膜贴于培养基表提取出的DNA提取的RNA病毒（诺如病面病毒（腺病毒）毒I型和II型、肠道病毒）肠道病毒核酸的提取反转录成cDNA分别置于指定温度的培养基中培养第一次RT-PCR扩增提取出的DNA提取出的计数滤膜上菌落病毒（腺病毒）RNA病毒第一次RT-PCR扩增反转录成cDNA2%琼脂糖凝胶电泳阳性样品送至华大基因公司进行基因测序实时荧光定量PCR检测NCBI官网进行BLAST序列比对13 第2章材料与方法2.2.6质量控制为了实验结果的准确性，在定性实验中，每次实验均设有阴性对照和阳性对照，保证了实验结果的可靠性；定量实验中，为避免待测样品RNA携带的PCR抑制剂对实验的影响，在每个反应管中均添加了质控RNA标准品，同时设置了对照组。对所有实验数据进行试录入，合格后再正式录入。使用边录入边核查的方式进行数据录入，录入完毕后，再次对数据进行核对，纠正错误，保证实验数据录入过程中的质量。2.2.7统计学方法本研究为调查性研究，理化指标、细菌指示指标为定量指标，病毒有定性和定量两种结果。定性检测记为阴性和阳性。12月、1月为冬季，2月为春季，5月、6月为夏季，10月和11月为秋季；5月、6月、10月定为丰水期，其余时间为枯水期。描述性统计分析采用描述性统计方法分析指示微生物和病毒的地域季节性差异。符合正态分布的数据使用最大值、最小值、平均值和标准差进行描述性分析。非正态分布的描述性分析包括最大值、最小值、中位数、四分位数间距。计数资料使用检出率进行描述分析。影响因素分析单因素分析：正态分布使用单样本Kolmgorov-Smimov拟合优度检验验证，符合正态分布（P＞0.05）的两组间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较用单因素方差分析，采用LSD（Least-significantDifferences）进行组间多重比较，若方差不齐时，采用近似F检验Brown-Forsythe法，组间多重比较选用Dunnett-t法。对不符合正态分布(P＜0.05）的数据，先进行对数转换后，符合正态分布的按照上述统计方法进行检验；不符合正态分布的，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组间的比较采用Kruskal-WallisH法。14 第3章结果第3章结果正态性检验结果显示，理化指标包括气温、水温指标数据符合正态分布。细菌指示指标、病毒指标的数据不符合正态分布，进行对数转化后，细菌指示指标和病毒指标符合正态分布。3.1鄱阳湖流域各指标的情况以及季节地域性差异3.1.1理化指标结果3.1.1.1地理位置2016年5月至2017年2月期间，对上述6个采样点每月进行采样、检测，共计7个月，采样点GPS坐标范围如表3。表3采样点GPS坐标范围采样地点北纬（N）东经（E）青山闸28°43’28”115°55’47”观鸟台28°41’13”115°53’56”托山28°56’17”116°21’12”吴城29°26’17”116°2’41”星子29°26’17”116°2’42”九江渡口29°25’47”115°48’49”3.1.1.2气温和水温共采样42个，期间气温最高为6月份33℃，最低为1月份2℃。水温最高为6月份30℃，最低为2月份2℃。不同季节间的气温和水温均有显著性差异。单因素方差分析结果显示，水温和气温在不同季节的均值方差不齐（P＜0.01），通过近似F检验Brown-Fosythe法，水温和气温在组间有统计学差异（P＜0.001）。通过Dunnett-t检验方法做多重比较，水温和气温在春季和秋季间的15 第3章结果均值没有显著差异，其余组间均有显著差异（P＜0.01）。详细见表4。表4水温和气温在不同季节间的分布和差异情况指标季节（n）最大值（℃）最小值（℃）xsFP气温春季（6）221218.20±3.87夏季（12）332531.20±1.2032.75＜0.001秋季（12）291012.00±5.60冬季（12）826.58±1.89全年（42）33216.80±16.00水温春季（6）221017.30±4.50夏季（12）302429.30±2.0033.51＜0.001秋季（12）23913.00±5.10冬季（12）525.17±1.59全年（42）30216.00±9.903.1.2病毒定性检测结果3.1.2.1不同季节间各病毒情况诺如病毒I型采样期间所有采样点检出阳性20例，检出率为47.60%；季节分布中，春季（100.00%）、秋季（66.70%）阳性检出率最高，采用Kruskal-WallisH法得出，季节之间检出率的差异无统计学意义（2=3.778P=0.052）。诺如病毒II型采样期间采样点检出阳性13例，检出率为31.00%。季节分布中，冬季（58.30%）、春季（50.00%）阳性检出率最高，不同季节之间阳性检出率无统计学差异（2=1.063P=0.303）。采样期间所有采样点肠道病毒检出阳性24例，检出率为57.10%；季节分布中，春季（83.33%）、秋季（75.00%）阳性检出率最高，采用Kruskal-WallisH法得出，季节之间检出率的差异无统计学意义（2=2.760P=0.097）。肠道腺病毒采样期间阳性检出27例，检出率为64.30%。季节分布中，检出率最高为春季（83.30%）和秋季（75.00%），季节间差异没有统计学意义。3.1.2.2不同汛期间病毒情况汛期分布中，诺如病毒I型丰水期检出率更高，为61.11%，采用Wilcoxon法得出，汛期之间的检出率的差异无统计学意义（2=2.244P=0.134）。诺如病毒16 第3章结果II型枯水期检出率更高，为38.89%。采用Wilcoxon法得出，汛期之间的检出率的差异无统计学意义（2=0.082P=0.775）。肠道病毒枯水期检出率更高，为77.78%。采用Wilcoxon法得出，汛期之间的检出率的差异无统计学意义（2=0.032P=0.859）。腺病毒枯水期检出率更高，为77.78%。采用Wilcoxon法得出，汛期之间的检出率的差异无统计学意义（2=0.844P=0.358）。见表4。3.1.2.3不同采样点间各病毒情况诺如病毒I型和II型不同采样点之间的检出率的差异无统计学意义。肠道病毒在不同采样点间差异有统计学意义（2=7.321P=0.007），且在星子和九江渡口检出率最高，为71.43%。腺病毒在九江渡口检出率最高，为100.00%。采用Kruskal-WallisH法得出，采样点之间的检出率的差异有统计学意义（2=6.326P=0.012）。见表5。表5不同季节、汛期及采样点间病毒检出情况分组(N)诺如病毒I型诺如病毒II型肠道病毒腺病毒季节春季6(%)6(100.00)3(50.00)5(83.33)5(83.33)夏季12(%)2(16.67)1(8.33)5(41.67)6(50.00)秋季12(%)8(66.70)2(16.67)9(75.00)9(75.00)冬季12(%)4(33.33)7(58.33)5(41.47)7(58.33)汛期丰水期18(%)11(61.11)6(33.33)10(55.55)13(72.22)枯水期24(%)9(37.50)7(29.17)14(58.33)14(58.33)采样点青山闸7(%)3(42.85)3(42.85)3(42.85)3(42.85)观鸟台7(%)3(42.85)2(28.57)2(28.57)4(57.14)托山7(%)4(57.14)1(14.28)3(42.85)3(42.85)吴城7(%)4(57.14)3(42.85)4(57.14)5(71.43)星子7(%)2(29.00)1(14.28)5(71.43)6(85.71)九江渡口7(%)4(57.14)3(42.85)5(71.43)7(100.00)17 第3章结果3.1.3病毒定量检测结果表6鄱阳湖水系肠道病毒定量检测情况(GC/L)时间地点诺如病毒II型肠道病毒腺病毒2016/05青山闸9194.1393307964.69391356.683观鸟台1305.2746678.05518723.710托山0.000567784.16639011.350吴城8487.976156782.11768253.220星子453796.760229082.253575727.800九江渡口4159765.000456673.042598343.3202016/06青山闸9877789.3422906864.3226688789.100观鸟台0.0006897.344458765.000托山0.00068079.3421055444.900吴城9099.89925633.684897789.990星子567734.25634456.8998779980.000九江渡口2345899.910455647.677899877.6702016/10青山闸401920.3433861981.2691050365.473观鸟台100294.7857468483.828556938.996托山0.0000.0000.000吴城38981076.2001673658.401573599.924星子22524039.3803300643.593789725.504九江渡口183513.6152293563.937428489.8602016/11青山闸1257891.3582837055.2412000809.924观鸟台113051.2086330130.055718723.713托山56680339.1005741566.166968011.548吴城857487.9761391322.117558253.151星子55374096.7602027416.253755727.306九江渡口6154197581.000955726.042698343.3222016/12青山闸102608659.5005385941.7282461629.333观鸟台0.0000.0000.000托山4935578.9338003342.049631161.083吴城0.0000.0001220268.533星子13252817.8101124448.134313665.410九江渡口743226.388801767.340164452.4622017/01青山闸5868.7100.000721280.710观鸟台0.000678879.776721280.710托山0.0000.000765789.430吴城7898.980778890.6640.000星子10099.675898761.0328793345.680九江渡口3567823.670700876.564808803.45018 第3章结果本实验检测病毒为诺如病毒II型，肠道病毒和腺病毒三种。在鄱阳湖水样中这三种病毒均有不同程度的检出，其中腺病毒检出率最高，为91.67%，肠道病毒与诺如病毒II型的检出率分别为86.11%、77.78%。鄱阳湖水系定量检测病毒情况如表6所示。3.1.3.1诺如病毒II型采样期间诺如病毒II型所有采样点共检出阳性28例，检出率为77.78%。最大值2016年11月的九江渡口，为6154197581GC/L，最小值为无检出。Levene检验得出诺如病毒II型在采样区域进行分组后得到其方差不齐，单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。Levene检验得出诺如病毒II型在采样点方差不齐。单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。3.1.3.2肠道病毒肠道病毒采样期间所有采样点检出阳性31例，检出率为86.11%。最大值2016年12月的托山，为8003342.049GC/L，最小值为无检出。Levene检验得出肠道病毒在采样区域进行分组后得到其方差不齐，单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。Levene检验得出肠道病毒在采样点方差不齐。单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。3.1.3.3腺病毒腺病毒采样期间所有采样点检出阳性33例，检出率为91.67%。最大值2017年1月的星子，为8793345.68GC/L，最小值为无检出。Levene检验得出诺如病毒II型在采样区域进行分组后得到其方差不齐，单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。Levene检验得出诺如病毒II型在采样点方差不齐。单因素方差分析显示，不同采样点间差异无统计学意义。3.1.4指示微生物检测结果3.1.4.1菌落总数采样期间所有采样点的菌落总数指标分析，最大值为十月份的渡口（51000cfu/mL）；最小者为一月份观鸟台(5cfu/mL)，检测检出率达100.00%。表5为菌落总数不同采样点的分布和差异情况，采样点进行分组后用Levene检验得出菌落总数用得到其方差不齐（P<0.001）。秩和检验分析显示，不同采样点间19 第3章结果2差异有统计学意义（=14.491P=0.013）。图3为采样期间不同汛期和不同季节菌落总数分布箱式图，不同汛期（P=0.723）和不同季节（P=0.191）间资料通过Levene检验得到其均为方差齐性。单因素方差分析显示，不同汛期间菌落总数的差异无统计学意义，不同季节间的菌落总数的差异也无统计学差异。表7菌落总数不同采样点间（cfu/mL）的基本分布情况采样点最大值中位数最小值P25P75F’P青山闸（7）3100050005023014000观鸟台（7）6500120510190托山（7）650012020201450014.4910.013吴城（7）225009502003902200星子（7）34500350280300390渡口（7）5100037000140245044000图2菌落总数不同汛期和季节间分布箱式图3.1.4.2总大肠菌群采样期间所有采样点的总大肠菌群的指标分析，检出率达52.40%。最大值为2016年十一月和2017年二月份的青山闸，值为（220000cfu/mL）。表8为总大肠菌群不同采样点分布和差异情况，Levene检验显示采样点分组后Levene检20 第3章结果验显示方差不齐(P=0.011)。不同采样区域总大肠菌群之间的差异无统计学意义，不同采样点的差异无统计学意义。图3为全年不同汛期和不同季节的总大肠菌群的分布箱式图，不同汛期和不同季节间指标资料通过Levene检验得到其方差不齐。秩和检验分析显示，不2同汛期间总大肠菌群的差异无统计学意义（=1.528P=0.224）。总大肠菌群在不2同季节间差异无统计学意义（=1.098P=0.362）。表8总大肠菌群不同采样点间（cfu/mL）的基本分布情况采样点最大值中位数最小值P25P75FP青山闸（7）2200007000022000观鸟台（7）1000001006.4130.267托山（7）1000001750吴城（7）310000050星子（7）200500050渡口（7）1005000100图3总大肠菌群不同汛期和季节间的分布差异箱式图3.1.4.3粪大肠菌群粪大肠菌群的指标分析显示其检出率达38%，最大值为2016年十一月和2017年二月份的青山闸，值为（240000cfu/1mL）。表9为粪大肠菌群不同采样点的分布和差异情况，采样点进行分组后用Levene检验得到方差不齐（P<0.001）。秩和检验分析显示，不同采样点粪大肠菌群之间的差异无统计学意义。21 第3章结果图4为粪大肠菌群不同汛期和不同季节的分布箱式图，Levene检验不同汛期和不同季节间指标资料其方差不齐。秩和检验分析显示，不同汛期间粪大肠2菌群的差异无统计学意义（=5.239P=0.222）。不同季节间的粪大肠菌群的差异2也无统计学意义（=4.239P=0.356）。表9粪大肠菌群不同采样点间（cfu/mL）的基本分布情况采样点最大值中位数最小值P25P75FP青山闸（7）240000000240000观鸟台（7）1000001006.9950.221托山（7）100000500吴城（7）24005000星子（7）1005000100渡口（7）100500100图4粪大肠菌群不同汛期和季节间的分布箱式图3.1.4.4大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌的指标分析显示其检出率达21.42%，最大值为2016年十一月份和2017年二月份的青山闸，值为（3000cfu/1mL）。表10为大肠埃希氏菌不同采样点的基本分布和差异情况，用Levene检验得出采样点分组后方差不齐。秩2和检验分析显示，不同采样点的差异有统计学意义（=9.042P=0.107），Dunnett-t法对采样点间多重比较得出：青山闸与九江渡口之间的差异有统计学意义。图5为大肠埃希氏菌不同汛期和不同季节的的分布箱式图，不同汛期和不22 第3章结果同季节间指标资料通过Levene检验得到其均为方差不齐。秩和检验分析得出，不同汛期间大肠埃希氏菌的差异无统计学意义（F=1.785P=0.789）。不同季节间的大肠埃希氏菌的差异也无统计学意义（F=0.807P=0.498）。表10大肠埃希氏菌不同区域和采样点间（cfu/mL）的基本分布情况采样点最大值中位数最小值P25P75FP青山闸（7）3000200003000观鸟台（7）1000010托山（7）100001009.0420.107吴城（7）1000000星子（7）100000渡口（7）1500015图5大肠埃希氏菌不同汛期和季节间的分布差异箱式图3.1.4.5肠球菌肠球菌的指标分析显示其检出率达40.48%，最大值为2017年一月份的青山闸，值为（150cfu/1mL）。表11为肠球菌不同采样点基本分布和差异情况，Levene检验得出采样点分组后方差不齐。秩和检验分析显示，不同采样点的差异有统2计学意义（=25.566P=0.0001），青山闸与观鸟台、青山闸与托山、青山闸与吴城，九江渡口与观鸟台之间的肠球菌的差异有统计学意义。图6为肠球菌不同汛期和不同季节的分布箱式图，Levene检验得出，不同季节间指标资料通过到其均为方差齐性（P=0.066），不同汛期分组指标方差齐性23 第3章结果（P=0.761）。单因素方差分析显示，肠球菌在不同汛期间的差异无统计学意义（F=0.791P=0.507）。不同季节间肠球菌的差异无统计学意义（F=0.136P=0.714）。表11采样期间不同区域和采样点间肠球菌（cfu/mL）的基本分布情况采样点最大值中位数最小值P25P75FP青山闸（7）1508106110观鸟台（7）0000025.5660.0001托山（7）00000吴城（7）00005星子（7）75015渡口（7）5070510图6肠球菌不同汛期和季节间的分布差异箱式图3.2指标间的相关性结果采用Spearman等级相关，分析理化指标、细菌指示指标及病毒之间的相关性。结果显示,气温与水温的相关系数最高，rs=0.964(P＜0.01）。细菌与气温均呈正相关，菌落总数（rs=0.207），总大肠菌群（rs=0.301），粪大肠菌群（rs=0.268），大肠埃希氏菌（rs=0.301），肠球菌（rs=0.304），P值均小于0.05。五种细菌指示指标菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希式菌和肠球菌之间的两两24 第3章结果做相关性，其中菌落总数与总大肠菌群、大肠埃希氏菌呈正相关(P＜0.01)，大肠埃希氏菌与总大肠菌群、粪大肠菌群呈正相关（P＜0.01）。病毒结果显示，诺如病毒I型和II型与气温呈负相关，诺如病毒I型相关系数rs=-242，诺如病毒II型相关系数rs=-2.219，P值均小于0.05。诺如病毒I型和II型与水温呈负相关，诺如病毒I型相关系数rs=-295，诺如病毒II型相关系数rs=-2.248，P值均小于0.05。病毒之间无相关关系，未发现肠道病毒与指示微生物之间具有相关性。表12细菌、病毒和理化指标间的Spearman等级相关分析结果菌落总大肠粪大肠大肠埃诺如病诺如病肠道病气温水温肠球菌腺病毒总数菌群菌群希式菌毒I型毒II型毒气温1.000水温0.964a1.000菌落总数0.207a0.266a1.000总大肠菌群0.301a0.245a0.353a1.000粪大肠菌群0.268a0.308a0.1790.6731.000大肠埃希式菌0.301a0.281a0.395a0.842a0.714a1.000肠球菌0.304a0.267a0.2540.153-0.0020.1311.000诺如病毒I型-0.242a-0.295a-0.016-0.180-0.205-0.1930.0701.000诺如病毒II型-0.219a-0.248a0.019-0.064-0.130-0.219-0.1960.1871.000肠道病毒0.1350.1350.004-0.254-0.072-0.110-0.0060.248-0.0451.000腺病毒0.1990.1500.002-0.143-0.042-0.131-0.0510.114-0.0380.2581.000注：a等级相关结果P＜0.05;3.3两种实验方法检测病毒的比较3.3.1结果比较通过配对卡方检验比较分析两种实验方法的结果显示，夏威夷实验室建立的方法与军事医学科学院建立的方法检测肠道病毒的结果差异无统计学意义（P＜0.005）。25 第3章结果表13两种实验方法的结果比较夏威夷方法军事医学科学院方法合计阳性阴性阳性31334阴性202合计333363.3.2其他参数比较军事医学科学院使用的方法中，用于核酸提取的开始容积为DNA:1ML;RNA:140µL。而夏威夷实验室使用的方法中，用于核酸提取的开始容积为600µL，并且全部用于DNA和RNA。两方法最终提取出的核酸数量也不相同，军事医学科学院方法提取出的核酸数更多，总共180µL核酸，夏威夷方法总共提取出了60µL核酸。在实验时间的花费上，夏威夷方法在病毒浓集和提取部分耗时更少，总共耗时不超过1小时，军事医学科学院方法耗时至少6小时。表14两种实验方法其它方面比较项目军事医学科学院方法夏威夷方法用于病毒浓缩的水样品体积50L500-2000mL洗脱液终体积40mL<5mL病毒浓缩时间>6小时<1小时用于核酸提取的开始容积DNA：1MLDNAandRNA：≦600µLRNA：140µL提取出的核酸最终体积DNA：100µL,DNA：15µL,RNA：80µLRNA：45µL所用试剂盒价格QIAampViralRNAMiniKit:¥3010;thePowerWater®RNAUNIQ-10OrderViralGenomeDNAIsolationKit:¥4500ExtractionLit:¥54426 第4章讨论第4章讨论4.1鄱阳湖流域肠道病毒及细菌污染状况鄱阳湖作为长江供水的吞吐型湖泊，拥有极其丰富的生态资源，其为当地居民提供丰富的水产品和观赏性娱乐场地。但是随着工业化和城镇化的进程，使得多元化污染物污染湖泊，鄱阳湖的水质状况发生了恶化。当前，还没有专家学者检测过鄱阳湖水系中肠道病毒的存在状况。鄱阳湖水系的总体水质状况越来越严重，2008年以来，全年的湖体水质劣于Ⅲ类的面积比例逐渐下降。从汛期与非汛期的变化来看，2008年以来，鄱阳湖水质呈下降趋势，尤其是在非汛期[25]。本次研究为第一次在江西南昌鄱阳湖水系检测其肠道病毒污染状况，结果显示：所有水样品均检测到阳性病毒，这意味着鄱阳湖水系存在污染问题。除此之外，此次研究中，腺病毒是四种病毒中检出率最高的病毒，其结果与Connell2012和Tong2011年的研究结果一致[26,27]。本次实验所检测的四种病毒在每一个采样点至少检出一次阳性结果，意味着鄱阳湖水系可能存在持续的粪便污染。其原因可能来自两个方面：第一.来自鄱阳湖五大流域污染物，这五大流域分别是赣江、抚河、信江、饶河和修河；第二.鄱阳湖水系有来自居民区、城市废水、工业废水和农业污染[28]。同时，肠道病毒能隐藏在人类和温血动物的粪便里[29]，并通过水中的鱼贝类释放到水里，使得水质被粪便污染[30]。采样点中观鸟台位于鄱阳湖南部，属于南矶山自然保护区，许多候鸟会在冬季迁徙过来，因此水中也会有大量候鸟活动留下的粪便。而拥有同样地理特征的还有吴城和星子采样点，因有大量游客到此，加大了此处水质的人为娱乐功能，也带来了潜在的水质污染，这也就能解释吴城和星子这两个采样点肠道病毒的检出状况。青山闸被检出诺如病毒I和II型、肠道病毒和腺病毒这四种病毒的存在，意味着青山闸的污染较为严重，可能的原因是：青山闸与其它采样点的不同指出在于其位置更靠近南昌市区，承载南昌市区的废水排泄，并且它还是赣江南部分支汇入鄱阳湖的交汇口。在本次实验采样期间，发现青山闸采样点水面有漂浮来自城市的各种生活垃圾和工业废水，并且有特殊难闻气味，27 第4章讨论因此增加了水质污染状况和肠道病毒的阳性检出率。本实验的5种细菌指示指标：菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希式菌和肠球菌之间做相关性，其中菌落总数与总大肠菌群、大肠埃希氏菌有相关性，大肠埃希氏菌与总大肠菌群、粪大肠菌群有相关性。这可能是由于菌与水温和水体环境有关，水温会同时影响指示菌。4.2中国当前使用的水质指示指标介水传染病能够通过饮用被致病微生物或者病原体污染的饮用水、进行诸如游泳、划船和水上运动等娱乐活动所获得[31]。许多水中病原体来源于人类和动物粪便，这些病原体通过粪-口途径在公众间传播。饮用水微生物安全评价应该致力于保护人类免受介水传染病的影响，因为水中可能含有导致介水传染病发生的病原体，如细菌、病毒和原生生物。中国在1983年制定《地表水质量标准》，1988年修订后引入总大肠菌群这一指标，之后修订引入了粪大肠菌群，但没确定其标准。最近使用的是2002年修订的《中华人民共和国地表水环境质量标准》（GB3838-2002），其内容有关于粪大肠菌群的标准。粪便指示菌用来监测水体是否存在粪便污染，同时也可能出现在其他被肠道致病微生物污染的水体中。总大肠杆菌、粪大肠杆菌、大肠埃希氏菌和粪链球菌因为相比其他病原体简单易测，目前普遍被用来评价水质污染状况[32]。然而，当前使用的所有细菌指示物都不能满足所有理想的水质指示标准[33]。另一方面，肠道病毒能通过粪便排放，因此，废水中也能检测到其的存在。废水处理的过程并不能完全消除病毒的浓度和感染性，因此，能够污染饮用水而造成健康风险[34]。有文献显示肠道病毒的存在并不总是与细菌指示物如大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的存在有关[35,36,37]。细菌总数和大肠菌群数用于指示微生物污染。细菌总数代表水中总的微生物污染情况，大肠菌群数代表总的致病微生物污染。然而，一些致病微生物如肠道病毒，对氯耐受性比细菌更强，所以其对公众健康会造成潜在危害。因此，肠道病毒被一些研究者作为一种选择性指示物评价水质标准。比如：Allmeann等人使用夏威夷大学建立的方法检测中国武汉娱乐水中的肠道病毒存在状况。该研究通过在符合娱乐水标准的水中检测出了肠道病毒的存在，证实了肠道病毒对氯的抵抗力很强[38]。除此之外，陈慧玲等人使用实时荧光定量PCR的方法28 第4章讨论检测深圳水中的肠道病毒，并指出加强肠道病毒的监测是非常有必要的[39]。但是，由于多种原因的存在使得肠道病毒直到现在在中国还没有作为一项用于检测水质的指示指标。4.3两种检测水中肠道病毒方法分析本次研究使用国内外两种实验方法进行水中肠道病毒浓集和病毒检测，比较两种方法发现两方法检测肠道病毒的结果无统计学差异，但是两实验方法的其他参数比较发现各有其优缺点，目前肠道病毒的检测方法还处在探讨和摸索阶段，寻找一种肠道病毒的快速有效并且可靠的检测方法至关重要，其中肠道病毒的浓集方法是整个检测过程的关键所在，直接影响肠道病毒的检出效果。本实验中，夏威夷大学使用的膜过滤吸附法浓集病毒，所需采集的水样少，病毒浓集时间较快，但由于滤膜能承载的量有限，在湖水较混浊的情况下，就算静置后再进行过滤浓集，还是会因为水中的细小固体悬浮物和水体细菌的存在造成水样通不过滤膜，导致滤膜上富集的病毒较少，影响检测结果。军事医学科学院使用的载阳电荷滤料法浓集病毒后进行定量检测，病毒浓集时间较慢，需采集的水样较多，但是其检测方法能确切检出病毒数量。目前常用的水中病毒浓集方法有絮凝沉淀法、吸附洗脱法、超滤法、免疫法、细胞培养法等。例如南华大学则先后使用粗滤膜和微孔过滤膜去除水中的固体悬浮物和水体细菌进行预过滤，再使用新型阳离子纳滤膜富集水体中病毒，但是预处理膜在使用同时，不仅去除了大颗粒物，也把聚集的病毒吸附，或把固体物中的病毒也一起去掉了，导致病毒检出率降低[50]。因此，膜过滤法需要进一步探索在过滤过程中过滤次数和过滤时间以及水样是否进行预处理和如何进行预处理等问题。29 第5章结论第5章结论1.在2016年5月-2017年2月共7个月采样期间，6个采样点均检测到肠道病毒阳性，说明鄱阳湖水存在一定的人类粪便污染；2.鄱阳湖可用于农业、运输、养殖、蓄洪、调节生态功能、捕鱼、划船等，因此需要建立有效可靠的水质监测系统以保护公众健康；3.病毒检测阳性不一定意味着具有感染性病毒的存在。但这一结果意味着当地政府有必要加强对湖水污染的监控，特别是要尽快确认当前污染的来源，从而有效控制污染的持续；4.未发现在鄱阳湖检测到的肠道病毒和细菌微生物以及病毒与细菌微生物具有相关性，说明仅依赖细菌微生物作为水质检测指标是不够的，在今后的检测中，要同时检测细菌和肠道病毒，从而确保水质检测和水质安全评估的准确性。30 致谢致谢三年的研究生生涯转瞬即逝，留下的无限珍贵的回忆，现在即将结束，心中有颇多感慨和无尽的感恩。虽然研究课题和实验任务都是较为繁琐和艰辛，不过有幸是我有老师、同学、朋友和亲人的指导帮助和鼓励，让我能在完成好课题和实验的同时，撰写好毕业论文。首先要感谢的是我的导师南昌大学公共卫生鲁元安教授、南昌大学公共卫生学院袁兆康教授，非常荣幸在研究生的三年里有二位导师的谆谆教诲和不厌其烦的指导帮助。鲁老师严谨的教学爱度，袁老师崇高的治学态度，您们的严于律己，对待科研的专注精神是我的榜样，让我受益匪浅。鲁老师对我科研的帮助，让我对英文文章的写作有了一定的经验；对我生活上的关怀，让我觉得温暖备至。袁老师耐心的帮我修改文章，教我如何写作构思，使我在研究生生涯得到了锻炼。本人课题从选题、构思、实验材料、实验方法、写作和修改都凝结着这二位导师的和心血。在这里向这二位导师表示真挚的感谢和崇高的敬意和感谢！同时感谢徐群英老师和军事医学科学院谌志强老师对我实验方面提供的帮助，感谢学院里各位老师的谆谆教诲和帮助。感谢统计教研室刘晓君、潘冰冰师兄师姐们在课题中的指导，感谢美国夏威夷大学公共卫生学院的袁芳、His-Tong师姐在实验中的耐心帮助，感谢许蕊、杨继平师姐在实验中的指导，感谢黄凌、谢飞、刘蓉、潘文进、姜晓庆、王健等同学们的给力支持。非常感谢有你们的陪伴鼓励和支持帮助，让我的研究生生涯过得充实且圆满。最后向我敬爱的老师们和可爱的同学表示衷心感谢，真心感谢你们的耐心帮助和支持！祝福大家在今后的生活中，越来越好，一切顺利！31 参考文献参考文献[1]罗喜成,刘润萍,王景峰.从水资源现状看水资源保护的重要性[J].民族高等教育研究,2009,15(2):68-69.[2]HaiyanD.Correlationandimprovedmeasuresbetweendrinkingwaterqualityandurbanpublichealth[J].ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse,2012,107-112.[3]DziubanEJ,LiangJL,CraunGF,HillV,YuPA&PainterJ,etal.Surveillanceforwaterbornediseaseandoutbreaksassociatedwithrecreationalwater-unitedstates,2003-2004[J].Mmwr.surveillanceSummariesMorbidity&MortalityWeeklyReport.surveillanceSummaries,2006,53(8):1-22.[4]XueliE,BoL.Theinfluenceofdrinkingwaterpollution[J].ChineseJournalofPublicHealthEngineering,2006,5(1):3-5.[5]SinclairRG,JonesEL,GerbaCP.Virusesinrecreationalwater-bornediseaseoutbreaks:areview[J].JournalofAppliedMicrobiology,2009,107(6):1769-1780.[6]马宁，肖利红.不同污染指示菌对河流的细菌学评价[J].环境监测管理与技术,2002,14(1):24-26.[7]刘灵芝,黄毅.水体中大肠杆菌的生物检测法2斑贝检测法[J].微生物学杂志,2002,22(3):41-44.[8]FormigaCruzM,AllardAK,CondenHanssonAC,etal.Evaluationofpotentialindicatorsofviralcontaminationinshellfishandtheirapplicabilitytodiversegeographicalareas[J].Appl.EnvironmentalMicrobiology,2003,69(3):1556-1563.[9]ByamukamaD,MachRL,KansiimeF,etal.Discrimi2nationefficacyoffecalpollutiondetectionindifferenta2quatichabitatsofahigh2altitudetropicalcountry,usingpre2sumptivecoliforms,Escherichiacoli,andClostridiumperfrin2gensspores[J].Appl.EnvironmentalMicrobiology,2005,71(1):65-71.[10]HarwoodVJ,WhitlockJ,WithingtongV.Classificationofantibioticresistancepatternsofindicatorbacteriabydis2criminantanalysis:Useinpredictingthesourceoffecalcontaminationinsubtropicalwaters[J].Appl.EnvironmentalMicrobiology,2002,66(9):3698-3704.[11]KinzelmanJ,NgC,JacksonE,GradusS,etal.EnterococciasindicatorsofLakeMichiganrecreationalwaterquality:Comparisonoftwomethodologiesandtheirimpactsonpublichealthregulatoryevents[J].Appl.EnvironmentalMicrobiology,2003,69(1):92-96.[12]BorchardtMA,BertzPD,SpencerSK,etal.IncidenceofentericvirusesingroundwaterfromhouseholdwellsinWisconsi[J].Appl.EnvironmentalMicrobiology,32 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综述综述国内外饮用水水质微生物指标的使用比较及展望朱慧(综述)鲁元安袁兆康（审校）摘要：近年来，因接触被微生物污染的饮用水而导致人类介水传染病频繁发生。介水传染病能引起呕吐、腹痛腹泻、心血管疾病等，严重时可导致死亡等危害公众健康的后果，使得饮用水水质卫生越来越被重视，其中病原微生物污染是水中主要的污染源。现如今，普遍用于评价水质状况好坏的主要水质指标为总大肠菌群和大肠埃希氏菌。然而，接触符合水质微生物指标的水依旧能引起水生疾病的发生，由此提出问题---目前用于评价饮用水水质安全标准的微生物指标是否足够安全可靠？饮用水中主要病原微生物包括细菌、肠道病毒、原生生物和藻类，这些病原微生物在国内外不同国家均不同地作为选择性水质指标来监测水质安全。因此，研究国内外不同的饮用水水质评价指标及其以及使用是必不可少的，尽管诸如肠道病毒的病原微生物被建议作为一项水质指标评价饮用水水质，但在中国仅使用细菌微生物和原生生物作为微生物指标。此篇综述主要通过研究国内水质指示标准的使用情况，从中揭示国内指示指标的主要不足之处，更好的完善国内水质指示标准。1.研究背景水既是人类赖以生存生存的必需元素，也是传播疾病的重要介质。生活饮用水安全更是重大的公共卫生问题。据报道，全球疾病负担中6%与水质有关[1]。随着经济的不断发展，水质污染问题变得日益严重，从而影响生活饮用水的质量。WHO的研究调查发现，全球80%的疾病是由接触了受污染的饮用水导致的，能引起包括消化道疾病、感染性疾病、皮肤病、癌症等多种疾病在内的超过50种严重疾病的发生[2]。在美国，在2011-2012年间报道了32起饮用水污染导致的介水传染病的暴发，至少431人患病，102人住院，14人死亡[3]。在中国，每年将近有2.5亿人患有感染性疾病，将近一千到二千万死于感染性疾病。据报道，35 综述在1980至1998年间，伤寒发病率在江苏省每年已达到34.34/10万人，总报告病例为42万[4]。中国拥有排名世界第六的丰富的水资源，然而，由于中国人口居多，人均水资源就变得相当少了。全国600个城市中大约有300个城市处于水质缺乏地区。除此之外，日益严峻的水污染问题也使得水资源日益匮乏。因此，完善当前水质指示系统对于中国来说是极其重要的事情。介水传染病能够通过饮用被致病微生物或者病原体污染的饮用水、进行诸如游泳、划船和水上运动等娱乐活动所获得[5]。许多水中病原体来源于人类和动物粪便，这些病原体通过粪-口途径在公众间传播。饮用水微生物安全评价应该致力于保护人类免受介水传染病的影响，因为水中可能含有导致介水传染病发生的病原体，如细菌、病毒和原生生物。微生物水质指标通常是一种特殊的微生物，它们能通过粪便物质进入水中，但其测量的方法要比那些对人体健康构成威胁的微生物更容易测量[6]。一种有用的指标必须具备以下特点：必须广泛存在于人类和其他温血动物体内；必须简便易测；不能出现在自然水、环境或者水配网系统[7]。目前，粪便指示菌用来监测水体是否存在粪便污染，同时也可能出现在其他被肠道致病微生物污染的水体中。总大肠杆菌、粪大肠杆菌、大肠埃希氏菌和粪链球菌因为相比其他病原体简单易测，目前普遍被用来评价水质污染状况[8]。然而，当前使用的所有细菌指示物都不能满足所有理想的水质指示标准[9]。另一方面，肠道病毒能通过粪便排放，因此，废水中也能检测到其的存在。废水处理的过程并不能完全消除病毒的浓度和感染性，因此，能够污染饮用水而造成健康风险[10]。有文献显示肠道病毒的存在并不总是与细菌指示物如大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的存在有关[11,12,13].除此之外，与目前使用的其他细菌指示物相比，水中噬菌体的存在于人类肠道病毒的存在更为相似。除了上述提到的微生物指标外，水质指示标准中还有其他使用的指标，但是在不同的国家使用情况不同。本文选择世界部分国家，描述其水质指示系统中使用的微生物指标，并水质标准的异同之处，评价现有的水质指示系统，并列举了常用的微生物指示指标极其在当地的使用情况。本文的主要目的是对目前用于评价微生物指示指标系统进行分析讨论，指出我国饮用水标准存在的问题并提出建议。36 综述2.三大水质指示系统及标准在当今世界的许多国家，存在许多不同类型的水质指示标准。其中三种代表性的标准：美国环保局（USEPA）的国际饮用水标准；欧盟（EC）的《饮用水水质指令》；世界卫生组织（WHO）的《饮用水水质准则》，这三大标准也是其他部分国家制定本国水质标准的基础。2011年，世界卫生组织（WHO）发布第四版《饮用水水质准则》，包括28种公认的水生病原体微生物指标。其中12种细菌、8种病毒、6种原生生物和2种寄生虫[14]。目前使用的美国环保局的国际饮用水标准是2009年发布的，该标准被分为两个部分：国家一级饮用水标准（NPDWRs）和国家二级饮用水标准（NSDWRs）。其中国家一级饮用水标准属于强制性标准，总共包括7种微生物指标。与其相比，1998年通过的欧盟饮用水水质指令98/83/EC只包含了2种微生物指标。3.目前世界部分国家使用的不同水质指示系统3.1中国水质指示系统目前，国家水环境标准与人类健康之间的关系一直是中国关注的焦点[16]。饮用水水质标准是确保饮用水使用安全的标准，并且为卫生部门检测饮水安全提供基础。中国饮用水水质标准的原则是：1.不允许水中出现病原微生物；2.水中化学物质和放射性物质不能对人类健康造成伤害；3.水的感官性状良好。上海是中国第一个建立当地饮用水管理系统的城市，并且政府于1950年颁布饮用水水质标准。随着饮用水水质标准的建立，卫生部于1955年起草饮用水临时标准方案，并将其在全国12个城市付诸实施。1959年，该饮用水临时标准方案重新被卫生部命名为饮用水水质标准，该标准有2个细菌学指标：细菌总数和大肠菌群数[17,18]。虽然该标准在1976年和1985年之间被修改过三次，但是直到2001年，大肠埃希氏菌才被被作为细菌指示物加入标准中[19]。随着原生动物导致的疾病数量的增多，贾第鞭毛虫和隐孢37 综述子虫在2006年被添加至标准中。具体指标和限制罗列于表1中。细菌总数和大肠菌群数用于指示微生物污染。细菌总数代表水中总的微生物污染情况，大肠菌群数代表总的致病微生物污染。然而，一些致病微生物如肠道病毒，对氯耐受性比细菌更强，所以其对公众健康会造成潜在危害。因此，肠道病毒被一些研究者作为一种选择性指示物评价水质标准。比如：Allmeann等人使用夏威夷大学建立的方法检测中国武汉娱乐水中的肠道病毒存在状况。该研究通过在符合娱乐水标准的水中检测出了肠道病毒的存在，证实了肠道病毒对氯的抵抗力很强[20]。除此之外，陈慧玲等人使用实时荧光定量PCR的方法检测深圳水中的肠道病毒，并指出加强肠道病毒的监测是非常有必要的[21]。但是，由于多种原因的存在使得肠道病毒直到现在在中国还没有作为一项用于检测水质的指示指标。表1.部分国家饮用水微生物水质标准比较国家/组织指示物限值中国总大肠菌群不得检出耐热大肠杆菌不得检出大肠埃希氏菌不得检出菌落总数100(CFU/ml)贾地鞭毛虫<1/10L隐孢子虫<1/10L世界卫生组织（WHO）总大肠菌群不得检出/100ml大肠埃希氏菌不得检出耐热大肠杆菌不得检出肠球菌不得检出噬菌体不得检出肠道病毒不得检出欧盟（EU）菌落总数(22℃)100/ml菌落总数(37℃)20/ml大肠埃希氏菌0/250ml肠球菌0/250ml铜绿假单胞菌0/250ml产气荚膜梭菌0/250ml38 综述（续表1）国家/组织指示物限值美国环境保护署（USEPA）粪大肠菌群和大肠埃希氏菌公共卫生目标:0总大肠菌群0隐孢子虫0病毒0贾地鞭毛虫0日本一般细菌<100/ml大肠杆菌不得检出新加坡同WHO英国肠球菌龙头水：0/ml大肠埃希氏菌大肠杆菌水库水：0/ml大肠埃希氏菌法国菌落总数(22℃)<100/ml(72h)菌落总数(37℃)<10/ml(24h)总大肠菌群0/100ml耐热大肠杆菌0/100ml粪链球菌0/100ml沙门氏菌0/5L粪便噬菌体0/50ml肠道病毒0/10L德国大肠埃希氏菌管网水：0/100ml处理水：100/1ml俄国菌落总数100/ml总大肠菌群3/1000ml病原微生物不得检出/50ml大肠埃希氏菌不得检出/100ml肠球菌不得检出/100ml耐热大肠菌群不得检出/100ml杆噬菌体不得检出/100ml梭状芽胞杆菌孢子不得检出/20ml澳大利亚大肠埃希氏菌不得检出/100ml总大肠菌群不得检出/100ml39 综述3.2亚洲其他国家水质指示指标3.2.1日本水质指示指标日本卫生部在1955年7月颁布第一个饮用水标准。这一标准参照WHO的饮用水水质准则，并在此基础上修订了两次[22]。1993年，日本将一般细菌和大肠菌群作为微生物指标。其中一般细菌为不超过100/毫升，大肠菌群在水中不得检出。最新修订的水质标准于2015年4月1日实施，其中使用的微生物指标与中国使用的较为接近[23]。总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌均不得在水中检出，一般细菌检出量不得超过100/毫升。3.2.2新加坡水质指标新加坡，一个坐落亚洲东南部马来西亚半岛最南端的一个热带岛屿国家[24]，并且新加坡是一个没有地下水的国家，其主要水源来自于以下四个因素：海水淡化、新生水、水库水和来自例如马来西亚等国家的水供应。其中水库水的作用是相当重要的，因为其不仅仅提供饮用水资源，也提供了娱乐水资源。因此，当地政府更加重视水库水的管理和水质监测[26]。新加坡使用的水质标准是参照WHO颁布的饮用水水质标准，该指南于1965年被世界卫生组织起草，并于1986年颁布第四此修改的指南，新加坡政府于2011年7月在国际水资源周正式发布此次指南[27]。第一次和第二次修改的指南，只有两个微生物指标。当第三次修订指南时，WHO开始关注各种各样的微生物指标，添加了25个新的水质病原体指标。直到2011年，世界卫生组织开始表明被病原微生物污染的水质导致的介水传染病对人类健康的影响风险，并且将致病微生物放于首位。因此，最新指南发布与2011年，具有28项水生病原微生物，其中包含12项细菌和8项肠道病毒。3.3.3马来西亚水质指标在马来西亚，主要的水资源是河流和小溪，这在很大程度上取决于降雨量[28]。马来西亚水质标准的建立是以WHO水质标准和澳大利亚水质标准为基础的。除此之外，马来西亚根据本国情况添加了其他指标。根据1990年颁布的标准，马来西亚微生物指标包含7种。总大肠菌群和肠道病毒选择使用WHO1984年颁布的饮用水准则的微生物标准。当前用于检测总大肠菌群的方法有：最大近似数（MPN）和滤膜过滤法。这两种方法有不同的指标限制。该标准的优点就是根40 综述据不同的水资源制定不同的检测频率（表2）。表2.马来西亚饮用水微生物指标测试频率指标限制参考处理水水库水管网水井水MPN法:<10/100ml;总大肠菌群WWM2YWHO膜过滤法:3/100ml粪大肠埃希氏菌0/mlWWM2Y粪链球菌0WNWNWNWNBritish梭状芽胞杆菌0WNWNWNWN病毒0WNWNWNWNWHO原生动物0WNWNWNWN寄生虫0WNWNWNWNW:每周至少检测一次;M:每月至少检测一次;2Y:两年检测一次;WN:必须检测指标3.3欧洲国家水质指标欧共体（目前称作“欧盟”）由28个国家组成，如法国、德国和其他欧洲国家根据成员国标准（75/440/EEC）颁布了其本国的水质标准。目前，水质保护两个重要的指南：1）欧盟水质指南（98/83/EC）和2）水框架指南(2006/60/EC)。在欧盟水质指南（98/83/EC）中，水质微生物指标有大肠埃希氏菌和肠球菌，指南规定每1毫升水中不得检出微生物，则认为水质是安全的[29]。该指南是针对每一个成员国提出的，每个成员国可以根据自己的情况修改指标[30]。欧洲绝大多数国家都采用的上述指南，但是有些国家，比如英国、法国和德国等国家是以欧盟水质指令为标准建立的本国特定的水质标准，而俄罗斯，不以欧盟水质指令为基础，已经建立了属于本国自己的标准。在欧盟国家中，英国拥有发达的经济和最丰富的水资源，其中主要水资源为河流。1996年，英格兰和威尔士颁布地表水水质标准。该标准规定了细菌指标，如龙头水中肠球菌和大肠埃希氏菌每1毫升不得检出，水库水和出厂水中大肠菌群和大肠埃希氏菌每1毫升不得检出[31]。该标准与欧盟水质指令一致。在2000年，水供应（水质）标准规定用于饮用水的地表水资源标准与1996年41 综述标准相同。该水质指示系统由三个组织负责：水务署、饮用水检测系统和饮用水委员会[30]。法国当前主要使用的饮用水水质标准（95-368）是参照欧盟标准EU80/778/EC，并分别在1990年、1991年和1995年进行了三次修订。大多数指标值是欧洲最高耐受值，特别是综合型微生物指标标准。法国水质标准有7种微生物病原体，5种细菌指示物和2种病毒。细菌指示物：大肠埃希氏菌和粪肠球菌均要求么哦100毫升不得检出，梭状芽孢杆菌被要求每20毫升不得超过1个，沙门氏菌被要求每5升不得检出，葡萄球菌被要求每100毫升不得检出。对病毒的要求则是每10升水中不得检出病毒，噬菌体每50毫升不得检出[32]。位于欧洲中部的德国是一个拥有许多跨国流域河流的国家。尽管在德国，水短缺并不是主要问题，但是水污染状况确实一个巨大的隐患[33]。德国在20世纪70年代经历了经济的快速发展，伴随而来的是严重的环境污染问题。因此，除了参与欧盟有关政策和规则的修订，德国根据本国河流情况制定了许多自己的标准。1986年5月22日德国开始实行了法国饮用水法则，另外，2000年颁布的德国标准中清楚的规定饮用水需要满足一下要求：（1）不得存在病原体；（2）对人类健康无害；（3）无大多数微生物。大肠埃希氏菌被要求管网水中每100毫升不得检出；处理过的水中每1毫升不得超过100[34]。俄罗斯的首都莫斯科拥有俄罗斯四分之三的人口。俄罗斯的饮用水源主要来自于集中式供水。俄罗斯中部城市式定居地埃文基自治区生物污染达到27%，其他地区生物污染相对低一些（2.5%-12%）。污染源主要来源于一般细菌（17.5%），大肠埃希氏菌（12.5%）[35]。俄罗斯饮用水标准由卫生部制定，具有其一定特色的。因其标准水平与国际标准接近，俄罗斯政府制定了国家水质标准：饮用水标准2874-82以及1998年之后为新建水厂制定的健康标准-标准2.1.4.599-96。这两个标准的微生物指标显示在表3。42 综述表3.俄罗斯饮用水微生物指标单位标准Standard2874-82标准Standard2.1.4.599-96菌落总数/ml10050(95%)总大肠菌群/1000ml30(95%)病原微生物/50ml-0杆噬菌体/100ml-0梭状芽胞杆菌孢子/20ml-0大肠埃希氏菌/100ml-0(95%)肠球菌/100ml--耐热大肠杆菌/100ml-0注：标准Standard2874-82是国家标准;标准Standard2.1.4.599-96是1998年之后建立的健康标准。3.4美国水质指示指标1970年12月2日，美国成立了环境保护机构（EPA），旨在保护人类免受环境污染所带来的伤害。EPA制定了水质标准来确保人类用水安全。美国联邦政府国际技术咨询委员会（NTAC）于1968年提出了美国第一个水质标准。一些用于衡量娱乐水质卫生标准的指标有总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和肠球菌[36]。总大肠菌群和粪大肠菌群是美国环境保护机构于1976年提出使用的指标，并在水质标准中建议娱乐水质标准中：30天内采集至少5个样本数，粪大肠菌群数量水平不应超过每100毫升200个的对数值[37]。这一标准是国际技术支持委员会于1968年首次提出的，它被美国近95%的州和地区所采用[38]。饮用水和娱乐水中出现粪大肠菌群意味着水质被人或动物粪便所污染。大肠杆菌（总大肠杆菌和粪大肠杆菌）并不能完全反应经消毒处理后的水中病原体的存在，因为大肠杆菌对化学消毒的敏感性较高，且与原生动物和肠道病毒的存在并无关联[39]。另外，由于大肠杆菌在环境中也能生存，故已经被认为不是一种可以完全指示粪便污染的指标[40]。因此，肠道病毒、产气荚膜梭菌和噬菌体被提出作为评价饮用水的选择性指示指标[39]。Dufour于1972至1982年间研究三个地区海水和两个地区淡水水质，发现在胃肠炎和两种水质细菌指示物（肠球菌和大肠埃希氏菌）之间存在明显线性关系，但是胃肠炎的发生却与粪大肠菌群浓度之间无统计学关联[41,42]。由于大肠埃希氏菌、肠球菌和胃肠疾病的发生43 综述之间存在密切关联，美国环境保护署于1986年将大肠埃希氏菌和肠球菌作为粪便污染的指示指标[43]。1986年娱乐水质标准（RWQC）制定了肠球菌水质标准为33-35CFU/100ML[44]。粪便污染指示菌作为水质指标评价水质已经使用了大约一个世纪。然而，Ostrolenk等人提出肠球菌可能是相比大肠埃希氏菌更加合适的水质指示指标[44]。这一提议再20世纪70年代之后逐渐被证实[41,45,46]。目前，美国环境保护署推荐使用的评价娱乐水质的细菌学指标就是肠球菌，因为相比其他粪便指示菌如粪大肠菌群和大肠埃希氏菌，肠球菌的出现与人类健康影响有更强的相关性[46,47]。其他病原体如产气荚膜梭菌，则被认为是可能可以用于评价水环境污染的指标[48]。目前，水质监测使用的是2001年建立的国家一级饮用水标准（NPDWR），这是一项强制性标准。该标准中的微生物指标如表4所示。其中值得注意的是，该标准不仅规定了隐孢子虫、鞭毛虫、军团菌和肠道病毒这些在其他国家水质标准中并不常见的指标，还规定了浑浊度作为微生物指标，因为水质高浑浊度通常与病毒、细菌等其他病原微生物的存在有关[42]。美国环境保护机构修改使用大肠埃希氏菌和肠球菌作为评价淡水水质指标[44]。2000年10月，美国国会要求各州采用美国环境保护机构制定的指标并建立一个监控项目[50]。然而，由于生理生态学和不同数量的细菌指示物与病原体之间的关系，使得美国一些州根据在上述标准基础上本地实际情况添加使用指示指标。夏威夷、南加州、大湖州和南弗罗里达都是每股最受欢迎的四个海滩。2012年娱乐水质标准（RWQC）将这四个地区的气候、水质、动植物分布、降雨或干旱频率以及海水与淡水的不同之处与其它地区进行比较[44]。从1958年开始，加利福尼亚便使用总大肠菌群数作为当地娱乐水质标准，然而，1999年7月，提出需同时检测总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌[51]。夏威夷娱乐水质标准于1982年规定：要求其粪大肠菌群数每100毫升不得超过200[52]。同时因粪便指示菌通常可出现在环境、土壤和水中，因此夏威夷还将产气荚膜梭菌用于评价娱乐水质的第二指标。美国水质指示物目前还是使用细菌指示指标：总大肠菌群、粪大肠菌群和肠球菌来监测水质，然而，在细菌指示物的符合标准的水中却依旧能够检测到肠道病毒的存在。因此，美国的关注焦点在肠道病毒的研究和其他可更好的指示粪便污染的指标研究上[53]。44 综述表4.国家一级标准的微生物指标指标限制(mg/L)饮用水污染源隐孢子虫0人类和动物粪便贾地鞭毛虫0人类和动物粪便异养菌总数不明确自然存在军团杆菌0水中常见总大肠菌群（大肠埃希氏菌和粪大0总大肠杆菌:自然存在;肠菌群）粪大肠杆菌和大肠埃希氏菌:人类和动物粪便肠道病毒0人类和动物粪便浊度不明确土壤冲刷3.5澳大利亚水质指标澳大利亚是位于大洋洲的一个发达国家，因其水资源短缺，使得公众对水资源的关注非常重视。因此，在饮用水安全上，澳大利亚政府根据世界卫生组织、欧盟和美国环境保护机构制定的三大权威标准基础上，建立了本国相对完善的水质标准。该国的水资源管理是通过城市和城镇来管理的[54]。当前使用的原因是标准是1996年修订的，值得指出的是，该标准不仅有一般微生物指标，还囊括了一些不规则检测微生物指标[55]。22项包括细菌、病毒、原生生物、有毒藻类、大肠埃希氏菌和总大肠菌群在内的微生物指标均规定每100毫升水中不得检出，20项不规则检出的微生物指标中包括一些不得在水中检测的指标和一些由于数据不充分还不能被当做指标的微生物。此外，该标准要求对地表水的微生物检测必须一周一次，地下水微生物检测必须两周一次。肠道病毒：腺病毒、肠道病毒、诺如病毒和轮状病毒均能通过受污染的饮用水引起胃肠炎。尽管这些病毒指标没有给出限制，但是它们被列为保护公共卫生标准的指标。与此同时，由于军团菌和假单胞菌的研究数据不充分，并没有作为指示指标列于标准中。澳大利亚饮用水标准覆盖面比较广泛，均考虑到了能影响人类健康风险的微生物指标。3.6非洲水质指示指标非洲人口结构的变化将导致人口增长和城市化水平的提高，这就意味着到[56，57]2050年会有57.7%的非洲人将会居住在城市。发展中国家的基础设施跟不45 综述上人口增长和城市化步伐，这将增大水资源短缺和水污染发生的风险[58]。非洲将近有一半的人口不能饮用纯净的水源，三分之二的人口缺乏管理粪便排泄物的基础设施[59]。水质指标仅在南非水质标准（WQC）中于1984年规定粪大肠菌群为唯一水质指标，并规定：直接接触的娱乐水质中每100毫升不得超过100；饮用水中每100毫升不得超过15[60]。非洲大陆的水质指示系统的建立是一个巨大的难题，因为数据鲜为人知。由于非洲人口的增加、水资源供应和公共卫生服务资源紧缺，加上经济萧条、战乱、干旱和其他自然灾害，直接导致了饮用水安全无法得到保证。除此之外，非洲整个国家还没有建立起本国的水质监测标准，也并没有以三大权威标准作为水质评价标准，因此，对非洲国家来说，未来的关注重点应该在水质指标的建立和粪便处理的技术引进上。4.当前指标系统存在的挑战当前，WHO、EC和USEPA发布的饮用水水质标准是国际水平上最先进的水质标准，也是世界绝大多数国家水质标准的基础。这三大权威标准中，微生物指标分别有2、5、7项。世界卫生组织将微生物指标作为监测饮水安全的重要工具。因此在水资源的选择、清洁水的方法、消毒和水供应的过程中，需要建立使用高效的保护措施。尽管有些国家寻找并使用了可靠的方法检测病原微生物，但当前水质指示系统还是很大程度上依赖于细菌指示物来监测水质。细菌指示物如大肠埃希氏菌是监测水质粪便污染的一个很好的指标。但是，肠道病毒等其他病原微生物在世界绝大多数国家还没有被当作指标来监测水质安全。不同的国家也根据本国实际情况制定了微生物指标。在美国，USEPA颁布的国际饮用水标准已经相对比较完善，但是肠道病毒因其长时间存活率、低感染剂量、难检测度以及需要高敏感性检测方法等原因还未作为一项指标纳入标准中。此外，肠道病毒导致介水疾病发生的流行病学研究也缺少数据，这在当前是其作为指示指标纳入标准中的很大一个问题。在中国，水中肠道病毒的研究以及其他粪便污染指标的研究相对甚少。完善水质指示系统的挑战之一就是先使用更好显示污染的细菌指标。例如：产气荚膜梭菌因其与热带地区水生疾病的关系，夏威夷便将其作为一项水质指标纳入标准。在中国不同地区，有必要寻找相应的补充性指标监测水质。与此同时，当前细菌指示物的限制相对俄罗斯来说相对宽松[34],因此，需要做更加深入的研究来分析当前使用的指示指标对当前46 综述水质情况和粪便污染情况是否有效。据报道，中国的水传播疾病发病数量仍然很高，2004年四川省有123名学生感染了被污染的饮用水引起的肝炎[4]。5.建立新水质指示系统的需要---中国未来的指示指标系统展望由于微生物的潜在暴露使得中国更加关注饮水安全，为了提高水质安全，中国需要建立更加严格和完善的指示系统，并严格执行水质标准。中国饮用水质量至今仍然停滞了11年，经济的增长同时加剧了水质的恶化。全球水质关注点主要在微生物指标上，因此，未来指示系统需要考虑更多的细菌指示物、病毒指示物和原生生物作为水质指标，并根据当前水质质量重新评估其限制。6.总结本篇文章描述了世界一些国家饮用水监测系统指标信息。在公共卫生领域，水质安全一直是一个非常重要的话题。政府和政策决议者高度重视水传播疾病这一传播媒介。世界卫生组织饮用水标准建立的过程是非常严格的，包含大量参数，其微生物指标有总大肠菌群和大肠埃希氏菌。该标准作为世界许多国家制定水质标准的基础，如泰国和菲律宾，并且在新加坡和香港，该标准被当做水质指示标准监测本国水质。欧洲饮用水水质准则有总共5项细菌指标，在欧洲一些国家，如法国，已经将肠道病毒作为指示指标检测水质。美国环境保护机构微生物指标总共有7项，包括细菌指示物：粪大肠菌群和大肠埃希氏菌；隐孢子虫等原生生物；以及病毒。根据一些流行病学数据，一些原生生物如贾地鞭毛虫和隐孢子虫，都是水传播疾病相关的病原体。因此，在美国，英国，澳大利亚已经将这些病原体纳入标准中。为了更好的监测水质，中国有必要寻找并考虑纳入其他合适的细菌、病毒和原生生物作为微生物指示指标。47 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