《载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
西医科号：ＧｕａｎｘｉｌＵｉｇｉＭｅｄｃａｎｉｖｅｒｓｔｙ０１５２０２８０学号：２硕士学位论文载脂蛋白Ｅ对ＥＡＥ小鼠发病前期巨噬细胞分泌－ＭＭＰ－９、ＴＩＭＰ１及炎症因子的影响卢珍梅：神经病学导师姓名：唐玉兰专业名称申请学位类型：学术型学位答辩委员会主席：刘开祥答辩委员会委员：陆晖曾丽梁志坚罗曙光二〇一八年五月 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得广西医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过一的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字曰期：２帥年６月／Ｚ曰学位论文版权使用授扠书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：在校期间论文的知识产权属广西医科大学。学校有权保存论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印或其它手段保存、汇编本论文，学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同、媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定食办＾学位论文作者签名：ｆ每导师签字：５卢玲签字日期年＆月Ｕ日签字日期：年６月Ｋ曰 个人简历基本情况姓名：卢珍梅性别：女民族：壮族出生年月：1989年11月籍贯：广西南宁政治面貌：群众学习工作经历（从本科学历起）起止时间所在院校或单位学历学位职称2010.9-2015.7右江民族医学院学士无2015.9-至今广西医科大学硕士无研究生期间科研经历项目起止时间项目名称项目来源本人承担任务2015.1-2018.12载脂蛋白E对实验性自身免国家自然课题实施、疫脑脊髓炎的血脑屏障通透科学基金论文写作性的影响及作用机制地区基金项目研究生期间临床工作经历起止时间单位职称2018年1月-2018年4月广西医科大学第一附属医院实习医师 目录一、论文：载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响1.中文摘要........................................................................................................12.英文摘要........................................................................................................33.前言..............................................................................................................54.材料与方法....................................................................................................75.结果............................................................................................................126.讨论............................................................................................................157.小结............................................................................................................228.参考文献......................................................................................................239.中英文缩略词对照表..................................................................................32二、综述：巨噬细胞在神经免疫性疾病、神经退行性疾病中的作用1.正文..............................................................................................................342.参考文献......................................................................................................54三、致谢.............................................................................................................73四、攻读硕士研究生期间撰写的文章.............................................................75 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响摘要目的探讨载脂蛋白E（ApoE）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠发病前期脾脏巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）及炎症因子的影响。方法依照随机数字表法，20只ApoE基因敲除型(ApoE-/-)C57BL/6J小鼠分为ApoE-/-EAE组和ApoE-/-对照组，20只野生型(WT)C57BL/6J小鼠分为WTEAE组和WT对照组，每组10只。以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)作为抗原诱导ApoE-/-EAE组和WTEAE组小鼠，建立EAE模型，ApoE-/-对照组和WT对照组小鼠用生理盐水代替MOG35-55。造模后7d，提取小鼠脾脏巨噬细胞进行体外培养，用MOG35-55刺激ApoE-/-EAE组和WTEAE组巨噬细胞，予等量生理盐水处理ApoE-/-对照组和WT对照组巨噬细胞，48h后采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液中MMP-9、TIMP-1、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的浓度。结果WTEAE组巨噬细胞的MMP-9、IFN-γ、TNF-α及IL-6分泌量均明显高于WT对照组，ApoE-/-EAE组巨噬细胞的MMP-9、IFN-γ、TNF-α及IL-6分泌量均明显高于ApoE-/-对照组，ApoE-/-EAE组巨噬细胞的MMP-9、IFN-γ、TNF-α及IL-6分泌量均明显高于WTEAE组，WTEAE组巨噬细胞的TIMP-1分泌量明显高于WT对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在EAE发病前期，脾脏巨噬细胞分泌的MMP-9及炎症因子增多，而ApoE表达的缺乏进一步促进巨噬细胞分泌更多的MMP-9及炎症因子，ApoE可能会通过调节巨噬细胞分泌MMP-9及炎症因子，起到1 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响保护血脑屏障完整性、减轻炎症反应的作用。关键词载脂蛋白E，实验性自身免疫性脑脊髓炎，巨噬细胞，基质金属蛋白酶-9，基质金属蛋白酶组织抑制因子-1，炎症因子2 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响EFFECTOFAPOLIPOPROTEINEONSECRETIONSOFATRIXMETALLOPROTEINASE-9,MATRIXMETALLOPROTEINASETISSUEINHIBITOR-1ANDINFLAMMATORYFACTORSINMACROPHAGESATEARLYSTAGEOFEXPERIMENTALAUTOIMMUNEENCEPHALOMYELITISABSTRACTObjectiveToexploretheeffectofapolipoproteinE(ApoE)onsecretionsofmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9),matrixmetalloproteinasetissueinhibitor-1(TIMP-1)andinflammatoryfactorsinspleenmacrophagesatearlystageofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE).MethodsInaccordancewithrandomnumbertable,20ApoEknockout(ApoE-/-)C57BL/6JmiceweredividedintoApoE-/-EAEgroupandApoE-/-controlgroup(n=10);and20wildtype(WT)C57BL/6JmiceweredividedintoWTEAEgroupandWTcontrolgroup(n=10).Myelinoligodendrocyteglycoprotein35-55(MOG35-55)wasusedasantigentoinduceEAEmodelsintheApoE-/-EAEgroupandWTEAEgroup,andMOG35-55wasreplacedbynormalsalineinApoE-/-controlgroupandWTcontrolgroup.Thespleenmacrophageswereisolatedfrommiceafter7thdofmodelingandculturedin3 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响vitro;themacrophagesoftheApoE-/-EAEgroupandWTEAEgroupwerestimulatedbyMOG35-55,whilethemacrophagesoftheApoE-/-controlgroupandWTcontrolgroupweretreatedwithequivalentnormalsaline.Forty-eighthafterthat,thecontentsofMMP-9,TIMP-1,interferongamma-γ(IFN-γ),tumornecrosisfactor-α(TNF-α)andinterleukin-6(IL-6)intheculturemediumweredeterminedbyELISA.ResultsThecontentsofMMP-9,IFN-γ,TNF-αandIL-6intheWTEAEgroupweresignificantlyhigherthanthoseoftheWTcontrolgroup(P<0.05);thecontentsofMMP-9,IFN-γ,TNF-αandIL-6intheApoE-/-EAEgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheApoE-/-controlgroup(P<0.05);thecontentofMMP-9,IFN-γ,TNF-αandIL-6inApoE-/-EAEgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheWTEAEgroup(P<0.05).TheTIMP-1secretionofmacrophagesinWTEAEgroupwassignificantlyhigherthanthatinWTcontrolgroup(P<0.05).ConclusionsAtearlystageofEAE,macrophagessecretehighlevelsofMMP-9andinflammatoryfactors,andthedeficiencyofApoEfurthercontributestothesecretionsofMMP-9andinflammatoryfactorsbymacrophages.ApoEmayplayaroleinprotectingtheintegrityofblood-brainbarrierandalleviatingtheinflammatoryresponseofthecentralnervoussystemthroughtheeffectsonmacrophages.KEYWORDSApolipoproteinE,Experimentalautoimmuneencephalomy-elitis,Macrophage,Matrixmetalloproteinase-9,Matrixmetalloproteinasetissueinhibitor-1,Inflammatoryfactor4 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响前言多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是以慢性炎性脱髓鞘为主要病理特征的中枢神经系统常见自身免疫性疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)是公认的研究MS的动物模型。载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)是中枢神经系统中主要的载脂蛋白，具有调节脑血管完整性及抗炎作用[1,2]。外周组织中，ApoE主要由肝脏、巨噬细胞产生，起到调节胆固醇代谢的功能。人的ApoE属于多态性蛋白，分为ApoE2、ApoE3及ApoE4。随着人们对ApoE与多发性硬化的关注程度不断提高，越来越多APOE多态性与MS疾病关系的观点涌现，但看法不一[3-5]，至今ApoE在多发性硬化发病过程中的作用机制尚未明确。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及它的抑制物—基质金属蛋白酶(MMPs)组织抑制因子-1(TIMP-1)在血脑屏障完整性中扮演着关键角色。本课题组前期研究发现，在EAE发病后，ApoE表达的缺失能增加中枢神经系统中MMP-9的表达，加重血脑屏障完整性的破坏[6]，而ApoE拟肽可抑制中枢神经系统MMP-9的表达[7]，提示ApoE能保护EAE的血脑屏障完整性，但具体是通过何种机制呢？目前国内外未见相关报道。干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎症因子在MS/EAE发病中的作用值得注意，炎症因子IFN-γ和TNF-α不仅是疾病诱导的重要介质，而且是复发缓解型EAE疾病进展的重要介质[8]。本课题组发现，EAE发病后ApoE表达的缺失会促进CNS炎症因子IFN-γ、TNF-α及IL-6等的表达[9,10]，说明ApoE能减轻EAE的炎症反应。至于ApoE如何减轻EAE的炎症反应，值得探讨。研究显示MS/EAE模型中表达升高的MMP-9主要由单核细胞、巨噬细胞等分泌[11]。而巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，可分泌TNF-α、IL-6等炎症因子参与炎症反应[12]。有研究证实巨噬细胞分泌炎症因子过程在5 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响EAE发病中占有重要地位，同时其他免疫细胞如T细胞等也共同参与炎症反应[13]。那么，ApoE对EAE的血脑屏障完整性及炎症反应的影响是否与巨噬细胞分泌的MMP-9及炎症因子等有关呢？本研究通过体外培养EAE小鼠发病前期的脾脏巨噬细胞，观察ApoE表达的缺失对巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响，以探讨ApoE发挥保护EAE的血脑屏障完整性及减轻EAE的炎症反应的作用途径。6 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响材料与方法1.研究材料1.1实验动物SPF级雌性8~10周龄ApoE基因敲除型(ApoE-/-)C57BL/6J小鼠及野生型(WT)C57BL/6J小鼠各20只，体质量18~22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物许可证号——CXK(京)2009-0004]。所有实验动物在广西医科大学实验动物中心SPF级动物房饲养，给予普通饲料喂食。1.2主要试剂髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55上海生工生物工程有限公司(MOG35-55)(纯度>95%)百日咳毒素(PTX)美国Sigma公司完全弗氏佐剂(CFA)美国Sigma公司热灭活结核杆菌(H37Ra)美国Difco公司RPMI-1640培养基美国Gibco公司胎牛血清美国Gibco公司青霉素/链霉素液（双抗）美国Gibco公司小鼠基质金属蛋白酶9（MMP-9）武汉华美生物工程有限公司ELISA试剂盒小鼠基质金属蛋白酶组织抑制因子1武汉华美生物工程有限公司（TIMP-1）试剂盒小鼠γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂武汉华美生物工程有限公司盒小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）武汉华美生物工程有限公司ELISA试剂盒小鼠白介素6（IL-6）ELISA试剂盒武汉华美生物工程有限公司7 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响红细胞裂解液北京索莱宝有限公司PBS缓冲溶液北京索莱宝有限公司D-Hanks缓冲液武汉博士德有限公司200目筛网江苏世泰实验器材公司细胞培养瓶苏州海狸生物医学工程有限公司75%乙醇广西博哼医疗用品有限公司1.3主要仪器及设备4℃及-20℃冰箱中国海尔公司-80℃超低温冰箱日本三洋公司JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司制冰机日本三洋公司1000uL移液器德国Eppendorf公司100uL移液器芬兰CAPP公司10uL移液器芬兰CAPP公司离心机德国Eppendorf公司细胞培养箱上海智城分析仪器有限公司超净工作台上海浦东跃欣科学仪器厂酶标仪美国Bio-Rad公司2方法2.1建立EAE模型及分组将MOG35-55溶于0.01mol/LPBS，配成2mg/mL剂量，并与等量含4mg/mLH37Ra的CFA充分混匀，全玻璃注射器抽打成油包水乳状，制作成完全抗原。按照随机数字表法，将20只ApoE-/-C57BL/6J小鼠分为ApoE-/-EAE组和ApoE-/-对照组，20只WTC57BL/6J小鼠分为WTEAE组和WT对照组，每组10只。ApoE-/-EAE组、WTEAE组于小鼠背部多点皮下注射完全抗原(0.2mL/8 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响只)，免疫当天记为第0天，第0、2天分别给每只小鼠腹腔注射PTX500ng/次，ApoE-/-对照组与WT对照组除用生理盐水代替MOG35-55外其余步骤相同。2.2小鼠脾脏巨噬细胞体外培养及干预免疫后第7天，参考Nath等方法[14]制备小鼠脾脏巨噬细胞，具体步骤：（1）脱臼处死小鼠，75%酒精消毒，无菌操作解剖小鼠脾脏，置于预冷D-hanks清洗，200目筛网上均匀研磨小鼠脾脏，以无菌D-hanks冲洗过滤；（2）将滤液转移至15ml离心管，1000r/min离心5min，弃上清，重复洗涤离心，弃上清；（3）加入红细胞裂解液，冰上静置10min以去除红细胞，1000r/min离心5min，弃上清。D-hanks冲洗三次，离心同上。（4）加入RPMI-1640培养液悬浮沉淀，调整细胞数至5×106/ml，置于T25培养瓶，在37℃、5%CO2培养箱中培养；（5）2h后弃掉培养液（除去未贴壁的淋巴细胞等），用D-hanks液反复冲洗数次，贴壁即为巨噬细胞；（6）用10%血清、1%双抗(青霉素及链霉素)的RPMI-1640培养基（简称完全培养基）培养细胞；（7）ApoE-/-EAE组、WT-EAE组培养瓶中加入MOG35-5520ug/ml，ApoE-/-与WT对照组培养瓶加入等量生理盐水，置37℃、5%CO2培养箱孵育；（8）48h后吸取各组细胞培养液，1000r/min离心5min，取上清液保存-20℃待测。2.3细胞因子的检测（1）将试剂盒中的密封袋移至室温，室温平衡至少30分钟，从密封袋取9 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响出实验所需板条；（2）设置空白孔、标准孔、待测样本孔。空白孔中加入样本稀释液，标准孔中加入标准品，待测样本孔中加入稀释好的待测样本，加样体积均为100ul，轻轻晃动混匀；（3）用封板膜封板，37℃孵育箱中孵育2h；（4）预先备好生物素标记抗体工作液、洗涤工作液；（5）揭掉封板膜，弃去孔内液体，拍干，洗涤工作液200ul/孔，浸泡1min后弃去，重复5次，拍干；（6）空白孔中加入样本稀释液，100u/孔，其它每孔中加入生物素标记抗体工作液100u/孔，用新的封板膜封板，于37℃孵箱中孵育60min；（7）提前准备辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，避光室温放置；（8）弃去孔内液体，拍干，洗涤工作液200ul/孔，浸泡1min后弃去，重复5次，拍干；（9）在每个孔中加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100ul，使用新的封板膜封板，转至37℃孵箱中孵育60min；（10）提前打开酶标仪电源开关，预热仪器，设定检测程序；（11）操作同步骤（8）；（12）在每个孔中依序加入底物溶液90ul，使用新的封板膜封板，在37℃避光条件下孵育15-30分钟；（13）在每个孔中依序加入终止液50ul，轻弹板子，充分混匀，使反应终止；（14）在终止反应后的5分钟内利用酶标仪在450nm波长依序检测各个孔的光密度（OD）值；（15）记录机器的读数结果；（16）以标准品浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，以CurveExert1.4软件绘制标准曲线，通过标准曲线得以计算出待测样本的浓度值，记录结10 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响果。3统计学分析采用SPSS17.0软件处理数据，呈正态分布的计量资料以均数依标准差(χ±s)表示，2组间均数比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。11 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响结果1.各组巨噬细胞培养液中MMP-9、TIMP-1的浓度通过对各组巨噬细胞培养液的MMP-9、TIMP-1蛋白水平进行ELISA检测发现：与WT对照组相比，WTEAE组巨噬细胞培养液的MMP-9蛋白浓度明显升高；与ApoE-/-对照组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的MMP-9蛋白浓度明显升高；与WT对照组相比，ApoE-/-对照组巨噬细胞培养液的MMP-9蛋白浓度明显升高；与WTEAE组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的MMP-9蛋白浓度明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。具体内容见表1、图1。与WT对照组相比，WTEAE组巨噬细胞培养液的TIMP-1蛋白浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与ApoE-/-对照组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的TIMP-1蛋白浓度略微升高；与WT对照组相比，ApoE-/-对照组巨噬细胞培养液的TIMP-1蛋白浓度略微升高；与WTEAE组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的TIMP-1蛋白浓度基本等同，差异均无统计学意义(P>0.05)。具体内容见表1、图1。2.各组巨噬细胞培养液中IFN-γ、TNF-α及IL-6的浓度通过对各组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α及IL-6的蛋白水平进行ELISA检测发现：与WT对照组相比，WTEAE组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α、IL-6蛋白浓度明显升高；与ApoE-/-对照组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α、IL-6蛋白浓度明显升高；与WT对照组相比，ApoE-/-对照组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α、IL-6蛋白浓度明显升高；与WTEAE组相比，ApoE-/-EAE组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α、IL-6蛋白浓度明显升高，差异均有12 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响统计学意义(P<0.05)。具体内容见表2、图1。1各组巨噬细胞培养液中的MMP-9、TIMP-1浓度表1各组巨噬细胞培养液的MMP-9、TIMP-1浓度比较（x±s）组别MMP-9（pg/ml）TIMP-1（pg/ml）ApoE-/-对照组33.69±2.4630.88±3.91ApoE-/-EAE组484.64±23.39abc33.45±7.11WT对照组27.86±1.58a25.72±5.78WT-EAE组145.57±13.51ab33.03±3.57b与ApoE-/-对照组比较,aP<0.05；与WT对照组比较,bP<0.05；WT-EAE组比较,cP<0.052各组巨噬细胞培养液中的IFN-γ、TNF-α及IL-6浓度表2各组巨噬细胞培养液的IFN-γ、TNF-α及IL-6浓度的比较（x±s）组别IFN-γ(pg/ml)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)ApoE-/-对照组23.51±1.6577.09±4.7449.68±4.47ApoE-/EAE组92.97±4.37abc428.53±9.29abc770.12±39.52abcWT对照组18.85±0.71a84.28±4.09a36.39±3.83aWT-EAE组55.08±3.79ab293.64±19.44ab462.38±22.00ab与ApoE-/-对照组比较,aP<0.05；与WT对照组比较,bP<0.05；WT-EAE组比较,cP<0.0513 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响图1A、B、C、D、E依次是各组小鼠脾脏巨噬细胞培养液的MMP-9、TIMP-1、IFN-γ、TNF-α及IL-6浓度与ApoE-/-C组比较，*P<0.05；与WT-C组比较，！P<0.05；与WT-EAE组比较，#P<0.05.FigureA、B、C、D、EarerespectivelytheconcentrationofMMP-9、TIMP-1、IFN-γ、TNF-αandIL-6inculturemediumofSpleenmacrophages.*P<0.05，ComparedwithApoE-/-Cgroup；！P<0.05，comparedwithWT-Cgroup；#P<0.05，comparedwithWT-EAEgroup.14 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响讨论一、ApoE对EAE发病前期巨噬细胞的MMP-9、TIMP-1分泌情况的影响血脑屏障(BBB)将脑组织与血液隔开，有效阻止血液中的有害物质进入脑组织，对中枢神经系统(CNS)微环境稳态的维持至关重要。血脑屏障的组织结构由脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接、周细胞、星型胶质细胞足突、基膜及细胞外基质(ECM)组成[15]。各种类型的蛋白酶与细胞外基质降解有关，但基质金属蛋白酶（MMPs）被认为是参与细胞外基质降解的主要酶类[16]。MMPs家族是一组含锌的Ca2+依赖性肽链内切酶，其成员有明胶酶、胶原酶、基质分解酶、基质溶解酶和膜型基质金属蛋白酶[17]。明胶酶B(MMP-9)属于MMPs的明胶酶亚科，它能水解血脑屏障的基质成分，包括IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和硫酸乙酰肝素，破坏血脑屏障的完整性[18]。在MS病理学，MMP-9活性在所有MMPs中占主导地位[19]。作为MMPs的内源性抑制剂，基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）可逆地抑制MMPs的活性。目前已知的TIMPs由四种蛋白酶抑制剂组成，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4[16]。TIMP-1是MMP-9的有效抑制剂[17]。MMP-9、TIMP-1含量的改变与各种疾病有关[20,21]。MMP-9/TIMP-1的动态平衡，是保证血脑屏障完整性的必要条件，其比值失衡，在MS/EAE的发病机制中具有关键作用[22,23]。MMP-9被发现在不同类型的MS患者的血清和脑脊液中表达升高，而调控MMP-9活性的内源性抑制物TIMP-1的表达变化不明显[23-26]。利用明胶酶谱检测、正电子发射断层显像（PET）等方法也发现MMP-9在MS脑组织中表达升高，但TIMP-1无明显变化[6,27]。MMP-9在MS/EAE发病机制中发挥多种作用：1.降解细胞外基质，破坏血脑屏障，为免疫细胞侵袭中枢神经系统实质创造条件；2.降解髓鞘碱性蛋白[28]，基质金属蛋白酶（包括MMP-9）水解15 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响的髓鞘碱性蛋白的产物，是免疫原性肽的来源，可增强MS的自身免疫反应和导致表位扩散。作为CNS中最主要的载脂蛋白，ApoE是低密度脂蛋白(LDL)受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)等的配体，主要的生理作用是调节脂蛋白代谢[29]。ApoE还间接对抗谷氨酸所致的神经毒性损伤作用[30]，参与轴突再生[31]，通过不同的信号通路发挥神经保护作用[32,33]。此外，ApoE也有免疫调节方作用[34,35]。ApoE在众多神经系统疾病中具有重要的作用，人的ApoE属于多态性蛋白，分为ApoE2、ApoE3及ApoE4。近来，人们对APOE多态性与MS疾病关系的观点不一，有研究[3,36]认为ApoE等位基因4ε的存在与MS疾病的发展、MS患者的认知功能恶化相关，ApoE等位基因2ε对MS可能存在保护作用。有研究[4]则得出相反的结论，更是有研究[5,37]认为APOE多态性与MS的易感性、严重程度无相关性。小鼠只有一种ApoE亚型[38]，敲除小鼠的ApoE基因以制造ApoE蛋白的缺乏，是当今研究ApoE在各种疾病中的作用的常用手段。EAE是国内外公认的研究MS的动物模型，EAE可由MOG、髓鞘碱性蛋白（MBP）等作为抗原和完全弗氏佐剂诱导，诱发T淋巴细胞介导的自身免疫反应，EAE的病理特征、表现和MS相似[39]。国外研究学者发现，ApoE缺乏会增加年龄逐渐递增的老年健康小鼠（108天左右）的BBB通透性，但对年轻小鼠（31天左右）却无影响[40]。为了消除年龄对小鼠血脑屏障的影响，本实验严格控制小鼠的年龄（8-10周）。本课题组在EAE研究中发现，ApoE具有保护血脑屏障完整性的作用，ApoE基因缺失会增加EAE急性期小鼠中枢神经系统中MMP-9的活性，观察到的内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5和闭合蛋白的表达降低，提示血脑屏障通透性升高[6]。而予以ApoE拟肽治疗能抑制EAE慢性期小鼠中枢神经系统中MMP-9的表达[7]。这表明，在EAE中，ApoE可通过调节中枢神经系统中MMP-9的表达来保护血脑屏障的完整性。16 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响但是，ApoE具体是通过何种方式或途径调节中枢神经系统中MMP-9的表达呢？有研究报道，MS/EAE中MMP-9主要来源于巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等，TIMP-1也由分泌MMPs的细胞生成[11,41]。笔者推测，ApoE发挥保护EAE的血脑屏障完整性的作用途径是否与巨噬细胞分泌的MMP-9、TIMP-1有关呢？有研究已表明EAE发病时浸润中枢神经系统的主要细胞是T细胞、巨噬细胞，且MMP-9的表达水平升高[6,42,43]，但在EAE发病前期，关于中枢神经系统中巨噬细胞浸润及MMP-9的表达情况，目前尚少见报道。本研究采用MOG35-55制成乳化抗原后诱导C57BL/6J小鼠建立EAE模型，根据前人实验研究[6,9,42]，此模型多在8天后发病，为探讨EAE发病前期情况，本实验选择的时间点是免疫诱导后的第7天。本研究发现WTEAE组巨噬细胞的MMP-9分泌量明显高于WT对照组，TIMP-1分泌量亦升高但升高幅度相对较小；ApoE-/-EAE组MMP-9分泌量明显高于其对照组，TIMP-1分泌量却无明显改变，由于TIMP-1能与MMP-9以1:1比例特异性结合，阻断MMP9与底物的结合调节其活性，因此以上提示，在EAE发病前期，巨噬细胞参与了血脑屏障完整性的破坏。此外，ApoE-/-EAE组巨噬细胞的MMP-9分泌量亦明显高于WTEAE组，但两组的TIMP-1水平无明显差异，说明ApoE表达的缺失会增强EAE发病前期巨噬细胞对MMP-9的分泌，很有可能通过此种作用途径加重对血脑屏障完整性的破坏。本实验提示在EAE发病前期，ApoE缺乏不影响巨噬细胞TIMP-1分泌水平，而在动物实验研究、MS患者的临床检验中也显示，血清、脑脊液或脑组织中TIMP-1表现为小幅度降低或是无明显改变[6,23-27]]。总之，ApoE保护EAE的血脑屏障完整性的作用途径可能为：ApoE通过减少EAE发病前期巨噬细胞分泌MMP-9，进而影响中枢神经系统中MMP-9的表达，调节MMP-9在血脑屏障损伤中的作用，保护血脑屏障的完整性。17 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响二、ApoE对EAE发病前期巨噬细胞的炎症因子分泌量的影响IFN-γ、TNF-α、IL-6等炎症因子在MS/EAE发病中的作用不可忽视。在体外，从复发缓解型多发性硬化（RR-MS）患者采取外周血单个核细胞（PBMC），PBMC在MBP衍生肽刺激下，产生的IFN-γ水平与MS的功能损害相关[44]。TNF以两种生物活性形式存在，跨膜的TNF和可溶的TNF。在EAE，可溶性肿瘤坏死因子促进中枢神经系统炎症，跨膜的肿瘤坏死因子是神经保护因子[45]。TNF-α与MS进展有关，在多发性硬化脱髓鞘中的致病作用[46]。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE，抗TNF-α治疗减少EAE发病率和延迟发作，但对疾病的严重程度没有影响[47]。在疾病恢复期，进展型MS患者、RR-MS患者的血清IFN-γ、TNF-α、IL-6不同程度地高于健康者[8,48]。细胞因子IFN-γ和TNF-α不仅是疾病诱导的重要介质，而且是复发缓解型EAE疾病进展的重要介质[8]。参与MS复发的发病机理的主要Th1细胞因子是干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-a）、白细胞介素-1β（IL-1b）和IL-6[49]。关于炎症因子与血脑屏障关系的研究，Th1细胞因子激活脑内皮细胞（CEC）可调节血脑屏障[49]，另有研究在人脑微血管内皮细胞（HBMvEC）体外培养模型中，添加TNF-α或IL-6，诱导NADPH氧化酶活化和ROS生成，可能导致连接蛋白（VE-Cadherin,occludin,claudin-5,ZO-1)）的转录下调和连接复合体的翻译后修饰/下调，促进HBMvEC通透性增加[50,51]。巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成员，具有吞噬作用、抗原提呈作用、分泌活性物质等作用。巨噬细胞在MS中既能通过产生炎症因子等致病，又能协助中枢神经系统修复，发挥着双面作用[52]。近年来越来越多的研究表明ApoE具有抗炎作用[2,53]。ApoE基因敲除的胶质细胞体外培养，在LPS刺激下，表达的TNF-a,IL-1β,和IL-6升高[34]，其他研究[35,54]也表明ApoE缺乏增强胶质细胞的炎症反应。我们以MOG作为免疫18 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响原诱导小鼠启动外周免疫反应，并提取脾脏巨噬细胞进行体外培养，排除了神经胶质细胞在中枢发挥的免疫作用的干扰，更好地了解ApoE对巨噬细胞的影响。本研究发现，EAE组(ApoE-/-EAE组、WTEAE组)巨噬细胞的炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-6分泌量明显高于相应对照组，表明在EAE发病前期，巨噬细胞参与了免疫反应；而ApoE-/-EAE组巨噬细胞的炎症因子分泌量亦明显高于WTEAE组，提示ApoE表达的缺失会增强巨噬细胞产生的免疫反应。查阅相关文献，Valentin-TorresA等人[55]发现，中枢神经系统浸润巨噬细胞持续的TNF生成与进展型EAE的疾病严重程度相关，抗TNF单克隆抗体治疗后，疾病进展得到控制：中枢神经系统炎症得到减轻---髓鞘丢失和白细胞浸润以及巨噬细胞活化均减少；恢复了BBB完整性并增强了中枢神经系统的抗炎反应。结合文献[56]报道，笔者推测可能是由于ApoE表达的缺失，引起巨噬细胞表面的ApoE受体---极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)无法与ApoE结合，导致巨噬细胞向促炎表型(即M1型)转变，而给予ApoE补充可能可通过抑制巨噬细胞的免疫反应来减轻EAE的炎症反应。三、MMP-9与炎症因子在MS/EAE中的关系MS是一种以中枢神经系统慢性炎症脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。其可能的机制是CD4+T淋巴细胞对自身髓鞘抗原产生免疫应答。在外周，自身反应性CD4+T细胞被抗原呈递细胞激活后产生各类细胞因子，根据CD4+T细胞产生的细胞因子将其分类：1型辅助T（Th1）、Th2细胞、Th17细胞、T调节细胞（Tregs）等。经典的Th1细胞因子包括IFN-γ、TNF-a，Th2细胞则主要分泌IL-10、IL-4、IL-5等抗炎因子，Th17细胞最初是以其主要分泌的IL-17而命名。有研究发现，Th17细胞、CD4+T细胞均可产生IFN-γ和IL-17，将这类细胞称为Th1/Th17细胞[57,58]。此外，在MS发病中，CD8+T、B细胞等参与炎症反19 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响应及组织损伤[59]。本研究发现，在EAE发病前期，巨噬细胞分泌的MMP-9及炎症因子的表达水平均升高，ApoE表达的缺失可增强这一反应，提示ApoE、MMP-9及炎症因子之间可能存在某种联系。关于MMP-9与炎症因子之间的关系，有研究报道，一方面MMPs能激活TNF-α，使其具有生物活性[60]；。另一方面，促炎性T辅助1(Th1)型细胞因子和趋化因子，例如TNF–α、IL–1等，能促进MMP-9的产生，IL-6、IFN-γ等则促进或抑制MMP-9在各种类型细胞中的表达[61,62]。有研究通过静脉注射TNF-α给野生型小鼠后，发现血清TNF-α水平升高促进脑组织MMP-9的激活[63]。抗IL-6和抗TNF-α降低循环血白细胞释放的MMP-9蛋白水平，对MMP-9活性无影响，TIMP-1释放不受抗IL-6或抗TNF-α抗体的影响[64]。本实验中，巨噬细胞释放的IL-6、TNF-α水平升高，或许对巨噬细胞的MMP-9释放水平有促进作用，但不影响TIMP-1释放水平。另外有研究报道MMPs与白介素在MS中可能存在协同作用[65]。本课题组最近的研究也发现ApoE对星形胶质细胞的MMP-9表达的影响与星形胶质细胞分泌的炎症因子有关[66]。笔者推测，EAE中巨噬细胞分泌的MMP-9和炎症因子相互促进，形成正反馈效应，扩大炎症反应，同时ApoE表达的缺乏也促进这一炎症反应。有研究显示，ApoE表达的缺乏使巨噬细胞的miR-146a表达水平降低，引发miR-146a负调控的转录因子核因子-kB(NF-kB)通路激活,导致巨噬细胞诱发炎症反应；而在高脂血症小鼠炎症反应中，ApoE可通过此通路减轻炎症反应，进而抑制动脉粥样硬化[67]。小鼠脑外伤模型研究证实，ApoE表达的缺乏可通过增强NF-kB/MMP-9通路的激活，破坏血脑屏障的完整性[68]。笔者推测，在EAE中，ApoE表达的缺乏会增强NF-kB通路的激活，进而调控巨噬细胞的免疫反应及对MMP-9的分泌，影响EAE的血脑屏障完整性及EAE的炎症反应。综上所述，本研究发现，在EAE发病前期，经MOG35-55诱导活化20 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响的巨噬细胞的MMP-9及炎症因子分泌量增多，ApoE表达的缺乏可进一步增强巨噬细胞的分泌功能，ApoE可能是通过调节巨噬细胞分泌MMP-9及炎症因子，起到保护血脑屏障完整性、减轻炎症反应的作用。至于EAE发病后巨噬细胞发生了怎样的变化以及ApoE表达的缺乏会对巨噬细胞产生什么影响及其影响机制等问题，有待进一步研究证实。21 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响小结我们研究结果表明，在EAE发病前期，脾脏巨噬细胞分泌的MMP-9及炎症因子增多，而ApoE表达的缺乏进一步促进巨噬细胞分泌更多的MMP-9及炎症因子。ApoE可能是通过调节巨噬细胞分泌MMP-9及炎症因子，起到保护EAE血脑屏障完整性、减轻EAE炎症反应的作用。22 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硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响中英文缩略词对照表缩写英文全称中文全称MSmultiplesclerosis多发性硬化EAEexperimentalautoimmune实验性自身免疫性脑脊髓炎encephalomyelitisApoEapolipoproteinE载脂蛋白EMMP-9Matrixmetalloproteinase-9基质金属蛋白酶-9MMPsMatrixmetaloproteinases基质金属蛋白酶TIMP-1Tissueinhibitorofmetalloproteinases1基质金属蛋白酶组织抑制因子-1IFN-γInterferon-γ干扰素-γTNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αIL-6Interleukins-6白介素-6WTwild-type野生型MOGmyelinoligodendrocyteglycoprotein髓鞘少突胶质细胞糖蛋白BBBBlood-BrainBarrier血脑屏障CNScentralnervoussystem中枢神经系统ECMextracellularmatrix细胞外基质PETPositronEmissionTomography正电子发射断层显像LDLLowdensitylipoprotein低密度脂蛋白LRPLowdensitylipoproteinreceptorrelated低密度脂蛋白受体相关蛋白proteinMBPMyelinbasicprotein髓鞘碱性蛋白RR-MSRelapsedremissiontypeMS复发-缓解型MS32 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响PBMCperipheralbloodmononuclearcells外周血单个核细胞IL-1βInterleukins-1β白细胞介素-1βCECcerebralendothelialcells脑内皮细胞HBMvECHumanbrainmicrovascularendothelial人脑微血管内皮细胞细胞cellNADPHnicotinamideadeninedinucleotide烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸phosphateoxidase氧化酶ROSreactiveoxygenspecies活性氧LPSlipopolysaccharide脂多糖VLDL-Rverylowdensitylipoproteinreceptor极低密度脂蛋白受体Th1Thymushelper1辅助1型胸腺（细胞）Th2Thymushelper2辅助2型胸腺（细胞）Th17Thymushelper17辅助17型胸腺（细胞）TregRegulatoryTcells调节性T细胞IL-1Interleukins-1白细胞介素-1NF-kBNuclearFactor-kappaB核因子-kB33 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响综述巨噬细胞在神经免疫性疾病、神经退行性疾病中的作用摘要巨噬细胞是机体免疫系统重要的细胞成员，具有吞噬作用、抗原提呈作用、分泌炎症介质等不同功能。炎症等条件下，巨噬细胞可被激活，激活的巨噬细胞分化为两个不同的表型，即M1促炎表型和M2抗炎表型，巨噬细胞的表型变化及产生的各种细胞因子等在许多神经系统疾病中有重要作用。本文主要针对巨噬细胞的起源、极化作用、表型功能及目前巨噬细胞在神经免疫性疾病，如多发性硬化、视神经脊髓炎、吉兰巴雷综合征、重症肌无力，神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病中的作用作简要综述。关键词：巨噬细胞，多发性硬化，视神经脊髓炎，吉兰巴雷综合征，重症肌无力，阿尔茨海默病RoleofmacrophagesinNeuroimmunediseasesanddegenerativediseasesMacrophagesareimportantcellularmembersoftheimmunesystem,whichhavedifferentfunctionssuchasphagocytosis,antigenpresentation,andsecretionofinflammatorymediators.Underinflammationorotherconditions,macrophagescanbeactivated,thentheactivatedmacrophagescanbedifferentiatedintotwodifferentphenotypes,MainlyM1pro-inflammatoryphenotypeandM2anti-inflammatoryphenotype,Thephenotypechangesofmacrophagesandthecytokinesproducedbymacrophagesplayanimportantroleinmanynervoussystemdiseases.Theorigin,polarization,phenotypeandroleofmacrophagesinNeuroimmune34 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响diseases，suchasMultiplesclerosis，Opticneuromyelitis，Guillain-Barresyndrome，Myastheniagravis，anddegenerativediseases，suchasAlzheimersdisease，Parkinson'sdiseasearereviewedinthispaper.Keyword:Macrophages,Multiplesclerosis,Neuromyelitisoptica,Guillain-Barresyndrome,Myastheniagravis，Alzheimersdisease巨噬细胞几乎分布在全身各个组织，巨噬细胞所呈现出的状态、表型功能是受它们的微环境决定的。促炎表型巨噬细胞倾向于分泌有害分子，抗炎表型巨噬细胞产生有利因子，前者促进疾病发展，后者有助疾病恢复。巨噬细胞表型变换出现在神经免疫性疾病如多发性硬化症（MS）、视神经脊髓炎（NMO）、吉兰巴雷综合征（GBS）、重症肌无力（MG）的各个阶段，巨噬细胞也在神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等疾病中占有重要地位，进一步探讨巨噬细胞在这些疾病发生发展中发挥的作用及相关机制，或许可以为这些疾病的治疗提供新靶点。1巨噬细胞的起源及生物学功能1.1巨噬细胞起源单核吞噬细胞系统（MPS）理论是关于巨噬细胞来源的最早理论，当时vanFurth等人[1]于1968年提出所有组织中的巨噬细胞起源于血液循环中的单核细胞。长期以来，人们认为骨髓中的造血干细胞从骨髓释放入外周血中，形成单核细胞，单核细胞迁入组织成为组织巨噬细胞。如今，随着命运图谱分析[2,3]、世系追踪[4]等实验技术的开展，研究者们已证实，单核细胞不是巨噬细胞的唯一来源。Hoeffel团队研究[5]表明，在胚胎期，组织巨噬细胞有两个不同来源，一方面，由早期红髓系祖细胞衍生的卵黄囊巨噬细胞产生，另一方面，晚期红髓系祖细胞在胎儿肝脏获得c-Myb表达后，产生胎儿单核细胞，随后胎儿单核细胞定植到组织并分化为组织巨噬细胞。小胶质细胞的前体细胞主要来源于卵黄囊巨噬细胞，而成年体内的35 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响大多数组织巨噬细胞主要由胎儿单核细胞分化而来[5,6]也有研究者[7]指出，除了小胶质细胞、表皮朗格汉斯细胞起源于卵黄囊，其他所有组织驻留的巨噬细胞来源于胎儿造血干细胞。组织巨噬细胞的起源尚存在争议，但学者们多赞成，大多数组织巨噬细胞，如肝Kupffer细胞，脾、肺和腹腔巨噬细胞，它们的主要巨噬细胞群在出生前已经建立，在成年体内，它们不依赖于血液单核细胞的补充而维持自我更新。最近研究[3]报道，在一定情况下，循环单核细胞可以分化为组织巨噬细胞，这些由循环单核细胞分化而来的巨噬细胞和来源于胚胎前体的巨噬细胞可争夺niches，niches有利于巨噬细胞的自我维持。至今，很多关于巨噬细胞起源的研究仍局限在啮齿类动物和细胞，人类巨噬细胞的确切起源有待考究。1.2巨噬细胞极化与表型功能巨噬细胞可清除衰老、死亡细胞，具有营养、调节和修复功能，在维持机体稳态、宿主防御中发挥重要作用。巨噬细胞对宿主配体和微生物的识别，主要由其质膜受体介导，例如CD206是清除甘露糖终端糖蛋白类的受体，Toll样受体-4和CD14与细菌膜成分（如脂多糖）发生反应，诱导促炎症信号，等等[8]。分布在不同组织的巨噬细胞功能不同[9]。在静息态下，巨噬细胞的激活状态或极化状态受所处环境的影响。促炎性巨噬细胞（M1）和抗炎性巨噬细胞（M2）是巨噬细胞极化的最常报道表型，M2又进一步分为M2a，M2b、M2c和M2d[10]。促炎性巨噬细胞，也称经典活化巨噬细胞，在脂多糖（LPS）刺激下产生，或是LPS与Th1细胞因子，干扰素-γ（IFN-γ）、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）联合作用下分化，M1表达高水平的一氧化氮（NO）、IL-2、CD86，还生成白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-12、IL-23、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,是高效的抗原提呈细胞，有助于免疫介导组织的损伤[11,12]。抗炎性巨噬细胞，也称替代性活化的巨噬细胞，由Th2型细胞因子如IL-4、IL-13刺激产生，M2表达TGF-β、高水平抗炎细胞因子IL-10[12]。其中M2a生长刺激免疫、组织36 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响修复，招募Th2细胞，M2b巨噬细胞具有促炎和抗炎功能，可招募调节性T（TReg）细胞，M2c巨噬细胞能清除碎屑、促进愈合和螯合铁[13]。近来研究报道，人类单核细胞在GM-CSF、M-CSF分别作用下，各自向M1、M2表型方向分化[14]。M1和M2巨噬细胞分泌不同趋化因子，M1细胞分泌CXCL9和CXCL16等招募Th1淋巴细胞、自然杀伤细胞，M2巨噬细胞分泌CCL1、CCL122、CXCL13等招募Th2淋巴细胞、调节性T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞[15]。M1反应刺激Th1应答，如CTL和进一步M1型活化；M2刺激Th2反应，比如抗体产生和进一步扩增M2型反应[16]。在肿瘤疾病状态下，M1促进肿瘤细胞的破坏，M2促进肿瘤发生发展[17]。1.2.1巨噬细胞极化机制巨噬细胞促炎表型与抗炎表型极化状态的相互转换，是微环境中各种信号通路发生改变的结果，这些信号通路有c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路、Notch信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信号通路、JAK/STAT信号通路、TLR/NF信号通路[18]。调控促炎性/抗炎性巨噬细胞极化的转录因子包括C/EBPβ、PPARγ、STAT1、STAT6、IRF4、IRF5[19]。JNK通路在M2表型分化中起着重要作用[20]。MicroRNAs(miRNAs，微小RNA)是非编码单链RNA分子，具有17-22个核苷酸，调控转录后的基因表达水平[21]。有报道miRNAs介导的通路与巨噬细胞极化相关：miR-146a通过靶向Notch1通路调制巨噬细胞向M2方向极化[22]。miR-24抑制巨噬细胞的活化，减少促炎性细胞因子（IL-6、IL-12、TNF-α）的产生[23]。miR--148-3p通过靶向PTEN／Akt通路产生更多ROS，增强杀菌活性，又通过NF-κB通路促进炎症反应，促进巨噬细胞向M1极化，抑制巨噬细胞向M2极化[24]。在疾病的不同发展阶段，识别巨噬细胞所处的不同亚型、活化状态、极化状态，有助于更好地理解疾病的发展进程。37 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响2巨噬细胞在神经免疫性疾病中的作用巨噬细胞在人体内普遍存在，在生理、疾病环境中均起着重要作用。巨噬细胞几乎参与每一种疾病，包括感染、肿瘤、炎症性疾病（如动脉粥样硬化、肥胖、2型糖尿病）、自身免疫性疾病[12]。神经免疫性疾病是一类复杂的自身免疫性疾病，常见的疾病有多发性硬化（MS）、视神经脊髓炎（NMO）、吉兰－巴雷综合征（GBS）。这些疾病的发病机制至今未明确，也一直是研究的热点，越来越多的数据表明巨噬细胞与这些疾病的发生发展有关。2.1巨噬细胞在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用MS的发病年龄多在20~40岁，是青壮年非外伤性残疾的主要原因[25]。神经功能障碍、行动不便、疲劳等症状严重影响MS患者的生活质量。最初根据其病程大致分为复发-缓解型MS（RRMS）、原发性进展型MS(PPMS)、继发进展型MS（SPMS），随着各项辅助检查手段的提高、研究的进一步深入，如今各型MS的临床分类及分类依据更加详细[26]。虽然多发性硬化的病因尚未明确，但近来研究显示其发病机制与基因、环境因素有关，已发现超过200个基因座（基因在染色体上的位置）与MS的易感性相关[27]。EB病毒感染、维生素D缺乏、吸烟、儿童肥胖等因素被证实增加MS患病风险[28]。MS的病理表现：T细胞和巨噬细胞浸润、髓鞘脱失、轴突损伤[29,30]。巨噬细胞在MS中发挥双重作用，一方面，巨噬细胞释放炎症细胞因子、释放蛋白酶和自由基损伤神经元和少突胶质前体细胞、使T淋巴细胞再激活并募集其至CNS；另一方面，巨噬细胞释放神经营养因子、清除抑制性髓鞘碎片、参与轴突再生作用、促进髓鞘再生，帮助中枢神经系统的修复[31,32]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是广泛用于MS研究的动物模型，通过髓鞘抗原MOG、髓鞘碱性蛋白（MBP）等与佐剂的接种38 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响主动免疫诱导，或是髓鞘磷脂反应性T细胞的被动转移诱导，来诱发T淋巴介导的自身免疫反应，可导致不同物种、小鼠品系的瘫痪、脱髓鞘病变等，以此模仿MS的临床和病理表现[33,34]。巨噬细胞在EAE发病机制中起重要作用，HuitingaI等通过消除大鼠脾脏和肝脏中的巨噬细胞，发现EAE的临床表现减轻[35]。巨噬细胞是最先浸润至CNS的细胞，对EAE的发展非常重要[36]。EAE的炎症部位聚集大量巨噬细胞及巨噬细胞分泌的炎症因子（TNF-α和iNOS），与EAE严重程度有关[37]，利用USPIO增强MRI检测炎症病灶早期的巨噬细胞浸润，可预测复发性EAE的严重程度与疾病发展[38]。LiptonHL等将泰勒小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)感染小鼠，诱导Th1CD4+T细胞对病毒和髓鞘蛋白做出应答，以此作为MS实验动物模型，其中巨噬细胞在MS动物模型的发病中具有关键作用，单核细胞招募到CNS后分化为巨噬细胞，一些巨噬细胞被感染以使感染持续下去，另一些巨噬细胞则被激活以介导对髓磷脂膜的损伤[39]。然而，活化的巨噬细胞摄取髓磷脂颗粒，与MS的脱髓鞘形成有关，在MS的脱髓鞘病变部位，摄取髓脂颗粒后的巨噬细胞形成泡沫状，泡沫状巨噬细胞具有抗炎作用，表达抗炎细胞因子如IL-10,TGF-b和IL-4[40]。可见，巨噬细胞在MS/EAE中有不同的表型及功能，发挥破坏及保护的双重作用[32,41]。因此，巨噬细胞参与EAE的发病的多个阶段，具有双重作用。2.1.1小胶质细胞/单核细胞来源的巨噬细胞在MS、EAE中作用单核吞噬系统包括单核细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞。小胶质细胞属于单核吞噬系统，是定居中枢神经系统（CNS）的巨噬细胞。在正常、生理条件下，CNS很少出现浸润的巨噬细胞。CNS病变时，单核细胞源性巨噬细胞，在血脑屏障(BBB)破坏后侵入CNS。单核细胞源性巨噬细胞与小胶质细胞表达许多相同的分子标记物（F4/80、CD11b、CD11c等），在病理条件下很难将两者区分[42]。为区分出这两类细胞，人们一直寻找方法，也发现很多解决的办法，比如根据解剖部位、细胞形态和超微39 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响结构、标记物（单核细胞标记：CCR2和Ly6C；小胶质细胞CD45lo/int型），其他方法如骨髓嵌合体、Cx3cr1-的世系追踪等提高，但每种方法均有其利弊[43]。例如，有研究将巨噬细胞与小胶质细胞表面分子表达及功能差异作为鉴别两者的依据，在EAE高峰期，CD11bposCD45intLy-6Cneg小胶质细胞表现出微弱的免疫激活表型，而CD11bposCD45highLy-6Cpos浸润巨噬细胞被强烈激活，表达更高水平的炎性因子[44]。但由于各种动物模型的差异、实验条件等的限制，很难将这两种细胞完全区分，许多研究人员将这些细胞共同称为巨噬细胞/小胶质细胞。BerardJL等报道，在复发-缓解（relapsing-remitting，RR）EAE或慢性（chronic，CH）EAE病程的开始、高峰期、缓解/进行性阶段，CD11b+/CD45high细胞和CD11b+/CD45low细胞，是CNS中细胞数量最多的细胞[45]，巨噬细胞/小胶质细胞在MS、EAE中的具体作用值得探讨。（1）细胞活化对神经元、少突胶质细胞产生的影响利用PET和放射配体[11C](R)-PK11195观察到，继发进展型MS患者的正常脑白质（NAWM）中，小胶质细胞的活化数量，与MS进展相关联[46]。激活的小胶质细胞通过谷氨酰胺酶产生谷氨酸盐，经过缝隙连接的半通道释放，诱导兴奋性神经毒性，会导致MS的神经变性[47]。慢性复发性EAE的缓解期，海马区小胶质细胞仍处于活化状态，活化的小胶质细胞释放活性氧（ROS），ROS进一步产生NADPH氧化酶，引起神经再生障碍、海马突触可塑性受损，或许是MS相关的认知损害的机制[48]。拉喹莫德防止活化的小胶质细胞中的miR124a降低，miR124a维持小胶质细胞处于静止态，激活小胶质细胞可产生炎性因子、诱导型一氧化氮（NO）合酶等，进而产生自由基毒性，神经元死亡[49]。在MS病灶，活化的小胶质细胞聚积铁，由于细胞铁含量与Sema4A生成量是正相关，故活化的小胶质细胞产生相当多的Sema4A，Sema4A与少突胶质细胞（OLS）上的受体（Tim2）结合，对OLS存在细胞毒性作用：使OLS崩40 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响溃，膜起泡，磷脂酰丝氨酸倒置，最终导致细胞凋亡[50]。miR-30a调节小胶质细胞的炎症反应，促进少突胶质前体细胞（OPCs）的凋亡，抑制OPC分化，miR-30a在移植小胶质细胞中的过度表达加剧了EAE的进展[51]。（2）对T细胞影响小胶质细胞、浸润的巨噬细胞，在中枢神经系统中可发挥APC功能。小胶质细胞可表达MHCⅠ类和II型分子、一系列共刺激分子，是抗原递呈细胞。小胶质细胞参与T细胞活化的大致过程：小胶质细胞的MHC分子与T细胞的特异性T细胞受体（TCR）结合，在多种共刺激的参与下刺激T细胞的活化[52]。在出现EAE的临床症状之前，小胶质细胞、浸润的巨噬细胞上调MHCII和共刺激分子CD80，CD86和CD40表达的，提高APC作用[53]。（3）脱髓鞘与髓鞘再生作用髓鞘是神经细胞轴突表面的一层膜，其具有保护轴突、绝缘、加快神经冲动传导速度的作用。EAE发病前，当免疫细胞尚未浸润至CNS时，小胶质细胞已处于激活状态，此时可观察到轴突-神经胶质改变。而小胶质细胞的持续激活，会使轴索神经胶质区遭到永久性破坏，影响正常神经传导，造成病理上的脱髓鞘病变[54]。髓鞘碎片清除对MS中枢神经系统髓鞘再生是必需的。在EAE高峰期的CNS中，IFN-β主要来源于小胶质细胞分泌，IFN-β介导髓鞘碎片的清除[55]，当小胶质细胞清除髓鞘碎片能力降低，会影响轴突和髓鞘的完整性，从而妨碍髓鞘的正常再生[56]。小胶质细胞通过包住、吞噬、降解清除神经元碎片，一方面有利于受损神经元的修复和再生，另一方面，神经元抗原的自身免疫是轴突损伤的病理机制之一，小胶质细胞吞噬髓鞘和神经元抗原，可能导致抗原呈递和神经元的自身免疫[57]。可见小胶质细胞、单核细胞源性巨噬细胞对髓鞘的破坏、修复发挥双面作用。大量的小胶质细胞/巨噬细胞表达的CCR5在髓鞘再生的早41 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响期阶段明显升高，髓鞘再生结束后显著下降，这或许是小胶质细胞/巨噬细胞发挥修复功能的机制之一[31]。酪氨酸激酶受体（MerTK）介导单核细胞源性巨噬细胞的髓鞘吞噬作用，复发缓解型MS患者的单核细胞源性巨噬细胞（MDMS），MerTK与其配体（生长停滞特异性6）表达降低，吞噬髓鞘的能力降低[58]。轴突损伤与脊髓中小胶质细胞/巨噬细胞积聚有关[49]。在MS影响的正常脑组织中，少突胶质细胞分泌的分子伴侣HSPB5，触发小胶质细胞/巨噬细胞中TLR2介导的保护性反应，然而当T细胞浸润CNS，其释放IFN-γ，在IFN-γ存在的情况下，HSPB5引发小胶质细胞/巨噬细胞产生TNF-α,、Il-6、Il-12,、Il-1β、活性氧及CXCl9、CXCl10、CXl11，表现出强烈的炎症反应，随后这些病变部位出现脱髓鞘[59]。（4）抑制激活小胶质细胞、单核细胞源性巨噬细胞激活后对MS/EAE造成破坏，很多治疗药物就是根据这原理，设法抑制它们的活化，也起到一定疗效。艾拉莫德抑制脑实质巨噬细胞/小胶质细胞激活，改善EAE的急性和慢性期[60]。拉喹莫德抑制小胶质细胞/巨噬细胞的激活，发病前治疗可减少神经轴突损伤，病程高峰期时治疗，停止进行性脱髓鞘和轴突丧失[49]18β-甘草次酸通过对MAPK信号通路的抑制来抑制小胶质细胞的激活，减少小胶质细胞分泌炎症因子与趋化因子，促进脑源性神经营养因子（BDNF）的释放，进而防止致脑炎的T细胞招聘进入CNS，缓解炎症引起的脱髓鞘、增强少突胶质前体细胞（OPC）分化来促进髓鞘再生[61]。尼莫地平诱导小胶质细胞特异性凋亡，促进髓鞘再生[62]。不同时期抑制小胶质细胞的激活，对疾病的影响有所不同，如诱导EAE前抑制小胶质细胞的激活，发病的严重程度和恢复程度没有改变，仅轻微减慢EAE的进展速度；诱导EAE发生时抑制小胶质细胞的激活，明显改善EAE的发病症状[63]。调节小胶质细胞活化作为治疗手段，其潜在机制仍然是令人难以捉摸的。42 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响2.1.2M1型、M2型小胶质细胞/巨噬细胞EAE中，小胶质细胞/巨噬细胞也可分为促炎性小胶质细胞/巨噬细胞（以下简称M1）和抗炎性小胶质细胞/巨噬细胞（以下简称M2）。M1、M2巨噬细胞在EAE不同时期占有主导地位，在急性EAE的早期阶段，M1巨噬细胞(ED1+iNOS+细胞)在数量上占优势，在高峰期和恢复阶段，M2巨噬细胞(ED1+Arg-1+细胞)数量增多，超过M1巨噬细胞[64,65]。M1极化的巨噬细胞和/或小胶质细胞在轴突丢失中起关键作用。限制单核细胞源性巨噬细胞向中枢神经系统转运，或减少单核细胞源性巨噬细胞、小胶质细胞向M1极化，可减少轴突损失和减缓MS患者临床神经功能缺损的进展[66]。M2型驱动少突胶质细胞分化，有利于髓鞘再生[67]。趋化因子是巨噬细胞趋化的主要介质，CCL19,CCL21,CCL24,CCL25,CXCL8,CXCL10和XCL2，特异性诱导的M1型巨噬细胞趋化性，没有一种趋化因子专门介导趋化M1型[68]。在EAE的CNS炎症早期，选择性消除星形胶质细胞产生的CCL2，可减少CNS中经典活化（M1）单核细胞源性巨噬细胞和M1小胶质细胞的累积，可减轻EAE临床症状、减缓脊髓轴突丧失的进程[66]。EAE的早期，NK细胞分泌IFN-γ，促进巨噬细胞向M1表型极化[69]。M1/M2失衡和M2表达受损，是疾病复发的关键因素。有利于向M2转化的药物可能是治疗方法[70]。发病后的EAE小鼠，脂质体包裹的糖皮质激素治疗能改善EAE小鼠的临床症状，和抑制促炎性巨噬细胞的活性、上调M2表型相关的抗炎基因的表达[71]。雌激素促进M2小胶质细胞/巨噬细胞极化，M2极化促进调节性B细胞的产生，阻碍EAE进展[72]。法舒地尔治疗EAE小鼠，能转换巨噬细胞从M1至M2表型，进而延迟EAE发病，改善EAE的严重程度[73]。此外，亚精胺，一种天然多胺，亦能延迟EAE的发病,减轻疾病严重程度，其治疗作用依赖于诱导巨噬细胞的抗炎功能，增强巨噬细胞arginase1表达，降低(IL-1β),IL-12和CD80表达[74]。然而，M2的过度激活或激活时间延长，会促进纤维化和瘢43 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响痕形成，可能妨碍髓鞘再生，不利于功能恢复[13]。因此利用M1向M2转化以达到缓解或治疗疾病目的需要掌握一定的度，也并不是任何时候转化都会取得好的效果。调控机制Notch受体是很多细胞上的跨膜蛋白，Notch配体与受体结合而转导信号，控制许多细胞过程，包括细胞分化。哺乳动物中的Notch蛋白家族包括四个受体Notch1-4及一系列配体Jagged（Jag1、Jag2）、Deltalike（DLL1、DLL3和DLL4）。最近研究，DLL4促进血单核细胞分化为炎性的M1巨噬细胞,通过DLL4/Notch信号通路阻止M2巨噬细胞分化[75]。而脑中的MicroRNA-124由小胶质细胞表达，MicroRNA-124可维持CNS中小胶质细胞的静息态，促进单核细胞源性巨噬细胞从M1型向M2型转化，减少巨噬细胞炎性因子（TNF-α、iNOS）分泌，抗炎性因子（TGF-β1）分泌增多[76]。YuZ等人[77]发现MSX3是介导小胶质细胞M2极化的一个同源盒基因,上调小胶质细胞中的MSX3水平，小胶质细胞向M2方向极化,抑制病灶炎症反应和脱髓鞘反应，MSX3通过激活小胶质细胞JAK3-STAT6和PPARγ信号通路，促进M2极化。2.2巨噬细胞在视神经脊髓炎中的作用视神经脊髓炎（Neuromyelitisoptica，NMO）是一种主要累及视神经和脊髓的严重的中枢神经系统自身免疫性疾病[78]。大多数NMO患者血清中存在一类特异性免疫球蛋白G抗体（NMO-IgG），NMO-IgG被作为NMO的特异性标记物，Lennon等[79]发现该抗体选择性地结合星形胶质细胞足突上的部分金属蛋白复合物，即水通道蛋白4（AQP4），证实NMO-IgG是AQP4抗体。AQP4是CNS中主要的水通道蛋白，除了存在血脑屏障和室管膜–脑脊液屏障的星形胶质细胞足突上，还存在视神经、骨骼肌细胞、胃壁细胞、肾主细胞、肠、唾液腺、嗅上皮、肺泡、内耳[80]。NMO-IgG与星形胶质细胞上的AQP4结合，可诱导补体依赖性细胞毒性44 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响（CDCC）和抗体依赖性细胞毒作用（ADCC），导致星形胶质细胞死亡、血脑屏障破坏[81]、脱髓鞘和神经元损伤。巨噬细胞也参与NMO的CDCC和ADCC。NMO的病理表现包括AQP4、髓鞘的丢失，补体并活化沉积在血管周围，粒细胞和巨噬细胞浸润和小胶质细胞激活等[82]，病理表现：广泛轴突损伤、坏死和相关的空泡。NMO的动物模型包括体外脊髓切片培养模型、被动转移NMO-IgG抗体和炎症因子注射模型、被动转移NMO-IgG抗体和人类补体模型、脑内或鞘内被动转移NMO-IgG抗体介导模型等，但目前没有动物模型能诱导动物产生致病性NMO-IgG抗体，最大限度符合NMO的致病机制、病理特征和临床症状等是未来动物模型研究的努力方向[83]。NMO患者的脊髓病变部位存在广泛的巨噬细胞/小胶质细胞浸润[84,85]。当在离体培养的脊髓片中加入NMO-IgG抗体和补体时，可诱导产生NMO样病变，而巨噬细胞加重病变的严重程度[86]。在NMO患者的脑部病灶中，CD68+巨噬细胞和小胶质细胞表达干扰素-γ诱导蛋白30（IFI30）和CD163，与病变部位的脱髓鞘、轴突丧失、坏死、空洞形成和血管纤维化相关，提示巨噬细胞在NMO病理上发挥重要作用[87]。在脑内注射NMO–IgG建立的大鼠NMO模型中，减少巨噬细胞的数量可降低NMO病变的严重程度[86]，提示巨噬细胞对NMO病理改变的影响不可忽视。AsavapanumasN等利用人血清AQP4免疫球蛋白G（NMO-IgG）在脑内针刺伤后予腹腔内注射，制造的视神经脊髓炎病变模型，造模后第5天，大多数巨噬细胞对精氨酸酶1阳性，而非iNOS阳性，显示以M2型巨噬细胞为主[88]。或许，巨噬细胞在NMO中并非都是致病性，也可能发挥抗炎等有利作用。其他关于巨噬细胞与NMO的研究：基于NMO中的AQP4Ab测定需要高灵敏度的细胞培养系统，KariyaY等人利用免疫印迹（WB）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法发现，骨桥蛋白在NMO患者脑白质明显45 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响升高，其中骨桥蛋白是由星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞及浸润的巨噬细胞生成，并证明NMO患者中脑脊液整合素αvβ3通过激活磷脂酰肌醇3-激酶和MEK1／2信号通路促进巨噬细胞趋化作用，认为脑脊液骨桥蛋白可作为NMO患者的生物标志物[89]。目前关于巨噬细胞在NMO及其动物模型中的作用的研究较少，巨噬细胞亚型、巨噬细胞极化在NMO不同时期的变化对NMO的影响等方面，更是缺乏研究。希望今后有更多的研究来阐明巨噬细胞与NMO之间的关系，并探讨其相关机制，或许可以为NMO的治疗方向提供新思路。2.3巨噬细胞在吉兰巴雷综合征中的作用吉兰巴雷综合征（Guillain-Barresyndrome，GBS）是由自身抗体攻击鞘磷脂蛋白或外周神经的轴突成分引发周围神经系统脱髓鞘的自身免疫性疾病，也是最常见和最严重的急性麻痹性神经病[90]。GBS最常见的症状包括肢体无力、反射消失和麻痹[90]。其中急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病（AIDP）和急性运动轴索性神经病（AMAN）是GBS的两个主要亚型，前者以脱髓鞘病变为主，后者以轴索变性为主[91]。GBS的相关病理学发现炎性细胞浸润脊髓根或外周神经，尤其是T淋巴细胞和巨噬细胞，伴有节段性脱髓鞘区，并继发轴索变性[92]。实验性自身免疫性神经炎（experimentalautoimmuneneuritis,EAN）作为人类GBS的动物模型，利用外周神经髓磷脂免疫啮齿类动物。各种不同的神经病理学和急性运动感觉的症状取决于抗原和宿主种类。神经内膜巨噬细胞是定居周围神经系统中的巨噬细胞。周围神经病变时，单核细胞源性巨噬细胞通过粘附分子的协同作用和趋化信号等迁移至外周神经，故在GBS中存在这两种巨噬细胞。巨噬细胞在GBS/EAN的发病过程中起着重要作用。在免疫反应起始阶段，神经内膜巨噬细胞发挥抗原呈递作用，有助于触发自身免疫反应[93]。M1型巨噬细胞也参与EAN的诱导阶段，是EAN发病过程中的主要参与者RAD001巨噬细胞在疾病中46 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响的破坏作用：巨噬细胞在受体或补体帮助下，引起脱髓鞘、轴突损失，还分泌自由基、促炎症因子如TNF-a等损伤组织[93]。EAN中T细胞和巨噬细胞的浸润程度，与疾病的严重程度相一致[94]。抑制巨噬细胞浸润至外周神经，可改善EAN模型的神经系统症状[95]。而降低巨噬细胞炎症因子分泌，也有助于抑制EAN发病、降低的临床严重程度[96]。然而巨噬细胞在疾病中也发挥有利作用：CCR2招聘巨噬细胞至损伤的周围神经系统后，巨噬细胞吞噬碎片，有利于沃勒变性后的轴突再生[97]。在疾病恢复过程中，巨噬细胞促进T细胞凋亡、分泌抗炎症因子IL-10和TGF-β，参与神经膜细胞增殖，促进疾病恢复[93]。有研究显示，TNF-α能诱导巨噬细胞向促炎（M1）型极化，上调促炎因子IL-12和NO的表达，TNF-a缺乏，巨噬细胞由促炎表型向抗炎表型转化，上调抗炎因子IL-10表达，延缓EAE发病，减轻临床程度[98]驱动巨噬细胞从M1型向M2型转化，已成为当今EAN治疗的一个靶点。富马酸二甲酯衰减(DMF)、化合物A（糖皮质激素受体的植物源性配体）诱导抗炎性巨噬细胞，起到一定疗效，病理上减少周围神经、脊髓的炎症细胞浸润，EAN的临床严重程度也得到一定减轻[99,100]。此外，依维莫司抑制mTOR通路，促进p-Akt表达,从而导致M2巨噬细胞极化，改善EAN大鼠的预后[101]。认清定居巨噬细胞、单核细胞源性巨噬细胞及M1、M2型在GBS、EAN疾病过程中的作用，探索巨噬细胞与疾病的关系，能更好地理解疾病的发生发展。2.4巨噬细胞在重症肌无力中的作用重症肌无力（MyastheniaGravis，MG）是最常见的神经肌肉接头功能障碍引起的自身免疫性疾病，临床特征为眼肌、延髓和肢体肌肉疲劳无力[102]。与MG相关的致病抗体主要包括，针对乙酰胆碱受体（AChRs）、肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）、脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）的抗体47 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响[103]。大约10%的自身免疫性MG患者患有胸腺瘤，60%的病人胸腺增生，可见胸腺的异常与MG的发病机制相关[104]。最近报道，特异性miRNAs与MG相关的胸腺改变有关，特别是miR-7-5P，miR-125a-5P和miR-20b-3P*也是有意义的[105]。实验性自身免疫性MG（EAMG），通过自动免疫接种自抗原（auto-Ags）或auto-Abs的被动转移建立，目前有三种EAMG模型包括AChR-EAMG和MuSK-EAMG和LRP4-EAMG，这些模型模拟人类疾病的许多特征[102]。早期研究发现，EAMG的急性期以巨噬细胞浸润，肌肉终板的和肌肉纤维坏死的炎症为特征[106]。后来研究也发现，在EAMG的早期阶段，浸润巨噬细胞出现在肌肉组织[107]。在EAMG的急性期，巨噬细胞作为APC细胞发挥作用，同时有助于慢性期自身-AChR的产生[108]。CavalcanteP等人利用PCR技术，在几个MG患者的胸腺中检测到脊髓灰质炎病毒，且该病毒存在巨噬细胞的细胞质中，提示脊髓灰质炎病毒感染巨噬细胞，可能与MG的发病有关[109]。巨噬细胞在重症肌无力方面的研究报道寥寥无几且历史久远，而关于巨噬细胞极化等在重症肌无力方面的研究报道更是少见，期待后续有更多研究。3巨噬细胞在神经退行性疾病中的作用3.1巨噬细胞在阿尔茨海默病中的作用阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一种主要影响老年人的以伴有认知功能减退和记忆丧失等为主要临床特征的神经退行性疾病。AD的病理学特征有淀粉样斑块（Aβ）、神经原纤维缠结、神经元和突触丢失[110]。AD的发病机制尚未明确，当前研究认为与遗传背景、环境、年龄、ApoE等因素相关。与阿尔茨海默病风险相关的免疫功能基因有ABCA7、APOE、TREM2、CD33等[111]。目前AD的动物模型主要包括转基因模型（APP、Aβ、APP/PS1、APP/Tau等）、非转基因模型（急性Aβ注射、急48 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响性tau注射、衰老动物模型等），各类模型各有优、缺点[112]。3.1.1TREM2小胶质细胞是中枢神经系统的巨噬细胞，小胶质细胞与AD疾病关系的研究是当今研究的热点。TREM2是一种小胶质细胞表面受体，在小胶质细胞上高度表达，TREM2能触发细胞内蛋白酪氨酸磷酸化[113,114]。oAβ以高亲和力与TREM2结合，在小胶质细胞中激活TREM2依赖的信号通路[115]。在AD的5XFAD模型，TREM2通过使小胶质细胞聚集在Aβ斑块周围，有效防止Aβ沉积，并改变β斑块结构，从而限制神经炎性损伤，保护AD[116]；TREM2的缺失，增加了β淀粉样蛋白（Aβ）的积累[113]。而JiangT等[117]利用APP/PSEN1转基因小鼠，也发现TREM2通过增强小胶质细胞对淀粉样β(Aβ)的吞噬作用，改善淀粉样病变。他们还将P301S小鼠作为Tau病理学的一个动物模型，研究发现疾病进展过程中，TREM2在小胶质细胞上的表达上调，在沉默脑的TREM2后，P301S小鼠的tau病理加重，小鼠的神经退行性改变和空间学习障碍更为严重[118]。JiangT等[119]证明TREM2通过抑制小胶质细胞的炎症反应，改善活化的小胶质细胞对神经元的tau过度磷酸化的病理作用。此外，最近一项研究[120]表明，在AD小鼠模型的脑中，增加TREM2基因的剂量可改变小胶质细胞的转录程序，增强小胶质细胞的吞噬活性，改善AD小鼠模型行为缺陷，减少斑块相关神经炎病理学、改善认知缺陷。以上研究均提示TREM2在AD中发挥有利作用。然而有研究显示，TREM2在AD病理学中发挥有害作用：在AD的APP/PS1小鼠模型中，TREM2的缺失，使CD45hiLy6C+巨噬细胞基本上被消除，免疫反应减轻，淀粉样蛋白积累减少，tau的病理学得到改善[121]。3.1.2小胶质细胞、巨噬细胞在AD中的作用在AD的转基因小鼠模型TgAPP/PS1和TgAPP/PS1dE9,单核细胞源性巨噬细胞（MDM）浸润在非常老的小鼠中，且表达基础水平的活化标记49 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响物，而小胶质细胞仅在正常老化和Aβ病理下表现出激活的表型，两种细胞存在不同的炎性表型[122]。相对于单核细胞源性巨噬细胞而言，人们对小胶质细胞在AD中的研究更多。Aβ可刺激小胶质细胞活化，一方面，活化的小胶质细胞吞噬作用增强，可通过吞噬Aβ和释放酶降解Aβ，延迟AD的进展，另一方面，老化的小胶质细胞在这些过程的作用效率越来越低，容易对刺激做出过度激活，并引发过强烈的反应，可能引起神经元损伤[123,124]。有研究，CD33在AD患者脑组织中的表达增加，CD33抑制小胶质细胞摄取Aβ[125]。而Hong等报道，受体C1q是经典补体级联的启动蛋白，抑制C1q,C3或小胶质细胞的补体受体CR3，可减少吞噬小胶质细胞的数量和减轻早期突触丢失程度；当暴露于可溶性Aβ低聚物时，成人脑内小胶质细胞发挥的吞噬突触材料是依赖CR3的过程，表明补体和小胶质细胞共同介导AD的早期突触丢失[126]。此外，小胶质细胞加剧tau扩散[127]，相反，小胶质细胞的缺失，显著抑制tau传播[128]。3.1.3小胶质细胞极化与阿尔茨海默病同巨噬细胞一样，小胶质细胞也可归为促炎的M1表型和抗炎的M2表型。APP23小鼠是淀粉样前体蛋白转基因小鼠，有研究[129]将微量白细胞介素-4/白细胞介素-13注射至4.5月龄大的APP23小鼠的一侧半球，免疫组化结果显示小鼠细胞因子注射后2天，小胶质细胞数量增加，其中小胶质细胞的精氨酸酶Ⅰ，YM1和CD163（M2型）的表达增多，TNF-α（M1型）水平降低，证明大多数活化的小胶质细胞具有M2样表型。该研究提示细胞因子可能是通过激活M2型小胶质细胞，诱导神经元内外Aβ肽类的降解和清除，显著改善4.5个月龄APP23小鼠的认知功能。JiangT等[130]发现，TREM2过表达，通过将小胶质细胞转换至M2表型，从而抑制神经炎症，减轻tau过度磷酸化引起的神经元和突触丢失，即改善小鼠的tau病理及空间认知损伤。HamelinL等[122]利用18F-DPA-714PET的功能显像、MRI等方法，来研究小胶质细胞活化与阿尔茨海默病临床进展的时态关50 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响系，发现小胶质细胞对疾病的影响可能与选取的病人有关而不是疾病阶段有关。3.2巨噬细胞在帕金森病中的作用帕金森病(parkinson'sdisease，PD)是一种与年龄相关的神经系统退行性疾病，其中含多巴胺神经元的黑质(NS)区逐渐丧失，导致震颤、肌强直、运动迟缓和体位异常等主要临床特征。造成多巴胺神经元在黑质区丧失的原因尚不明确。PD的发病机制尚不明确，迄今亦无有效的治疗措施，很多研究利用PD的动物模型探寻其发病机制及治疗策略。PD的动物模型多种多样，包括6-羟多巴胺(6-OHDA)模型、MPTP模型、鱼藤酮模型、神经炎症模型、转基因模型等[131,132]。3.2.1小胶质细胞、巨噬细胞在PD中的作用小胶质细胞、巨噬细胞在PD发病过程中具有致病作用，PD出现症状前，海马中大量小胶质细胞增殖提示神经炎症反应在PD病理学的发展中起重要作用[133]。在帕金森病的细胞培养和动物模型中，小胶质细胞线粒体功能受损可增强小胶质细胞NLRP3炎性体驱动的促炎症级联反应，增强多巴胺能神经变性过程[134]。激活的小胶质细胞释放自由基等有害物质，介导多巴胺能神经元的变性、神经毒性[135,136]。有研究将小鼠巨噬细胞和SH-SY5Y细胞（人多巴胺能神经元细胞模型）在体外共培养条件下，经脂多糖（LPS）刺激活化的巨噬细胞产生NO和活性氮物种（RNS），引起多巴胺能神经元氧化应激，最终导致多巴胺能神经元中硝化α突触核蛋白的形成[137]。而小胶质细胞、巨噬细胞产生的GDNF具有神经保护作用，人们已经成功转染GDNF至巨噬细胞，这些巨噬细胞可释放含有神经营养因子的外体，外体将GDNF有效转移到目标神经元，改善帕金森病小鼠的神经变性和神经炎症[138]。以上提示小胶质细胞、巨噬细胞在帕金森病中发挥双重作用。51 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响3.2.2小胶质细胞极化在慢性PD小鼠模型中，多巴胺能变性与小胶质细胞向炎症方向的逐渐极化有关。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ激动剂罗格列酮促进小胶质细胞向M2极化，起到神经保护作用[139]。MPTP诱导的PD临床前期动物模型，维生素D治疗一方面显著降低黑质致密区（SNC）和纹状体中神经元细胞的丢失、降低M1型小胶质细胞的激活，减少iNOS和TLR4的表达，另一方面增加M2型小胶质细胞活化数量，上调小胶质细胞的抗炎细胞因子（IL-10、IL-4和TGF-β）的表达，起到神经保护作用[140]。烟酸治疗PD患者，可能是通过烟酸受体GPR109A影响外周血巨噬细胞从M1（促炎）到M2（抗炎）极化，提高患者生活质量[141]。在MPTP诱导的小鼠PD模型黑质致密区，小胶质细胞从有害的M1表型向有益的M2表型转换是受到kir6.1-含ATP敏感性钾(kir6.1/K-ATP)通道的调控[142]。以上均提示小胶质细胞的M2表型在疾病发生发展过程中发挥有益作用。3.2.3药物治疗抑制小胶质细胞的活化神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠PD模型已被广泛应用，利用血管活性肠肽（VIP）治疗，可减少小胶质细胞激活后产生的细胞毒性介质如iNOS、IL-1β和TNF-α，显著降低黑质致密区中的多巴胺能丢失和黑质纹状体神经纤维丢失[143]。过氧化物酶增殖物激活受体（PPARγ）拮抗剂如吡格列酮治疗MPTP诱导的小鼠PD模型，可减少小胶质细胞的激活，阻断NFkB和iOS的激活[144]。脂多糖(LPS)注入大鼠黑质(SN)制作成的PD模型，生长抑素（SST）预处理可抑制小胶质细胞活化，减少TNF-α、ROS、IL-1β和前列腺素E2的产生。SST或许可作为包括PD在内的神经退行性疾病的药物治疗[145]。在脂多糖（LPS）诱导的PD模型中，尿酸盐通过激活小胶质细胞，调节尿酸转运体介导的胞内尿酸水平，从而保护多巴胺能神经元免受氧化应激诱导的细胞死亡[146]。52 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响近来有研究基于巨噬细胞的药物递送系统的神经保护作用，以巨噬细胞作为帕金森病（PD）治疗靶点。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是PD的细胞和动物模型中最有效的神经保护剂。然而，中枢神经系统中GDNF的传递受到血脑屏障（BBB）的限制。基于骨髓干细胞来源的巨噬细胞能够通过BBB和到达神经元变性的部位，BijuK等通过基因修饰的巨噬细胞，将GDNF递送至CNS[147]。CangC等亦利用转基因技术使得巨噬细胞脑内浸润，并运送GDNF至脑内，减轻线粒体神经元丢失和改善帕金森病小鼠模型MitoPark小鼠的帕金森病症状[148]。4结论巨噬细胞在神经系统疾病，诸如神经免疫性疾病、神经退行性疾病的病理中发挥复杂作用。在疾病的不同发展阶段，巨噬细胞的活化、表型等的变化取决于微环境的影响。进一步探讨巨噬细胞表型与表型之间转化的作用关系及相关机制，使巨噬细胞分化向有利于疾病的方向发展作为这些神经系统疾病的治疗靶点。53 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硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响的学业。感谢蒋海红、谭雅夫等舍友的关心与帮助，我们之间美好的友谊，让我研究生期间的业余多姿多彩，充满团结与友爱。最后，感谢我的父母和亲人们。感谢一直来给予我的支持和肯定，让我无所顾虑地专注学业。感谢他们在学习和生活上给予我无微不至的关怀。三年的时光转瞬即逝，除了不舍，还有对母校的祝福，满怀对老师、同学、朋友与家人的感恩之情。三年的锻炼，我收获无尽。一起走过的日子弥足珍贵。我会把这一切的美好铭记在心，带着这份感激之情继续努力，不断鞭策自己，创造更精彩的未来！74 硕士学位论文载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响攻读硕士研究生期间撰写的文章卢珍梅，卢文玉，唐玉兰，范丽君，李一锋，韦俊杰，韦云飞.载脂蛋白E对EAE小鼠发病前期巨噬细胞分泌MMP-9、TIMP-1及炎症因子的影响.中华神经医学杂志，2018，17(2):136-141.（中文核心期刊，第一作者）75 ＇？－：．祕ｉ＿＾ｙ＼ｖ＼
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